JPH0776242B2

JPH0776242B2 - 誘導体化されたアガロース生成物およびその製法

Info

Publication number: JPH0776242B2
Application number: JP3511239A
Authority: JP
Inventors: エムデュマイス，マキシン; ビーギセレイ，ケネス
Original assignee: FMC Corp
Current assignee: FMC Corp
Priority date: 1990-06-13
Filing date: 1991-06-06
Publication date: 1995-08-16
Anticipated expiration: 2010-08-16
Also published as: EP0591181B1; AU8075991A; DE69132033D1; EP0591181A4; EP0591181A1; WO1992000307A1; ATE190320T1; JPH05507112A; CA2083494A1; ES2143464T3; DK0591181T3

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕本発明はアガロースおよび（または）誘導体化アガロー
スの分画により得られる化合物ならびにその製法に関す
る。

天然または人造であれ、ほとんどの重合体性物質は現実
には混合物である。いくつかの混合物は、分子量のみが
変る点で、比較的簡単である場合がある。その他のもの
は化学的に変り得る。第一のタイプの混合物の例には、
多くの合成材料例えばポリエチレンまたはポリスチレン
が包含される。第二のタイプは広義には天然重合体例え
ば多糖類で代表される。多糖類の構成を分析、理解する
ために、多糖類の分画の手段を見い出す必要がある。そ
れは、新たに見い出された物質の化学的分析は物質が現
実に２種以上の化学的本体からなる、すなわち純粋でな
いときはほとんど有用ではないからである。分画されて
いる陸生植物多糖類の例はでんぷん（アミロースおよび
アミロペクチン）、アイレス（Iles）マンナン（グルコ
マンナンおよびアミロース類似のグルカン）およびいな
ごまめゴム（マンナン骨格上のガラクトースの多少の程
度の置換体）である。同様に、海草〔海草、海藻（macr
oarlgae）〕から得られる多糖類もまた分画されてい
る。例えば、アルギン（Ｄ−マンヌロン酸に富んだおよ
びＬ−グルロン酸に富んだフラクション）、カラゲニン
（κ−およびλ−）および寒天（アガロースおよびアガ
ロペクチン）である。

分画に用いる方法は多糖類の性状に基づいて変る。それ
故、あるものは、熱水および冷水双方に可溶であり、そ
して熱水にのみ可能であるものと混合していることがわ
かったときは、後者のものは混合物の熱溶液を冷却する
ことにより分離することができる。褐藻類からのラミナ
リンはこのようにして有枝鎖の形態および非有枝鎖の形
態に分割することができる。時には、帯電多糖類は特定
の陽イオンに対して異なった親和性を有する。それで、
κ−カラゲニンはナトリウム塩の存在下での異なった溶
解度によりλ−カラゲニンから分離することができる。
帯電多糖類と非帯電多糖類との分離は、反対の帯電分子
を用いて選択沈殿により、そして寒天の場合は少なくと
もポリエチレングリコールを包含する相分離技術により
達成される。これらの最後の３種の分画技術は、特許文
献、すなわち、スタンチオフ（Stancioff）D.J.、「セ
レクティブ・エクストラクション・オブ・ヒドロコロイ
ド・フラクションズ・フロ・シープランツ」（Selectiv
e Extraction of Hydrocolloid Fractions from
SeaPlants）、米国特許第3,176,003号、1965年３月30日
付；ブレセン（Blethen）Ｊ、「メソド・フォア・ザ・
セパレーション・オブ・アガロペクチン・フロム・アガ
ロース」（Method for the Separation of Agarop
ectin from Agarose）、米国特許第3,281,409号、196
6年10月25日付；およびポルソン（Polson）Ａ、「フラ
クネーション・オブ・ミクロスチュアズ・オブ・アガロ
ース・アンド・アガロペクチン」（Fractionationation
of Mixtures of Agarose and Agaropectin）、
英国特許第1,023,179号、1966年10月25日付にそれぞれ
開示されている。

寒天の分画はまたダクワース（Duckworth）およびヤフ
ェ（Yaphe）、泉により、そして更に近年にはこれら研
究者が開発した技術を用いてその他大勢の人々により広
く研究されている。これらの分画方法は主として種々の
フラクションの全般的な関係を研究する手段として設計
されていた。これらが用いた技術はイオン交換クロマト
グラフィーの技術であった。これらの研究の結果、ダク
ワースおよびヤフェは寒天は２種の別の重合体、アガロ
ースおよびアガロペクチンからなるものではなく、高度
にサルフェート化、非ピルベート化乃至中程度にサルフ
ェート化およびピルベート化乃至事実非帯電の荷電密度
の範囲の分子の連続体であると結論した。彼らはこの研
究の結果としてアガロースを「最低の荷電含量を有し、
それ故最大のゲル化能力を有する寒天中の分子の錯体の
フラクション」と再定義し、そしてこのフラクションを
単離する方法について特許を取得した（米国特許第3,75
3,972号、19738月21日付）。本質的には、この方法は寒
天をまず室温で希塩類水溶液で洗浄して高度にサルフェ
ート化された分子を除去し、次に30〜50℃で最も濃密に
ピルベート化された分子を除去することからなってい
る。次に、洗浄した寒天をポリエチレングリコール沈
殿、そして再溶解後にこの中間体をその次のイオン交換
クロマトグラフィーによる処理で精製した。生成物は実
質的に検出可能なピルベートを含有していずに、約0.05
重量％以下のサルフェト含量を有していると言われてい
た。

市販のアガロースの分析により、ほとんどのタイプは約
0.2％のピルベートを含有し、そしてサルフェート除去
の技術が改善されたのでサルフェースレベルが初期のア
ガロース調製でみられた0.5％の範囲から約0.1〜0.2％
に低下したことがわかった。しかし、例えばある種のア
ガロース誘導体の製造で使用されているようなアルカリ
による広汎な処理〔ガイスレイ（Guiseley）K.B.、「モ
デイファイド・アガロース・アンド・エイガー・アンド
・メソド・オブ・メイキング・セイム」（Modified Ag
arose and Agar and Method of Making Sam
e）、米国特許第3,956,273号、1976年５月11日付〕によ
り、サルフェートが更に除去される結果となり、それで
例えばFMC・コーポレーション（FMC Corporation）、
ロックランド（Rockland）、メイン（Maine）により商
標名シープラク（SeaPlaque）およびシープレプ（SeaPl
ep）で販売されているヒドロキシエチルアガロースのよ
うな誘導体は一般に約0.02〜0.08％サルフェートを含有
している。これらのものはまた方法が有効にピルベート
を除去しないので約0.2％のピルベートを含有してい
る。

