JPH0779717B2 - タンパク質結合酵素相補性検定に関する方法 - Google Patents

タンパク質結合酵素相補性検定に関する方法

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JPH0779717B2
JPH0779717B2 JP60505040A JP50504085A JPH0779717B2 JP H0779717 B2 JPH0779717 B2 JP H0779717B2 JP 60505040 A JP60505040 A JP 60505040A JP 50504085 A JP50504085 A JP 50504085A JP H0779717 B2 JPH0779717 B2 JP H0779717B2
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Description

【発明の詳細な説明】 1.発明の分野 本発明は、酵素相補正検定による被検体の定性的および
定量的分析に関する改良された方法および新規な組成物
に関するものである。より詳しくは、本発明は、組換え
DNA技術および化学的ポリペプチド合成技術の双方によ
り誘導された変容酵素、およびこのような酵素の均質系
［homogeneous］および不均質系［heterogeneous］のエ
ンザイム イムノアッセイ（酵素免疫検定法）における
使用方法に関するものである。また組換えDNA誘導およ
び化学合成酵素およびこのような酵素の均質系および不
均質系の受容体−配位子（レセプター−リガンド）相補
正検定における使用方法をも含むものである。
2.発明の背景 2.1.免疫検定系 先行技術は、ヤーロウとベーソン［Yalow and Berson］
（1960年，ジェイ．クリン．インベスト.,39:1157［J.C
lin.39:1157］）によるラジオイムノアッセイ（RIA）の
開拓的発展に端を発する多くの免疫検定法（イムノアッ
セイ）を教示する。RIAは、特異的抗体の定められた量
に関して放射性標識された検体の定められた量を標識さ
れていない検体の未知量と競合させることによって特徴
づけられる。抗体に結合したあるいは溶液中に遊離して
いる放射性検体の量が適当なカウンターにおいて定量さ
れそして非放射性検体の濃度が決定される。この一般的
機構における改良は、（１）放射性追跡子の酵素あるい
は螢光追跡子との置換、（２）多クローン性（ポリクロ
ーナル）動物抗体の単クローン性（モノクローナル）抗
体との置換、（３）分光光度計、螢光測光計、螢光偏光
計および粒子数測定器を含む信号検知の改良された方
法、ならびに（４）結合した追跡子の遊離追跡子からの
物理的分離を必要としない均質系の検定法の導入を含む
ものである。結合した追跡子の遊離追跡子からの分離
は、プラスチック、紙、ガラスあるいはアクリルアミド
などのような固形支持体をしばしば必要とするものであ
る。慣例上抗体は、固相に結合され、一方追跡子と未知
物は溶液中に遊離している。結合／遊離分離は、固相の
１ないしそれ以上の洗浄によって達成される。残留する
結合した活性が次に計測される。このような検定法は、
総じて不均質系の免疫検定法として公知である。これに
対して、均質系の検定法は、不正確でかつ時間浪費の分
離段階の必要性を除去するものである。
免疫検定法の商業化は、使用におけるラジオイムノアッ
セイから、酵素結合免疫吸着剤検定法（ELISA）へ、均
質系の検定法への変遷を見るものであった。この変遷
は、スピード、単純性、オートメーションおよび放射能
の不在という商業的要求によるものである。均質系の検
定法群はいくつかのタイプ、すなわち（１）比濁分析、
（２）粒子数測定、（３）螢光消光、（４）螢光偏光お
よび（５）酵素検定法からなるものである。
免疫反応を定量するために光分散を測定する最初の比濁
計は、1960年代後半に考案された。これらの初期の比濁
計は、新しい化学をもって10年後に改良され、分散角を
計測するためのより低い角度および反応物を混合した後
の最初の数秒間の間の抗原−抗体反応速度を計測する能
力を有するものとなった（ライチェ，アルパーおよびグ
レーブス,1969年，アルスリティス リューム．12:693;
ディートンら,1976年，クリン．ケム．221465［Ritchi
e,Alper and Graves,1969,Arthritis Rheum.12:693;Dea
tonet al.,1976,Clin.chem.22:1465］）。これらの検定
法は極めて感受性に貧しくそして例えば血清IgE,IgAお
よびIgMレベルのような、10-8Ｍよりも大きい濃度の検
体の測定に適用できるものである。均質系の粒子数測定
検定法においては、直径0.8μｍのポリスチレン粒子
（ラテックス粒子）が抗体により被覆される。抗原濃度
は、非凝集粒子に対して凝集粒子を識別し得る装置によ
って測定されるような凝集したラテックス粒子の濃度に
より決定され得る（カンビアソら,1977年，ジェイ．イ
ムノル．メソ.18:33［Cambiaso et al.,1977,J.Immuno
l.Meth.18:33］）均質系の螢光消光検定法は、抗原か抗
体のいずれかを螢光体で標識する。検体−抗体−螢光体
複合体は、抗原−螢光体あるいは抗体−螢光体のみのも
のと比較して著しくより低い螢光を発する（ウルマン
ら,1979年，ジェイ．バイオル．ケム.251:4172［Ullman
et al.,1979,J.Biol.Chem.251:4172］，米国特許第3,9
98,943号；同第3,996,345号；同第4,174,384号；同第4,
161,515号；同第4,208,479号および同第4,160,016
号）。これらのすべての検定法は、消光の量が試料中の
未知の検体あるいは抗体の量に関連するような螢光を消
光する種々の方法を含むものである。これらの検定法は
低い感受性のものである（10-10Ｍよりも大きな流体濃
度での検体）。この低い感受性は、内因性血清螢光およ
び静的な非酵素的拡大様式における螢光の使用によるも
のである。螢光偏光検定法は、抗原−螢光体に対して結
合する抗体によって顕著に低減される溶液における抗体
−螢光体の自由回転に基づくものであり、そして低分子
量（分子量1000ダルトン以下）検体で重要な商業的成功
を見いだしている。
種々の免疫検定法はそれぞれ商業的利点および欠点を有
している。RIAは感受性があり設定が容易であるが、放
射能、分離段階および高価な器械使用を必要とする。酵
素あるいは蛍光体を用いての不均質系の検定法は、放射
能およびいくつかの器械使用をなくすものであるが、分
離段階を必要とする。商業的見地からは、いくつかの理
由のために分離段階をなくすことが望ましい。分離は、
（１）徹底的な仕事であり、（２）時間浪費であり、
（３）付加的な装備を必要とし、（４）結果における変
化性を増加し、そして（５）高いレベルのオートメーシ
ョンを妨げるものである。均質系の免疫検定法の多くの
商業的利点にもかかわらず、わずかに３つ、すなわちル
ーベンステインら［Rubensteinet al］、米国特許第3,8
17,837号の酵素標識系、バードら,1977年，クリン．ケ
ム．23:1402［Burd et al.,1977,Clin.Chem.23:1402］
の基質標識系、および螢光偏光（ダンドリカーら,1973
年，イムノケミストリー［Dandliker etal.,1973,Immun
ochemistry］）が商業的成功を見い出しているにすぎな
い。しかもなお、これらの３つの検定系は、小さな分子
量（1000以下）の検体に限定されそして検体は10-10Ｍ
よりも大きな濃度において見出される。
2.2.酵素免疫検定系 酵素免疫検定法は、非常に好首尾なタイプの均質系の免
疫検定法である。均質系の酵素免疫検定法のいくつかの
別形態が、商業的成功を見出しており、（１）酵素標識
検体系と（２）基質標識検体系である。酵素標識検体系
においては、標識の酵素活性は、特異的抗体が検体−酵
素複合体を結合した場合に減少される。計測されるべき
検体は、定められた量の検体に関して定められた量の特
異的抗体と競合する。酵素活性は、未知の検体濃度に正
比例する。以下の特許はこの免疫検定系に基づいて発行
された：米国特許第3,817,837号；同第3,852,157号；同
第3,875,011号；同第3,966,556号；同第3,905,871号；
同第4,065,354号；同第4,043,872号；同第4,040,907
号；同第4,039,385号；同第4,046,636号；同第4,067,77
4号；同第4,191,613号および同第4,171,244号。この技
術の商業化は、低分子量検体および低感受性に限定され
ている（10-10Ｍより大きな濃度での分子量1000ダルト
ンより小さな検体）。
基質標識螢光免疫検定法は、酵素に関して検体の螢光発
生基質への共有結合を含むものである。この検体−基質
結合体は、螢光性ではない。抗体の不在下においては、
検体−螢光発生性基質は酵素により加水分解され螢光性
分子種をもたらす。特異的抗体の存在下においては、酵
素による基質への接近は縮小され、低減された螢光をも
たらす（バードら,1977年，クリン．ケム．23:1402;バ
ードら，アナル．バイオケム．77:56;ならびにコーエ
ン，ホランダーおよびボグノラスキー,1979年，ジェ
イ．ステロイドバイオケム．11:161［Burd et al.,197
7,Clin.Chem.23:1402;Burd et al.,Aual.Biochem.77:5
6;and Kohen,Hollander and Bognolaski,1979,J.Steroi
d Biochem.11:161I）。この検定系の商業化は、立体的
考慮に帰因して低分子量検体に限定され、そして上記螢
光消光検定法に関するものと同一の考慮に帰因して10
-10Ｍより大きな流体における濃度での検体に限定され
るものであった。
限定された商業化に対抗した数多くの均質系の酵素免疫
検定法が述べられてきている。
米国特許第4,134,792号は、標識として酵素阻害剤ある
いはアロステリックエフェクターなどのような酵素モン
ジュレーターを利用する免疫検定技術を述べている。特
異的抗体が酵素モジュレーター標識検体に結合した場
合、酵素モジュレーターはもはや酵素の活性を阻止する
ことができない。これゆえ遊離検体による酵素モジュレ
ーター標識検体の競合は、酵素モジュレーターの阻止を
回復させる。この分野におけるその他の特許には、米国
特許第3,935,074号；同第4,130,462号；同第4,160,645
号および同第4,193,983号が含まれる。
米国特許第4,213,893号および同第4,318,983号は、補因
子−アポ酵素系を用いる酵素免疫検定法を述べている。
特に、ホーンバイら［Hornby et al.］に対して発行さ
れた米国特許第4,318,983号（1982年３月９日）は、フ
ラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）標識された結合
体とFADが補欠分子族として作用するアポ酵素を用いる
方法を述べている。コリコら［Corrico et al.］に対し
て発行された米国特許第4,213,893号（1980年７月22
日）は、ホーンバイらの方法において使用するのに適し
た、例えばFAD標識チロキシンなどのような特定のFAD標
識結合体を述べている。FAD標識結合体は、このような
結合体の触媒活性のためにFADを必要とするアポ酵素と
のインキュベーションにより発生するホロ酵素活性を計
測することにより監視される。検体は、標識された補因
子が脱水素酵素とのそれの反応性を維持するように、FA
Dに共有結合される。脱水素酵素活性によって形成され
る還元FADの量は、検体に関して特異的な抗体の存在下
において減少される。還元FADの螢光定量的に監視され
た出現は、検体の量に正比例するものである（コーエン
ら,1978年，ホルモンと薬剤に関する酵素標識免疫検定
法，エス．ビー．パル編，ウォルター デギター，ベル
リン アンドニューヨーク，第67〜79頁中［Kohen et a
l.,1978,in Enzyme−labeled Immunoassay for Hormone
s and Drugs,S.B.Pal,ed.,Walter deGuiter,Berlin and
New York,pp.67−79］）。乳酸脱水素酵素およびジア
ホラーゼを用いるビオチンおよび2,4−ジニトロフルオ
ロベンゼン検体に関する同様の系が述べられている（キ
ャリコら,1976年，アナル．バイオケム．72:271［Carri
co et al.,1976,Anal.Biochem.72:271］）。いずれの系
も、分析される血清試料中に一般に存在する内因性の補
因子および酵素からの干渉になやまされるものである。
いくつかの酵素がペプチドフラグメントから再形成され
ることが、観察されてきているが、例えばリボヌクレア
ーゼＡ（リチャードとビサヤシル,1959年，ジェイ．バ
イオル．ケム．249:1459［Richards and Vithayathil,1
959,J.Biol.Chem.249:1459］）ブドウ球菌性ヌクレアー
ゼ（ライトら,1974年，ジェイ．バイオル．ケム．249:2
285［Light el al.,1974,J.Biol.Chem.249:2285］）お
よびβ−ガラクトシダーゼ（タングレイとズィアビン,1
976年，バイオケミストリー 15:4866［Langley and Za
bin,1976,Biochemistry 15:4866］）を含むほんのわず
かのものしか酵素活性を回復していない。ウシ膵臓性リ
ボヌクレアーゼのズブチリシンによるタンパク質分解
は、２つの成分、すなわちペプチド（Ｓ−ペプチド）と
タンパク質（Ｓ−タンパク質）を産する。Ｓ−ペプチド
とＳ−タンパク質のいずれも単独では、評価し得るリボ
ヌクレアーゼ活性を示さない。これらの成分が、等モル
において混合された場合、ほとんど完全な酵素活性が回
復される。Ｓ−ペプチドとＳ−タンパク質はKeq＝５×1
0-9Ｍを有して非常に迅速にかつ強力に再結合する（リ
チャードとビサヤシル,1959年，上記）。ブドウ球菌性
ヌレアーゼは不活性なペプチドフラグメントからの生物
学的に活性な酵素の再構成を示す。完全な149アミノ酸
ブドウ球菌性ヌクレアーゼ構造のアミノ酸６〜48番を含
むヌクレアーゼ−Ｔ−（６〜48）［Nuclease−Ｔ−（６
−48）］は、ヌクレアーゼ−Ｔ−（50〜149）［Nucleas
e−Ｔ−（50−149）］と、活性なヌクレアーゼ−T1を形
成するために、温度変化性のほとんどない0.03〜0.05/s
の一次速度定数をもって再結合する（ライト，上記）。
より詳細に下記で述べるように（第2.3節）、エシャリ
