JPH0776170B2 - 微量乳化を用いる小胞の製造方法 - Google Patents

微量乳化を用いる小胞の製造方法

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JPH0776170B2
JPH0776170B2 JP61019163A JP1916386A JPH0776170B2 JP H0776170 B2 JPH0776170 B2 JP H0776170B2 JP 61019163 A JP61019163 A JP 61019163A JP 1916386 A JP1916386 A JP 1916386A JP H0776170 B2 JPH0776170 B2 JP H0776170B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、極めて高い剪断力で脂質組成物を微量乳化す
る（microemulsify）ことにより、大量の（commercial
quantities）単一ラメル小胞の形態の小さな脂質ミセル
粒子（micellular particles）を製造する方法に係る。
（従来の技術） （リポソームとしても公知の）小胞の形態の単一ラメラ
（unilamellar）リン脂質ミセル粒子には、動物モデル
を用いるヒトの腫瘍の如き異常の診断用として、またイ
メージング剤の如き各種物質のキヤリヤとして研究者の
関心が向けられつつある。特に、（2000Å未満の）小さ
な小胞を標識して腫瘍にターゲツトしうることが報告さ
れている〔プロフイツト（Proffitt）ら、ジエー．ヌク
ル．メド．（J.Nucl.Med.）24（１）p.45−50（198
3）〕。前記小胞は、腫瘍の治療用薬剤の強力なキヤリ
ヤとしても有用である。また、小さな小胞はイン・ビト
ロなイムノアツセイにも有用である〔米国特許第4,342,
826号明細書およびデイー．パパハドヨポーロス（D.Pap
ahadjopoulos）編、アナルス ニユーヨークアカデミー
サイエンス（Annals N.Y.Acad.Sci.）,308（197
8）〕。小胞の組織特異性を高めるために小胞表面に各
種炭水化物誘導体を導入するか、或いは小胞の安定性を
高めるためにコレステロールを添加することによつて修
飾した、イメージング剤および治療薬含有小胞もある
〔マウク（Mauk）およびギヤンブル（Gamble），アナ
ル．バイオク．（Anal.Bioc.）,94,p,302〜307（197
9）；マウク（Mauk）ら,P.N.A.S.（U.S.A.）77（８）、
p,4430〜4434（1980）およびリポソーム テクノロジー
（Liposome Technology），ターゲツトされた薬剤供給
および生物学的相互作用（Targetted Drug Delivery an
d Biological Interaction）,Vol II,ジー．グレゴリア
デイス（G.Gregoriadis）編C.R.C.プレス社（198
4）〕。
リポソームの如き小胞は従来、超音波処理、透析、注入
あるいは逆相蒸発（reverse phase evaporation）の方
法を用いて製造される。これらの方法は公知であり、下
記文献に記載されている。ハング（Huang）、バイオケ
ミストリー（Biochemistry）,8,p.344（1969）（超音波
処理）；ローデン（Rhoden）およびゴールデイン（Gold
in），バイオケミストリー（Bio Chemistry）,18,p.417
3（1979）（透析）；クレマー（kremer）ら，パイオケ
ミストリー（Biochemistry）,16,p.3932−3935（1977）
（注入）；リポソーム テクノロジー（Liposome Techn
ology），リポソームの製法（Preparation of Liposome
s）,Vol.I,グレゴリアデイス（Gregoriadis）編CRCプレ
ス社（1984）。これらの方法には大量の小胞を有利に製
造できない欠点を含めて幾つかの欠点がある。