本発明の方法では、水性媒質中あるいは小量の水を含む
C₂−C₅ポリオール中のアガロースあるいは誘導体化アガ
ロースの溶液を形成させる。第一の沈殿（以下フラクシ
ョンＡ）は水溶液を極性溶媒と接触させることにより、
あるいはポリオール溶液を冷却することにより形成さ
れ、このフラクションＡは以下に詳記する特性を有して
いる。溶液から沈殿を除去し、そして次に上澄液を水性
塩溶液で処理して第二の沈殿（以下フラクションＢ）を
形成させることができ、このものはフラクションＡとは
著しく異なっていることが見い出された。

アガロース出発物質が非誘導体化されている場合の更に
他の態様において、フラクションＡおよびＢを次に誘導
体化する。

第１図は、先行技術のアガロースおよび本発明のフラク
ションＢ誘導体化アガロース生成物で得られた数値を比
較するためにDNAフラグメントの塩基対に対して、フラ
グメント遅延（Fragment Retardation（Rf）をプロッ
トしている曲線である。

第２図は、本発明および先行技術についてゲル強度対ゲ
ル化温度を示す曲線である。

実際の実施例以外、あるいは他に指示のある場合以外、
本文で使用される成分の量、パラメーターあるいは反応
条件を示す全ての数字はいずれの場合も用語「約」で加
減されるものと理解すべきである。

本発明の方法は広義には次のプロセス工程を包含するも
のである： A. （ａ）水性媒質中または（ｂ）水１〜15重量％を含
有するC₂−C₅ポリオール中の誘導体化アガロースの溶液
を形成させ、 B. 上記溶液を、溶液が（ａ）を包含するときは、例え
ばC₁−C₄アルカノールまたはアセトンである水混和性極
性溶媒と接触させるか、あるいは、溶液が（ｂ）を包含
しているときは、溶液を冷却してフラクションＡを包含
する沈殿を形成させ； C. 溶液からフラクションＡ沈殿を単離し、そして、 D. 残りの上澄溶液をフラクションＢを包含する沈殿を
生成させる沈殿誘起に有効な量で存在する水性塩溶液と
接触させる。

非誘導体化アガロースを出発物質として用いる場合、フ
ラクションＡおよびフラクションＢを次に例えば米国特
許3,956,273号に記載されたような既知の方法で誘導体
化する。

工程Ａは好ましくは、水性媒質を使用する場合、出発ア
ガロースまたは誘導体化アガロースを蒸溜水にスラリー
化し、そして、伝導率測定が塩含量がNaClとして塩の10
mM以下、更に好ましくは4mM以下、そして最も好ましく
は経済上実施可能なほどの低いレベル例えばNaClとして
2mMまたはそれ以下に相当するレベルに低減したことを
示すまで、くりかえして濾過し、そして必要に応じて再
懸濁することによって実施される。塩含量は理想的には
0.003〜0.4mMの範囲にある。次に、得られた懸濁液を加
熱して誘導体化アガロースまたはアガロースを溶解する
（例えば沸騰まで）。次に、得られた溶液を、好ましく
は50〜75℃の範囲の温度に、冷却する。pHは好ましくは
０〜8.0の範囲にあり、更に好ましくは7.0〜7.4の範
囲、そして最も好ましくは7.2である。pHが所望の範囲
内にないときはpHをアルカリまたは酸例えばNaOHまたは
酢酸の添加により所望の範囲内に調節することができ
る。

工程Ａを水１〜20重量％、好ましくは１〜15重量％含有
するC₂−C₅ポリオールを用いて実施する場合、アガロー
スまたは誘導体化アガロースを溶液が得られるまで加熱
してポリオールに溶解する。プロピレングリコールは好
適なC₂−C₅ポリオールである。

誘導体化アガロースはアルキル化、アルケニル化、アシ
ル化またはヒドロキシアルキル化アガロースであってよ
く、ここでアルキル、アルケニルおよびアシル基は１〜
４個の炭素原子を含有し、またヒドロキシアルキル基は
２〜４個の炭素原子を含有するモノヒドロキシアルキル
基または３〜４個の炭素原子を含有するジヒドロキシア
ルキル基である。このような誘導体化アガロースはその
製法も含めて既知である。上で検討した米国特許第3,95
6,273号を参照。例えば、ジヒドロキシプロピルアガロ
ースはアガロースを１−クロロ−2,3−ジヒドロキシプ
ロパンと反応させることにより製造できる。いずれの源
からの誘導体化アガロースも本発明の実施化に使用する
ことができるが、アガロースがゲリジウム（Gelidium）
またはプテロクラジア（Pterocladia）海草種、グラシ
ラリア（Gracilaria）と前述したものとの混合物から、
あるいはこれらの任意の混合物から得られる誘導体化ア
ガロースが好ましい。また、本文で使用するのに好まし
い誘導体化アガロースはC₂−C₃ヒドロキシアルキル化ア
ガロース、C₁−C₃アルキル化アガロース、グリオキザル
アガロースあるいはジヒドロキシプロピルアガロースで
ある。最も好ましいのはヒドロキシエチル化アガロース
およびメチル化アガロースである。

工程Ａで使用する場合の非誘導体化もしくは天然アガロ
ースは任意の源から得ることができるが、ゲリジウムま
たはプテロクラジア海草種あるいはグラシラリアとこれ
らとの任意の混合物からのアガロースが好ましい。