キア・コリ［E. Coliの欠失突然変異体からのポリペプ
チドフラグメント（例えばM15）は、熱的処理あるいは
臭化シアン処理されたβ−ガラクトシダーゼ酵素から誘
導された小さなペプチドフラグメントと組合された場合
に酵素活性を回復するものであることが知られている。
一方の臭化シアンで生成したフラグメントはCNBr2と呼
ばれ、他方はCNBr24と呼ばれる。
より最近になって、このようなポリペプチドフラグメン
トの再結合に基づく免疫検定法が、ファリナとゴルケ
［Farina and Golke］（1983年３月29日発行の米国特許
第4,378,428号）によって、またゴネリら［Gonelli et
al.］（1981年，バイオケム．アンド バイオフィズ．
レス．コミュン．102:917〜923［1981,Biochem.and Bio
phys.Res.Commun,102:917−923］）によって述べられ
た。これらの中に開示されたすべての実験的な例は、リ
ボヌクレアーゼ触媒活性を発生するためのＳ−ペプチド
/S−タンパク質の再結合に基ずくものであった。１つの
検体がリボムヌクレアーゼの小さなズブチリシン開裂ペ
プチド、すなわちＳ−ペプチド（アミノ酸１−20）に共
有結合的に付着された。これは１つの検体と共役され、
そして活性なリボヌクレアーゼを再形成するためにＳ−
タンパク質（アミノ酸21−124）と組合される。この検
体に特異的な抗体はリボヌクレアーゼ活性の再形成を阻
止する。この検定法はすべてのオートクレープ滅菌され
ていない生物学的溶液における内因性リボヌクレアーゼ
活性の存在により限定されるものである。
この系によって決して応対されないその他の同様な深刻
な欠点は、連結されるポリペプチドの平衡定数を調製す
ることの不可能性、および高分子量タンパク質に結合し
得る一方、活性な酵素を再形成をも行ない得る免疫反応
性のポリペプチドを作製することの不可能性を含むもの
である。利用されるすべてのポリペプチドは活性なリボ
ヌクレアーゼを形成するために再結合し得る新規でない
触媒的に不活性なポリペプチドであった。
CNBr2あるいはM15に１つの検体を付着させるためのファ
リナとゴルケ［Earina and Golke］（米国特許第4,378,
428号）によって提唱された化学的作用でのより顕著な
欠点が発見されている。試験されたすべての場合におい
て、ポリペプチド類のいずれか上の有効なNH2、COOHお
よびSH基を介しての検体の付着は、相補し得ないペプチ
ドを生じた。多くのアミノ、カルボン酸およびフルフヒ
ドリル官能性を有するM15をカップリングすることは、
すべての場合において（慎重に制御された条件ですら）
M15を不活性とした。動力学は、活性を不活性にするの
に十分である単一ヒットを示す。CNBr2は内部のリシン
を含んでおらず、１つの非反復の［unique］スルフヒド
リル基および数個のカルボン酸基を含んでいる。ラング
レー［Langley］との一致（“β−ガラクトシダーゼα
−相補正の分子状態”と題された工業博士論文，ユーシ
ーエルエイ,1975年［Ph.D.thesis entitled“The Molec
ular Nature of β−garactosidase α−complementati
on“,UCLA,1975］）において、Ｎ＝末端α−アミノ基へ
のカップリングはCNBr2の相補性活性を不活性とする。C
NBr2の調製（ラングレー，フォウラーおよびゼビン,197
5年，ジェイ．バイオル．ケム．250:2587［Langley,Fow
ler and Zabin,1975,j.Biol.Chem.250:2587］）におい
て、第76位のスルフヒドリルは、臭化シアン開裂に先だ
ち、還元されそしてヨード酢酸でアルキル化された。こ
のスルフヒドリルがアルキル化されないとすると、CNBr
2活性は精製の段階の初期には維持され得るが、均質性
へと精製する前に失われる。また、このスルフヒドリル
が、ヨード酢酸の代わりに検体のマレイミド誘導体でア
ルキル化されるとすると、結合体の不溶性が精製をさま
たげる。最後に、試験されたすべての場合において、CN
Br2のCOOH部分へのカップリングは、相補性活性を不活
性とした。それゆえ、適当な免疫反応性で相補する試薬
を調製するためにCNBr2およびM15を使用することは困難
なことであると思われる。
2.3.相補性とβ−ガラクトシダーゼ 酢酸β−ガラクトシダーゼは、酵素結合免疫吸着剤検定
法（ELISA）（エングバールとペールマン,1971年，イム
ノケミストリー8:871［Engvall and Perlmann,1971,Imm
unochemistry8:871］）および均質系の基質標識検定法
（バードら,1977年，クリン．ケム．23:1402［Burd et
al.,1977,Clin.Chem.23:1402］）において広範な使用を
見出されている。加え、β−ガラクトシダーゼは、DNA
クローニングおよびDNA配列に関する普及した遺伝子の
基礎を形成する（メッシング,1983年，メソッヅ イン
エンザイモロジイ 101:20［Messing,1983,Method in
Enzymology101:20］）。
β−ガラクトシダーゼは、54,000ドルトンに等しい分子
量（MW）を有する四量体タンパク質である。４つの同一
のモノマーは1021アミノ酸からなり、それぞれ116,000
ドルトンのMWを有する。第１図に示すような単量体タン
パク質は、３つの領域、すなわち（１）Ｎ−末端近位セ
グメント（α−領域）、（２）中間領域、および（３）
Ｃ−末端遠位セグメント（ω−領域）に分けられる。
β−ガラクトシダーゼから誘導された変異体ポリペプチ
ドは、適当なβ−ガラクトシダーゼネガティブ変異体の
抽出物に添加された場合、相補し得るあるいは酵素活性
を自発的に回復し得るものとして知られている。この現
象は、シストロン内相補［intracistronic complementa
tion］とて知られる。α−相補性の一例は、M15/CNBr2
相補系によって提供される。M15変異体ポリペプチドは
β−ガラクトシダーゼのアミノ酸11〜41番を欠いてお
り、そして溶液中において酵素的に不活性な二重体とし
て存在する。臭化シアン（CNBr）開裂によりβ−ガラク
トシダーゼから誘導されたポリペプチドは、アミノ酸３
〜92番から成るものである。CNBr2は、二量体M15と混合
された場合、完全な酵素活性を有するβ−ガラクトシダ
ーゼ四量体の自発的再構成をプロモートする（ラングレ
ーとゼアビン,1976年，バイオケミストリー15:4866［La
ngley and Zabin,1976,Biochemistry 15:4866］）。M15
ペプチドはα−アクセプター（α−受容体）として知ら
れており、またCNBr2は、α−ドナー（α−供与体）と
して知られている。このことは、十分に研究された相補
系を表わしている一方、CNBr2はβ−ガラクトシダーゼ
中のアミノ酸23〜31番の欠失変異体であるM112二量体に
関するα−ドナーとして与えられ得る（リン，ビラレジ
ョおよびゼアビン,1970年，バイオケム，バイオフィ
ズ．レス．コモン．40:249;セレダとゼアビン,1979年，
バイオケム．18:404;ウェルフィー，フォウラーとゼア
ビン,1981年，ジェイ．バイオル．ケム．256:6804;ラン
グレーら,1975年，プロク．ナトル．アカド．サイ．ユ
ーエスエイ 72:1254［Lin,Villarejo and Zabin 1970,
Biochem.Biophys.Res.Commen.40:249;Celeda,and Zabi
n,1979,Biochem.18:404;Welphy,Fowler and Zabin,198
1,J.Biol.Chem.256:6804;Langley et al.,1975,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 72:1254］）。その他のα−ドナー群
は、β−ガラクトシダーゼをオートクレーブ減菌するこ
とにより誘導されたポリペプチドを含むものである。こ
のペプチドは、しかしながら、今だ精製されておらずま
た配列も知られていない。M15およびM112以外のα−ア
クセプターは述べられていない。CNBr2によるM15の相補
の例において、アミノ酸配列３〜10番および42〜96番は
双方とも酵素的に活性な複合体において二重に存在す
る。
シストロン内相補はまた、β−ガラクトシダーゼのＣ−
末端（ω−領域）で起こる。入手できる最もよく知られ
た配列データは、少なくとも10個のアミノ酸、すなわち
1011〜1021番を欠失したX90ω−アクセプターペプチド
に関するものである。X90ペプチドは単量体として存在
し、そして酵素的に活性な四量体を再形成するために、
アミノ酸990〜1021番から成るβ−ガラクトシダーゼの
臭化シアン消化産物であるCNBr24によって相補され得る
ものである（ウェルフィーら,1980年，バイオケム．バ
イオフィズ．レス．コモン．93:223［Welphyet al.,198
0,Biochem.Biophys.Res.Common.93:223I）。
2.4.B型肝炎表面抗原 Ｂ型肝炎ウィルス（HBV）からのDNAはクローニングされ
ており、そしてプラスミドあるいはλ類縁ファージ（ラ
ムドイドファージ）ベクターに結合された後にフラグメ
ントの連続物としておよび完全な鎖状分子としてエシェ
リキア・コリ中において増殖されている（バーレルら,1
979年，ネイチャー（ロンドン）279;43〜47;チャルネイ
ら,1979年，プロク．ナトル．アカド．サイ．ユーエス
エイ76:2222〜2226;シニンスキーら,1979年，ネイチャ
ー（ロンドン）279:346〜468［Burrell et al.,1979,Na
ture（London）279:43−47;Charnay et al.,1979,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA76:2222;2226;Sninskey et al.,197
9,Nature（London）279:346−468］）。続いて、HBVの
表面抗原（HBV−SAg）がクローニングされ、そしてエシ
ェリキア・コリにおいて（マッケイら.1981年，プロ
ク．ナトル．アカド．サイ．ユーエスエイ 78:4510〜4
514［Mckayet al.,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:45
10−4514］）、酵母において、（バレンゼーラら,1982
年，ネイチャー298:347［Valenzuela et al.,1082,Natu
re 298:347］）、および哺乳動物細胞において（デュボ
イスら,1980年，プロク．ナトル．アカド．サイ．ユー
エスエイ 77:4549〜4553［Dubois et al.,1980,Proc.N
atl.Acsd.Sci.USA 774549−4553］）発現されている。
3.発明の概要 本発明は、高い（10-15Ｍ）感受性において、高分子量
および低分子量（分子量150〜30,000ドルトン）の双方
の検体の定量的分析のための酵素相補性検定に関する改
良された方法および新規な組成物を提供するものであ
る。この検定法はオートメーション化し得るものであ
る。
本発明によると、ポリペプチドは、組換えDNA技術によ
ってあるいは化学的ポリペプチド合成技術によって製造
される。［本明細書中で用いられる場合、“ポリペプチ
ド”なる用語は、ペプチドとタンパク質を含めたもので
ある。］ポリペプチドそれら自体は、酵素的に不活性で
あるが、水性媒体中でいっしょに反応した場合、これら
は、相補性として知られる現象を介して触媒的に活性な
酵素を形成するために結合する。β−ガラクトシダーゼ
は、これが分光測光法および螢光定量法を用いて検知で
きる数個の基質を有しており、従来の商業的免疫検定法
において有用性が示されており、かなり低濃度において
計測可能であり、そして遺伝学的に十分特徴ずけられて
いるゆえに、好まれる酵素である。有意でないバックグ
ラウンドから酵素活性を生成することによって、高い信
号対ノイズ比が達成される。本発明の改良された検定法
において用いられる新規なポリペプチドは、（ａ）検体
がポリペプチドに融合されるものである融合タンパク
質、検体およびポリペプチドに関してコードする配列を
含む組換え遺伝子の産物；（ｂ）検体との最適なカップ
リングのために遺伝子工学されたポリペプチド；（ｃ）
検体との最適なカップリングのために化学合成されたポ
リペプチド；および（ｄ）酸化、熱、pH、酵素分解など
のような環境因子に対する改良された安定性のために遺
伝子工学されたあるいは化学合成されたポリペプチドを
包含するものである。
これゆえ、方法は、（１）相補可能であり、（２）再結
合の平衡定数について組織的に調整され得るものであ
り、（３）特異的結合タンパク質と相互作用し得るもの
であり、そして（４）特異的結合タンパク質との相互作
用によって、β−ガラクトシダーゼの活性特性を有する
活性な酵素の形成を制御し得るものである適当なポリペ
プチドを提供するための組換えDNA技術あるいは化学的
ポリペプチド合成技術に基づいた免疫検定法を生み出す
ことに関して述べられる。
本発明の遺伝子工学されたおよび化学合成されたポリペ
プチドは、その他の相補する酵素系以上に独特な利点を
提供する。組換えDNA技術によって製造されるポリペプ
チドは、低いコストで大量に生成されることができ、均
質性のものに容易に精製でき、そして任意の大きさおよ
び配列で生成され得るものである。化学合成されるポリ
ペプチド、特にアミノ酸長さにおいて比較的小さなもの
であるポリペプチドは、高い収率において、制限のない
配列変化において生成され得る。いずれの調製技術も、
改良されたカップリング化学特性、酵素反応動力学、酵
素的検定感受性および／または安定性のポリペプチドを
導く、アミノ酸配列の巧妙な操作を提供するものであ
る。
本発明はまた、本発明の方法に従う方法を実行するため
のキットを包含するものである。
4.図面の簡単な説明 本発明は、以下の本発明の詳細な記述、本発明の特定の
実施態様の実施例への、および次のごとき添付図面への
言及によってより十分に理解され得るものであろう。
第１図は、β−ガラクトシダーゼポリペプチドを、自然
界に知られる欠失変異体M15、M112およびX90と共に図解
的に表わすものである。また選択臭化シアン（CNBr）開
裂ペプチドCNBr2、CNBr2/3−41およびCNBr24が表わされ
る。
第２図（ＡおよびＢ）（一定の比率に拡大して描かれた
ものではない。）はドメインにカップリングする検体を
含む種々の組換えプラスミドの構成を表わすものであ
る。
第３図は、α−ドナードメインおよびＢ型肝炎ウィルス
表面抗原（HBV−SAg）あるいはＢ型肝炎ウィルスコア抗
