JPH0779683B2 - 組換えｄｎａを含む遺伝子工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシン突然変異体 - Google Patents
組換えｄｎａを含む遺伝子工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシン突然変異体Info
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- JPH0779683B2 JPH0779683B2 JP60120735A JP12073585A JPH0779683B2 JP H0779683 B2 JPH0779683 B2 JP H0779683B2 JP 60120735 A JP60120735 A JP 60120735A JP 12073585 A JP12073585 A JP 12073585A JP H0779683 B2 JPH0779683 B2 JP H0779683B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、α−アミラーゼをコードする遺伝子を含む組
換えDNAを含む枯草菌微生物に関する。
換えDNAを含む枯草菌微生物に関する。
ヨーロッパ特許出願第81300578.2号明細書には、バクテ
リア性供与体微生物から得られるDNAを開裂し、得られ
たDNAフラグメントを、同様に開裂されたベクター（ベ
クターはプラスミドまたはλファージの誘導体のDNAを
含む）と結合したインビトロプロセスにより作られるア
ミラーゼをコードする遺伝子を含む新規な組換えDNAが
開示されている。この組換えDNAは、バクテリア性宿主
生物に挿入されることができ、後者はアミラーゼを作る
ために培養される。種々のバクテリア性供与体及びバク
テリア性宿主生物が、多数の適当なプラスミドおよびλ
ファージの誘導体と同様に、このヨーロッパ特許出願明
細書に記載されている。
リア性供与体微生物から得られるDNAを開裂し、得られ
たDNAフラグメントを、同様に開裂されたベクター（ベ
クターはプラスミドまたはλファージの誘導体のDNAを
含む）と結合したインビトロプロセスにより作られるア
ミラーゼをコードする遺伝子を含む新規な組換えDNAが
開示されている。この組換えDNAは、バクテリア性宿主
生物に挿入されることができ、後者はアミラーゼを作る
ために培養される。種々のバクテリア性供与体及びバク
テリア性宿主生物が、多数の適当なプラスミドおよびλ
ファージの誘導体と同様に、このヨーロッパ特許出願明
細書に記載されている。
微生物中へ遺伝子を導入するためのプラスミドの使用
は、広く行なわれている手法である。最近の文献には、
この目的のために提案された多数のプラスミドが記載さ
れている。特に、２つの論文、ジーン（Gene）、Elsevi
er Biomedical Press,15（1981）,43-58,Ilkka Palva
ら、および、19（1982）81-87,Ilkka Palvaには、宿主
として枯草菌を用いてダイレクトショットガンクローニ
ングによりバチルス・アミロリクイファシエンス（Baci
llus amyloliquefaciens）からα−アミラーゼをコード
する遺伝子を単離することが記載されている。バチルス
・アミロリクイファシエンスのゲノムは、部分的に、制
限酵素MboIにより消化され、２〜5kbのフラグメントが
単離され、プラスミドpUB110に結合された。コンペテン
ト枯草菌アミラーゼ−ネガティブ細胞がハイブリッドプ
ラスミドにより形質転換され、カナマイシン耐性形質転
換体がα−アミラーゼの生産のためにスクリーニングさ
れた。
は、広く行なわれている手法である。最近の文献には、
この目的のために提案された多数のプラスミドが記載さ
れている。特に、２つの論文、ジーン（Gene）、Elsevi
er Biomedical Press,15（1981）,43-58,Ilkka Palva
ら、および、19（1982）81-87,Ilkka Palvaには、宿主
として枯草菌を用いてダイレクトショットガンクローニ
ングによりバチルス・アミロリクイファシエンス（Baci
llus amyloliquefaciens）からα−アミラーゼをコード
する遺伝子を単離することが記載されている。バチルス
・アミロリクイファシエンスのゲノムは、部分的に、制
限酵素MboIにより消化され、２〜5kbのフラグメントが
単離され、プラスミドpUB110に結合された。コンペテン
ト枯草菌アミラーゼ−ネガティブ細胞がハイブリッドプ
ラスミドにより形質転換され、カナマイシン耐性形質転
換体がα−アミラーゼの生産のためにスクリーニングさ
れた。
遺伝子的に操作された微生物を工業的規模で用いること
の問題の一つは、遺伝子工学プロセスで導入された組換
えDNAの安定性である。もし安定性が欠けていたら、組
換えDNAは微生物の連続的発生が行なわれるうちに失わ
れるかまたは配列再配置を受ける傾向があり、結局、ア
ミラーゼをコードする遺伝子は子孫の微生物により全く
またはほとんど発現されなくなる。
の問題の一つは、遺伝子工学プロセスで導入された組換
えDNAの安定性である。もし安定性が欠けていたら、組
換えDNAは微生物の連続的発生が行なわれるうちに失わ
れるかまたは配列再配置を受ける傾向があり、結局、ア
ミラーゼをコードする遺伝子は子孫の微生物により全く
またはほとんど発現されなくなる。