工程Ｂにおいて、工程Ａで得られた溶液が水性である場
合、このものを水混和性極性溶媒例えばC₁−C₄アルカノ
ールまたはアセトン、好ましくはイソプロピルアルコー
ル（好ましくは、例えば40℃に加熱）と接触させて沈殿
を形成させる。第一の方法の工程Ｂで得られる沈殿（フ
ラクションＢ）を極性溶媒あるいはその水溶液で洗いす
すぎし、そして乾燥する。

工程Ａからの水溶液に加える極性溶媒の量は限定的では
ない。一般に、工程Ａで使用される誘導体化または非誘
導体化アガロースの重量の10〜50重量％の範囲で沈殿を
生成するのに十分な量が好ましい。例えば、工程Ａから
の溶液の２〜３倍容量の極性溶媒が極めて適している。

極性溶媒を水溶液に加えるのが、その逆よりもむしろ好
ましい。連続かくはんしながら、極性溶媒を水溶液の表
面下に加えるのが最も好ましい。後者の方法は、出発物
質とは関係なく、最も望ましい特性を有する生成物を生
じることがわかった。

工程Ａでの溶液がポリオール溶液である場合、次に加熱
溶液を例えば室温に冷却して工程Ｂ沈殿を形成させる。
冷却速度に限定はないが、ゆっくりと冷却あるいは急速
な冷却の場合若干異なった生成物が得られることがあ
る。

工程Ｃで、フラクションＡは任意の適当な技術例えば濾
過またはデカントにより残留溶液から単離できる。

誘導体化アガロースを初めに処理することにより、また
分画後の対応する誘導体化により共に得られるフラクシ
ョンＡ生成物は相互に全く類似している。これらのもの
は20〜32℃の範囲のゲル化温度;1.0重量％の濃度で50〜
900g/cm²の範囲のゲル強度、而してゲル強度はゲル化温
度が上記範囲内で増加するにつれて上記範囲内で増大す
る； 0.04未満の電気浸透値;60℃ 0.1M NaCl中1.5％濃度で
測定して12mPa.sを超えるブルックフィールド粘度；お
よび0.07重量％未満のピルベート含量を特徴とする。

得られる好ましいフラクションＡ生成物は、ゲル化温度
が27〜30℃の範囲にあり、かつゲル強度が200〜550g/cm
²の範囲にある生成物である。

所定のゲル化温度に対するフラクションＡのゲル強度は
常に同一ゲル化温度で誘導体化アガロース出発物質より
も大である。更に、既知のゲル化温度の誘導体化アガロ
ースは20〜32℃ゲル化温度範囲で40乃至500未満のゲル
強度を有し、これらは本発明のフラクションＡ生成物の
強度よりも著しく低いゲル強度である。（第２図参
照）。

上記フラクションＡ生成物に加えて、上記フラクション
Ａ生成物とは著しく異なった特性を有する初めにあるい
は次に誘導体化された第二のアガロース生成物も得られ
る。

本発明の方法の工程Ｄにおいて、水性塩好ましくは塩化
ナトリウム溶液の沈殿形成有効量を工程Ｃで得られた溶
液に加えると、第二の沈殿（フラクションＢ）が形成さ
れる。この工程を実施するにはまた、更に容易に濾過可
能な沈殿を形成させるために、水性塩溶液と共にC₁−C₄
アルカノールまたはアセトンの量を加えるのが非常に好
ましい。アルカノールまたはアセトンの添加量は限定的
ではない。しかし、一般には、工程Ｃからの溶液の量が
半分乃至２倍の量の使用が好都合である。

誘導体化されたままの、あるいは次に出発物質に基づい
て誘導体化されるフラクションＢは、0.3〜0.4％ピルベ
ートを含有し、かつ0.07〜0.11の電気浸透（EEO）値を
有している。フラクションＢ生成物のゲル強度は相当す
るフラクションＢ生成物のゲル強度よりも著しく低い。
フラクションＢ生成物は、実施例4Bに記載した試験に従
ってゲル125mmを超える脆性（もろさ）値を有する。フ
ラクションＢ生成物の濁度はゲル5cmを通して１％で100
NTV未満である。

本発明の方法では、分子サイズに従ってアガロースの単
純分画よりも一層複雑な結果が得られる。その理由は、
得られた２種の生成物フラクションが著しく異なった結
果、ピルベート％および電気浸透値を有するからであ
る。特許性に関する制限を伴うことなく、分画の可能な
メカニズムは、分子量に基づくものであり、かつ低MWフ
ラクションは一致してピルビン酸の形態で高いレベルの
酸性基を有するものである。このメカニズムは更に、塩
はよりイオン性のフラクションの共沈殿を促進するの
で、塩の実際の不存在下で分画工程を実施するのが望ま
しいことにより指示されるものである。

本発明の大きな特徴は前記したように性質が著しく異な
るフラクションＡとフラクションＢとをもつことにあ
る。フラクションＡとフラクションＢは実施例からも理
解されるように常に次のような関係をもっている。

かきにおいてＡはフラクションＡを、Ｂはフラクション
Ｂを、またSMは出発物質を示す。性質Ａ対ＢＡ対SM Ｂ対SM ゲル化温度Ａ＞Ｂ − SM≧Ｂ融点Ａ＞ＢＡ＞SM SM≧Ｂゲル強度Ａ＞ＢＡ＞SM SM＞Ｂ粘度Ａ＞ＢＡ＞SM SM＞Ｂピルベート含量Ｂ＞Ａ SM＞ＡＢ＞SM 電気浸透値Ｂ＞Ａ SM＞ＡＢ＞SM 本発明で得られる生成物（フラクションＡおよびＢ）は
水中で安定なゲルを形成し、そしてアガロース媒質が通
常使用される数多くの電気泳動もしくは拡散操作のいず
れでも、また周知のプロトコールに従って使用すること
ができる。例えば、電気泳動に加えて、アガロースは等
電点電気泳動、クロマトグラフィー分離、ならびに分
離、検定、指示、形質転換、（培養、クリーニング、ク
ローニング等）または生物学的材料の処理のためのその
他のプロセスに有用である。