可溶性および不溶性成分を用いて溶液からエマルジヨン
を製造するために均質化装置（homogeni−zing device
s）を使用することは、従来公知である（米国特許第4,1
27,332号明細書）。そのような均質化装置は、不溶性お
よび可溶性成分を分散させるために剪断力を生ずるよう
に操作する。これらの剪断力は、サンプル溶液が狭いチ
ヤネルを通るにつれて流体の蒸気圧が低下し、サンプル
溶液に気泡が急速に形成されることを含む空洞現象（キ
ヤビテーシヨン）として公知の方法によりもたらされ
る。次いで、気泡は溶液がこれらのチヤネル領域から移
動するにつれて崩壊し、剪断力を生ずる。しかしなが
ら、前記均質化装置は、ベーキング用（baking purpose
s）リポプロテインのような（１ミクロン以上）の大き
な粒子を有するエマルジヨンを形成する目的で（米国特
許第4,360,537号明細書）、或いは単に油と水のエマル
ジヨンを形成するために（米国特許第4,026,817号明細
書）比較的低圧（通常10,000psi以下）で操作されてい
る。
最近、小胞を製造する際にホモジナイザーの如き各種デ
バイス（装置）が使用されている（米国特許第4,411,89
4号明細書）。しかしながこれらのデバイスは、小胞を
形成するのに高い剪断力が要求されずかつイン・ビボで
最適に安定な小胞を形成しない小胞前駆体物質例えば大
豆レシチンあるいは卵レシチンの初期分散を促進するた
めに使用されてきた。また、フレンチ・プレス・アンド
・プレシツシヤー・セル（French Press and Pressure
Cell）も、小さな小胞を製造するために使用されてきた
（米国特許第4,263,428号明細書）。しかしながら、こ
の装置には脂質溶液を装置中に再循環させる手段が設け
られていないためサンプルを再充填させる（reload）の
に多くの時間を要する欠点がある。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明の目的は、小さな単一ラメラ小胞、特に体内の腫
瘍の治療および診断に適した小胞を大量に製造するため
の、有効かつ時間の節約ができかつ再現性のある方法を
提供することにある。
（発明の要旨） 本発明の（2000Å未満の）小さな単一ラメラ小胞を大量
に製造する方法では、所望の小胞を形成しうる脂質と他
の成分を含有する溶液を特定の温度に維持された変更改
良した均質化装置内に導入し、極めて高い剪断力を特定
時間加える。
本発明は更に、体内の腫瘍細胞をターゲツトするための
イメージング剤のキヤリヤとして使用するのに適した、
（2000Å未満の）小さな単一ラメラ脂質小胞を製造する
方法も包含する。これらの小胞は、小胞を形成しうる成
分、イオノフオア，キレート化剤、および用途によつて
は前記キレート化剤と結合する放射性トレーサーの溶液
を均質化装置に導入し、この溶液を特定温度に維持しな
がら前記溶液に極めて高い剪断力を特定時間加えること
により製造される。
本発明は、体内の腫瘍を治療するための治療薬のキヤリ
アとして使用するのに適した、（2000Å未満の）小さな
単一ラメラ小胞を製造する方法も包含する。これらの小
胞は、小胞を形成しうる成分、治療薬、および用途によ
つてはイオノフオア，キレート化剤および前記キレート
化剤と結合しうる放射性トレーサーの溶液を均質化装置
に導入し、この溶液を特定温度に維持しながら前記溶液
に極めて高い剪断力を特定時間加えることにより得られ
る。
（好ましい具体例の記載） まず、小胞を形成しうる物質の溶液の調製法について記
載する。本発明で好ましく使用される脂質はリン脂質で
あり、例えばジパルミトイル・ホスフアチジルコリン
（DPPC），ジステアロイル・ホスフアチジルコリン（DS
PC）およびこれらに類似する物質が含まれる。
リン脂質以外の両親媒性分子、例えばホスホグリセリド
も使用されうる。疎水性効果（Hydrophobic Effect），
チヤールス・タンホード（Charles Tanford），ウイリ