原からなるタンパク質ドメインで構成されるＮ−末端お
よびＣ−末端融合タンパク質を図解的に示すものであ
る。
第４図（Ａ−Ｃ）は、詳細な説明の第6.1節において述
べるようにして調製される典型的な新規のポリペプチド
酵素−ドナーのDNAおよびアミノ酸配列を表すものであ
る。第４図において、＊は、検体へカップリングするの
に有用な反応基を有するアミノ酸を示すものである。
第５図（ＡおよびＢ）は、天然のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子DNAおよびアミノ酸配列と共に、β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子のα−領域中に導入される欠失を表わす新
規なポリペプチド酵素−アクセプターを表わすものであ
る。比較のために、公知の欠失変異体M15およびM112も
示される。
第６図は、検体−結合タンパク質がアビジンであるビオ
チンのための均質系の検定法に関する競合的結合線をグ
ラフ的に表わすものである。
第７図は、検体−結合タンパク質がアビジンであるビオ
チンのための検定法に関する競合的結合曲線（投与量応
答曲線）をグラフ的に表わすものである。
第８図は、検体−結合タンパク質がアガロース固定化ア
ビジンである酵素−ドナーCNBr2と酵素−アクセプタ−E
A23の相補の阻止を例示する競合的結合曲線をグラフ的
に表わすものである。
第９図（ＡおよびＢ）は、ジゴキシンに対する酵素免疫
検定法における酵素−アクセプターEA23および酵素−ド
ナージゴキシン結合体の濃度の種々の組合せの効果をグ
ラフ的に表わすものである。第9A図は、５×10-8Ｍに固
定されたEA23および1:20と1:30の希釈の酵素−ドナー結
合体で得られた投与量応答曲線を表わすものである。第
9B図は、１×10-7Ｍに固定されたEA23および1:20と1:30
希釈の酵素−ドナー結合体で得られた投与量応答曲線を
表わすものである。
第10図は、第二抗体、ヤギ抗ウサギ抗体が、相補プロセ
スにおいて酵素−ドナー結合体との抗体相互作用の阻止
効果を高めるために用いられるジゴキシンのための免疫
検定法に関する投与量応答曲線を表わすものである。
第11図（一定の比率に拡大して描かれたものではない）
は、種々の遺伝子領域および制限酵素開裂部位を示す。
プラスミドp169の図解的表示である。
第12図は、ED1およびED3に関しコードする遺伝子の部位
のヌクレオチド配列を表わすものである。関連アミノ酸
配列および制限酵素開裂部位が示される。ED3N−末端フ
ラグメントのCys（システイン）残基における星印は検
体カップリング残基を示すものである。
第13図（一定の比率に拡大して描かれたものではない）
は、種々の遺伝子領域および制限酵素開裂部位を示す、
p180シリーズのプラスミドの図解的表示である。
第14図は、ED3およびED4のアミノ酸配列を表わすもので
ある。Cys残基上の星印は、検体カップリング残基を示
すものである。
第15図は、ED酵素ドナーシリーズのアミノ酸配列を表わ
すものであり、第15A図、第15B図、第15C図、第15D図、
第15E図、第15F図、第15G図、第15H図および第15I図は
それぞれ、ED3、ED4、ED5、ED7、ED8、ED13、ED14、ED1
5およびED17のアミノ酸配列を表わすものである。いく
つかの残基上の星印は、検体カップリング残基を示すも
のである。
第16図（一定の比率に拡大して描かれたものではない）
は、種々の遺伝子領域および制限酵素開裂部位を示す、
p190シリーズのプラスミドの図解的表示である。
第17図はジゴキシン酵素免疫検定法におけるジゴキシン
−ED3Aを用いるジゴキシンに関する滴定曲線をグラフ的
に表わすものである。
第18図は、ED4−T4、EA22および第二抗体を用いるチロ
キシン（T4）検定からの標準曲線をグラフ的に表わすも
のである。
第19図は、ED5−ジゴキシン、EA22および第二抗体を用
いるジゴキシン検定からの標準曲線をグラフ的に表わす
ものである。
第20図（一定の比率に拡大して描かれたものではない）
は、種々の遺伝子領域および制限酵素開裂部位を示す、
プラスミドp166、p175、p177の図解的表示である。
第21図は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのための均質系の
検定法に関する投与量応答曲線を表わすものである。
5.発明の詳細な説明 本発明は、水性媒体中でいっしょにインキュベートされ
た場合に相補のプロセスによって活性なβ−ガラクトシ
ダーゼ酵素複合体を形成するものであり組換えDNA技術
あるいは化学的ポリペプチド合成技術を用いて調製され
る酵素的に不活性なポリペプチドを用いる、種々の検体
に対する改良された検定法からなるものである。本発明
の方法によると、組換えDNA技術は、相補に必要とされ
る一方のあるいは双方を調製するために用いられ得る。
この２つのペプチドは、（１）酵素アクセプター［enzy
me−acceptor］および（２）酵素ドナー［enzyme−dono
r］と呼ばれる。DNA合成技術は、種々の長さのポリペプ
チドに関してコードする遺伝子配列の調製に適用され得
る。酵素ドナーおよび酵素アクセプターは、それらの技
術によって調製される。化学的ポリペプチド合成技術
は、アミノ酸長さが比較的短いポリペプチドの調製に通
常適用される。この理由ゆえ、化学的技術は、β−ガラ
クトシダーゼ系の酵素ドナーの合成に最も適したもので
あり、これはこの系の酵素ドナーは、酵素アクセプター
に比較してアミノ酸配列において主として短いものであ
るからである。もちろん、これは、ペプチド合成技術に
よって、機能的な酵素−アクセプターが調製できないと
いうことではない。
本明細書において定義されるように、酵素アクセプター
は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の欠失変異体によって
生成された酵素的に不活性なポリペプチドであって、酵
素ドナーと組合された場合に相補のプロセスによって活
性なβ−ガラクトシダーゼを形成し得るものである。本
明細書において構成されたすべての酵素アクセプター
は、β−ガラクトシダーゼのＮ−末端をコード化するβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−領域においての欠失で
ある。これらの酵素アクセプターのいくつかは、より高
い安定性を与えるために、曝れたシステイン残基の除去
を介してさらに操作されている。
本明細書において定義されるように、酵素ドナーは、２
つのドメイン、すなわち（ａ）活性な酵素を形成するた
めに酵素アクセプターと組合せられ得るタンパク質配列
を含むα−ドナードメインと（２）検体結合タンパク質
［analyte−binding−protein］と相互作用し得る検体
ドメインから成る酵素的に不活性なポリペプチドであ
る。検体ドメインは、検体カップリングドメインあるい
は（２）タンパク質ドメインのいずれかである。
本明細書において定義されるように、検体カップリング
ドメインは、検体の共有結合のために都合のよい部位を
提供するためにポリペプチド中に挿入あるいは置換され
たアミノ酸で構成される。この化学的なカップリング部
位は、最も頻繁には、シスチンあるいはリシン残基に関
連するスルフヒドリルあるいはアミノ基であるが、
（ａ）相補のプロセスあるいは（ｂ）検体の検体結合タ
ンパク質との相互作用と干渉することなく検体に結合し
て得る任意のアミノ酸の任意の適当な化学的反応基であ
り得る。化学的反応基の位置は、検定法の立体障害要求
に合致するように変えられ得る。
本明細書において定義されるように、タンパク質ドメイ
ンは、タンパク質抗原あるいは抗原の免疫反応基（エピ
トープ）からなるものである。例えば、腫瘍性、細菌
性、真菌性、ウィルス性、寄生体性、マイコプラズマ
性、組織適合性、分化およびその他の細胞膜抗原類、病
原体表面抗原、毒素類、アレルゲン類、薬剤類ならび
に、ゴナドトロピンホルモン、卵胞成熟ホルモン、甲状
腺刺激ホルモン、フェリチンもしくは検体と同様のある
いは全く同一の任意のその他の抗原性分子を含む（もち
ろんこれらに限定されるわけではない。）任意の生物学
的に活性な分子などのような抗原が、可能なものであ
る。本明細書において定義されるように、検体ドメイン
がタンパク質ドメインである酵素ドナーはまた“融合タ
ンパク質”と呼ばれる。遺伝子工学によって構成された
すべての酵素ドナーが、α−ドナードメインと検体ドメ
インを有する融合タンパク質をコード化する遺伝子融合
を表わすものであるが、本明細書において定義されるよ
うな“融合タンパク質”なる用語は、α−ドナードメイ
ンとタンパク質抗原の免疫反応性エピトープを特異化す
るタンパク質ドメインとから構成されるもののみに適用
できるものである。［もちろん、タンパク質ドメインに
関して、ある抗体以外のある検体結合タンパク質と相互
作用し得る非免疫反応性タンパク質あるいはそのフラグ
メントから成ることは可能である。］融合タンパク質の
タンパク質ドメインは、検体ドメインが検体カップリン
グドメインであるものにおいては必要であるような、検
体ドメインへ検体を共有結合する必要性を除去するもの
である。これは、融合タンパク質のタンパク質ドメイン
部分が、本質的に、検体結合タンパク質に関して遊離検
体と競合し得る検体（あるいは、少なくともその近類似
体）であるゆえである。
試料あるいは媒体中に含まれる検体に対する任意の酵素
検定法におけるように、検定混合物中に試薬として含ま
れる検体結合タンパク質は、遊離検体および、酵素ドナ
ーの検体ドメインにカップリングしたあるいは検体ドメ
インの一部として融合した検体の双方と、競合的に相互
作用するあるいは組合せするものでなければならない。
酵素ドナーにカップリングしたあるいは酵素ドナー中に
融合した検体（以下“酵素ドナー結合体［enzyme−dono
r conjugate］”と呼ぶ）との検体結合タンパク質の相
互作用は、酵素ドナーと酵素アクセプターとの相補のプ
ロセスを阻止するものでなければならない。本明細書に
おいて定義されるように、検体結合タンパク質は、従来
の（多クローン性）および単クローン性抗体（およびそ
のフラグメント）を含む特異的抗体分子、レセプター、
輸送タンパク質、レクチン、ならびにアビジン、チロキ
シン結合グロブリンなどを含む（もちろんこれらに限定
されるわけではない。）その他の結合タンパク質を含む
ものである。本明細書において定義されるように、検体
結合タンパク質なる用語は、糖タンパク質、リポタンパ
ク質などのようなタンパク質様物質を包含するものであ
る。
本発明の改良された酵素検定法は、競合的結合機構に基
づくものである。本発明によると、カップリングされた
または融合された関心の検体（あるいは同一検体誘導
体）からなるβ−ガラクトシダーゼ系の酵素ドナー（す
なわち酵素ドナー結合体）の既知量が、特異的検体結合
タンパク質の既知量および酵素ドナーと相補し得る酵素
アクセプターの既知量と組合せられる。特異的検体結合
タンパク質の既知量に対する酵素ドナー結合体の検体ド
メインの既知量と試料中の遊離未知検体との競合は、酵
素ドナー結合体をそれが酵素アクセプターに結合するよ
うに自由とする。酵素ドナー結合体と酵素アクセプター
との会合［association］は、触媒的に活性な酵素複合
体の形成をもたらし、これゆえ、試料中に検知できるβ
−ガラクトシダーゼ酵素活性が監視される。結果的に、
試料中の遊離検体の量は、計測可能な酵素活性の正比例
関数として決定される。酵素活性は、酵素触媒反応によ
る基質転化の速度を、分光測光法および螢光定量法など
を含む（もちろんこれらに限定されるわけではない。）
種々の技術の任意なものによって監視することにより計
測される。本発明の検定法の競合的反応は以下のように
表わされる。
なお以下において、検体、酵素−ドナー結合体、酵素ア
クセプター、検体結合タンパク質、およびβ−ガラクト
シダーゼ酵素はそれぞれA;ED〜A;EA;AbpおよびＥで表わ
される。
式中K2aおよびK2dは、酵素ドナー結合体と検体結合タン
パク質の会合および解離の定数を表わすものである。
式中K3aおよびK3dは、酵素ドナー結合体と酵素アクセプ
ターポリペプチドとの会合および解離の定数を表わすも
のである。
検体結合タンパク質（Abp）の酵素ドナー結合体（ED〜
Ａ）上の接近可能な決定基への結合は、酵素アクセプタ
ーが不活性な二重体をとどめるように相補性反応を阻止
する。
これゆえ反応（２） ED〜Ａ＋Abd ED〜Ａ−Abp は、反応（３） ED〜Ａ＋EA Ｅ と競合する。
Abp、ED、ＡおよびEAの既知量を用いると、複合される
β−ガラクトシダーゼ［Ｅ］の活性は、試料中の関心の
遊離検体の未知濃度に正比例するであろう。
従来の酵素検定法におけると同様に、十分な感受性のた
めには、検体結合タンパク質にカップリングした酵素ド
ナー結合体の酵素−アクセプターとの相補による活性な
酵素の形成が最小限なものとされなければならない。言
い換えれば、以下の（４）および（５）のいずれかある
いは双方は、わずかに最小限で進行するかあるいは全く
進行しないものでなければならない。
（４）ED〜Ａ−Abp＋EAED〜Ａ−Abp−EA 式中、ED〜A;AbpおよびEAは上記と同様のものであり、
また活性な酵素（Ｅ）により触媒される反応に関する基
質および産物はそれぞれＳおよびＰで表わされる。
十分な感受性を有する特別な検定法を設計するための臨
界成分は、（１）酵素ドナー結合体および酵素−アクセ
プターに関する会合定数（K3a；（２）特異的結合タン
パク質（［Abp］）の濃度；（３）特異的検体結合タン
パク質および酵素ドナー結合体に関する会合定数
（K2a）；ならびに酵素アクセプターの濃度の間の関係
である。
ファリナとゴルケ［Farina and Golke］（米国特許第4,
378,428号）によって提唱された次の不等式は、特別の
検定法を設計することにおける指針として用いられ得
る。
式中、K3は反応（１）および（３）に関する平衡定数を
表わし、また［Abp］、［EA］および［ED〜Ａ］はそれ
ぞれ、検体結合タンパク質の濃度、酵素アクセプターの
濃度および検体にカップリングした酵素ドナーの濃度で
ある。この分析は、上記反応（１）および（２）に関す
る平衡定数は同一であることおよび反応（４）および
（５）は全く進行しないことを仮定する。
ファリナとゴルケ（上記）によってより詳細に説明され
るように、式K3［Abp］／K1が［EA］よりも約２〜100
倍、好ましくは約５〜25倍大きいものであるように、検
定が設計されることが通常望ましい。さらにED〜Ａの濃
度は、予想される未知の検体濃度のものの約10〜100倍
の因子にあるべきである。これは、検定されるべき試料
中における変化する検体濃度に対して満足に応答する、