フラクションＡのピルベート含量が低減されているため
に、この生成物は極めて低い電気浸透（EEO）値を有し
ている。溶媒および水和陽イオンの逆流が電気泳動を受
ける全ての材料に対して効用を有している。中性分子は
逆に掃引され（陽極方向に）、一方陽イオンは加速さ
れ、そして陰イオンは遅延される。遅延および逆移動は
ある種の適用例例えば向流電気泳動に有利なことがあ
る。それはプロセスの成功はある種の成分の逆流移動に
左右されるからである。しかし、一般には、これはDNA
分子の分離に利点をもたらすものではないが、むしろプ
ロセスを単に減速させ、電気泳動操業時間を更に長くさ
せる。PFGEにおける如く、操業に多くの時間または多く
の日数さえも要する場合、低い方のEEOが有利なことは
立証された事実である。〔例えば、ライ（Lai）E.、ビ
レン（Birren）B.W.、クラーク（Clark）S.M.、シモン
（Simon）M.I.、およびホック（Hook）L.、（1989年）
ビオテクニクス（BioTechiniques）、７巻、37−42頁を
参照〕。

次に実施例を掲げて本発明を具体的に説明する。

実施例電気浸透（EEO）とは電気泳動中電極方向への水性ゲル
を経由する流体の浮動と開示することができる。電気的
に中性あるいはほぼ中性の分子が電気泳動される試料に
存在する場合に浮動が生じ、そしてゲル媒質が帯電す
る。アガロースが媒質である場合、陰イオン性残渣例え
ばピルベート（そしておそらくはエステルサルフェー
ト）が存在し、そしてゲルに正味の負電荷を付与する。
ゲルそれ自体は陽極に移動し得ないが、そのまわりの水
球が結合陰イオンと会合した水和陽イオンにより陰極の
方に吸引もしくはねじられる。結果として、試料中の中
性分子が水により陰極の方に徐々に引きよせられる。

EEOは相対移動度（−m_r）として数字で表わされ、そし
て0.05M,pH8.6バルビタール緩衝剤中アガロースの１重
量％溶液を調製することにより測定される。この溶液3m
lを清浄な顕微鏡スライドに注加し、そして室温でゲル
化させる。皮下注射器に連結した直角としたNo.13注射
針を用いて、ゲルの中心部から単一の孔を吸引する。0.
05M,pH8.6バルビタール緩衝剤中10mg/mlデキストラン50
0〔フアルマシア（Pharmacia）〕および2mg/ml結晶性
（×）ヒトアルブミンからなる標準式試験液を調製す
る。小孔スポイトを用いて、吸引された孔をほぼ満たす
のに十分な溶液を加える。次に、これらのスライドを紙
灯心を用いて電気泳動のための位置におく。一定の電圧
設定を用いて10ボルト/cm（75ボルト）の電位をかけ
る。

電気泳動を３時間続け、次にスライドを除く。目測は２
段階で行われる。スライドをまず15分間変性（3A）エタ
ノールに入れ、その後にデキストランの位置を原点につ
いて測定することができる（OD＝原点からのデキストラ
ンへの距離、中心−中心）。測定後、スライド50mlを水
酢酸中0.5gアミドブラックから調製し、次にエタノール
で500mlたした蛋白質染色溶液に移す。15分後、スライ
ドを1:1酢酸（５％）：エタノール溶液で洗って過剰の
染色液を除去する。１時間で十分であるが、アルブミン
位置は通常15分後に測定することができる。スポットの
中心から原点の中心への距離を測定する（OA＝原点から
アルブミンへの距離）。電気浸透の程度（−m_r）は次の
式を用いて算出できる。

−m_r＝（OD/OA＋OD）本文記載のゲル強度（「破断強度」としても知られてい
る）はフォスター（Foster）等の米国特許第3,342,612
号に記載された操作および装置を用いることにより、そ
してプランジャーを16.83cm/分の定速で前進させる自動
駆動装置を設けることにより測定することができる。ゲ
ル化は溶液を水浴中２時間10℃に冷却することにより試
験のために達成される。次に、ゲルを水浴から除去し、
そして面積1cm²を有するサーキュラープランジャーを用
いてゲル強度を測定する。

実施例１予め本文に記載の如く脱塩しておいたヒドロキシエチル
化アガロース〔シープラーク（SeaPlaque）アガロー
ス〕20gを蒸溜水１に、まず電子オーブンで加熱し次
に混合物をホットプレートで沸騰させることにより、溶
解した。溶液を水浴で54℃に冷却し、該温度に維持し、
この間に54℃に加熱した共沸イソプロピルアルコール
（aze.IPA）２をアガロースゾルの表面下に加えた。
混合物を連続してかくはんした。添加完了後（２分）、
形成した沈殿（フラクションＡ）をU.S.シーブ・シリー
ズ（Sieve Series）No.120シーブ（ASTM−E11−78）を
用いて篩別し、そして60重量％IPAで２回洗浄した。次
に、液体2M NaCl 50mlを含むaze.IPAの別の１に加
えて第二の沈殿（フラクションＢ）を形成せしめた。混
合物を室温に冷却し、そして沈殿が沈降した後に、この
沈殿を篩別した。このものを次に希IPAで洗って塩を除
去した。２種のフラクションを分析し、出発物質と比較
した。結果を次の表に示す。

実施例２他のバッチのヒドロキシエチル化誘導体化アガロースを
実施例１と同じ実験規模で同じ操作で処理して操作の普
遍さを実証した。結果を以下の表に示す。データが得ら
れたいずれのケースでも、Ａフラクションの粘度および
ゲル強度はＢフラクションよりも著しく高いことがわか
る。また、ピルベート（pyruvate）およびEEOはＢフラ
クションではより高いものであった。Ａフラクションの
ゲル化および溶融温度はＢフラクションよりも高いもの
であった。これらのフラクションは出発（未分画）物質
とは異なっていることもわかる。