本発明者は今や、ヨーロッパ特許出願第81300578.2号明
細書に記載されたあるアミラーゼをコードする遺伝子を
含むが、そこには特に記載されていないプラスミドから
得られる組換えDNAを開発した。このプラスミドは、Jou
rnal of Bacteriology 1978,第134巻，第318-329頁にも
記載されたpUB110である。プラスミドpUB110は、ヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ酵素により不活性化された
カナマイシンまたは類似の抗生物質に対する耐性をコー
ドする遺伝子を含む。本発明者はこのプラスミドおよび
α−アミラーゼをコードする遺伝子から得られる組換え
DNAが、宿主微生物中に導入され得ること、および特に
宿主が枯草菌である場合、突然変異体を作って培養する
ことができ、これは高められた安定性および高いコピー
数をもつことを見出した。従って、この新規な組換えDN
Aを含む突然変異体微生物は、α−アミラーゼの生産の
ために、特に巨大菌のα−アミラーゼ（特に有用な特性
をもつアミラーゼである）の生産のために工業ベースで
使用できる。
細書に記載されたあるアミラーゼをコードする遺伝子を
含むが、そこには特に記載されていないプラスミドから
得られる組換えDNAを開発した。このプラスミドは、Jou
rnal of Bacteriology 1978,第134巻，第318-329頁にも
記載されたpUB110である。プラスミドpUB110は、ヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ酵素により不活性化された
カナマイシンまたは類似の抗生物質に対する耐性をコー
ドする遺伝子を含む。本発明者はこのプラスミドおよび
α−アミラーゼをコードする遺伝子から得られる組換え
DNAが、宿主微生物中に導入され得ること、および特に
宿主が枯草菌である場合、突然変異体を作って培養する
ことができ、これは高められた安定性および高いコピー
数をもつことを見出した。従って、この新規な組換えDN
Aを含む突然変異体微生物は、α−アミラーゼの生産の
ために、特に巨大菌のα−アミラーゼ（特に有用な特性
をもつアミラーゼである）の生産のために工業ベースで
使用できる。
従って、本発明は、約6.7kbの長さおよび第１図にに示
される制限酵素切断地図を有する、α−アミラーゼをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドpAMY100を含む遺伝子
工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシン耐性突然変
異体であって、1mlあたり少なくとも250μｇのカナマイ
シンを含む栄養培地で生育でき、寄託番号が枯草菌NCIB
11984（BAS72）であることを特徴とする遺伝子工学的に
作りだされた枯草菌微生物に関する。
される制限酵素切断地図を有する、α−アミラーゼをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドpAMY100を含む遺伝子
工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシン耐性突然変
異体であって、1mlあたり少なくとも250μｇのカナマイ
シンを含む栄養培地で生育でき、寄託番号が枯草菌NCIB
11984（BAS72）であることを特徴とする遺伝子工学的に
作りだされた枯草菌微生物に関する。
さらに本発明は、寄託番号が枯草菌NCIB11984（BAS72）
である遺伝子工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシ
ン耐性突然変異体であって、1mlあたり少なくとも750μ
ｇのカナマイシンを含む栄養培地で生育でき、寄託番号
が枯草菌NCIB11985（BAS73）であることを特徴とする遺
伝子工学的に作りだされた枯草菌微生物に関する。
である遺伝子工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシ
ン耐性突然変異体であって、1mlあたり少なくとも750μ
ｇのカナマイシンを含む栄養培地で生育でき、寄託番号
が枯草菌NCIB11985（BAS73）であることを特徴とする遺
伝子工学的に作りだされた枯草菌微生物に関する。
当該組換えDNAは、供与体微生物である巨大菌（Bacillu
s megaterium）NCIB11568−これは、α−アミラーゼお
よびβ−アミラーゼを各々コードする遺伝子を含む−か
ら得られるDNAを開裂し、その結果得られる、α−アミ
ラーゼをコードする遺伝子を含むDNAのフラグメント
を、同様に開裂さたプラスミドのベクターpUB110と結合
させるインビトロ法によって作られ、本発明者によって
pAMY100と名付けられたものである。
s megaterium）NCIB11568−これは、α−アミラーゼお
よびβ−アミラーゼを各々コードする遺伝子を含む−か
ら得られるDNAを開裂し、その結果得られる、α−アミ
ラーゼをコードする遺伝子を含むDNAのフラグメント
を、同様に開裂さたプラスミドのベクターpUB110と結合
させるインビトロ法によって作られ、本発明者によって
pAMY100と名付けられたものである。
本明細書において使用される巨大菌という術語は、Berg
eyのManual of Determinative Bacteriology,第８版,R.