ー‐インターサイエンス（Wiley Interscience）（198
0），バイオロジカル リピド（Biological Lipids），
（Ch,ll）,p.106−109を参照されたい。比較的高温（37
℃以上）で相転移を示す炭化水素鎖を有する化合物を使
用することが好ましく、これによつてイン・ビボで優れ
た安定性を有する小胞が形成される。相転移点が炭化水
素鎖の長さの関数であることも公知である〔疎水性効果
（Hydrophobie Effect），チヤールス タンホード（Ch
arles Tanford）（第２版、1980）〕。従つて、少なく
とも16個の炭素原子を含む炭化水素鎖を有する小胞形成
化合物が好ましい。しかし、そのような長い炭化水素鎖
を用いても小胞を形成することは難しい。
特定の温度を維持しうるレザバー（reservoir）を備え
た均質化装置を以降に特定する高い圧力下で操作するこ
とによつて、長鎖炭化水素化合物を大量生産しうる改良
された小胞に変換させることができることは驚くべき知
見である。
本明細書に開示された方法を用いて製造される小胞の安
定性を高めるために、コレステロールを脂質溶液に添加
してもよい。また小胞を腫瘍の位置を決定し診断するた
めのイメージング剤のキヤリアとして使用するときに
は、キレート化合物を脂質溶液に添加して小胞内にとり
込んでもよく、放射線標識用外部カチオン（external c
ation）を負荷（担持）するためにイオノフオアを小胞
内のキレート剤に加えてもよい。イメージングはガンマ
ーカメラを用いて行なわれる。好ましいイオノフオアは
A23187であるが、他にラサロシド（lasalocid）Ａ（Ｘ
−537A）およびラソロシド（lasolocid）の５−ブロモ
誘導体のようなポリエーテル類；ボーベライシン（beau
vericin）のような環式デプシペプチド類；バリノマイ
リン（valinomylin）のような環式ペプチド類およびア
レナシオリド（arenaciolide）のような抗真菌性毒素も
有用なイオノフオアである。好ましいキレート化剤はニ
トリロ酢酸（NTA）であるが、他のキレート化剤も使用
可能である。例えばカチオンが多価金属イオンの場合に
は、前記イオンに対するポリアミノカルボン酸キレート
化剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸、ジエチレン
トリアミンペンタ酢酸、ジアミノシクロヘキサンテトラ
酢酸およびイミノジ酢酸が使用される。腫瘍をイメージ
ングするのに有用な薬剤の中には、ジアトリゾイツク塩
〔例えばヒパーク メグルミン（Hypaque meglumin
e）〕のようなＸ線イメージング用造影剤あるいは常磁
性イオンおよびそれらの強キレート化剤との複合体（例
えばガドリニウム−DTPA）のような核磁気共鳴（NMR）
イメージング剤が包含されうる。
本発明は、患者の腫瘍のような異常を治療すべく治療剤
を運搬させる（carry）ために小胞を使用することにも
係る。メソトレキセート，アラビノシルアデニンまたは
アクチノマイシンＤのような化学療法剤を本発明のマイ
クロカプセル化（microencapsulation）工程中に小胞に
付加してもよい。また腫瘍の放射線療法用にヨウ素131,
イツトリウム90またはリン32のような放射性核種を製造
された小胞に本明細書に記載の方法に従つて付加しても
よい。
本発明においては、小胞形成物質の溶液から小さな単一
ラメラ脂質小胞のミクロエマルジヨンを製造するために
必要な極めて高い局在化（localized）剪断力を生ずる
ように、高圧で操作しうる均質化装置を使用しなければ
ならない。このような装置は改良された（modified）ガ
ウリンホモジナイザー（Gaulin Homogenizer）（モデル
15M）であり、ホモジナイジング弁を用いて脂質溶液を
分散しうるように設計されている。ホモジナイザーの仕
様書には、連続運転の場合には55MPa（8,000p.s.i.）の
圧力で、また断続運転の場合には69MPa（10,000p.s.