実施例３ヒドロキシエチル化アガロースの分別を、ジャケット付
タンク中水50ガロン（210）に溶解したヒドロキシエ
チル化アガロース5kgを用いて、パイロットプラントで
スケール・アップした。溶液を160゜Ｆ（71℃）に冷却
し、そしてそのpHを8.0に調節した。105゜Ｆ（41℃）に
予熱したイソプロピルアルコール（80重量％）を最終容
量が205ガロン（215）となるまで表面下のかくはん水
溶液中にポンプ輸送した。この点での温度は120゜Ｆ（4
8℃）であり、そして最終アルコール力価は66％であっ
た。混合物を温度が110゜Ｆ（43℃）となるまでジャッ
ケットを通して冷水をポンプ輸送して冷却した。沈殿を
沈降させ、次に第二フラクションを、当初の沈殿からの
上澄アルコールを105゜Ｆ（40.5℃）の塩化ナトリウム
を７ポンドを含有する80％IPAの追加100ガロン（105
）中にポンプ輸送することにより、採取した。採取し
た多糖の総収率は87％であり、ＡとＢとのフラクション
間で5:4に分れた。分析上、物質は基本的には実験室調
製試料と同じであった。

実施例4A 改良された低ゲル化温度／低溶融温度（LGT）アガロー
ス（フラクションＡ生成物）のより高いゲル強度によ
り、パルス場ゲル電気泳動（PFGE）（米国特許4,483,45
2号、コロンビア大学）と組み合せて使用される技術で
の実在する生成物にまさる利点を提供する。この技術
は、裸の高分子量例えば染色体、DNAを含有するゲルの
ブロックの調製を包含し、そして細胞をLGTアガロース
の溶液と混合する工程、混合物を冷却してゲル化させ、
かくして細胞をゲル内に埋封する工程、およびゲルを細
胞壁を溶去するが、DNAに有害な作用を及ぼさない酵素
で処理する工程を包括している（米国特許第4,695,548
号および同第4,861,448号、コロンビア大学）。この埋
封技術なしでは、DNAはとり扱いにより十分なせん断を
受けるであろうし、特にマイクロピペットを用いて電気
泳動のためにゲルを移動させるとき、研究者にとって有
用ではないより小さいフラグメントに破砕することにな
ろう。DNAを含有するゲルプラグをスライスし、そして
小片をパルス場ゲルのウエルに挿入し、低ゲル化温度
（LGT）アガロースの一滴で適切に密封し、そして適切
な長さの時間電気泳動させる。ゲルプラグのとり扱いは
それで操作の臨界的工程である。高分子量DNA例えば酵
母染色体DNAあるいは重合化より小さいNDA分子例えばλ
−ファージ（「λラダー」）を含有するゲルプラグを分
子量マーカーとして働かせるために製造する場合、鋳型
からのプラグの除去、および酵素処理および洗浄を包含
するその後の工程により、この目的のためにデザインさ
れた生成物〔インサート（InCert）アガロース、FMC−
ビオプロダクツ（BioProducts）製、ロックランド（Roc
kland）、ME04841、米国〕を使用する場合高い磨砕速度
が得られる。しかし、本発明の新規な低ゲル化温度アガ
ロースをかかるゲルプラグの調製に使用した場合、より
高い濃度を使用する必要なしに、付加強度が得られた。
この濃度は、高い目のゲル濃度は試薬およびDNAの拡散
性に対して不利な効果を有するので、望ましいものでは
ない。付加強度により、拒絶速度を低下させることによ
ってプラグの製造コスとの低減が提供される。

実施例4B アガロースゲルを包括するいくつかの適用例例えば蛋白
質または低分子量DNAの電気泳動のためには、分子量の
より大きい化合物の分離に使用するよりも高い濃度でゲ
ルを調製することが必要である。アガロースが低濃度で
極めて高い粘度を有していなくとも、濃度が増大するに
つれて、粘度は急速に上昇する。この理由から、アガロ
ースにとってはアガロースのLGTタイプを包含するほと
んどの製品で普通にみられるよりもなお低い粘度を有す
るのが有利である。かかる製品は、米国特許第3,956,27
3号のもとで製造され、FMC・バイオプラダクツにより商
標名ヌシーブ（NuSieve）アガロースで市販されてい
る。低粘度ゲル化材料は典型的には同一材料のより高い
粘度の試料のゲルよりももろいゲルを形成する。これに
より、比較的低い方の濃度で高粘度の材料から作られて
いるゲルよりも高いゲル強度を有していたとしても、低
粘度材料のゲルをとり扱うのが一層難しくなる。本文に
記載した方法で得られた第二フラクション（「Ｂ」フラ
クション）はそのもろさを伴なうことなくヌシーブアガ
ロースの属性の多くを有している。これらのゲルのもろ
さを定量する努力において、次の試験が考案された。す
なわち、3mm厚のゲルを巾12.6cmおよび長さ19.7cmを有
する標準電気泳動ゲルトレーに流延した。ゲルが室温で
１時間ゲル化された後、ゲルの外側cmを各側からトリミ
ングしてメニスカスによって生じたより厚い部分を除去
した。次に、ゲルをガイドとして透明なプラスチック平
定規を用いてトレー上で25.4mm巾の細長片に注意深く切
断した。細長片を１つづつゆっくりとトレーの端で引き
外した。トレーは実験作業台±２、3cmで水平に保持さ
れていた。張出しゲルの重量により、そのもろさに基づ
いて、ある点で破断せしめた。破断フラグメントの長さ
を測定し、そして各供試試料について４数値の平均値を
求めた。次の表から、本発明の改良生成物の増大された
凝集強度が実証される。

実施例５「Ｂ」フラクションの低い目の粘度のために、現存する
生成物、シープラーク・アガロースで好都合に製造され
得るよりも高い濃度でゲルを製造することができる。こ
れを具体的に説明するに、実施例１の方法に従って４％
溶液をシープラーク・アガロースから、またＢフラクシ
ョンから製造した。粘度測定は、ブルックフィールド
（Brookfield）シンクロ−レクトリック（Synchro−lec
tric）粘度計、モデルLVTを用いて60rpmで２種の溶液に
ついて行った。粘度は未分画材料については153mPa.s、
またＢフラクションについては僅か44.3mPa.sであっ
た。これは低い目の分子量DNAフラグメントの分離に必
要とされるような高濃度でゲルを流延させるときに著し
い改善である。

