JPH0779692B2 - 一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法 - Google Patents

一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法

Info

Publication number
JPH0779692B2
JPH0779692B2 JP10320086A JP10320086A JPH0779692B2 JP H0779692 B2 JPH0779692 B2 JP H0779692B2 JP 10320086 A JP10320086 A JP 10320086A JP 10320086 A JP10320086 A JP 10320086A JP H0779692 B2 JPH0779692 B2 JP H0779692B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
stranded
double
column
eluted
tpa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP10320086A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS62259585A (ja
Inventor
光義 森井
正治 大岡
伸広 川嶋
則子 鈴木
俊彦 鈴木
Original Assignee
三井東圧化学株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 三井東圧化学株式会社 filed Critical 三井東圧化学株式会社
Priority to JP10320086A priority Critical patent/JPH0779692B2/ja
Priority to ZA873049A priority patent/ZA873049B/xx
Priority to US07/043,746 priority patent/US4898825A/en
Priority to CA000536036A priority patent/CA1284961C/en
Priority to AU72418/87A priority patent/AU590840B2/en
Priority to FI871948A priority patent/FI96211C/fi
Priority to NO871883A priority patent/NO173287C/no
Priority to DK198702337A priority patent/DK173151B1/da
Priority to EP87304077A priority patent/EP0245100B1/en
Priority to DE8787304077T priority patent/DE3780506T2/de
Publication of JPS62259585A publication Critical patent/JPS62259585A/ja
Publication of JPH0779692B2 publication Critical patent/JPH0779692B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一本鎖t-PA（組織プラスノーゲンアクチベー
ター）及び二本鎖t-PAを含有する混合物より一本鎖t-PA
及び二本鎖t-PAを分離精製する方法に関する。
本発明において、ETI即ち、「エリスリナ・ラティシマ
（まめ科植物Erythrina Latissima,広葉エリスリナ）及
び他のエリスリナ種の種子中に生成し、かつトリプシ
ン、プラスミン及びt-PAの阻害剤であるが、ウロキナー
ゼには作用しない型の固定化クリッツ型阻害剤」を使用
する。
この阻害剤をt-PAの精製に適用することは公知（特開昭
59-118717号）であるが本発明におけるようにこのもの
について二種の緩衡液を使い分けるとどうなるかという
ことは知られていない。
tPA活性を有する物質には一本鎖tPAと二本鎖tPAが存在
しこれらを別々に分離、精製する必要から本発明の方法
を創作するに至った。
一本鎖t-PAだけを取得する公知の方法としては、細胞培
養する際に蛋白質分解酵素阻害剤を添加し、さらに培養
液から分離精製する工程を蛋白分解酵素阻害剤の存在下
に行う方法がある（D.C.Rijken et al,J.Boil,Chem.25
6,7035〜7041,1981）。しかし、この方法では一本鎖t-P
Aから二本鎖t-PAへの移行を完全に阻止することはでき
ないので手段としては不充分なものでしかない。
t-PAを分離精製する工程で一本鎖t-PAと二本鎖t-PAが分
離できる手段としては、一本鎖t-PAを特異的に結合する
固定化モノクローナル抗体を用いた方法も知られている
（Bio-Pool社カタログ（Swede-n）。しかしながら固定
化モノクローナル抗体を用いる精製法はt-PAに対する吸
着能力、使用時の安定性及び実用性の面で充分な再現性
ある方法とは言えず、抗ヒトt-PA抗体に反応する分子量
11万±２万ダルトンの蛋白質との分離ができない欠点が
ある。
本発明の方法によればt-PAにつきその一本鎖と二本鎖の
分離が実現されるが、被験試料によっては少量のトリプ
シン様酵素が挟雑している場合があり、これがETIに対
して吸脱着することにより本発明の分離について擾乱因
子となりうる。これの為には予めこの挟雑物の除去を前
処理として行っておくとよい。
この除去方法としては、STI即ちETIと分子量がほぼ同じ
で、アミノ酸配列も相同性を有する大豆の種子に生成す
るクニッツ型阻害剤を（固定化して）使用すればよい。
STIを特異性の面でETIと類似しているが、STIはt-PAを
阻害しない。この為、両者を組み合わせて使用すると固
定化抗ヒトt-PAモノクローナル抗体と同様の選択性をも
たせることができる。即ちヒトt-PAを含む細胞培養液を
固定化STIカラムに通過させ、培養液中に含まれる微量
の不純蛋白分解酵素のうちETIに結合する型の蛋白分解
酵素を結合除去し、非吸着溶液をETIカラムに通過させ
てt-PAを吸着させ、次いで不純蛋白質を洗浄除去して
後、溶出溶媒のpHを変化させることにより一本鎖及び二
本鎖t-PAが別々に分離溶出されるのである。
本発明は、t-PAを含む細胞の種類に関係なく適用可能で
ある。つまり、メラノーマ細胞、ヒト正常細胞、及び遺
伝子組み換え技法を用い、ヒトt-PA遺伝子を組み込んだ
細胞のいずれからも一本鎖と二本鎖t-PAの分離精製が可
能である。その上、培養培地の組成にかかわらず、つま