i.）の圧力で操作するように指示されているが、安全性
について十分注意すれば最高83MPa（12,000p.s.i.）の
圧力でホモジナイザーを短時間運転することができるこ
とが今回知見された。好ましい具体例では、ホモジナイ
ザーを用いて溶液を１/mの速度でホモジナイジング弁
を通過させて再循環させる。
ガウリンホモジナイザーに改良を加えて、約５−10℃と
80℃に維持された２個の熱交換レザバーと、長鎖炭化水
素の小胞形成成分を小胞に変換させるのを助長するフイ
ードバツクループが備えられている。熱交換レザバーの
温度が高温のときには、所望のサイズの小胞を得るため
に広範囲の圧力セツテイングが使用されうる。剪断力が
生ずるホモジナイジング弁領域の温度に比べて脂質溶液
の実際の温度は数度高いので、レザバー温度が高いとき
には高圧は望ましくない。もし高圧にすると、分散弁領
域の溶液の温度は更に上昇してしまうであろう。従つて
操作温度が高いときには圧力をより低くセツトすればよ
く、各種生物学的用途に適した大きさの小胞が得られ
る。上記したようにこの効果は恐らく、長鎖炭化水素の
両親媒性分子が相転移点を超える温度で小胞により容易
に変換されるためであろう。
本発明では、動的光散乱の原理を用いて溶液中の粒子サ
イズの分布を決定するニコンプ（Nicomp）200レーザー
・パーテイクル・サイズ・インストウルメントを用いる
こともできる。簡単に言えば、レーザー光を小胞サンプ
ル溶液に通し、自己相関関数として表示される一連の時
間依存性（time−dependent）の計算結果を用いて散乱
光の強度における揺動の時間挙動から粒子サイズを測定
する。粒子の流体力学半径（Rh）は、最小二乗法を用い
るストークス−アインシユタイン関係より算出する。分
布はガウス分布であると仮定して、サンプルからニコン
プ（Nicomp）により生じる平均半径および粒子分布を得
る。しかしながら粒子分布が二頂分布であるときにはこ
の仮定は適当でなく、ニコンプの製造業者が提供する専
有計器プログラム（proprietary instrument program
s）を用いてサンプルデーターを二頂分布に割り当て（a
ssign）、該分布における粒子の絶対値平均直径（avera
ge mean diameter）（Rhの関数）を求めれば良い。本発
明方法で製造された小胞では二頂サイズ分布が得られ
た。ニコンプ製造業者（米国、サンタバーバラ）から購
入したプログラムを備えたデーターを用いて、サンプル
中の小胞の絶対値平均直径値〔ストークス−アインシユ
タイン（Rh×２）〕を得た。ニコンプ・サイズ・インス
トウルメントを通つた幾つかのサンプルについて小胞の
顕微鏡検査を行つたところ、ニコンプから得られた二頂
サイズ分布カーブの主ピーク内に大部分の小胞の直径が
実際に包含されることが示された。従つて、本実施例で
報告したサイズのデーターについては、本発明方法によ
つて製造した所与のサンプルの小胞の直径を、平均スト
ークス−アインシユタインおよびアベレージ主ピーク小
胞直径の両方として示す。
動的光散乱の詳細については、ビー．チユー（B.Ch
u），レーザー光散乱（Laser Light Scattering），ア
カデミツクプレス，ニユーヨーク（1974）およびニコン
プ・サイズ・インストウルメントに添加の説明書を参照
されたい。なお、上掲した文献の開示内容はすべて参照
により本明細書中に包含されるものとする。
（実施例） 以下の実施例は単に本発明を例示するためのものであつ
て、本発明を限定するものではない。
実施例1:小胞溶液の調製 マウク（Mauk）ら、アナル．バイオク．（Anal.Bio
c.）,94,p.302−307（1979）に記載の方法および米国特
許第4,310,506号明細書に開示の方法を用いて、小胞溶
液を調製した。簡単に言えば、カルビオケム（Calbioch
em）から入手したＬ−α−ジステアロイル・ホスフアチ