実施例６誘導体化アガロース例えばヒドロキシエチルアガロース
（あるいはアガロースの第二フラクションのヒドロキシ
エチル化による）から得られるフラクションＢの他の利
点は、電気泳動中高分子を篩化する能力の増大にある。
シープラーク・アガロースは、それを製造する未誘導体
化アガロースよりも高分子を分離する能力がより大きい
ことが示されている〔セルウエル（Serwer）Ｐ、アレン
（Allen）J.L.、およびハイエス（Hayes）S.J.、エレク
トロフォシス（Electrophorsis）、1983年、４巻、232
−36頁〕。前述したヌシーブ・アガロースがシープラー
ク・アガロースに関連があるとしても、未誘導体化アガ
ロースにすぎない。それで、これらのアガロースを篩化
能力の順に配列すると、次シリーズが形成される：未誘
導体化ヌシーブ、シープラーク、分画シープラークＢフ
ラクション。この増大した篩化能力は、ヌシーブ・アガ
ロース４〜９％および実施例１の方法で得られたシーブ
ラーク・アガロースのＢフラクションの４〜９％の範囲
の種々の濃度で一連のゲルを操作することにより実証さ
れた。標準NDAマーカーセットをこれらのゲル中でマー
カー色素ブロモフェノールブルーと共に電気泳動させ、
そしてフラグメントと色素との泳動距離を、各レーンで
の色素フロントをマークし、そしてDNAをエチジウムブ
ロマイドで染色した後のゲルの写真で測定した。

第１図に示しまた以下のデータに基づいたRf対log塩基
対（４％ゲル）のプロットから、分画した材料（フラク
ションＢ）はヌシーブ・アガロースよりもDNAフラグメ
ントの遅延をより大きくさせることが立証している。こ
れが分画した試料のより高いEEOで生じる加工品ではな
いことが、実際の移動距離よりもむしろRfをプロットす
ることにより立証される。その理由は、いずれのEEO効
果もまたブロモフェノール・ブルーマーカー色素で発現
されるからである。曲線の直線部分はフラクションＢに
ついて70〜350塩基対およびヌシーブ・アガロースにつ
いて120〜600塩基対の範囲にあると推定された。このこ
とは更にフラクションＢ材料での篩化の度合がより大き
いことを示している。その理由は、その最も有用な範囲
が低分子サイズであるからである。

この実験の過程で、分画アガロース（フラクションＢ）
の別の利点が明らかになった。すなわち、ゲルはその相
対ヌシーブゲルよりも外観が更に明瞭であった。この利
点は、分離された物質の目視が増進される。この観察
は、ヌシーブ・アガロースおよび実施例4BのＢフラクシ
ョンの１％ゲルの5cmを経る濁度を測定することにより
数量化された。方法は、濁度の標準曲線を4000NTUフル
マジン（Formazin）濁度標準の系列希釈から調製する標
準方法であり、供試試料の濁度を曲線から求めた。結果
は以下の通りであった。

改良された製品は同じような現在の市販製品よりも透明
なゲルを形成していることが容易にわかる。

実施例７実施例１に記載の如くヒドロキシエチル化アガロースを
分画する能力はヒドロキシエチル基の作用ではないこと
が次の実験からわかる。ゲリジウム（Gelidium）海藻寒
天から誘導された天然のアガロース20gを２％溶液とす
るのに十分な水に溶解した。pHを7.0〜7.5に調節した。
この溶液を約54℃に冷却し、そして同じく54℃に加熱し
たaze.IPAの２を加えた（表面下に）。沈殿したアガ
ロース（フラクションＡ）をNo.120篩に流出させること
によりアルコールから分離した。ここで約42〜45℃のア
ルコールを、塩化ナトリウム0.1モルを溶解したaze.IPA
の他の１に滴加した。第二の沈殿（フラクションＢ）
が形成し、そして一夜沈降させた。両方のフラクション
を60％IPAで洗いすすぎし、絞り出しし、そして実験室
サンプルミルでU.S.シーブ・シリーズ（U.S. Sieve S
eries）No.20篩を通して粉砕する前に、空気循環炉で55
℃で乾燥した。異なったバッチのアガロースを出発物質
として、実験を更に２回くりかえした。結果を次の表に
示す。

ここで、ゲル強度がより高く、またより低い材料への分
画がなされ、また電気浸透特性が分割されたことが明確
にわかった。

実施例８この方法もまたスケール・アップし得ることを実証する
ために、パイロット・プラントでマルチ・キログラム・
バッチでくりかえした。いくつかの代表的な結果を次の
表に示す。

実施例９誘導体化アガロースを分画することにより製造される如
く分画されたアガロースを誘導体化することにより分析
上および機能上併せて同一の物質が形成されることを実
証するために、次の実験を行った。

A. 先の実施例８で最初に列挙した操業の低電気浸透性
アガロースから製造した超低電気浸透性フラクション
（フラクションＡ）を次の如く処理した：アガロース30gおよび蒸留水575mlを混合し、そして電子
アオーブン中沸騰するまで加熱した。次に混合物を溶液
が完成するまでかくはんしながら沸騰水浴中に保持し、
次に14M水酸化ナトリウム中4.4M水素化ホウ素ナトリウ
ムの市販溶液〔モートン・チオコル（Morton Thioko
l）からのヴェンピュア（Venpure）6mlを加え、次いで
すぐに以下の表に指示したとおりの12M水酸化ナトリウ
ム溶液（生成物Ａ、ＣおよびＥ）を異なった量で加え
た。異なったレベルで使用して置換度を変化させた試薬
２−クロロエタノール（CLETOH）の分解により生じる異
なった量の酸性度とするのに異なった量が必要とされ、
それにより塩基の生味の濃度は約0.4〜0.5Mに保持され
た。約２〜４倍量の水で希釈した後、試薬を滴加した。
反応混合物を試薬添加完了後約１時間かくはんしてお
き、次に約1100mlに希釈してそして3M酢酸で中和した。
次に、これらを、繊維の形態（以下本文では凝塊と称す
る）で沈殿した生成物を採取するために、共沸イソプロ
ピルアルコール（87.7重量％）の２容量（すなわち、約
2400ml）にかくはんしながら加えた。凝塊をU.S.シーブ
・シリーズNo.120ステンレス鋼スクリーンで圧縮し、そ
して圧縮凝塊に留保されているアルコールの概算重量の
５〜６倍で２度洗浄した。すき間の液体の重量は凝塊を
秤量し、そして30g、すなわち100％採取率が仮定される
値を差引くことにより見積りした。生成物を一夜55℃の
空気循環炉で乾燥し、次に大気中に報知して水分との平
衡を確立した。次に生成物を秤量し、実験室ミルでU.S.
シーブ・シリーズNo.20篩を通して粉砕し、そして試験
した。