E.Buchanan ＆ N.E.Gibbons共編，第537頁に記載されて
いるような、特にバチルス・カロタルム（Bacillus car
otarum）を含む、巨大菌の容認されている異名を含む。
eyのManual of Determinative Bacteriology,第８版,R.
E.Buchanan ＆ N.E.Gibbons共編，第537頁に記載されて
いるような、特にバチルス・カロタルム（Bacillus car
otarum）を含む、巨大菌の容認されている異名を含む。
本発明による組換えDNAの製造は、本明細書で後述する
実施例に記載されるような慣用の周知手段を用いて行な
われる。
実施例に記載されるような慣用の周知手段を用いて行な
われる。
工業的使用のために、組換えDNAは、本発明により、先
ず、宿主微生物中に入れられる。宿主はα−アミラーゼ
をコードする遺伝子が欠けていて、胞子形成しない枯草
菌、好ましくは、枯草菌BGSC 1A289の無胞子性突然変異
体（以下BAS8と呼称する）である。後者が組換えDNApAM
Y100のための宿主である場合、新しい微生物（寄託番号
枯草菌NCIB11980）が得られる（以下BAS35と呼称す
る）。
ず、宿主微生物中に入れられる。宿主はα−アミラーゼ
をコードする遺伝子が欠けていて、胞子形成しない枯草
菌、好ましくは、枯草菌BGSC 1A289の無胞子性突然変異
体（以下BAS8と呼称する）である。後者が組換えDNApAM
Y100のための宿主である場合、新しい微生物（寄託番号
枯草菌NCIB11980）が得られる（以下BAS35と呼称す
る）。
改善された安定性および高いコピー数を得るために、下
記の手法を用いて、BAS35を突然変異させて、これらの
望ましい特性が高められている生物を得ることができる
ことが見出された。BAS35は、先ず、250μg/mlのカナマ
イシンまたは類似の抗生物質−ヌクレオチジルトランス
フェラーゼ酵素により不活性化され得る−を含む栄養培
地で生育させる。いくつかのコロニーはこの培地で生育
でき、他のものは生育できず、前者がより高いカナマイ
シン耐性を持つ。この培地で生育する能力を持つコロニ
ーが選択され、次に別途に培養される。選択された株は
BAS35の突然変異体であることがわかり、枯草菌NCIB119
84として寄託された（以下BAS72と呼称する）。しかし
もしこの新しい突然変異株を1mlあたり750μｇのカナマ
イシンを含む栄養培地に移すと、この培地で生育でき、
従って750μg/mlのカナマイシン濃度に抵抗するよう適
応された突然変異体の選択を更に行なうことができる。
この突然変異体が選ばれ、別途に生育され、枯草菌NCIB
11985として寄託された（以下BAS73と呼称する）。突然
変異体BAS72およびBAS73の両者は、カナマイシン耐性を
持つ他に、高められた安定性および増加されたコピー数
を示す。すなわちBAS35のコピー数は約15であるが、BAS
72のそれは少なくとも25、BAS73のそれは少なくとも35
である。この手順は、例えば5000μg/mlまでの、より高
い濃度の抗生物質に対してさえ抵抗し、従ってより高い
コピー数をもつ突然変異株を作るために用いることがで
きる。
記の手法を用いて、BAS35を突然変異させて、これらの
望ましい特性が高められている生物を得ることができる
ことが見出された。BAS35は、先ず、250μg/mlのカナマ
イシンまたは類似の抗生物質−ヌクレオチジルトランス
フェラーゼ酵素により不活性化され得る−を含む栄養培
地で生育させる。いくつかのコロニーはこの培地で生育
でき、他のものは生育できず、前者がより高いカナマイ
シン耐性を持つ。この培地で生育する能力を持つコロニ
ーが選択され、次に別途に培養される。選択された株は
BAS35の突然変異体であることがわかり、枯草菌NCIB119
84として寄託された（以下BAS72と呼称する）。しかし
もしこの新しい突然変異株を1mlあたり750μｇのカナマ
イシンを含む栄養培地に移すと、この培地で生育でき、
従って750μg/mlのカナマイシン濃度に抵抗するよう適
応された突然変異体の選択を更に行なうことができる。
この突然変異体が選ばれ、別途に生育され、枯草菌NCIB
11985として寄託された（以下BAS73と呼称する）。突然
変異体BAS72およびBAS73の両者は、カナマイシン耐性を
持つ他に、高められた安定性および増加されたコピー数
を示す。すなわちBAS35のコピー数は約15であるが、BAS
72のそれは少なくとも25、BAS73のそれは少なくとも35
である。この手順は、例えば5000μg/mlまでの、より高
い濃度の抗生物質に対してさえ抵抗し、従ってより高い
コピー数をもつ突然変異株を作るために用いることがで
きる。
安定性およい高いプラスミドコピー数を持つBAS72およ
びBAS73は、巨大菌NCIB No.11568のα−アミラーゼを
作るために工業的に用いるのに適している。なぜなら
ば、この両者はこのアミラーゼをコードする遺伝子を含
む組換えDNAであるpAMY100を含むからである。
びBAS73は、巨大菌NCIB No.11568のα−アミラーゼを
作るために工業的に用いるのに適している。なぜなら
ば、この両者はこのアミラーゼをコードする遺伝子を含
む組換えDNAであるpAMY100を含むからである。
高コピー数突然変異株を工業的使用のためにより安定に
するために、各微生物に含まれる組換えDNAからカナマ
イシン耐性をコードする遺伝子を除去するのが好まし
い。これは、公知の遺伝子工学手法、例えば組換えDNA
を微生物から除き、インビトロで開裂し、そしてそれか
らカナマイシン耐性をコードする遺伝子を制限酵素によ
り除去する手法によって行なわれ得る。得られたDNAは
次にリガーゼにより連結され、枯草菌宿主、例えばBAS