反応（３）において形成される触媒的に活性な酵素の量
をもたらすものである。
本発明の酵素相補性検定法の成分は、水性媒体あるいは
凍結乾燥形態のいずれかにおけるキット中に包装され得
る。それぞれの成分ないしは試薬は、別々に、または検
定の感受性が変化されずかつ成分が悪影響を及ぼされな
い限りにおいて他方の成分といっしょに包装され得る。
このキットの１つの商業的実施態様は、クローン化酵素
ドナー免疫検定法［Cloned Enzyme−Doner Immunoassa
y］［CEDIA"'］と呼ばれる。
5.1.酵素ドナー 本発明によると、改良された酵素検定法は、組換えDNA
技術および／または化学的ポリペプチド合成技術を用い
て調製された酵素ドナーおよび酵素アクセプターの使用
により達成される。このような技術は、適当な反応基、
例えばアミノ、スルフヒドリル、カルボキシルなどを有
するアミノ酸の挿入あるいは置換により、酵素ドナーと
検体の間の共有結合に関する改良された化学特性をもた
らすものである。このような技術は、相補にするポリペ
プチドのアミノ酸配列を組織的に決定することにより、
酵素アクセプターと酵素ドナーとの間の会合定数のより
正確な制御をもたらすものである。さらに、このような
技術は、これらのポリペプチドの低価格で確かな源を産
出するものである。
5.1.1酵素ドナー：改良されたカップリング化学特性 本発明の１つの実施態様によると、１つのα−ドナード
メインと１つの検体ドメインを有する酵素−ドナーは、
検体を検体ドメインへカップリングさせるための化学特
性を改良するために、組換えDNA技術の使用によって調
製される。これらの酵素ドナーポリペプチドは、相補に
必要とされるα−ドナードメイン配列から変化される距
離で、検体の共有結合的付着のための都合のよいカップ
リング部位を提供する。
１つの検体カップリングドメインを含有するこのタイプ
の酵素ドナーポリペプチドを得るために、当業者に公知
であるプラスミドpUC13（第2A図参照）が、種々の酵素
を用いてα−領域中の異なる部位で開裂され得る。例え
ば、HaeII、BglＩ、MstＩあるいはPvuＩでの開裂は、Ｈ
−シリーズ、Ｂ−シリーズ、Ｍ−シリーズおよびＰ−シ
リーズα−領域をそれぞれ生じる。Ｂ−シリーズおよび
Ｈ−シリーズはT4 DNAポリメラーゼおよびS1ヌクレアー
ゼで処理される。Ｈ−シリーズとＰ−シリーズは処理さ
れない。DNAのそれぞれのシリーズは、多重クローニン
グ部位においてSatＩで消化され、そしてα−相補ペプ
チドをコードする小さなDNAはアガロースゲル精製によ
り精製され、DEAE−セルロース紙上に電気泳動され、溶
出されそしてエタノール沈殿される。
さらに、プラスミドは、温度誘発性プロモーター［temp
erature inducible promoter］の調節［regulatory con
trol］下にα−ドナー配列を置くことを遺伝子工学され
得る。これは、温度感応性であり、タンパク質発現の温
度誘発を準備する１つλリプレッサータンパク質（λCI
遺伝子によってコードされた）と組合せて、１つのλPr
プロモーターを用いて達成され得る。λ変異体遺伝子CI
857は、37℃より高い温度で不活性である温度感応性リ
プレッサータンパク質に関してコードするものである。
以下、λCI遺伝子に関するものはCI857変異体遺伝子に
言及する。
本発明の他の実施態様によると、１つのα−ドナードメ
インと１つの検体ドメインを有する酵素ドナーは、検体
を検体ドメインにカップリングするための化学特性を改
良するために、化学的ポリペプチド合成技術の使用によ
って調製される。これらの酵素ドナーポリペプチドは、
相補に必要とされるα−ドナードメイン配列から変化さ
れる距離で、検体の共有結合的付着のための都合のよい
カップリング部位を提供する。化学的ポリペプチド合成
技術はまた、α−ドメインおよびタンパク質ドメインか
らなる酵素ドナーを調製するために用いられ得る。酵素
ドナーペプチドは、標準合成技術によって自動化ペプチ
ド合成器において合成される。簡単に述べると、所望の
ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸を表わす保護された
アミノ酸が架橋ポリスチレンビーズに付着される。この
樹脂ビーズは、付加的なアミノ酸が、段階的様式におい
てカップリングされ得る固相として機能する。ペプチド
は、カルボキシ末端からＮ−端末へ連続的に鎖を成長さ
せることによって生成される。固相は、反応を迅速に10
0％完了に導くことを、過剰な試薬を用いることによっ
て容易とする。過剰な試薬は、次に容易に洗浄除去され
得る。合成段階の完了時に、ペプチドは樹脂より除去さ
れそして精製される。
本発明の方法により調製される酵素ドナーペプチドは、
CNBr2/M15、CNBr/M112およびCNBr24/X90相補系の従来の
ポリペプチドより、検体に対する付着に関する優れたカ
ップリング化学特性を有するものである。
多くのアミノ、カルボン酸およびスルフヒドリル基を有
するM15への検体のカップリングは、すべての場合にお
いて（十分に制御された条件においてすら）、M15を不
活性とした。動力学実験は、活性を不活性とするのに十
分である単一ヒットを示している。同一の結果がM119お
よびX90でも期待されるものであった。
試験されたすべての場合において、NH2、COOHおよびSH
基を介してCNBr2ペプチドへの検体の共有結合付着は、
相補し得ないポリペプチドをもたらした。CNBr2は、内
部のリシンを含んでおらず（有効なNH2基がない）、１
つの非反復のスルフヒドリル基および数個のカルボン酸
基を含んでいる。最初に、ラングレーとの一致（“β−
ガラクトシダーゼ α−相補性の分子状態”と題された
工学博士論文,UCLA,1975年）において、Ｎ−末端α−ア
ミノ基へのカップリングは、CNBr2の相補活性を不活性
とすることが示されている。一連の実験において、異な
る分子量の化合物のいくつかが、CNBr2ペプチドのＮ−
末端を位置する単一アミノ基に共有結合的に付着した。
以下の化合物は、このペプチドのＮ−末端アミノ基と反
応した：無水コハク酸（MW100ダルトン）；ビオチン−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル（MW342ダル
トン）;4−フェニルスピロ［フラン−２（3HO,−１′−
フタロン］−3,3′ジオン（フルオレサミン）（MW278ダ
ルトン）；およびジクロロトリアジニルアミノフルオロ
セイン−ジヒドロクロライド（MW568ダルトン）。これ
らの酵素ドナー結合体による相補は、遊離CNBr2ペプチ
ドによる相補と比較された。M15あるいはEA23酵素アク
セプターのいずれかを相補するCNBr2の能力は、付着し
た化合物によってそれぞれ約25％、39％、46％および63
％阻害された。組み換えDNA技術によって調製された酵
素ドナーポリペプチドのＮ−末端アミノ基へのこれらの
同様の化合物の同一の共有結合的付着は、相補を同様に
阻害したことに注意すべきである。これゆえ、検体、特
に約500ドルトンより大きな分子量の検体のＮ−末端の
アミノ基へのカップリングは、酵素−ドナーポリペプチ
ドによる相補をかなり制限するものである。
第二に、精製されたCNBr2ペプチドにおいては、検体の
共有結合的付着のために有効な遊離スルフヒドリル基が
ない。CNBr2の調製（ラングレー，フォウラーおよびゼ
ビン,1975年，ジェイ．バイオル．ケム．250:2587［Lan
gley,Fowler and Zabin,1975,J,Biol.Chem.250:258
7］）において、第75位のスルフヒドリルは、臭化シア
ンによる開裂に先だち、還元されそしてヨード酢酸でア
ルキル化される。このスルフヒドリルがアルキル化され
ないとすると、CNBr2活性は、精製の段階の初期には維
持され得るが、均質性への精製の前に失われる。また、
このスルフヒドリルがヨード酢酸の代わりに検体のマレ
イミド誘導体でアルキル化されると、結合体の不溶性が
精製をさまたげる。
第三に、試験されたすべての場合において、CNBr2のCOO
H部分へのカップリングは相補性活性を不活性とした。
例えば、テオフィリン−８−プロピルアミンが、水溶性
カルボジイミド１−エチル−３−（３−ジメチル−アミ
ノプロピル）カルボジイミド（EDAC,シグマケミカル
カンパニー［Sigma Chemical Co.］、ミズーリー州セン
トルイス）を用いて、テオフィリンをCNBr2にカップリ
ングする試みにおいて用いられた。テオフィリン−８−
プロブチレートが、クックら［Cook et al.］（1976
年，レス．コム．ケム．パス．ファラム．13:497〜505
［1976,Res.Comm.Chem.Path.Pharm.13:497−505］）に
従い合成され、そして修正されやカーティウス［Curtiu
s］転位（ウォッシュボーンとペーターソン、システィ
ク コム.1972年．2（４）:227〜230［Wash−borne and
Peterson,Synthetic Comm.1972,2（４）:227−230］）
によってテオフィリン−８−プロピルアミンに転化され
た。精製された生成物の構造は、デューク ユニヴァー
シティ［Duke University］でティー．バナロン博士［D
r.I.Vanaman］によって質量分析学により確認された。
0.1MNaPO4、pH7.4の0.5ml中のCNBr2の２×10-11とテオ
フィリン−８−プロピルアミンの１×10-5molを含む数
本の試験管に対し、EDACの減少量が添加された。得られ
た相補活性は、酵素−アクセプターとしてM15および基
質としてのＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシドを有する0.5M PM2緩衝液［PM2 Buffer］中におい
て測定された。EDACは使用の直前に溶解され、冷水中に
希釈され、種々の希釈の10μｌが反応管中に添加され
た。1.403;0.000;0.000;0.010;0.018;0.125;および0.98
3の光学濃度（414nm）がそれぞれ、0;1×10-6;1×10-7;
1×10-8;1×10-9;1×10-10;1×10-11モルのEDACの濃度
を用いて計測された。これらのデータは１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとの
カップリングを試みられたCNBr2の迅速な不活性化を示
すものである。
これに対して、本発明により調製される酵素−ドナーポ
リペプチドは、Ｎ−末端より十分に離れたスルフヒドリ
ル、アミノあるいはカルボキシル基を、触媒的に活性な
酵素複合体を酵素アクセプターと形成するための酵素ド
ナー結合体の能力と干渉することなく検体がこれらの基
に共有結合的に付着されるように、提供するために、遺
伝子工学されるあるいは化学的に合成される。スルフヒ
ドリルおよびアミノ基が好ましいものである。
遊離スルフヒドリルが存在する場合、それは検体上に存
在する反応基と反応し得る。このような反応基として
は、反応性ハロアルキル基および酸／ハロ基、ｐ−メル
クリベンゾエート基ならびにミカエル型付加反応［Mich
ael−typeaddition reaction］し得る基（例えば、マレ
イミドや、ミトラルとラウトン,1979年，ジェイ．アメ
ル．ケム．ソシ．101:3097〜3110［Mitral and Lawton,
1979,J.Amer.Chem.Soc.101:3097−3110］において述べ
られたタイプの基などを含む）などが含まれるが、もち
ろんこれらに限定されるわけではない。本明細書におい
て定義されるように、ハロアルキルは、臭素、ヨウ素、
あるいは塩素で置換された１〜３個の炭素原子の任意の
アルキル基からなる。検体が、酵素ドナーの遊離スルフ
ヒドリル基に対してカップリングするためのこのような
反応基を有していない場合、検体の誘導体が、このよう
な反応基を含むように調製され得る。
5.1.2酵素−ドナー：融合タンパク質 本発明の他の実施態様によると、酵素ドナーポリペプチ
ドは、α−ドナードメインをコード化する遺伝子を、検
定されるべきタンパク質検体（あるいはその一部）をコ
ード化する他の遺伝子と、連結する［ligating］あるい
は融合することにより調製される。適当な宿主細胞にお
ける連結された遺伝子の発現は、酵素アクセプターとの
相補および検体結合タンパク質への特異的結合のいずれ
をもなし得る融合タンパク質産物をもたらす。これゆ
え、本発明のこの実施態様により調製された融合タンパ
ク質は、いずれも融合された遺伝子によりコード化され
た、２つのドメイン、すなわち（１）α−ドナードメイ
ンと（２）タンパク質ドメインとから成るものである。
先の述べたように、本発明において利用されるタンパク
質ドメインは、タンパク質抗原の免疫反応性エピトープ
からなるものである。
融合タンパク質をコード化する遺伝子を構造する［cons
truct］ために、問題の２つの遺伝子は、翻訳解読枠が
維持されかつ終止コドンによって不断とされるように、
これらのコード化配列と連接されなければならない。さ
らに、宿主がリプレッサーを含む株である場合、融合タ
ンパク質は、導入のリブレッサーの不活性化に対する応
答においてのみ産出される。融合タンパク質は、相補性
活性に関して、酵素アクセプターの生体内相補［in vi
vo complementation］によって同定される。免疫反応性
およびタンパク質ドメインとの抗体の相互作用による相
補の免疫特異性阻止に関する遺伝的構造のスクリーニン
グは、試験管内的に［invitro］行なわれる。
融合タンパク質は、免疫反応性ポリペプチドがα−ドナ
ードメインのＮ−末端にあるいは酵素−ドナーポリペプ
チドのＣ−末端に付着されることで構造されることがで
きる（第４図参照）。α−ドナードメインとタンパク質
ドメインの間のスペーサー配列は、相補性を高めるある
いは、相補における特異的結合タンパク質との相互作用
の阻止効果を高めるために用いられ得る。
さらに、特定のタンパク質検体に関してコードする完全
遺伝子の融合は、必要とされないものである。例えば、
関連ヒト糖タンパク質ルトロピン［leutropin］（黄体
化ホルモン;LH）、フォリトロピン［follitropin］（卵
胞刺激ホルモン;FSH）、チロトロピン（甲状腺刺激ホル
モン;TSH）およびヒド絨毛性ゴナドトロピン（hCG）は
αおよびβ−サブユニットからなる。これらすべてのホ
ルモンのα−サブユニットは同一のものである。しかし
ながらそれぞれの場合において、β−サブユニットは異
なっており、そしてそれぞれのホルモンの独特の特異性
および生物学的活性を与えるものである。これゆえ、β
−サブユニットのみが、このグループの特定のホルモン
に関して特異的な免疫検定法を構成するために、α−ド