B. 先の実施例８で最初に列挙した分画からのフラクシ
ョンＢ材料を用いて同様の実験を行って、生成物Ｂ、Ｄ
およびＦを得た。

二組の基本試薬の量および分析を次の表に提示する。

生成物ＥおよびＦを製造するのに使用したクロロエタノ
ールのレベルは所望の置換度を生じ、そしてこれらの生
成物はそれぞれ分画されたヒドロキエチル化アガロース
のＡおよびＢフラクションに匹敵し得る。

実施例10 実施例９で用いたのと同じ分画アガロース30.0gおよび
蒸留水575mlの分散液を電子オーブンで沸騰するまで加
熱し、次に沸騰水浴に移し、そこで総加熱時間が約30分
となるまでかくはんしながら保持した。次に、これを83
℃に冷却し、そして44M NaBH₄/14M NaOH溶液4.0mlを
加え、次いで約14分後に12M NaOHの35.8mlを加え、総
アルカリ度を503mg当量〔（４）（18.4）＋（35.8）（1
2）〕とした。かくはん機で生じた渦の滴下ロートにジ
メチル硫酸17.3ml（183mg当量）を注加した。滴加には1
2分より多少短い時間を要し、また溶液の温度は添加を
通じて85℃であった。添加開始後２時間、蒸留水400ml
を加え、次いで3M酢酸約106mlを加えて中和をした。次
に、急速かくはんしながら、混合物を予め42℃に加温し
ておいた共沸イソプロピルアルコール/2400mlに注加し
て凝固プロセスの過程でのゲル化を防止した。凝塊を排
水しU.S.スタンダード・シーブ・シリーズNo.120篩でプ
レスし、次に60％イソプロピルアルコールの見積り残留
液重量の５倍で２回洗浄した。乾燥し、そして空気中で
平衡化した後、採取した生成物は重量27.68gであった。
このものをNo.20篩を通過し得るサイズに粉砕し、そし
て関心のある特徴のある特性について分析した：１％ゲル強度＝627g/cm² 1.5％ゲル温度＝29.0℃ 1.5％溶融温度＝69.5℃ これらの特性は分画ヒドロキシエチルアガロースで得ら
れる特性と同様であり、そして材料を更に試験して作用
上匹敵し得ることを実証した。

実施例11 この実施例では、ヒドロキシプロピルアガロースを製造
した。アガロースの溶解は実施例10の如くであった。添
加総アルカリは314mg当量であり、使用した総プロピレ
ンオキサイドは739mg当量（50ml）であった。しかし、
加水分解でアルカリを消費しないので、過剰のアルカリ
を必要としなかった。添加時間は49分であり、そして添
加開始から希釈および中和への経過時間の合計は２時間
であった。凝固およびその他の採取工程はメチル誘導体
について記載したとおりであった。収量は3.1gであっ
た。ゲル強度は216g/cm²、ゲル温度は27.5℃、また溶融
温度は67.0℃であった。

実施例12 ９％水を含有するプロピレングリコールを用いてアガロ
ースを分画する以外は実施例７の方法をくりかえした。
91％プロピレングリコール中のアガロースの溶液を約13
0℃から室温に冷却し、この間に沈殿が形成した。この
沈殿を液相から分離し、60％IPAで洗い、乾燥し、そし
て粉砕すると低いピルベート（pyruvate）含量および出
発未分画アガロースよりも低いEEO（0.05対0.10）、お
よび僅かに高いゲル強度（1394g/cm²対1314g/cm²）を有
する材料が得られた。この分画材料30gを実施例９に用
いたのと同一のレベルの２−クロロエタノール、生成物
Ｅ、を用いてヒドロキシエチル化した。その理由は、こ
れによりほぼ正しい置換度が提供されたからである。特
性はこの新規生成物について予測した範囲内にあった。
すなわち、現在入手可能な低ゲル化（低溶融）温度より
も高いゲル強度および低EEOを有していた。それらはそ
れぞれ370g/cm²および0.02であった。ゲル化および溶融
温度はそれぞれ28.0℃および63.5℃であった。

実施例13 分画された誘導体化アガロースと誘導体化分画アガロー
スとの類似性を更に具体的に説明するために、実施例８
に記載の分画されたアガロースの混合物を用いてパイロ
ットプラント操業を行った。分画したアガロース26kgを
生蒸気の注入により濾過水85ガロン（357）に溶解し
た。190゜Ｆ（86℃）の温度に達した後、蒸気注入速度
を低下させ、そして混合物を更に半時間沸点以下に保持
した。市販の14M水酸化ナトリウム溶液中の4.4M水素化
ホウ素ナトリウム1500ml（モートン・チオコールからの
ヴェンピュア）を加える前に、温度を180゜Ｆ（82℃）
に低下させ、そして混合物を20分間180゜Ｆ（82℃）に
保持した。水酸化ナトリウム44ポンド（20kg）を冷濾過
水10ガロン（42）に溶解し、そしてアガロース溶液に
加えた。溶液の容量を次に水を加えて135ガロン（567
）に調整した。約３時間かけて、エチレンオキサイド
11.5ポンド（5kg）を反応混合物中に吹き込み、そして
添加完了時3M酢酸33ガロン（139）を加えてpHを7.0に
低下させる前に更に30分間かくはんを続けた。次に、ヒ
ドロキシエチル化アガロースを100〜110゜Ｆ（約40℃）
に予熱した80％IPAの４容量中に沈殿させることにより
採取した。混合物を＜80゜Ｆ（26℃）に冷却し、そして
振動スクリーンを用いて液体から分離した。これをアル
コール200ガロン（840）部分量・・・３×60％および
２×80％…で５回洗い、絞り、細断し、乾燥そして粉砕
した。次の表では、本生成物の分析値と実施例３の予め
ヒドロキシエチル化アガロースの分画生成物の分析値と
を比較する。