り血清添加培地からも血清無添加培地と同様に一本鎖t-
PAと二本鎖t-PAの分離精製が可能である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
〔実施例〕
実施例１ 親和試薬（ETI試剤）の調整： 本発明で用いるETI試剤は、以下のようにしてセファロ
ーズカラムに調製して用いた。
エリスリナラティシマ種子をジョベール（Jou-bert）ら
の方法に従って採集し加工した（Joubert et al,Hoppe-
Seyler's Z.P-hysiol.Chem.,362,531〜538,1981）。種
子をすりつぶし、脱脂し、0.5モル/lNaCl水溶液により1
0℃で一夜抽出した。
その上澄液を硫酸アンモニウムで塩析し、その沈澱物を
回収し、続いてセファデックスG50、DEA-セルロースお
よびDEA-セファローズのクロマトグラフィーにかけた。
最終精製物は、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含
有15％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に付した場
合、みかけ分子量22.000ドルトンの単一バンドとして移
動した。
精製物（25mg）を市販臭化シアン活性化アガロース5ml
に通常方法で結合させた。
親和試薬は、NaCl0.4モル/l、0.1％TritonX-100および
0.02％ナトリウムアジド安定剤を含むpH7.4のリン酸緩
衡液に対して平衡化させた。
この親和試薬を使い捨てプラスチックシリンジの円筒で
造られた5mlのカラムに充填した。
親和試薬（STI試剤）の調整： 又前処理で用いるSTI試剤の調製は、以下のようであ
る。
STI-セファローズの調製：大豆種子より前記のETIの場
合と同様に磨砕、抽出、硫安沈澱、クロマトグラフ精製
により精製したクニッツ型阻害剤（STI）25mgを得て市
販の臭化シアン活性化アガロース5mlに通常の方法で結
合させた。
親和試薬は、NaCl0.4モル/l、0.1％TritonX-100を含むp
H7.4のリン酸緩衡液に対して平衡化させた。この親和試
薬を使い捨てプラスチックシリンジの円筒で造られた5m
lのカラムに充填した。
これらを使用し、一本鎖及び二本鎖t-PAを精製した。
例えば、ボウズ（Bowes）メラノーマ細胞培養液〔10％
熱不活性（56℃、30分間）胎児牛血清及び20KIU/mlのア
プロチンを含む〕2lをTween80（0.02％）及び食塩（0.4
モル/l）で安定化後、STI-セファローズカラムに適用し
た。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定したところ、カラムに適用された活性の約98％
が確認された。この画分に食塩を終濃度1.0モル/lにな
るように加え安定化後、ETI-セファローズカラムに適用
した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約10％が確認
された。この画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動後のザイモグラフィーで調べると、プラスミノーゲン
アクチベーターとして11万±２万ダルトン及び７万ダル
トンの二種類が確認された。全溶液をETI-セファローズ
カラムに通過させた後、20倍カラム容量の0.2％Tween80
を含む1.0M食塩水でカラムを洗った。この方法により、
カラムに適用された活性の約５％が検出され、ザイモグ
ラフ上で11万±２万及び７万ダルトンのバンドがプラス
ミノーゲンアクチベーターとして確認された。
吸着した蛋白質は、0.15MNaClを含む0.2Mクエン酸緩衡
液を用い、pH5.5からpH3.0までのリニア‐グラジエント
法で溶出した。
この方法によりpH5.2からpH4.5の範囲で一つのピークが
得られ、pH4.5からpH3.7の範囲でもう一つのピークが得
らた。この二つの分画をあわせるとカラムに適用した活
性の80-85％を示した。メルカプトエタノールで還元し
た試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で
調べた結果、pH5.2からpH4.5の範囲で溶出されるものは
還元しても分子量に変化はなく、７万ダルトンを示した
が、pH4.5からpH3.7の範囲で溶出されるものは還元する
と７万ダルトンのバンドは消失し３万から４万ダルトン
付近にバンドが確認された。この結果から、pH5.2からp
H4.5の範囲で溶出されるt-PAは一本鎖t-PAであり、pH4.
5からpH3.7の範囲で溶出されるt-PAは二本鎖t-PAである
ことが確認された。
実施例２ 人胎児包皮細胞培養液〔10％熱不活性（56℃、30分間）
胎児牛血清及び20KIU/mlのアプロチンを含む〕2lをTwee
n80（0.02％）及び食塩（0.4モル/l）で安定化後、STI-
セファローズカラムに適用した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約98％が確認
された。この画分に食塩を終濃度1.0モル/lになるよう
に加え安定化後、ETI-セファローズカラムに適用した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約45％が確認
された。この画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動後のザイモグラフィーで調べると、プラスミノーゲン
アクチベーターとして10万ダルトン付近に２〜３本、５
〜７万ダルトン付近に２〜３本、３万５千ダルトン付近
に１本のバンドが確認された。
t-PAを吸着したETI-セファローズカラムの洗浄に1.0MNa
Cl及び0.2％Tween80を含む20倍カラム容量の0.1MNH4HCO
3pH7.5の緩衡液でカラムを洗った。
この方法によりカラムに適用された活性の約５％が検出
され、ザイモグラフで上記と同じバンドが確認された。
溶離緩衡液には0.15MNaClを含む0.1Mグリシン塩酸緩衡
液でpH4.5及びpH3.5のものを用いて溶出した点のみをそ
れぞれ実施例１の場合と異にし、他は全く同様におこな
ったところ次の結果を得た。
分離されたpHの異なる２種の分画をあわせるとカラムに
適用された活性の40-50％を示した。メルカプトエタノ
ールで還元した試薬をポリアクリルアミドゲル電気泳動
後の銀染色で調べると、pH4.5で溶出されるものは還元
しても分子量に変化はなく、７万ダルトンを示したが、
pH3.5で溶出されるものは還元すると７万ダルトンのバ