8、あるいは「治癒された」形のBAS72またはBAS73の中
に再挿入される。
するために、各微生物に含まれる組換えDNAからカナマ
イシン耐性をコードする遺伝子を除去するのが好まし
い。これは、公知の遺伝子工学手法、例えば組換えDNA
を微生物から除き、インビトロで開裂し、そしてそれか
らカナマイシン耐性をコードする遺伝子を制限酵素によ
り除去する手法によって行なわれ得る。得られたDNAは
次にリガーゼにより連結され、枯草菌宿主、例えばBAS
8、あるいは「治癒された」形のBAS72またはBAS73の中
に再挿入される。
組換えDNAを含む微生物は、本発明によれば、種々のア
ミラーゼを作るように遺伝子工学的に作りだされ得る
が、本発明者の英国特許出願第8414272号明細書に記載
されているような多糖類、例えば澱粉の転化および部分
的澱粉加水分解を解媒する活性をもつ酵素である巨大菌
NCIB No.11568のα−アミラーゼを作るために特に有用
である。
ミラーゼを作るように遺伝子工学的に作りだされ得る
が、本発明者の英国特許出願第8414272号明細書に記載
されているような多糖類、例えば澱粉の転化および部分
的澱粉加水分解を解媒する活性をもつ酵素である巨大菌
NCIB No.11568のα−アミラーゼを作るために特に有用
である。
本発明を以下の実施例により更に説明する。そこでは以
下の寄託された株およびプラスミドが用いられた。
下の寄託された株およびプラスミドが用いられた。
枯草菌BGSC 1A289:この生物は、α−アミラーゼをコー
ドする遺伝子が欠けている突然変異体である。これは、
オハイオ州立大学のバチルス遺伝子貯蔵センターから入
手した。
ドする遺伝子が欠けている突然変異体である。これは、
オハイオ州立大学のバチルス遺伝子貯蔵センターから入
手した。
pUB110:前述した通りである。
pAMY1（寄託番号NCIB11570としての大腸菌に入れられ
た）：巨大菌NCIB11568のα−アミラーゼをコードする
遺伝子を持つ2.2kbHindIII挿入物を有する大腸菌プラス
ミドpBR322の誘導体。このプラスミドはヨーロッパ特許
出願第81300578.2号明細書に記載されている。
た）：巨大菌NCIB11568のα−アミラーゼをコードする
遺伝子を持つ2.2kbHindIII挿入物を有する大腸菌プラス
ミドpBR322の誘導体。このプラスミドはヨーロッパ特許
出願第81300578.2号明細書に記載されている。
実施例１ pAMY100:pUB110から得られ、巨大菌NCIB11568のα−ア
ミラーゼをコードするDNAセグメントを有する組換えプ
ラスミド（プラスミド地図は第１図参照） 供与体DNAはpAMY1であり、インビトロ組換えが、１μｇ
のpAMY1DNAと、EcoRI制限酵素10単位で開裂された２μ
ｇのpUB110DNAの間で行なわれた。連結（リゲーショ
ン）は、コンカテマーを作るために１単位のT4DNAリガ
ーゼの存在下に高濃度（75μgDNA/ml）で行なわれた。
ミラーゼをコードするDNAセグメントを有する組換えプ
ラスミド（プラスミド地図は第１図参照） 供与体DNAはpAMY1であり、インビトロ組換えが、１μｇ
のpAMY1DNAと、EcoRI制限酵素10単位で開裂された２μ
ｇのpUB110DNAの間で行なわれた。連結（リゲーショ
ン）は、コンカテマーを作るために１単位のT4DNAリガ
ーゼの存在下に高濃度（75μgDNA/ml）で行なわれた。
得られた生成物は、Clowes ＆ Highes編、Experiments
in Microbial Genetics,Blackwell 1968に記載された手
順により、BGSC 1A289を形質転換するために用いられ
た。カナマイシン耐性でアミラーゼを産出するクローン
が、10μg/mlのカナマイシンおよび１％澱粉を与えられ
たLB培地中で固定された。アミラーゼを産出するクロー
ンは、ヨーロッパ特許出願第81300578.2号明細書，第20
頁，段落Ｂに記載された手段により、ヨウ素蒸気で同定
された。
in Microbial Genetics,Blackwell 1968に記載された手
順により、BGSC 1A289を形質転換するために用いられ
た。カナマイシン耐性でアミラーゼを産出するクローン
が、10μg/mlのカナマイシンおよび１％澱粉を与えられ
たLB培地中で固定された。アミラーゼを産出するクロー
ンは、ヨーロッパ特許出願第81300578.2号明細書，第20
頁，段落Ｂに記載された手段により、ヨウ素蒸気で同定
された。
陽性クローンから、pAMY100、全pUB110を保持するプラ
スミド、AMYフラグメント、およびAMYフラグメントをフ
ランク（flank）するHindIII部位により制限されたpBR3
22の小さな部分のみを有するクローンが選択された。
スミド、AMYフラグメント、およびAMYフラグメントをフ
ランク（flank）するHindIII部位により制限されたpBR3
22の小さな部分のみを有するクローンが選択された。
次にpAMY100 DNAがこの株から抽出され、実施例３に記
載するように、BAS8を形質転換するために使用された。
載するように、BAS8を形質転換するために使用された。
実施例２ 枯草菌BGSC1A289の無胞子性突然変異体，枯草菌BAS8の
調製 BGSC1A289の一夜培養物のサンプルにUV光を放射し、下
記の培地を連続的継代培養でイノキュレートするために
用いた。
調製 BGSC1A289の一夜培養物のサンプルにUV光を放射し、下
記の培地を連続的継代培養でイノキュレートするために
用いた。
デイフコ（Difco）酵母抽出物 1g MgSO4・7H2O 200mg FeSO4・7H2O 10mg MnSO4・H2O 7mg CaCl2・2H2O 73mg PO4緩衝液pH7.0 0.067M グルタミン酸塩 0.1M メチオニン 40mg 芳香族アミノ酸 40mg H2O 1L この培地は、BergereおよびHermierにより胞子形成誘発