実施例３の分画ヒドロキシエチル化生成物＝SPQ−A; 実施例13のヒドロキシエチル化分画生成物＝HE−XLE; 市販の標準ヒドロキシエチル化アガロース＝SPQ_o 本発明の生成物のより高いゲル強度およびより低いEEO
（最初の二つのカラム）は三番目のカラムに示す市販標
準生成物、シープラーク・アガロースとの比較により容
易に明らかとなる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開平１−51401（ＪＰ，Ａ) 米国特許3956273（ＵＳ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】用いた出発物質（SM）に対し誘導体化フラ
クションＡ（Ａ）と誘導体化フラクションＢ（Ｂ）が常
に次の関係を満足することを特徴とするフラクションＡ
及びフラクションＢからなる分画誘導体化アガロース生
成物。性質Ａ対ＢＡ対SM Ｂ対SM ゲル化温度Ａ＞Ｂ − SM≧Ｂ融点Ａ＞ＢＡ＞SM SM≧Ｂゲル強度Ａ＞ＢＡ＞SM SM＞Ｂ粘度Ａ＞ＢＡ＞SM SM＞Ｂピルベート含量Ｂ＞Ａ SM＞ＡＢ＞SM 電気浸透値Ｂ＞Ａ SM＞ＡＢ＞SM
【請求項２】C₂−C₃ヒドロキシアルキル化アガロース、
C₁−C₃アルキル化アガロース、グリオキザルアガロース
あるいはジヒドロキシプロピルアガロースであることを
特徴とする請求項１の誘導体化アガロース生成物。
【請求項３】ヒドロキシエチル化アガロースであること
を特徴とする請求項１の誘導体化アガロース生成物。
【請求項４】メチル化アガロースであることを特徴とす
る請求項１の誘導体化アガロース生成物。
【請求項５】A.水性媒質中または水１〜15重量％を含有
するC₂−C₅ポリオール中の誘導体化アガロースの溶液を
形成させ、 B.上記溶液を、溶液が水性であるときは、C₁−C₄アルカ
ノールまたはアセトンである水混和性溶媒と接触させる
か、あるいは、溶液がC₂−C₅ポリオールを包含している
ときは、溶液を冷却して第一の誘導体化アガロース生成
物を包含する沈澱を形成させ、 C.溶液から沈澱を単離し、そして、 D.工程Ｃで得られた溶液を水性塩溶液と第二の誘導体化
アガロース生成物を包含する沈澱させるのに十分な量で
接触させる工程を特徴とする用いた出発物質（SM）に対し誘導体化
フラクションＡ（Ａ）と誘導体化フラクションＢ（Ｂ）
が常に次の関係を満足することを特徴とするフラクショ
ンＡ及びフラクションＢからなる分画誘導体化アガロー
ス生成物の製造法。性質Ａ対ＢＡ対SM Ｂ対SM ゲル化温度Ａ＞Ｂ − SM≧Ｂ融点Ａ＞ＢＡ＞SM SM≧Ｂゲル強度Ａ＞ＢＡ＞SM SM＞Ｂ粘度Ａ＞ＢＡ＞SM SM＞Ｂピルベート含量Ｂ＞Ａ SM＞ＡＢ＞SM 電気浸透値Ｂ＞Ａ SM＞ＡＢ＞SM
【請求項６】工程Ａで使用される誘導体化アガロースが
C₂−C₃ヒドロキシアルキル化アガロース、C₁−C₃アルキ
ル化アガロース、グリオキザルアガロースまたはジヒド
ロキシプロピルアガロースであることを特徴とする請求
項５の方法。
【請求項７】工程Ａで水性媒質が6.0〜8.0のpHを有する
ことを特徴とする請求項５の方法。
【請求項８】工程Ａで水性媒質が7.0〜7.4のpHを有する
ことを特徴とする請求項７の方法。
【請求項９】pHが7.2であることを特徴とする請求項７
の方法。
【請求項１０】工程Ａで水性媒質が10mM未満の塩含量を
有することを特徴とする請求項５の方法。
【請求項１１】塩含量が4mM未満であることを特徴とす
る請求項10の方法。
【請求項１２】工程Ａで塩含量0.003〜0.4mMK範囲にあ
ることを特徴とする請求項10の方法。
【請求項１３】工程Ａで使用される誘導体化アガロース
が、ゲリジウム（Gelidium）またはプテロクラジア（Pt
erocladia）海草種、ゲリジウムおよび（または）プテ
ロクラジアとグラシラリア（Gracilaria）との混合物か
ら、あるいはこれらの混合物からのアガロースを誘導体
化することによって得られることを特徴とする請求項５
の方法。
【請求項１４】工程Ｂで溶媒がイソプロピルアルコール
であることを特徴とする請求項５の方法。
【請求項１５】工程ＡでC₂−C₅ポリオールがプロピレン
グリコールであることを特徴とする請求項５の方法。
【請求項１６】工程Ｂで溶媒を水溶液に加えることを特
徴とする請求項５の方法。
【請求項１７】溶媒を、溶液をかくはんしながら、溶液
の表面下に加えることを特徴とする請求項11の方法。
【請求項１８】工程Ｄで水性塩溶液が水性塩化ナトリウ
ムであることを特徴とする請求項５の方法。
【請求項１９】工程ＤでC₁−C₄アルコールまたはアセト
ンも溶液に加えることを特徴とする請求項５の方法。