ナードメイン配列に融合される必要があるであろう。
あるいはまた、遺伝子配列をコードするα−ドナーに融
合されるタンパク質ドメインに関しコードする免疫反応
性配列は、非反復の免疫反応性エピトープで表わされ得
る。例えばhCGのβ−サブユニットの独特なカルボキシ
末端30アミノ酸延長（ビルケンら,1982年，エンドクリ
ノロジイ110:1555［Birken et al.,1982,Endocrinology
110:1555］）がhCGに関する検定においてタンパク質ド
メインとして用いられ得る。
その他の例示的実施例によると、完全Ｂ型肝炎ウィルス
表面抗原に関する配列あるいはこの配列のほんの小さな
部分が、Ｂ型肝炎ウィルスに関する免疫反応性エピトー
プとして用いられることができた（レーナーら,1981
年，プロク．ナトル．アカドサイ．ユーエスエイ78:340
3［Lernere et al.,1981,Proc.Natl.Acad.Soc.USA78:34
03］）。
酵素ドナーは、市販のDNA合成器および同様なものを用
いるDNAの直接合成を含む組換えDNA技術を包含する種々
の方法によって調製されることができる。
5.2.酵素アクセプター 先に述べたように、酵素ドナーと酵素アクセプターポリ
ペプチドとの間の会合の定数は、任意の酵素相補性検定
系で満足な感受性を達成するための重要なパラメーター
である。本発明によると、酵素ドナーと酵素アクセプタ
ーとの間の会合の定数を調製するために、酵素ドナーα
−ドメイン（上記、第５、１節参照）あるいは酵素アク
セプターのいずれかのアミノ酸配列が組織的に変えられ
る。
酵素ドナーに対して変更された親和性を有する酵素アク
セプターは、欠失作成あるいは、天然のβ−ガラクトシ
ダーゼをコード化するlac遺伝子のα−領域のDNA配列中
への枠内における連結へと続く所望のアミノ酸配列を運
搬するDNAの直接合成を含む（もちろんこれらに限定さ
れるものではない。）種々の組換えDNA技術を用いて調
製される。
欠失作成による酵素アクセプターの調製に関する例示的
技術は、第６図（下記）において詳細に表わされる。非
常に簡単にのべると欠失作成技術は、所望のアミノ酸配
列を得るために、例えばBal31消化のような部位特異的
消化へと続く、β−ガラクトシダーゼＺ遺伝子のα−領
域中への、特定の制限酵素に関して特異的な部位の導入
を含むものである。適当な制限酵素での消化の後に、生
存可能な酵素アクセプターは、生体内相補能を用いて単
離される。例えば、相補は、関心の酵素ドナーならびに
酵素アクセプターに関しコードする温度誘発性遺伝子を
負うプラスミドを、AMA1004（AMA1004は、galU,galK,St
rAr，hsdR-，leuB6,trpC,Δ（lacIPOZ）C29である。）
（カサダバンら,1983年，メソッズインエンザイ←モロ
ジイ［Casadaban et al.,1983,Methods in Enzymology1
00:293］）のような株中に形質転換し、そして誘導物質
イソプロピルチオガラクトシドおよび色素産生性基質５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシドを含むプレートにおいて選択することに
よってスクリーニングされ得る。30℃では白色であるが
42℃では青色のコロニーは、生存可能な酵素アクセプタ
ーの産生を示す。このような酵素アクセプターからのDN
AはSalＩで切断され、再連結されそしてAMA1004中へ形
質転換される。酵素アクセプターポリペプチドは次に精
製される。
あるいはまた、酵素−アクセプターは、任意の市販のDN
A合成器を用いるDNAの直接合成によって調製され得る。
所定の合成DNA配列は、次にアニーリングされそして適
当なプラスミドベクター中へ連結される。例えば、プラ
スミドp150はBamHIおよびXhoＩ制限酵素で消化される。
所望の合成DNA配列は次にBamHI/XhoＩギャップ中に挿入
される。
本発明の他の実施態様によると、改良された安定性の酵
素アクセプターが、酵素相補性検定における使用のため
に調製される。酵素アクセプターの不安定性は、酸化状
態によって最も顕著に影響される。エチレンジアミン四
酢酸（EDTA）および２−メルカプトエタノールもしくは
ジチオトレイトールのような還元剤は、酵素アクセプタ
ーの安定性を劇的に改良する。これらの結果は、不安定
性の原因としての酵素アクセプターにおける曝れたスル
フヒドリル基を指すものである。ジョルンヴォール、ウ
ォウラおよびゼアビン（バイオケミストリー,1978年，1
7:5160〜5164［Biochemistry,1978 17:5160−5164］）
によると、天然β−ガラクトシダーゼの単量体ポリペプ
チド鎖の16のシステイン残基の２つが酵素の表面上に位
置される。しかしながら、酵素−アクセプターM15は、
表面上に５つのシステイン残基を含む。これゆえ酵素ア
クセプターの安定性を改良するために、曝されたシステ
イン残基は、第6.2節において述べられる改良された酵
素−アクセプターから組織的に除去される。酵素アクセ
プターをコード化する遺伝子は、適当なM13バクテリオ
ファージ中にクローニングされ、一本鎖DNAが単離され
そしてザ アプライド バイオシステムズ インコーポ
レーション［the Applied Biosystems,Inc.］DNA合成器
において合成された適当なオリゴヌクレオチド プライ
マーにアニーリングされた。ゾラーとスミス［Zoller a
nd Smith］（メソッズ イン エンザイモロジイ 198
3,100,468〜500,アカデミックプレス［Methods in Enzy
mology 1983,100,468−500,AcademicPress］）によって
述べられるような標準的方法がこれらの作成において用
いられる。
5.3.検体 本発明の改良された方法および新規な組成物は、薬剤、
薬剤代謝産物、生物学的活性分子、ステロイド、ビタミ
ン、産業汚染物、農薬およびそれらの代謝産物、食品添
加物、除草剤およびそれらの代謝産物、風味剤および食
品毒、病原体およびこれらの産生する毒素、ならびにそ
の他の関心物質を含む種々の検体の存在および／または
量を測定するために用いられることができる。例えば、
約2,000ドルトンより大きな分子量を有するタンパク質
のような、比較的高分子量の検体が、より小さな検体と
同様に、本発明の改良された検定法および組成物を用い
て検知および／または測定され得る。このような検体の
例示的な例としては、以下のようなものが含まれるが、
これらに限定されるわけではない。高分子量 低分子量 癌胚抗原 エストリオール フェリチン ジゴキシン ヒトＴ細胞白血病ウィルス チロキシン インスリン プロプラノロール α−胎児タンパク質 メトトレキセート 風疹ウィルス フェンシリジン ヘルペスウィルス メサドン サイトメガロウィルス モルヒネ 卵胞成熟ホルモン ジアゼパム 甲状腺刺激ホルモン オキサゼパム 黄体化ホルモン キニジン 肝炎ウィルス プロポキシフェン 絨毛性ゴナドトロピン Ｎ−アセチルプロカインアミド 卵胞ホルモンレセプター セコバルビタール 甲状腺刺激ホルモンレセプター トブラマイシン ポリオウィルスレセプター ゲンタマイシン インスリン輸送タンパク質 テオフィリン プロテインＡ アンフェタミン コンカナバリンＡレクチン ベンゾイルエクゴニン 小麦胚凝集素レクチン フェニトイン 分泌タンパク質 プロカインアミド コレラ毒素 ライドカイン アビジン カルバマゼピン プリミドン バルプロイックエシッド フェノバルビタール エトスクシンイミド ビオチン 5.4.酵素基質 本発明の改良された酵素検定法において、試料混合物中
の未知検体の量は、β−ガラクトシダーゼ酵素の活性の
正比例関数として測定される。酵素活性は、酵素的に触
媒された反応の産物の出現によってあるいは、酵素基質
の消失によって監視される。これは、基質の転化率であ
る。分光測光的あるいは蛍光定量的検定に適したβ−ガ
ラクトシダーゼに関する基質としては、ｐ−アミノフェ
ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド;2′−Ｎ−（ヘキシ
デカノール）−Ｎ−（アミド−４′−ニトロフェニル）
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド;4−メチルウンベル−リ
フェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ナフチル−AS
−B1−β−Ｄ−ガラクトピラノシド;1−ナフチル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド;2−ナフチル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシドモノハイドレート;0−ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド;m−ニトロフェニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド;p−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド；ならびにフェニル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド,5−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド，レソルフィン−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド,7−ヒドロキシ−４−トリフルオ
ロメチルクマリン，ω−ニトロスチリル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド，およびフルオレセイン−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシドなどが含まれるが、もちろんこれらに限
定されるわけではない。
5.5.検体結合タンパク質 本発明の酵素検定法は、遊離検体と酵素ドナー結合体と
の間の検体結合タンパク質に対する競合的相互作用を利
用するものである。酵素ドナー結合体の相互作用は、相
補反応を阻止する。第12節および第13節（下記）におけ
る実施例において詳細に述べられるように、検体結合タ
ンパク質に対して特異的な抗体あるいは抗体フラグメン
トの付着は、立体障害効果を高めるのに有用であり、そ
してこれゆえ検体結合タンパク質に結合した酵素ドナー
結合体による相補の阻止に寄与する。
本発明の１つの実施態様によると、検体結合タンパク質
は、１つの抗体分子である。このような場合において
は、検定は、酵素免疫検定である。このような検定に有
用な抗体分子としては、測定されるべき検体に対して特
異的な従来の（多クローン性の）および単クローン性の
抗体（ならびに多クローン性および単クローン性抗体の
フラグメント）の双方が含まれる。
本発明の他の実施態様によると、検体結合タンパク質
は、ビオチンに対して特異的親和性を有するアビジンで
ある。このような場合においては、酵素検定は、ビオチ
ンのみならず、アビジンに対する親和性を保持するビオ
チンの誘導体を測定するのに有用である。
本発明の他の実施態様によると、検体結合タンパク質
は、レセプター、レクチン、輸送タンパク質などを含む
（しかしながらこれらに限定されるわけではない。）結
合タンパク質である。
6.実施例：組み換え方法による酵素ドナーおよび酵素ア
クセプターの調製 以下のすべての実験において、すべてのDNA制限および
修飾酵素は、ニュー イングランド バイオラブス［Ne
w England Biolabs］（マサチューセッツ州ベバリー）
から得られ、そして製造業者の指示に従って用いられ
た。
6.1.酵素ドナー 6.1.1.p125酵素ドナー プラスミドp125は温度誘発性プロモーター（λPr）の調
節下にα−ドナー配列を置くために遺伝子工学された。
さらに、発現したα−ドナーペプチドは、Ｃ−末端近く
に１つの非反復のシステイン残基を含むものである。こ
れは、プラスミドpUC13をBglＩで開裂することにより達
成され、そして得られた一本鎖末端はS1ヌクレアーゼで
の処理により除去された。プラスミドは次にBamHIで消
化された。β−ガラクトシダーゼα−遺伝子をコード化
する約170bpのDNAフラグメントが次にアガロースゲル電
気泳動法によって精製された（第２図参照）。
プラスミドｐβgal2は、温度誘発性Prプロモーターの調
節下にlacオペロンを運ぶプラスミドpCVQ2（クイーン,1
983年，ジェイ，モレク，アプライト，ジュネテックス
2:1［Queen,1983,J,Molec.Applied Genetics2:1］）の
誘導体である。その他の遺伝子作成のために有用なλ調
節配列を形成するために、プラスミドｐβgal ２は修
飾された。プラスミドｐβgal ２はBamHIおよびSalＩ
で消化され、そしてlacオペロンをコード化するDNA配列
が除去された。pBR322配列（amprおよびoriを含む）お
よびCIを含むDNAフラグメントがアガロースゲル電気泳
動により単離された。BamHI、EcoRI、HindIIISallＩお
よびXbaＩに関する認識配列を含む合成DNAリンカーが連
結されそして次に、BamHIおよびSalＩ付着端を有するよ
り短いマルチリンカーセグメントを作るためにBamHIお
よびSalＩで開裂された。これらのDNAフラグメントは、
ｐβgal ２から単離されたBamHI/SalＩフラグメントに
連結された。得られたプラスミドであるp121Bは、ベク
ターのBamHIとSalＩの間にEcoRIおよびXbaＩ認識部位を
含んでいる。プラスミドp121BはBamHIおよびPvuIIで消
化された。β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性
amprを授与するものである。）、ファージλCI遺伝子
（温度制御されたリプレッサー）および複製のプラスミ
ド起点（ori）を含むBamHI/PvuII DNAフラグメントがア
ガロースゲル電気泳動により精製された。pUC13からのB
glＩ（−）／BamHI DNAフラグメントとp121BからのBamH
I/PvuII DNAフラグメントが第2B図に示されるようにT4
DNAリガーゼを用いて連結された。この組換え型プラス
ミドは、一本鎖ファージM13およびその組換え体（β−
ガラクトシダーゼ変異体ポリペプチドM15をコード化す
るものである）の成長に関するエシェリキア・コリ細菌
性宿主の１つであるJM83（メッシング,1979年，レコン
ビナント DNA テクニカル ビュレッチン,NIH パブ
リケーションNo.79〜99,2,No.2:43〜48［Messing,1979,