培地として記載されている（Ann.Inst.Pasteur 106,214
-235,1964）。このような培地における連続的継代培養
は、増殖できる前に先ず発芽しなければならない胞子に
対して栄養細胞（胞子形成できない）に選択の利点を与
える。すなわち、各継代培養段階は、無胞子性突然変異
体の個数を増大できる。BAS8は６回の継代培養後に単離
された。
培地として記載されている（Ann.Inst.Pasteur 106,214
-235,1964）。このような培地における連続的継代培養
は、増殖できる前に先ず発芽しなければならない胞子に
対して栄養細胞（胞子形成できない）に選択の利点を与
える。すなわち、各継代培養段階は、無胞子性突然変異
体の個数を増大できる。BAS8は６回の継代培養後に単離
された。
枯草菌BGSC 1A289について報告された遺伝マーカーは次
の通りである： amy−E:α−アミラーゼの不存在という結果となる、枯
草菌のα−アミラーゼをコードする構造遺伝子中の突然
変異、 aroI906:芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン
およびトリプトファン）に対する要求（栄養要求性）と
いう結果となる、シキメートキナーゼをコードする構造
遺伝子における突然変異、 metB5:メチオンニンに対する要求という結果となる、メ
チオニン生合成経路の酵素の１つをコードする構造遺伝
子における突然変異、 sacA321:酵素を異化することができないという結果とな
る、蔗糖異化に関係する酵素をコードする構造遺伝子に
おける突然変異。
の通りである： amy−E:α−アミラーゼの不存在という結果となる、枯
草菌のα−アミラーゼをコードする構造遺伝子中の突然
変異、 aroI906:芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン
およびトリプトファン）に対する要求（栄養要求性）と
いう結果となる、シキメートキナーゼをコードする構造
遺伝子における突然変異、 metB5:メチオンニンに対する要求という結果となる、メ
チオニン生合成経路の酵素の１つをコードする構造遺伝
子における突然変異、 sacA321:酵素を異化することができないという結果とな
る、蔗糖異化に関係する酵素をコードする構造遺伝子に
おける突然変異。
紫外線処理の効果は、未知遺伝子中に突然変異を生じさ
せることであり、胞子形成をすることができないという
結果となった。突然変異体BAS8は、前述した胞子形成培
地中で107のバクテリアあたり１未満の胞子を作り、一
方枯草菌BGSC 1A289は同じ条件下で２つのバクテリアあ
たり１つの胞子を作る。突然変異生物枯草菌BAS8は、遺
伝マーカーspo−８を含むが、しかし同時に突然変異過
程でマーカーaroI906およびsacA321を失った。
せることであり、胞子形成をすることができないという
結果となった。突然変異体BAS8は、前述した胞子形成培
地中で107のバクテリアあたり１未満の胞子を作り、一
方枯草菌BGSC 1A289は同じ条件下で２つのバクテリアあ
たり１つの胞子を作る。突然変異生物枯草菌BAS8は、遺
伝マーカーspo−８を含むが、しかし同時に突然変異過
程でマーカーaroI906およびsacA321を失った。
実施例３ 組換えDNApAMY100を含むBAS35の調製 実施例１および前述のExperiments in Microbial Genet
icsに記載の方法により、pAMY100を用いてBAS8を形質変
換した。
icsに記載の方法により、pAMY100を用いてBAS8を形質変
換した。
BAS35のプラスミド安定性は、プラスミドpUB110がそれ
に対する耐性を与える抗生物質カナマイシンなしで完全
培地（ディフコ・トリプトン１％；ディフコ酵素抽出物
１％;NaC10.5％）中で37℃で連続的継代培養することに
より測定した。
に対する耐性を与える抗生物質カナマイシンなしで完全
培地（ディフコ・トリプトン１％；ディフコ酵素抽出物
１％;NaC10.5％）中で37℃で連続的継代培養することに
より測定した。
最初の継代培養は、20μg/mlのカナマイシンの存在下で
生育させた一夜培養物のサンプルでイノキュレートされ
た。各継代培養について、発生の数を測定するために、
イノキュレーションおよび生育の直後に肉眼カウントを
用いた。
生育させた一夜培養物のサンプルでイノキュレートされ
た。各継代培養について、発生の数を測定するために、
イノキュレーションおよび生育の直後に肉眼カウントを
用いた。
37℃の完全培地における指数増殖期におけるBAS35の発
生時間は30分である。
生時間は30分である。
各継代培養の後に、アミラーゼ陽性クローン（プラスミ
ドを保持している）のパーセントを測定した。結果は次
の通りであった： 世代数 Amy+のクローンの％ 10 100 19 100 29 90.7 35 58.7 46 14.4 53 4.9 実施例４ BAS35の突然変異体,BAS72の調製（これは高められたカ
ナマイシン耐性およびプラスミド安定性をコードする未
知遺伝子中に突然変異を含む） 約30μg/mlの最大濃度のカナマイシンに対する耐性を与
えるプラスミドpAMY100を含むBAS35を、完全培地におい
て一夜生育させた。突然変異原処理なしで0.1mlのサン
プルを、完全培地を含みかつ250μg/mlのカナマイシン
を補ったプレート上に広げた。37℃で２日のインキュベ
ーションの後、この濃度のカナマイシンに耐性のクロー
ンがインキュベーションされたBAS35細胞あたり10-6の