ンドは消失し３万から４万付近にバンドが確認された。
この結果から、pH4.5で溶出されるt-PAは一本鎖t-PAで
あり、pH3.5で溶出されるt-PAは二本鎖t-PAであること
が確認された。
実施例３ ヒトt-PA遺伝子を組み込んだマウス繊維芽細胞の培養液
〔２％熱不活性（56℃、30分間）胎児牛血清及び20KIU/
mlのアプロチンを含む〕2lをTween80（0.02％）及び食
塩（0.4モル/l）で安定化後、STI-セファローズカラム
に適用した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約10％が確認
された。この画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動後のザイモグラフィーで調べると、プラスミノーゲン
アクチベーターとして11万ダルトン±２万ダルトン及び
７万ダルトンの二種類が確認された。全溶液をETI-セフ
ァローズカラムに通過させた後、20倍カラム容量の0.2
％Tween80を含む2.0M食塩水でカラムを洗った。この方
法により、カラムに適用された活性の約５％が検出さ
れ、ザイモグラフで上で11万±２万及び７万ダルトンの
バンドがプラスミノーゲンアクチベーターとして確認さ
れた。
吸着した蛋白質は、0.15MNaClを含む0.2Mリン酸ナトリ
ウム溶液pH4.5及びpH3.5を用いて溶出された。
この２つの分画をあわせるとカラムに適用された活性の
約80％を示した。メルカプトエタノールで還元した試薬
をポリアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べる
と、pH4.5で溶出されるものは還元しても分子量に変化
はなく、７万ダルトンを示したが、pH3.5で溶出される
ものは還元すると７万ダルトンのバンドは消失し３万か
ら４万付近にバンドが確認された。この結果から、pH4.
5で溶出されるt-PAは一本鎖t-PAであり、pH3.5で溶出さ
れるt-PAは二本鎖t-PAであることが確認された。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一本鎖tPAと二本鎖tPAを含む水性媒体を、
    一旦、ETIを担持した担体と接触させてこれらtPAを吸着
    させ、その後、特異的に一本鎖tPAを溶離するpH領域で
    一本鎖tPAを溶離し、次いで、一本鎖tPAおよび二本鎖tP
    Aを溶離するpH領域で一本鎖tPAと二本鎖tPAまたは二本
    鎖tPAを溶離することを特徴とする一本鎖tPAと二本鎖tP
    Aを分離する方法。
  2. 【請求項２】一本鎖tPAと二本鎖tPAを含む水性媒体が、
    予め、STIを担持している担体で夾雑物の除去処理をし
    たものである特許請求の範囲第１項記載の方法
JP10320086A 1986-05-07 1986-05-07 一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法 Expired - Fee Related JPH0779692B2 (ja)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10320086A JPH0779692B2 (ja) 1986-05-07 1986-05-07 一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法
ZA873049A ZA873049B (en) 1986-05-07 1987-04-28 Methods for purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator
US07/043,746 US4898825A (en) 1986-05-07 1987-04-29 Methods for purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator
CA000536036A CA1284961C (en) 1986-05-07 1987-04-30 Methods for purification of single-chain and double- chain tissue plasminogen activator
AU72418/87A AU590840B2 (en) 1986-05-07 1987-05-01 Methods for purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator
FI871948A FI96211C (fi) 1986-05-07 1987-05-04 Menetelmä yksisäikeisen kudosplasminogeeniaktivaattorin (tPA) ja kaksisäikeisen tPA:n puhdistamiseksi ja eristämiseksi
NO871883A NO173287C (no) 1986-05-07 1987-05-06 Fremgangsm}te for rensing av enkeltkjedet og dobbeltkjedet vevplasminogenaktivator
DK198702337A DK173151B1 (da) 1986-05-07 1987-05-07 Fremgangsmåde til oprensning af enkeltkædet og dobbeltkædet vævsplasminogenaktivator
EP87304077A EP0245100B1 (en) 1986-05-07 1987-05-07 Purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator
DE8787304077T DE3780506T2 (de) 1986-05-07 1987-05-07 Reinigung des einkettigen und zweikettigen gewebeplasminogenaktivators.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10320086A JPH0779692B2 (ja) 1986-05-07 1986-05-07 一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS62259585A JPS62259585A (ja) 1987-11-11
JPH0779692B2 true JPH0779692B2 (ja) 1995-08-30