Recombinant DNA Technical Bulletion,NIH Publicatio
n No.79−99,2,No.2:43−48］）中に形質転換され、そ
してプラスミドp125が選択された。生体内相補が42℃で
は起こるが32℃では起こらず、プラスミドp125が温度誘
発性β−ガラクトシダーゼα−タンパク質を産生するこ
とが示された。
6.1.2.H,B,MおよびＰシリーズ酵素ドナー 一連の実験において、検体カップリングドメインを含む
タイプの酵素ドナーペプチドを得るために、（第5.1.1
節参照）種々のサイズとされたα−領域が、HqeII,Bgl
Ｉ、MstＩあるいはPvuＩで消化されたpUC13（ビェイラ
とメッシング,1982年，ジーン 19:259〜268;メッシン
グ,1983年，メソッズインエンザイモロジイ101:20−78;
ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ，メリーランド州
ガイゼルスバーグ［Vieira and Messing,1982,Gene 19:
259−268;Messing,1983,Methods in Enzymorogy101:20
−78;Bethesda Reseach Laboratories,Gaithers−berg,
MD］）から単離され、それぞれＨ−シリーズ、Ｂ−シリ
ーズ、Ｍ−シリーズおよびＰ−シリーズをもたらした。
Ｂ−シリーズ、ＭシリーズおよびＰ−シリーズをもたら
した。Ｂ−シリーズ、Ｐ−シリーズおよびＨ−シリーズ
はT4 DNAポリメラーゼおよびS1ヌクレアーゼで処理され
た。Ｍ−シリーズは処理されなかった。それぞれのシリ
ーズのDNAは、多重クローニング部位に位置するSacＩで
消化され、そしてα−相補するペプチドをコード化する
小さなDNA群は、製造業者によって述べられるように、
アガロースゲル精製によって精製され、DEAE−セルロー
ス紙（シュレイサー アンド シューレル［Schleicher
and Schuell］、ニューハンプシャー州ケーン）上の電
気泳動され、溶出されそしてエタノール沈澱された。
pBR322の2.3kbEcoRI−PvuIIフラグメント中にクローニ
ングされたエシェリキア・コリtrpプロモーター（EcoRI
−SstＩ、120bp）を担うプラスミドp141がNdeＩで消化
され、そしてDNAポリメラーゼクレノウ［Klenow］フラ
グメントならびにdATPおよびdTTP（ピーエル バイオケ
ミカルズ［PL Biochemicals］ウィスコンシン州ミルウ
ォーキー）で処理された。得られたDNAはSacＩで消化さ
れ、そしてM,B,HおよびＰシリーズのDNAを受けるための
ベクターとして用いられた。T4 DNAリガーゼでの処理に
続き、DNAはエシェリキア・コリ株E9001（Δlac pro，
thi，SupE,F′proAB,lacIQ,Z M15,株71.18とも呼ばれ
る；メッシングら,1977年，プロク．ナトル．アカド．
サイ．ユーエスエイ75;3642〜3646［Messinget al.,197
7,Proc.Natl.Acad.sci.USA 75;3642−3646］）中に形質
転換された。DNA構造は、マキシアシムとギルバート［M
axam and Gilbert］の方法（1980年，メソッズ インエ
ンザイモロジイ67:499［1980,Methods in Enzymology6
7:499］）によって配列決定され、そして第４図に示さ
れる。また、（*）で表わされるものは、検体の共有結
合的付着のための部位である。
エシェリキア・コリ株E9001におけるTrp制御下にα−領
域をコード化する得られた株は、Ｂシリーズに関して
は、プラスミドp130を担う株MG130、Ｍシリーズに関し
てはプラスミドp129を担う株MG129,またＨシリーズに関
してはプラスミドp131を担う株MG131であった。
異なるクローン化α−領域の発現レベルを改良するため
に、α−領域は新たなプラミドで移入され、そしてλPr
オペレーター−プロモーターの制御下におかれた。例え
ばMG141を作製するために、Ｈ−シリーズからのH6のDNA
配列をコード化する遺伝子が、以下に述べるようにλPr
およびλCI遺伝子へのTrpプロモーターの置き換えによ
って、Pr制御下に置かれた。
Trpオペレーター−プロモーター制御下にH6を含むプラ
スミドp131は、EcoRIで消化され、そして大きな方の約
2.1kbフラグメントがアガロースゲル電気泳動法によっ
て単離された。λPrおよびλCI遺伝子は、p125のEcoRI
消化の小さなフラグメントからゲル精製された。p131の
2.1kbフラグメントは,p125からの小さなフラグメントに
連結され、事実上TrpプロモーターをλPrおよびλCIプ
ロモーター系と置き換えた。この処方がλPr制御下の以
下のプラスミドおよび菌株、すなわちＢシリーズに関し
ては、プラスミドp139を担う株MG139;Mシリーズに関し
てはプラスミドp140を担う株MG140;およびＨシリーズに
関してはプラスミドp141を担う株MG141を得るために、p
130およびp129を用いて繰返された。DNA構造は、マキサ
ムとギルバート，メソッズ イン エンザイモノジイ
67:49（1980）［Maxam and Gilbert,Methods in Enxymo
logy67:499（1980）］の方法によって配列決定され、そ
して第４図に示される。
6.1.3.p148酵素ドナー p125からのλPr配列を利用して、新たなプラスミドが、
ペプチドのＮ−末端側に位置するシステイン残基を与え
るために、作製された。この新たなプラスミドであるp1
48はまた、ペプチドのＣ−末端近くに位置した３つのシ
ステイン残基を含んでいるものであった。プラスミドp1
25がBamHIおよびEcoRIで消化され、約1000bpのフラグメ
ントが、該ベクターより開裂され、そしてアガロースゲ
ル電気泳動により精製された。このフラグメントはλPr
配列を含むものであり、これは、pUC12の非反復のBamHI
/EcoRI制限部位中に連結された（メッシング,1983年，
メソッズ イン エンザイモロジイ 101:20〜78［Mess
ing,1983,Methods in Enzymology101:20−78］）。この
組換え型プラスミドはJM83細胞中に形質転換され、そし
て上記に述べたp125の作製と同一の様式において42℃で
生体内的に相補することが見出された。酵素−ドナーp1
48の構造はまた第４図に示され、これは検体の付着に関
して本発明により利用されるものであるアミノおよびス
ルフヒドリル基カップリング部位の位置を含むものであ
る。
6.1.4.酵素−ドナー３ 酵素−ドナー３（ED3）は、H6から作製された酵素−ド
ナー１（ED1）から作製された。ED1は以下のようにして
作製された。
DNAフラグメントの合成は、アプライド バイオシステ
ム、インコーポレーテッド（エイビーアイ，カリフォル
ニア州フォスターシティー）モデル380A DNAシンセサイ
ザー［Applied Biosystems,Inc.（ABI,Foster City,C
A）Model 380A DNA Synthesizer］において行なわれ
た。それぞれの配列は、プログラムメモリー中に入力さ
れ、そして機械は、所望の一本鎖DNAを自動的に製造
し、孔径制御ガラス支持体からそれぞれのフラグメント
を開裂し、そしてバイアル（小瓶）中にDNAを集めた。D
NA試料は、濃縮NH4OH1.5mlで６〜24時間、55℃で処理さ
れ、そしてサバント スピード ヴァク コンセントレ
ーター［Savant Speed Vac Concentrator］中で乾燥状
態とされた。
それぞれのDNAフラグメントの乾燥ペレットは、ホルム
アミドの微量（100〜200μｌ）に溶解され、そして12％
アクリルアミドゲル（BRL Model SO,30〜40cm,厚さ1.6m
m）上に精製され、そして200ボルトで一晩電気泳動され
た。所望のバンドが、蛍光バックグラウンドとしてベー
カー−フレックス シリカゲル IB−Ｆ（ジェイ ティ
ー ベーカー ケミカルカンパニー）［Baker−flex si
llica gel 1B−Ｆ（J.T.Baker Chemical Co.］を用いて
視織化された。所望のDNAバンドは、カミソリ刃を用い
てゲルより切り出され、そして該DNAは、インターナシ
ョナル バイオテクノロジーズインコーポレーテッド
（IBI）モデル UEA ユニット［International Biotec
hnologies Inc.（IBI）Model UEA unit］において製造
業者の指示に従いポリアクリルアミドゲル断片から電気
泳動された。DNAは、微量の緩衝液中に集められ、そし
てエタノール沈澱された。該フラグメントは、製造業者
の指示に従いT4 ポリヌクレオチド キナーゼで処理さ
れた。相補的DNA鎖が組合され、２分間90℃に加熱さ
れ、そして室温に徐冷された。アニーリングされたDNA
は、ハイブリッド（交雑）されていない鎖を除去するた
めにアガロースゲル電気泳動によって精製され、そして
連結反応に用いられた。
出発プラスミドは、制限部位BamHIとSalＩとの間に挿入
されたλPr制御下のH6遺伝子を含むp169であった（第11
図参照）。H6からED1への変化は、H6のＮ−末端とＣ−
末端の双方を、これらの間のα−ドメインを完全に残し
つつ、変化させることを含むものであった。p169の２つ
の部分標本（アリコート［aliquot］）が制限酵素を用
いて切断された。第１の部分標本は、EcoRIおよびBglＩ
で消化され、そして小さな150bp塩基対［base pair］フ
ラグメントがゲル精製された。p169の第２の部分標本
は、BamHIおよびSalＩで消化された。これは、プラスミ
ドをベクターおよびα−ドナー遺伝子領域に開裂する。
ベクター部分ガゲル精製された。
ED1の新たなＮ−末端コーディング領域は、アプライド
バイオシステム インコーポレーテッドの機械によって
合成された75bp DNAフラグメントであった（第12図参
照）。新たなｃ−末端コーディング領域である50bpDNA
フラグメントが、また合成された（第12図参照）。この
２つの新たなDNAフラグメントが、小さなEcoRI−BalI H
6 DNAフラグメントに連結された。この混合物は、約275
bpの新たなED遺伝子を得るために、BamHIおよびSalＩで
切断された。このDNAの断片は、ゲル精製されそしてベ
クターBamHI−SalI DNAフラグメント中に連結された。
ED1配列を確認した後に、このプラスミド（p181、第13
図を参照のこと）は、BamHIとEcoRIで切断され、75bp E
D1 N−末端が除去された。この領域は、BamHI−EcoRIス
ペース中に置換された30bpの新たな合成フラグメント
（第12図参照のこと。）によって置き換えられた。
これゆえED3は、ED1より15アミノ酸短いものであり、そ
のＮ−末端近くにシステイン残基を有する。ED1は、そ
の配列中にシステインあるいはリジンのいずれも有しな
い。第14図はED3のアミノ酸配列を画くものである。
6.1.5.酵素ドナー 3A 酵素ドナー3A（ED3A）のアミノ酸配列は第14図に示され
る。該ペプチドは、ベックマン（カリフォルニア州パロ
アルト）990B ペプチド シンセサイザー［Beckman
（Palo Alto,CA）990B Peptide Synthesizer］において
合成される。合成の方法はステワートとヤング［Stewar
t and Young］（ソリッド フェーズ ペプチド シン
セシス,176pp,ペース ケミカル カンパニー，イリノ
イ州ロックフォード,1984年［Solid Phase Peptide Syn
thesis,176bp,Pierce Chemical Co.,Rockford,Illinoi
s,1984］）によって述べられるようなものである。一般
的な化学薬品は、アルドリッチ［Aldrich］（ウィスコ
ンシン州ミルウォーキー）からのものである。BOC−ア
ミノ酸はペニンスーラ ラボラトリーズ［Peninsula La
boratories］（カリフォルニア州ベルモント）からのも
のである。側鎖保護は、Boc−Thr（OBzl）、Boc−Clu
（OBzl）、Boc−Ser（OBzl）、Boc−Asp（OBzl）、Cys
（MeOBzl）、Boc−Asn/HOBT、Boc−Arg（TOS）およびBo
c−His（TOS）である。バイオ−ラッド ラボラトリー
ズ［Bio Rad Laboratories］（カリフォルニア州リッチ
モンド）からのアミノメチルポリスチレン固相樹脂ビー
ズは、ステワートとヤング（1984年）によって述べられ
るようにジクロロヘキシル カルボジイミドを用いてｐ
−ヒドロキシメチルフェニル酢酸Boc−Thr（OBzl）にエ
ステル化される。用いられた合成スケールは、固相樹脂
に付着したBoc−Thr １モルとそれぞれのBoc−アミノ
酸3mlである。合成器は次に合成を実行するためにプロ
グラムされる。得られたペプチドは、無水フッ化水素酸
を用いて樹脂から開裂され、そして酢酸で抽出される。
水素添加に続き、ペプチドは、0.1％TFAおよび0.1％エ
タンチオールを含む水中に０〜80％のアセトニトリル階
調度を有するウォーターズ［Waters］フェニルカラムを
用いる調製用逆相HPLCによって精製される。部分的に精
製されたペプチドは、lmM NH4HCO3、lmM ２−メルカプ
トエタノール中に徹底的に透析され、そして凍結乾燥さ
れた。ペプチドのアミノ酸分析は第１表に示される。
分子量は、アミノ酸の平均分子量が114.943で4942.53で
ある。
要約すると、第４図に示されるポリペプチドは、必要と
されるα−相補する配列から、変化された距離に、都合
のよいカップリング側鎖を与える。組換え法により作製
されたペプチドをコード化するDNA配列は、標準的なマ
キサムとギルバートの技術によって決定され、予言され
た構造が確認された。H6のアミノ酸組成は、アミノ酸分
析によって確認された。
6.1.6.ED酵素ドナーシリーズ EDシリーズと呼ばれる一連の酵素ドナーは、組換えDNA
技術を用いて作製された。ED3は、すでに第6.1.4におい
て述べられている。このシリーズの他のメンバーには、
ED4,ED5,ED7,ED8,ED13,ED15およびED17が含まれる。酵
素ドナーのEDシリーズのアミノ酸配列は第15A〜Ｉ図に
表わされる。
ED4に関しコードする遺伝子は、以下の配列のDNAフラグ
メントをアプライド バイオシステムズ、インコーポレ
ーテッド モデル380A DNAシンセサイザーにおいて（第
6.1.4節において述べるように）最初に合成することに
よって作製された。
星印でマークされた“T"は、“C"からの変更を表わす。