確率で生じた。BAS72と名付けられた１つのクローンが
耐性クローンから選ばれ、高められた耐性をカナマイシ
ン表現型に与える突然変異はirk−72と名付けられた。
この表現型は、抗生物質の不存在下での数回の継代培養
後にその安定性を維持した。37℃での完全培養における
指数増殖期のBAS72の発生時間は60分である。
ドを保持している）のパーセントを測定した。結果は次
の通りであった： 世代数 Amy+のクローンの％ 10 100 19 100 29 90.7 35 58.7 46 14.4 53 4.9 実施例４ BAS35の突然変異体,BAS72の調製（これは高められたカ
ナマイシン耐性およびプラスミド安定性をコードする未
知遺伝子中に突然変異を含む） 約30μg/mlの最大濃度のカナマイシンに対する耐性を与
えるプラスミドpAMY100を含むBAS35を、完全培地におい
て一夜生育させた。突然変異原処理なしで0.1mlのサン
プルを、完全培地を含みかつ250μg/mlのカナマイシン
を補ったプレート上に広げた。37℃で２日のインキュベ
ーションの後、この濃度のカナマイシンに耐性のクロー
ンがインキュベーションされたBAS35細胞あたり10-6の
確率で生じた。BAS72と名付けられた１つのクローンが
耐性クローンから選ばれ、高められた耐性をカナマイシ
ン表現型に与える突然変異はirk−72と名付けられた。
この表現型は、抗生物質の不存在下での数回の継代培養
後にその安定性を維持した。37℃での完全培養における
指数増殖期のBAS72の発生時間は60分である。
BAS72中でのpAMY100の安定性 安定性はBAS35と同様に測定された。結果は次の通りで
ある。pAMY100は、BAS35におけるよりもBAS72中ではる
かにより安定であることは明らかである。
ある。pAMY100は、BAS35におけるよりもBAS72中ではる
かにより安定であることは明らかである。
世代数 Amy+のクローンの％ 11 100 17 100 29 100 34 100 45 100 50 100 実施例５ 先の実施例よりも高いカナマイシン耐性を与える未知遺
伝子の突然変異を含むBAS73の調製 BAS72（250μg/ml濃度のカナマイシンに耐性である）の
完全培地中での一夜培養物の0.1mlのサンプルを、750μ
g/mlのカナマイシンを補った完全培地を含むプレート上
に広げた。この濃度の抗生物質に自発的耐性のクローン
が、プレートされた細胞あたり10-6の確率で生じた。そ
のようなクローンの１つを精製し、BAS73と名付けた。7
50μg/mlのカナマイシンに対するその耐性は、抗生物質
不存在下での数回の継代培養後に安定に維持された。
伝子の突然変異を含むBAS73の調製 BAS72（250μg/ml濃度のカナマイシンに耐性である）の
完全培地中での一夜培養物の0.1mlのサンプルを、750μ
g/mlのカナマイシンを補った完全培地を含むプレート上
に広げた。この濃度の抗生物質に自発的耐性のクローン
が、プレートされた細胞あたり10-6の確率で生じた。そ
のようなクローンの１つを精製し、BAS73と名付けた。7
50μg/mlのカナマイシンに対するその耐性は、抗生物質
不存在下での数回の継代培養後に安定に維持された。
37℃での完全培地中での指数増殖期におけるBAS73の発
生時間は60分である。
生時間は60分である。
BAS73中でのpAMY100の安定性 プラスミド安定性がBAS35と同様に測定され、結果を以
下に示す。pAMY100はBAS35におけるよりもBAS73におい
てはるかに安定であることは明らかである。
下に示す。pAMY100はBAS35におけるよりもBAS73におい
てはるかに安定であることは明らかである。
世代数 Amy+のクローンの％ 10 100 18 100 28 100 34 100 45 100 50 100 実施例６ 枯草菌BAS35およびBAS73によるα−アミラーゼの製造 重量／体積パーセントで１％のバクトペプトン、３％の
酵母抽出物、0.5％のグルコースおよび0.5％のNaClを含
む15リットルの培地を含む４つの20リットル培養器を、
同じ培地中に含まれる予備培養物の１％でイノキュレー
トした。予備培養物は、培養器の前の最後の段階で約35
世代が作られるように数回の継代培養を行なうことによ
り作られた。
酵母抽出物、0.5％のグルコースおよび0.5％のNaClを含
む15リットルの培地を含む４つの20リットル培養器を、
同じ培地中に含まれる予備培養物の１％でイノキュレー
トした。予備培養物は、培養器の前の最後の段階で約35
世代が作られるように数回の継代培養を行なうことによ
り作られた。
２つの培養器には、カナマイシンの存在下（５μg/ml）
および不存在下で株BAS35を接種し、２つには、カナマ
イシンの存在下（５μg/ml）および不存在下で株BAS73
を接種した。培養器を250rpmで攪拌し、0.15L空気/L/分
で空気を吹き込み、40℃で55時間保った。６時間後およ
びさらに48時間の間、培養器に加えられたグルコース合
計が1.5％（w/v）となるようにグルコース溶液を連続的
に培養器に加えた。発酵の終了時に、培養ブロス中のα
−アミラーゼ活性を測定した。結果を以下の表に示す。
および不存在下で株BAS35を接種し、２つには、カナマ
イシンの存在下（５μg/ml）および不存在下で株BAS73
を接種した。培養器を250rpmで攪拌し、0.15L空気/L/分
で空気を吹き込み、40℃で55時間保った。６時間後およ
びさらに48時間の間、培養器に加えられたグルコース合
計が1.5％（w/v）となるようにグルコース溶液を連続的
に培養器に加えた。発酵の終了時に、培養ブロス中のα
−アミラーゼ活性を測定した。結果を以下の表に示す。