ジルコリン（DSPC）を、精製せずに小胞溶液のリン脂質
成分として使用した。コレステロール（CH）はシグマ
（Sigma）から、ニトリロ酢酸のトリナトリウム塩はア
ルドリツヒケミカル社（Aldrich Chemical Co.）から入
手した。イオノフオアA23187はリリー社（Eli Lilly C
o.）から入手した。その製造方法は米国特許第3,960,66
7号明細書に記載されている。
本実施例では、DSPCとコレステロールを2:1のモル比で
使用し（DSPHおよびCH、総脂質5g）、クロロホルム50ml
に溶解させ、ロータリー式蒸発機で乾燥させてフイルム
とした。フイルムを真空下で一晩乾燥後、0.5lリン酸緩
衝食塩水（Pi/NaCl:0.9％NaCl/5mMリン酸ナトリウム、p
H7.4）を用いて再水和させた。総脂質の濃度は約10mg/m
l−総脂質であつた。
第１図および第２図に示した如き改良がガウリンホモジ
ナイザー（モデル15M）を用いて、脂質溶液の微量乳化
を行つた。ホモジナイザーは、トランスミツシヨン4,圧
力調節スクリユー5,圧力ゲージ6,再循環ループ７および
ホモジナイジング弁アセンブリ８から構成されている。
改良点は第２図に示した２個の熱交換レザバー9,10にあ
り、これらは、サンプルが流れる時の圧力に応じて40〜
80℃の範囲、好ましくは70−75℃の範囲の特定の温度で
脂質溶液を維持する役割を有する。第２図の１方のレザ
バー９は約５−10℃の範囲に維持され、他のレザバーは
約80℃に維持される。
以下のようにしてホモジナイザーを作動させる。上記の
ようにして調製した脂質溶液を第１図の溶液タンク（re
ceptacle）11に導入し、次いで第３図のバルブ領域12に
高圧、低速で移動させる。溶液がバルブ14とバルブ座15
との間の 溝チャネル13を介して移動するにつれて速度
が急速に増大しかつ圧力が低下する結果、溶液中に蒸気
の気泡が形成する。溶液がより低い速度、より高い圧力
でバルブ領域12を出て行くにつれて、蒸気の気泡は消滅
する。この気泡の形成および消滅過程（空洞現象として
知られている）で、脂質溶液を微量乳化する高い剪断力
が発生する。続いて、マイクロエマルジヨンはバルブ領
域12を出、インパクトリング16に衝突し、ホモジナイザ
ーを通つて再循環する。
全脂質溶液をホモジナイジング弁領域（第３図の12）を
介して複数回再循環させて最適な微量乳化が達成される
ように、十分な時間均質化装置を運転するのが好まし
い。本実施例で使用した改良ガウリン均質化装置の容量
（0.5l）および流速（１／分）を考慮して、少なくと
も20回（約10分に対応する）、但し200回（100分に対応
する）を超えない回数循環させれば、生物学的用途に適
した小さな小胞のミクロエマルジヨンが十分に製造され
る。
本実施例では、小胞組成物を約50−80℃の範囲の特定温
度でホモジナイザーで15−90分間処理する。各工程（ru
n）中圧力は約55〜83MPa（約8,000p.s.i.〜12,000p.s.
i.）の間で調節した。
各工程後、ミクロエマルジヨン中の小胞のサイズを測定
した。
小胞整粒（Sizing） 均質化された小胞懸濁液約1mlを、エペンドルフ（Eppen
dorf）微量遠心分離機（モデル5414）を用いて10分間15
000rpmで遠心分離にかけた。小胞を懸濁状態に保ちなが
ら、光散乱測定で誤差を生ずる大粒子を底部に引き寄せ
た。６×50mmの試験管を過済PBSで洗浄し、次いで頂
部から5mm以内にPBSを充填した。遠心分離した小胞３〜
４μｌを試験管に入れ、試験管を数回反転させて内容物
を混合した。ニコンプ200レーザー・パーテイクル・サ
イズ・インストウルメントを用いて、小胞サンプルの絶
対値平均直径および主ピーク直径を上記のようにして測
定した。ニコンプ・パーテイクル・サイザーは、指示書
（取り扱いマニユアル）に記載されているように使用し
た。温度を20℃に設定した。適当な溝幅（好ましくは1.