このフラグメントは、プラスミドp181（ED1）からのBam
HI−PvuI切片に連結された（第13図参照のこと。）。得
られた切片は、除去されたBamHI−SphＩ領域を有するベ
クター（ED1−p181からのもの）中に連結し返された。
Ｃ（シトシン）のＴ（チミン）への変更は、システイン
（cys）残基を生成し、そして連結の後にPvuＩ部位を破
壊する。（粘着性の［sticky］端部は、連結に関しても
同様に維持される。） ED5に関してコードする遺伝子は、以下の配列のDNAフラ
グメントを最初に合成することによって作製された。
１つの星印でマークされた“T"は、“C"からの変更を表
わす。２つの星印でマークされた“T"は、“A"からの変
更を表わす。ＣのＴへの変更は、PvuII部位を破壊す
る。Ａ（アデニン）のＴへの変更は、セリン残基をシス
テイン残基へ変更する。このフラグメントは、プラスミ
ド182（ED2ないしはM15）DNAからのBamHI−PvuII断片お
よびPvuＩ−SalＩ断片に連結された（第13図参照のこ
と。）。連結された物質は、BamHIおよびSalＩで切断さ
れ、そして除去されたBamHI−SalI領域を有するプラス
ミドp182中に挿入された。
ED7に関してコードする遺伝子は、EcoRIおよびSalＩの
双方を用いてp183（ED3）およびp184（ED4）を切断する
ことにより作製された。p183からのベクターはゲル精製
（EcoRI−SalＩ（α）領域を有効に除去する。）され
た。これに対して、p184からの小さなEcoRI−SalＩ
（α）領域がゲル精製された。このp184EcoRI−SalＩ領
域が次に、p183EcoRI−SalＩベクター中に挿入され、連
結された。
ED8に関してコードする遺伝子は、M13mpllファージDNA
における部位特異的変異誘発を用いて作られた。プライ
マーが作製された（配列GGT AAC GCA AGG GRT TTC CCA
GTC）。このプライマーは、アミノ酸15〜22番に関しコ
ードするα−領域の感受鎖［sense strand］に相補性で
ある。所望される変更は、M13mpll、DNAのα−領域にお
けるアミノ酸20番でGlyをCysに変更するコドン20におけ
るＧのＴへの変更であった。これは、プライマーを一本
鎖M13mpllファージDNAにハイブリッド化させ、そしてDN
AポリメラーゼＩ“クレノウ［Klenow］フラグメント”
およびT4DNAリガーゼを用いて室温にて一晩プライマー
を延長させることによって達成された。このDNAは、非
二本鎖DNAを消去するためにS1ヌクレアーゼで処理さ
れ、次にJM103細胞に形質転換された。この形質転換か
らのファージは単離され、DNAが精製され、そしてプラ
イマー伸長および形質転換が合せて３回繰返された。そ
れぞれの反復は、所望される産物に関して豊かなものと
した。最後にミニ標本分析（mini−prep analysis］
が、個々のプラークからのM13 RF DNAにおいて行なわれ
た。所望の塩基変更は、BstNI部位を消失した。BstNIを
用いてのミニ標本DNAの制限分析は、候補物を識別し
た。所望の変更を担う二本鎖M13 RF DNAから、BamHI−B
glＩ断片が切り出され、そしてED2に関しコードするプ
ラスミドにおけるBamHI−BglＩ断片と交換された。
ED13（p193、第16図参照のこと。）に関しコードする遺
伝子は、以下の配列のDNAフラグメントを最初に合成す
る（上記と同様）ことによって作製された。
この合成フラグメントは、ED3を作製することに関して
第6.1.4節において述べたと同様にしてp182（ED2）中に
置換された。
ED14（p194、第16図参照のこと。）に関してコードする
遺伝子は、以下の配列のDNAフラグメントを最初に合成
する（上記と同様）ことにより作製された。
この合成フラグメントは、システイン置換に代わりリジ
ン残基という結果となる以外は、ED4に関して用いられ
たものと同様の術策を用いて作製された。
ED15（p195、第16図参照のこと。）に関してコードする
遺伝子は、以下の配列を有するDNAフラグメントを最初
に合成する（上記と同様）ことにより作製された。
このフラグメントはED5を作製するために用いたものと
同様の方法においてp182（ED2ないしはM15）中へ挿入さ
れた。
ED17（p197、第16図参照のこと）に関してコードする遺
伝子は、ED7に関しコードする遺伝子が作製されたもの
と同様な方法において作製されたED13およびED14遺伝子
の組合せである。
次のものは、酵素ドナーのEDシリーズと用いられ得る酵
素アクセプターの列挙である。酵素ドナー 酵素アクセプター ＊ ED3 M15,EA1,EA14,EA20,EA22 ED4 M15,EA1,EA14,EA20,EA22 ED5 M15,EA1,EA14,EA20,EA22 ED7 M15,EA1,EA14,EA20,EA22 ED8 M15,EA1,EA14,EA20,EA22 ED13 M15,EA1,EA14,EA20,EA22 ED14 M15,EA1,EA14,EA20,EA22 ED15 M15,EA1,EA14,EA20,EA22 ED17 M15,EA1,EA14,EA20,EA22 ＊その他の酵素アクセプターは試験されていない。
上記の酵素ドナーと酵素アクセプターの対のうち、ED5
とEA22の組合せが、本発明の相補性検定法における使用
に最も好ましい対である。
6.2.酵素アクセプター 実験の一群において、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の枠
内配列欠失のシリーズが、上記第6.1節において述べら
れた方法により酵素アクセプターのシリーズを調製する
ために構造された。pUC13が、PvuII（鈍い端部［blunt
end］を生じる）で消化され、そしてXhoＩ制限部位を含
む8bp合成DNAリンカーに連結され、新たなプラスミドで
あるpUC13Xが生成した。Xho Ｉ制限部位を含むα−領域が次に、天然β−ガラク
トシダーゼをコードする完全lacＺ遺伝子中にlacZ遺伝
子の残余物［remainder］あるいはバックグラウンドプ
ラスミドを崩壊することなく置き換えられた。このＺ遺
伝子は２つのBalＩ部位を含むものである。これらのBal
Ｉ部位の最初のものは、XhoＩリンカーが挿入されたPvu
II部位より下流のpUC13中におけるα−領域内に含まれ
る。これゆえ、pUC13Xからのα−領域は、BamHIとBalＩ
での消化によりプラスミドの残余物かた除去され、そし
てこの170bpフラグメントはB1Xと呼称された。
β−ガラクトシダーゼをコード化するlacＺ遺伝子の残
余物は、プラスミドｐβgal ２（クイーン,1983年，ジ
ェイ．モル．アプル．ジェネット．2:1（Queen,1983,J,
Mol.Appl.Cenet.2:1］）から得られた。このプラスミド
はBglＩおよびEcoRIで消化され、そしてＺ遺伝子の93％
を表わす２つのDNAフラグメントが単離された。それぞ
れのフラグメントの末端は、この作製において用いられ
るその他の末端のいずれとも異なるものであった。単離
されたフラグメントは、2115bp（以下B2と呼ぶ。）およ
び737bp（以下B3と呼ぶ。）であった。Ｚ遺伝子におけ
るEcoRI制限部位は、遺伝子のｃ−末端近くにある。こ
の末端はXhoＩ部位を含む遺伝子が作製される場合、存
在すべきである。
変異体Ｚ遺伝子がpF29中に挿入された。プラスミドpF29
は、EcoRI部位にＺ遺伝子のｃ−末端に融合されたＺ遺
伝子α−領域を含むものである。このα−領域は、BamH
I部位に挿入されたλPrプロモーターによって制御され
る。pF29を作製するために、２つの中間体プラスミド、
pF15およびpF16が作製された。ｐβgal2がAvaＩで消化
され、付着３′末端［cohesive 3′ end］がクレノウ
フラグメント［Klenow fragment］および４つのdNTPを
用いて満たされ、鈍い末端が生成された。SalＩリンカ
ー（GGTCGACC）（ニューイングランドバイオラブス［Ne
w England BioLabs］、マサチューセッツ州ベバレイ
が、T4 DNAリガーゼを用いて線状化プラスミドに連結
された。得られたDNAはEcoRIおよびSalＩで消化され、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子のオメガ（ω）末端を表わ
す300bpDNAフラグメントがアガロースゲル電気泳動によ
って精製された。このω−領域は以下のようにしてPrの
制御下のα−領域に融合された。
pUC12 DNA（ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ［Bet
hesda Reserch Laboratories］、メリーランド州ガイゼ
ルスバーグ）がBglＩで消化され、そしてクレノウフラ
グメントおよび４つのdNTPで処理することによって鈍い
末端が生成された。EcoRIリンカー（GGAATTCC）（ニュ
ーイングランド バイオラブス、マサチューセッツ州ベ
バレイ）がT4 DNAリガーゼを用いて鈍い末端に連結され
た。このDNAはBamHIおよびEcoRIで消化され、Ｚ−遺伝
子のα−領域を表わす180bpフラグメントがアガロース
ゲル電気泳動によって精製された。α−遺伝子フラグメ
ントおよびω−遺伝子フラグメントを受け入れるために
用いられたベクターは、BamHIおよびSalＩで消化されそ
してlacオペロン配列を除去するためにアガロースゲル
電気泳動により精製されたｐβgal2であった。該ベクタ
ー、α−遺伝子フラグメントおよびω−遺伝子フラグメ
ントは、T4 DNAリガーゼを用いて連結し合された。該DN
Aフラグメントの非反復の末端は、これらのフラグメン
トがクローニングされた順序を指図するものである。生
成プラスミドはpF15と呼称された。
pF15は、pF15をPvuIIで消化することによって生成した
鈍い末端に連結したSalＩリンカーを用いて、非反復のP
vuII部位をベクターSalＩ部位に転化することによって
さらに修飾された。この修飾pF15は、次にBamHIおよびS
alＩで消化され、そして最も長いDNAフラグメントがア
ガロースゲル電気泳動によって精製されて、α−ω遺伝
子配列およびSalI部位とPvuII部位の間に位置するDNAフ
ラグメントが除去された。修飾されていないpF15がま
た、BamHIおよびSalＩで消化されα−ωフラグメントが
精製された。修飾pF15からの大きなフラグメントがこの
α−ωフラグメントに連結され、プラスミドpF16が生成
された。
pF16は、pF15より約1350塩基対だけ小さいものであり、
非反復なNdeＩ部位をSalＩ部位に極めてより近いものに
移動する効果を有する。この巧妙な処置は、その後の作
製を通じて担われるものから不必要なDNAを消去する。
pF29を作製するために、pF16はClaＩおよびNdeＩで消化
され、そしてλCI、λPrならびにβ−ガラクトシダーゼ
のα−およびω−領域をコード化する1400bp DNAフラグ
メントがアガロースゲル電気泳動法によって精製され
た。AccＩおよびClaＩ制限部位が同一の付着末端を有
し、またNdeＩ制限部位が同一の末端を共有するゆえ
に、pF16からのDNA挿入物とpUC13ベクターとの連結は、
１回の配向のみで生起する。T4 DNAリガーゼを用いて
の連続はpF29を生成する。pF29は、１つのEcoRI部位を
含み、またClaＩ部位を含んでおらず、このことは、第
２のEcoRIおよびClaＩ部位は、修飾プラスミドの作製を
阻害するであろう（例えば、以下に述べるp149、および
p150から生成される欠失変異体のその後の分析）ゆえに
望ましいものであった。
pF29はBamHIおよびEcoRIで消化され、間にあるα−ドナ
ーが除去され、そしてこのベクターはB1XにB2を加え、
さらにB3を加えたもの（B1X＋B2＋B3）を用いて満たさ
れた。それぞれの断片の非反復な一本鎖末端は、該断片
が連結し合い得る順序を定義する。B1X、B2およびB3
は、上記に述べたようにBamHIおよびEcoRIで消化された
pF29ベクター中に連結され、これにより、λPr制御下
に、アミノ酸34をコード化する塩基対102で、XhoＩリン
カーを用いてＺ遺伝子が再構成される。得られたプラス
ミドはp149と呼称された。Xho ＩおよびBal31での消化に続く、生存可能な酵素アク
セプターの生成に関してスクリーニングするための方法
を開発するために、XhoＩを有しない別個のα−ドナー
がp149中へ挿入された。lacＺオペレータ、プロモータ
ーおよびα−ドナーを含むpUC13からのFunDII消化フラ
グメントが、クレノウフラグメントを用いて満たされた
p149のSalＩ部位中に挿入された。得られたプラスミド
はp150と呼称された。欠失が、p150をXhoIで消化し、そ
して次に該DNAをBal31エキソヌクレアーゼで消化するこ
とによって作製された。Bal31処理の後、プラスミドはT
4 DNAリガーゼと連続され、そしてAMA1004宿主細胞（AM
A1004は、galＵ、galＫ、strAr、hsdR-、leuB6、trpC98
3O、Δ（lacIPOZ）である。）C29（カサバダンら,1983
年，メソッズ イン エンザイモロジイ100:293［Casab
adan et al.,1983,Methods in Enzymology,100:293］）
中に形質転換され、そして誘導物質イソプロピル−チオ
ガラクトシド（IPTG）および色素産生性基質５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（Xgal、シグマケミカル カンパニー、ミズーリ
ー州セントルイス）を含むルニア−ベルタニ［luria−B
ertani］プレート上でスクリーニングされた。30℃では
白色だが42℃では青色のコロニーは、生存可能な酵素−
アクセプターの生成を示した。コロニーが選択され、プ
ラスミドDNAが調製された。プラスミドDNAは、α−ドナ
ーを除去するためにSalＩで消化され、そしてAMA1004宿
主細胞に形質転換された。配列欠失は、マキサムとギル
バート［Maxam and Gilbert］の配列決定法により確認
され、そして酵素アクセプターは、第7.1節において述
べるようにして精製された。得られた株は、第５図に示
される。
酵素アクセプターは、DNA合成技術を用いて作製され
た。例えば酵素−アクセプター１（ED1）は、XhoＩリン
カーを含むα−領域が以下の合成DNAフラグメントと代
えられること（５′→３′）を除いては、p149から作製
された。