Family

ID=14347873

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP10320086A Expired - Fee Related JPH0779692B2 (ja) 1986-05-07 1986-05-07 一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPH0779692B2 (ja)
ZA (1) ZA873049B (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3832898A1 (de) * 1988-09-28 1990-04-12 Boehringer Mannheim Gmbh Praeparat von in prokaryonten exprimiertem plasminogenaktivator
DE3903581A1 (de) * 1989-02-07 1990-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogenaktivator-derivat

Also Published As

Publication number Publication date
ZA873049B (en) 1988-02-24
JPS62259585A (ja) 1987-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wiman et al. The specific interaction between plasminogen and fibrin. A physiological role of the lysine binding site in plasminogen
Wiman et al. Structural Relationship between “Glutamic Acid” and “Lysine” Forms of Human Plasminogen and Their Interaction with the NH2‐Terminal Activation Peptide as Studied by Affinity Chromatography
Wun et al. Isolation and characterization of urokinase from human plasma.
Chibber et al. [48] Plasminogen
Husain et al. Rapid purification of a high-affinity plasminogen activator from human blood plasma by specific adsorption on fibrin/Celite.
JP2001086984A (ja) アフィニティークロマトグラフィーによって血液凝固第ｖｉｉ因子を活性化するプロテアーゼ、そのプロ酵素または両タンパク質の混合物を純粋形態で調製する方法
JP2001095563A (ja) イオン交換クロマトグラフィーによって血液凝固第ｖｉｉ因子を活性化するプロテアーゼ、そのプロ酵素または両タンパク質の混合物を純粋形態で調製する方法
CA1284961C (en) Methods for purification of single-chain and double- chain tissue plasminogen activator
WO1987001389A1 (en) Methods for the recovery of tissue plasminogen activator
AU597908B2 (en) A protein reagent having the ability to bind tissue plasminogen activator in its two chain form and/or its single chain form
CA1164341A (en) Isolation of plasminogen activators useful as therapeutic and diagnostic agents
Johnson et al. Rapid purification of human trypsin and chymotrypsin I
JPH0779692B2 (ja) 一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法
Movat et al. A small molecular weight permeability factor in guinea pig serum: adsorption to antigen-antibody aggregates
US4229540A (en) Hydrolase purified from human plasma
US4978620A (en) Process for separating single-chain TPA and double-chain from each other
JPH0223158B2 (ja)
Reid et al. [11] Preparation of human factor D of the alternative pathway of complement
CA1335186C (en) Method for purifying tissue plasminogen activator
Suzuki et al. [49] Purification of prekallikrein with arginine-agarose
CA1333163C (en) Methods for the recovery of tissue plasminogen activator
Schmitt et al. One-step purification of trypsin and α-chymotrypsin by affinity chromatography on Eupergit—aprotinin, a novel carrier for purification of serine proteases
Oshima et al. Purification of Carboxypeptidase A Using Sepharose 4B-Bound 3-Phenylpropionate
Granier et al. Large Scale Preparation of N-carboxypeptidase (Kininase I) as By-product of Routine Fractionation
JPH0393798A (ja) プラスミノゲン活性化因子阻害剤２（ｐａｉ―２）の精製方法

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Cancellation because of no payment of annual fees