4El m sec）およびプレスケール係数（好ましくは１）
を選択した。サンプルをニコンプに流した。50,000カウ
ント後、粒子サイズの正当な推定値を得た。
約50−80℃の範囲のレザバー温度、種々の圧力および時
間で本実施例に記載した微量乳化により製造した小胞の
サイズのデーターを、第１表に要約して示す。
第１表のデータから、ホモジナイザーを高圧で操作する
ことにより生ずる高い剪断力下で微量乳化すると、（20
00Å未満の）小さな脂質小胞が得られることが知見され
る。
レザバー温度が低い（約50−55℃）ときには、小さな小
胞が高い圧力（69MPa（10,000psi）より高い）下で再現
よく得られる。適当な小胞を製造する高いレザバー温度
（約70−75℃）,55MPa（8,000psi）より高い圧力下で微
量乳化を行うことにより、小胞を得ることが好ましい。
このような高温により、長鎖炭化水素を小胞を変換する
際の相転移点が高いために困難さの関数である使用圧力
がより広範囲となる。温度が低いときには、小胞前駆体
を小胞に変換するために十分な剪断力を発生させるべく
均質化装置を高圧で操作しなければならない。
こうして得られた小胞は、腫瘍の診断および治療、並び
にイン・ビトロなアツセイのような各種生物学的用途に
有用である。
実施例2:腫瘍のイメージング用修飾小胞の製造 次のように変更して実施例１と同様にして小胞溶液を調
製した。米国特許第4,310,506号および第3,960,667号明
細書並びにマウク（Mauk）ら,P.N.A.S. U.S.A.,76
（２）、765−769（1979）に記載の方法を用いてDSPC,C
H,A23187のモル比が2:1:0.004（DSPCおよびCH,総脂質5
g）となるように、イオノフオア A23187をDSPC:CH混合
物に添加した。A23187によつて、脂質小胞に111In+3の
ような放射性標識カチオンが負荷（loading）される。
小量のA23187を封入しても、微量乳化法による単一ラメ
ラ小胞の形成が妨害されることはない。
DSPC、CHおよびA23187成分をクロロホルム50mlに溶解
し、乾燥して上記の如き薄い脂質フイルムとした。次い
で、乾燥脂質フイルムを弱キレート化剤NTA（1mM）を含
むPBS溶液（pH7.4）0.5lを用いて再水和させた。総脂質
の濃度は約25mg/mlであつた。米国特許第4,310,506号明
細書およびマウク（Mauk）ら,P.N.A.S. USA76（２）,p.
765−769（1979）に開示されているように、NTAは放射
性標識用カチオンを全て小胞内に移動させる駆動力を与
える。NTAは上記したように好ましいキレート化剤であ
るが、他のキレート化剤を使用してもよい。更に、生物
分布の研究および診断方法のための、小胞の放射性標識
用カチオンとして111In+3は好ましいものであるが、キ
レート化剤と結合しうるカチオンであれば何でも使用し
うる。カチオンは、放射性活性トレーサーのグループ、
例えば111In，45Ca，51Cr，99Tc，67Ga，57Coおよび65Z
nから選択されることが好ましい。
PBS中でNTAを用いて再水和後、混合物を実施例１と同様
にして改良がガウリーンホモジナイザー中で微量乳化さ
せた。時間および圧力は実施例１の如く設定した。本実
施例の生物分布（bio−distributions）に適した小さな
小胞を製造するには、圧力69MPa（10,000p.s.i.），溶
液温度70℃、時間60分の各パラメーターに設定して微量