図１はpAMY100の制限地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 コリーネ・ヴアロン ベルギー国、ウアブル、アヴニユ・デユ ー・メネトリエ、６ (72)発明者 カリーヌ・ヴイルモ ベルギー国、シヤルロワ、アヴニユ・ド ウ・ウアーテルロー、11 (56)参考文献 特開 昭56−128796（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅ，19（1982）Ｐ．81−87
Claims (2)
- 【請求項１】約6.7kbの長さおよび下記図 に示される制限酵素切断地図を有する、α−アミラーゼ
をコードする遺伝子を含むプラスミドpAMY100を含む遺
伝子工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシン耐性突
然変異体であって、1mlあたり少なくとも250μｇのカナ
マイシンを含む栄養培地で生育でき、寄託番号が枯草菌
NCIB11984（BAS72）または枯草菌NCIB11985（BAS73）で
あることを特徴とする遺伝子工学的に作りだされた枯草
菌微生物。 - 【請求項２】1mlあたり少なくとも750μｇのカナマイシ
ンを含む栄養培地で生育でき、寄託番号が枯草菌NCIB11
985（BAS73）である、特許請求の範囲第１項記載の枯草
菌微生物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB848414271A GB8414271D0 (en) | 1984-06-05 | 1984-06-05 | Recombinant dna |
| GB8414271 | 1984-06-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6119491A JPS6119491A (ja) | 1986-01-28 |
| JPH0779683B2 true JPH0779683B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=10561932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60120735A Expired - Lifetime JPH0779683B2 (ja) | 1984-06-05 | 1985-06-05 | 組換えｄｎａを含む遺伝子工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシン突然変異体 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4806426A (ja) |
| EP (1) | EP0165002B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0779683B2 (ja) |
| AT (1) | ATE76902T1 (ja) |
| AU (1) | AU4313285A (ja) |
| BR (1) | BR8502681A (ja) |
| CA (1) | CA1279590C (ja) |
| DE (1) | DE3586145T2 (ja) |
| DK (1) | DK170735B1 (ja) |
| ES (2) | ES8702947A1 (ja) |
| FI (1) | FI91885C (ja) |
| GB (1) | GB8414271D0 (ja) |
| IE (1) | IE58259B1 (ja) |
| MX (1) | MX7725E (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4962026A (en) * | 1986-09-15 | 1990-10-09 | Enzyme Bio-Systems, Ltd. | Process for the production of panosyl derivatives |
| US5209938A (en) * | 1989-09-13 | 1993-05-11 | Cpc International Inc. | Method for retarding staling of baked goods |
| US6300115B1 (en) | 1998-05-18 | 2001-10-09 | Enzyme Bio-Systems Ltd. | Pullulanase expression constructs containing α-amylase promoter and leader sequences |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2759053A1 (de) * | 1977-12-30 | 1979-07-12 | Uhlin | Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns |
| ZA81424B (en) * | 1980-02-15 | 1982-02-24 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amylolytic enzymes and process for preparing same |
| IL61982A (en) * | 1980-02-15 | 1984-01-31 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes |
| FI64813C (fi) * | 1980-12-31 | 1984-01-10 | Ilkka Antero Palva | Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer |
| IT1156317B (it) * | 1982-09-08 | 1987-02-04 | Anic Spa | Vettori plasmidici ad espressione in bacillus subtilis e procedimento per la loro preparazione |
| DK135983D0 (da) * | 1983-03-25 | 1983-03-25 | Novo Industri As | Maltogen amylaseenzymprodukt og fremgangsmade til dets fremstilling og anvendelse |
-
1984
- 1984-06-05 GB GB848414271A patent/GB8414271D0/en active Pending
-
1985
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- 1985-05-23 US US06/737,311 patent/US4806426A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-24 FI FI852084A patent/FI91885C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-30 AU AU43132/85A patent/AU4313285A/en not_active Abandoned
- 1985-06-03 MX MX85956U patent/MX7725E/es unknown
- 1985-06-04 DE DE8585303947T patent/DE3586145T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-04 DK DK251485A patent/DK170735B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-06-04 BR BR8502681A patent/BR8502681A/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-06-04 AT AT85303947T patent/ATE76902T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-04 ES ES543860A patent/ES8702947A1/es not_active Expired
- 1985-06-04 EP EP85303947A patent/EP0165002B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-05 JP JP60120735A patent/JPH0779683B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-05 CA CA000483212A patent/CA1279590C/en not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-01-28 ES ES551307A patent/ES8802536A1/es not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ，１９（１９８２）Ｐ．８１−８７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0165002A2 (en) | 1985-12-18 |
| MX7725E (es) | 1991-01-30 |
| FI91885B (fi) | 1994-05-13 |
| FI852084L (fi) | 1985-12-06 |
| BR8502681A (pt) | 1986-02-12 |
| CA1279590C (en) | 1991-01-29 |
| JPS6119491A (ja) | 1986-01-28 |
| AU4313285A (en) | 1985-12-12 |
| IE58259B1 (en) | 1993-08-25 |
| ES543860A0 (es) | 1987-01-16 |
| EP0165002A3 (en) | 1987-09-02 |
| ATE76902T1 (de) | 1992-06-15 |
| ES8802536A1 (es) | 1988-07-16 |
| ES8702947A1 (es) | 1987-01-16 |
| GB8414271D0 (en) | 1984-07-11 |
| IE851287L (en) | 1985-12-05 |
| ES551307A0 (es) | 1988-07-16 |
| EP0165002B1 (en) | 1992-06-03 |
| DK251485D0 (da) | 1985-06-04 |
| DE3586145T2 (de) | 1992-12-03 |
| DK170735B1 (da) | 1995-12-27 |
| FI852084A0 (fi) | 1985-05-24 |
| DE3586145D1 (de) | 1992-07-09 |
| FI91885C (fi) | 1994-08-25 |
| US4806426A (en) | 1989-02-21 |
| DK251485A (da) | 1985-12-06 |
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