乳化を行うことが好ましいことが知見された。
得られたミクロエマルジヨンを標準的ゲル過法を用い
て過し、NTAを包囲する小さな小胞から大きな粒状物
および過剰の（非包囲）NTAを分離した。続いて小さな
小胞をアミコン（Amicon）中空フアイバー濃縮器（Holl
ow Fiber concentrator apparatus）を用いて濃縮し、
総脂質濃度をリン酸塩検定（phosphate assay）を用い
て測定した。PBSを用いて、最終総脂質濃度25mg/mlまで
小胞を希釈した。
負荷（loading） マウク（Mauk）およびギヤンブル（Gamble），アナル．
バイオク．（Anal.Bioc.）,94,p.302〜307（1979）に記
載の方法を用いて小胞に111In+3を負荷した。簡単に言
えば、小胞500μＬ（脂質5mg）を、所要の活性に依存し
て111In+3１−50μｌおよび104mM−クエン酸ナトリウム
中の3.4μＭ−InCl3（pH7.3）35μｌを用いてインキユ
ベートした。111In+3の添加量に等しい２×PBS量をイン
キユーベーシヨン混合物に包含させた。80℃でインキユ
ベートして最大負荷を得た。
本発明の小胞と超音波処理して得られた小胞との生物分
布およびターゲツト研究に対する適合性を比較検討し
た。超音波処理した小胞は、マウクおよびギヤンブル，
アナル，バイオク．（Anal.Bioc.）,94,p.302−307（19
79）および米国特許第4,310,506号明細書に記載に準じ
て製造した。簡単に言えば、実施例１と同じ組成の脂質
溶液を乾燥し、PBS中の1mM−NTA0.5mlで再水和させた。
混合物を室温、水浴中で10分間超音波処理し、60℃で10
分間インキユベートして構造的欠陥を焼還した（annea
l）。次いで小胞を低速で遠心して、チタニウムおよび
高度に凝集した物質を除去した。PBSで平衡化したセフ
アデツクスＧ−50カラムに調製物を通して、取り込まれ
なかつたNTAを除去した。小胞の特性は次下の通りであ
つた。
小胞整粒 本実施例の方法で製造された小胞を、ニコンプ・サイジ
ング・インストウルメント（Nicomp Sizing Instrumen
t）を用いて実施例１と同様にしてサイジング（整粒）
し、超音波処理小胞で得られた結果と比較した。第２表
に示すように、本発明方法により、超音波処理小胞のサ
イズに匹敵しかつ生物分布およびターゲツト研究に使用
するのい適したものと知見されている400−1000Åの範
囲のサイズを有する小胞が得られる。
負荷効率111 In+3を小胞に負荷した有効性を次のようにして調べ
た。上記のようにして負荷された111In+3小胞調製物100
μＬを予めpH7.4に調整した湿潤化ケレツクス（Chele
x）（ダウ・ケミカル社）0.5gに添加し、２分間混合し
た。PBS900μＬを添加し、混合物を室温でテーブルトッ
プ遠心機を用いて５分間遠心した。上澄液500μＬを除
去し、負荷効率（負荷された小胞のパーセンテージ）を
ガンマーカウンターで計数して測定した。500μＬサン
プルの放射性活性をオリジナルの小胞調製物100μＬの
放射性活性で割り、200を掛ける。
第２表に示すように、微量乳化法で得られた小胞にカチ
オン111In+3を負荷する効率（efficiency）は80％以上
であり、従来の超音波処理して製造された111In+3負荷
小胞で得られた値に匹敵する〔マウク（Mauk）および
（Gamble），アナル．バイオク．（Anal.Bioc.）,94,p.
302−307（1979）〕。
生物分布 本実施例で得られた小胞のイン・ビボでの使用に対する
適合性を調べるために、放射性活性トレーサー111In+3
を含む小胞をBALB/C雌マウスに投与し、動物組織内での
小胞の生物分布を分析した。マウスには実験開始９−10
日前に右大腿部にEMT6腫瘍を皮下移植した。
外側尾静脈を介して静注した。各マウスの体重を測定
し、24時間小屋に入れて置いた。屠殺前にマウスにエー
テル麻酔を施こし、約1/2〜1mlの血液を眼窩（orbit）
を介して取り出し、ベツクマン・ガンマー・カウンター
（Beckman Gamma Counter）5500ガンマー計数管に挿入
した。続いて、マウスの頸部を転位（dislocation）さ
せて殺し、次のサンプルを切開して取り出した。腫瘍，
肺，脾，腎，筋肉，小腸，胃，皮膚，尾および死体。
（筋肉，小腸，胃，皮膚，尾および死体を除く）これら
のサンプルをPBS中で十分に洗浄し、ガンマー計数管に
入れ、秤量した。全てのサンプルについてガンマーカウ
ンターで１分間計数し、各組織1gあたりの注入量（放射
性活性）のパーセンテージを求めた。組織サンプルを用
いて２個の小胞を調べた。
10,000psi（約70−75℃の温度）で微量乳化させて製造
された放射性標識小胞の生物分布の結果を、第３表に要
約する。第３表には、超音波処理して製造されかつ111I
n+3を標識した小胞の生物分布に関するデーターも比較
のために示す。結果は５匹のマウスについての平均値
（注入量/gm−組織の％）である。
第３表 小胞の生物分布 組織 微量乳化小胞 超音波処理小胞 1.血液 8.1 10.4 2.腫瘍 34.0 34.0 3.肺 5.3 6.2 4.肝 19.8 18.4 5.脾 26.2 25.1 6.腎 10.6 9.2 7.筋肉 1.2 0.8 8.小腸 4.1 3.1 9.胃 2.3 2.5 10.皮膚 3.3 3.7 11.尾 2.6 2.0 12.死体１−３ 1.7 1.5 微量乳化小胞と超音波処理小胞との組織分布は同等であ
ることが知見された。
これらの結果から、本明細書に開示の微量乳化法で製造
された小胞は、超音波処理により製造された小胞と同等
のサイズおよび安定性を有し、診断および治療のために
腫瘍をターゲツトすべくイン・ビボで使用するのに適し
ており、またイン・ビトロなバイオアツセイのような他
の生物学的用途に使用するのに適していることが知見さ
れる。
以上特定の用途について開示および図示してきたが、本
発明の原理は当業者にとつて自明の他の多くの用途に使
用できる。従つて、本発明は特許請求の範囲に記載され
たように限定される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、変更ガウリン均質化装置の正面図であり、 第２図は、変更ガウリン均質化装置の側面図であり、 第３図は、第２図の線３−３についてのホモジナイジン
グ弁アセンブリの断面図である。

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生物学的用途に適する直径2000Å未満の小
    さな単一ラメラ小胞の製造方法であって、 （ａ）少なくとも16個の炭素原子を含む炭化水素鎖を有
    するホスホグリセリドまたはリン脂質である両親媒性分
    子、および任意にイン・ビボで安定な脂質小胞を形成し
    得る他の成分を水和させ、 （ｂ）前記水和した両親媒性脂質分子を、再循環手段、
    ホモジナイジング弁アセンブリおよび水和した両親媒性
    脂質分子を40〜80℃の特定の温度に維持するためのリザ
    バーを有する均質化装置中に分散させて、直径2000Å未
    満の小さな単一ラメラ小胞を含むミクロエマルジョンを
    形成する、 工程を含むことを特徴とする前記方法。
  2. 【請求項２】再循環手段が55〜90MPaの圧力を有する特
    許請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】分散工程を、水和した両親媒性脂質分子を
    特定温度範囲に維持する均質化装置中で実施する特許請
    求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】均質化装置が熱交換機を含む特許請求の範
    囲第１項〜第３項のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】分散工程を、均質化装置を15〜90分間操作
    することによって実施する特許請求の範囲第１項〜第４
    項のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】両親媒性分子が、ホスファチジルコリン、
    ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジル
    セリンであるリン脂質である特許請求の範囲第１項に記
    載の方法。
  7. 【請求項７】リン脂質が、ジステアロイルホスファチジ
    ルコリンおよび／またはジパルミトイルホスファチジル
    コリンである特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】ミクロエマルジョン中の総脂質の最終濃度
    が25mg/mlである特許請求の範囲第１項に記載の方法。
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