（１）CAA CAG TTG CGC AGC CTG AA （２）AGG CTG CGC AAC TGT TGG GAA GGG CGA TCG （３）ACC CAA CTT AAT ACC GAT CGC CCT TCC （４）GTA TAA AGT TGG GTA ACG CCA GGG CCT TCC CA （５）CAA CGT CGT GAC TGG GAA GGA CCT GGC GTT （６）GTC ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG TGA ATT
CGA GCT CGC CCG GG （７）GAT CCC CGG GCG AGC TCG AAT TCA CTG GCC GTC
GTT TTA これらのフラグメントは、lacZ遺伝子のアミノ酸26〜43
番の枠内欠失をコード化するものであり、またBamHIお
よびBalＩの粘着性末端を担うものである。これらのフ
ラグメントはアニーリングされ、ゲル電気泳動により精
製され、BamHIで処理され、そしてB2にB3を加えたもの
（B2＋B3）にそしてpF29ベクター連結された。陽性のコ
ロニーが選択され、そしてDNA配列分析により確認され
た。
6.2.1.相補効率の比較 第6.2節で述べるようにして調製された酵素アクセプタ
ーの相補効率を評価するために、代表的酵素アクセプタ
ー調製物がH6を酵素−ドナーとして用いて比較された。
微小力価プレート形態が用いられ、2.5×10-8Ｍの適当
な酵素アクセプター調製物および1.25mg/ml0−ニトロフ
ェノール−β−０−ガラクトピラノシド基質を含む全容
量200μｌのPM2緩衝液（0.5M Na2HPO4,pH7.0,1mM MgS
O4,0.18mMMnSO4,1mM EDTA,0.02％ NaN3,0.05％ トゥ
イーン 20［Tween 20］）から構成された。H6の一連の
希釈物（1:20,1:40,1:80）が相補を開始するために添加
された。光学濃度（414nm）が、37℃での38分間および4
0分間インキュベーションで測定された。結果は第２表
に示される。
第２表に示されるように、種々の酵素−アクセプターの
相補効率は、相当異なるものであった。相対相補効率
は、EA14＝EA22＞EA20＞EA24＞EA23であった。
7.実施例：チロキシンに関する酵素免疫検定法 この実施例はチロキシンに特異的な抗体を検体結合タン
パク質として用いる、チロキシンに関する免疫検定法を
述べるものである。用いられた酵素ドナー−抗原は、ED
4であり、また酵素−アクセプターはEA22である。
7.1.酵素アクセプターの調製 β−ガラクトシダーゼの欠失変異体ポリペプチドが、所
望の酵素アクセプター菌株をTYブロス（１当たりバク
トトリプトン［Bacto tryptone］10g、酵母抽出物5g、N
aC15gおよびグルコース1gを含む、pH7.5）中で増殖させ
ることにより調製された。細胞は42℃で増殖させられ
た。細胞は遠心分離によって収穫され、破壊性緩衝液
（BB）（0.2M トリス ［Tris ］−HClpH7.6、0.2M N
aC1、0.01M 酢酸マグネシウム、0.01M ２−メルカプ
トエタノール ５％グリセロール）で洗浄され、次に遠
心分離によりペレット化され、そして凍結された。
細胞ペレット（15g）は40mlのBB中に懸濁された。リゾ
ザイム［Lysozyme］（シグマケミカル、ミズーリー州セ
ントルイス）が0.20mg/mlの最終濃度へ添加され、懸濁
液は、−70℃のアルコール浴中で凍結され、そして37℃
の水浴中で迅速に解凍された。解凍される懸濁液の温度
を４℃以下に保つために注意がはらわれた。溶解物の粘
度は、ビルソニック セル ディスラプター［Virsonic
cell disruptor］（モデル16−850,ビルティスカンパ
ニー，ニューヨーク州ガーディナー［Model 16−850,Vi
rtisCo.,Gardiner,NY］）を用いての音波処理によって
低減された。フェニルメチルスルフォニルフルオライド
（PMSF,シグマケミカル）が0.1mMの最終濃度へ添加さ
れ、そして不溶性物質が遠心分離（16,000×g,30分間）
によって除去された。1/10容量の30％硫酸ストレプトマ
イシン溶液がゆっくりと上澄液に添加された。氷上で15
分間の後、沈澱した核酸が16,000×ｇで20分間遠心分離
することにより除去された。清澄化された溶解物は、ゆ
っくりと80％飽和(NH4)2SO4溶液の等容量を添加するこ
とにより、(NH4)2SO4で40％飽和とされた。４℃で２時
間の攪拌に続き、沈澱した物質が、16,000Xgで30分間遠
心分離することにより集められた。
ペレットはBB中に再溶解されそして、水中に0.1MNaH2PO
4、pH7.2、50mM NaCl、1mM MgSO4,10mM ２−メルカプ
トエタノールを含有するものの1000容量に対して、６時
間後に１回交換を行なって、透析された。透析された酵
素−アクセプター抽出物は、同様の緩衝液中のアガロー
スに共有結合的に付着したｐ−アミノフェニル−１−チ
オ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの2.5×6cmカラムに適
用された。カラムは、最初に0.1M NaPO4、pH7.2、50mM
NaC1、10mM ２−メルカプトエタノールで、次に0.1M N
aPO4、pH7.2、50mM NaC1、10mM ２−メルカプトエタノ
ールで、最後に、0.1MNaPO4、pH7.2、50mM ホウ酸ナト
リウムpH9.0、10mM ２−メルカプトエタノール（当容
量の2.5M トリス−HCl pH7.0中）を用いて洗浄され
た。すべてのカラム操作は４℃で行なわれた。
溶出した酵素アクセプターは直ちに、0.1M NaH2PO4 pH
7.2、70mM NaCl、1mMMgSO（MgS04）および10mM ２−メ
ルカプトエタノールに対して十分に透析された。透析の
後、グリセロールが10％まで添加され、そして抽出物は
−20℃で保存された。これらの調製物は、ラエムリの不
連続ポリアクリルアミドゲル系［Laemmli dis−continu
ous polyacryl−amide gel system］（ラエムリ,1980
年，ネイチャー227:690［Laemmli;1970,Nature 227:69
0］）においてシングルバンドを生じた。
7.2.酵素ドナーの調製 前記に述べた種々の酵素ドナーポリペプチドは宿主細胞
から直接精製されることが不可能であった。例えば、エ
シェリキア・コリ株AMA1004に見出されるこれらのペプ
チドのレベルはささいなものであった。これに対して、
相補するペプチドに関しコードするプラスミドが、菌株
E9001（Δlac−pro，thi,,supE,F′proAB,lacIQ,ZM15,
また71.18とも呼ばれる。；メッシングら,1977年，プ
ロ．ナトル．アカド．サイ．ユーエスエイ 75:3642〜3
646［Messing et al.,1977,Pro.Natl.Acad.Sci.USA 75:
3642−3646］）に形質転換された場合、活性なβ−ガラ
クトシダーゼが生体内相補により形成された。β−ガラ
クトシダーゼが精製され、そして該相補するペプチド
が、6M尿素を用いての該酵素複合体の変性により回収さ
れた。
細胞は0.1％グルコース、50μg/mlアンピシリンおよび
0.3mM IPTGを追補されたルリア ベルタニ［Luria Bert
ani］培地において42℃で16時間培養された。細胞は遠
心分離により収穫された。以下の段階は、特に記述のな
い限り４℃にて行なわれた。
12リットルの全培養容量からの約40gの細胞が、80mlの
緩衝液Ａ（50ml トリス ,pH7.5,50ml NaCl,10ml MgCl
2,10mM ２−メルカプトエタノール）に再懸濁された。
リゾザイム（シグマケミカル、ミズーリー州セントルイ
ス）が0.20mg/mlの最終濃度へ添加され、そして該懸濁
液は、−70℃のアルコール浴中で凍結され37℃の水浴中
で迅速に解凍された。解凍される懸濁液の温度を４℃以
下に保つように注意がはらわれた。溶解物の濃度は、ビ
ルソニック セル ディプラスター（Model 16−850）
を用いての音波処理によって低減された。フェニルメチ
ルスルフォニル フルオライド（PMSF,シグマケミカ
ル）が0.1mMの最終濃度へ添加され、そして不溶性物質
が16,000Xgで30分間遠心分離することにより除去され
た。1/10容量の30％硫酸ストレプトマイシン溶液がゆっ
くりと上澄液に添加された。氷上で15分間の後、沈澱し
た核酸が16,000Xgで20分間遠心分離することにより除去
された。清澄化された溶解物は、ゆっくりと80％飽和(N
H4)2SO4溶液の等容量を添加することにより、(NH4)2SO4
で40％飽和とされた。４℃で２時間の攪拌に続き、沈澱
した物質が16,000Xgで30分間遠心分離することにより集
められた。ペレットは最小容量の緩衝液Ｂ（40mM トリ
ス ,pH7.5,0.1M NaCl,10mMMgCl2,10mM ２−メルカプ
トエタノール）中に溶解され、そし同じ緩衝液の200容
量に対して透析された。
透析された溶液は、緩衝液Ｂで平衡化されたDEAE−セル
ロース（ワットマン DE−52［Whatman DE−52］）の30
mlを充填した2.5×20cmカラムにかけられた。カラム
は、吸着されていない物質を除去するために緩衝液Ｂで
洗浄された。酵素は、直線的NaCl変化度（40mM トリス
,pH7.5,10mM MgCl2,10mM ２−メルカプトエタノール
中の0.01〜0.50M NaCl）で溶出された。それぞれの緩衝
液成分の容量は75mlであり、流速は0.50ml/分であっ
た。分画が述べられたような酵素活性に関して検定され
た。ピーク活性は、約0.3M NaClで表われた。酵素活性
を含む分画はプールされ、そして該プールは(NH4)2SO4
で40％飽和とされた。２時間の攪拌の後に、沈澱した物
質が12,000Xgで30分間遠心分離することで集められた。
ペレットは、最小容量の緩衝液Ｂに溶解され、そして次
にバイオ−ゲル Ａ−1.5m［Bio−Gel A−1.5m］を充填
された1.0×120cmカラム（床容量86ml,バイオ−ラッド
ラボラトリーズ［Bio−Rad Laboratories］，カリフ
ォルニア州リッチモンド）にかけられた。カラムは0.10
ml/分の速度で緩衝液Ｂを用いて展開された。分画は酵
素活性に関して検定され、ピーク活性を含む分画がプー
ルされた。等容量の100％飽和(NH4)2SO4溶液がゆっくり
と添加された。氷上で２時間の後、沈澱した物質が、1
2,000Xgで30分間遠心分離することにより集められた。
ペレットは最小容量の50mM KH2PO4、pH7.3、1mM EDTA中
に溶解された。溶液1ml当たり0.496gの固相電気泳動純
度の尿素（バイオ−ラッド［Bio−Rad］，カリフォルニ
ア州リッチモンド）がゆっくりと添加され、プールの最
終尿素濃度が6.0Mにされた。プールは、基質の添加後５
分間の間何らの酵素活性も視識されなくまるまで、氷上
に保たれた。変性された酵素プールは次に、セファデッ
クスＧ−75［Sephadex G−75］を充填された1.0×120cm
カラム（床容量84ml,ファラマシア ファイン ケミカ
ルズ［Pharamacia Fine Chemicais］，ニュージャージ
ー州ピスカタウェイ）にかけられた。カラムは、6.0M尿
素、50mM トリス 、pH7.6、0.15M NaCl、1mM EDTAを
用いて0.10ml/分の流速で展開させられた。分画は、M15
との相補活性に関して検定された。相補活性を含む分画
がプールされた。この分画プールは1mM NH4HCO34lに対
して３回透析され、そして凍結乾燥された。
7.3.チロキシン免疫検定法 ｍ−マレイミド−ベンゾイル−Ｌ−チロキシン−H6の酵
素−ドナー結合体は以下のようにして調製された。
Ｌ−チロキシン（遊離酸）（680mg）が、無水メチルア
ルコール（6.0ml）を用いて転化され、そして該溶液が
乾燥塩化水素の活発な蒸気を用いて飽和された。冷却の
後、飽和手順が繰返され、そして溶媒が減圧下に除去さ
れた。得られた結晶性の沈澱物は濾去され、無水エチル
アルコールを用いて洗浄され、次にエチルエーテルで洗
浄され、そして最後に乾燥された。乾燥されたチロキシ
ンメチルエステルハイドロクロライドは、50％水性エチ
ルアルコール中に溶解されそして溶液は2N水酸化ナトリ
ウム（１当量）で処理された。おびただしい量の白色沈
澱が直ちに形成されそして付加的な水が、沈澱を完全に
するために添加された。沈澱したＬ−チロキシン メチ
ルエステル遊離塩基を１時間冷却下に静置した後、該生
成物が遠心分離により回収されそして真空下に乾燥され
た。Ｌ−チロキシンメチルエステル遊離塩基（10mg）と
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド エステル（MBSE）5mg（ピエース ケミカル カ
ンパニー［Pierce ChemicalCo.］，イリノイ州ロックフ
ォード）が、無水テトラヒドロフラン1.0mlに溶解さ
れ、続いて粉未無水炭酸ナトリウム10mgが添加された。
混合物は30分間還流された。蛍光指示薬および溶媒系と
しての酢酸エチルを含むSiの 250F TLC ペレート 50
×20cm（ベーカー［Baker］，ニュージャージー州フィ
リップスバーグ）を用いる、シリカゲルＧを利用する薄
層クロマトグラフィー（TLC）による反応混合物の調査
は、反応が約70％完了したものであることを示した。Ｌ
−チロキシン メチルエステル遊離塩基とMBSFとの生成
物である、ｍ−マレイミド−ベンゾイル−Ｌ−チロキシ
ン（MBTM）はクロロホルム：メタノール混合物を溶離溶
剤として用いてシリカゲルカラムにより精製された。単
離されたMBTMの薄黄色の粉末は、TLCにより検定された
場合約80％純度であり、そして、MBSEあるいはＬ−チロ
キシンメチルエステルのいずれとも完全に異なるRfを有
していた。このMBTMは、蛍光指示薬を含むシリカゲルＧ
における短波長紫外線での吸収においてチロキシンに関
する特有の橙色を与え、またニンヒドリン陰性およびマ
レイミド基の存在は、5,5′−ジチオビス−（２−ニト
ロ安息香酸）を用いてシステインと反応するそれの能力
によって確認された。
H6酵素−ドナー ポリペプチド（10μｇ）が、0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液、pH7.0の0.15ml中に溶解された。
攪拌された上記の溶液に対し、テトラヒドロフラン1.0m
l中のｍ−マレイミドベンゾイル−Ｌ−チロキシン メ
チルエステル 0.3mgの５μｌアリコートの２つが添加
された。室温で１時間攪拌した後、反応混合物はバイオ
−ゲルＰ−２カラム［Bio Gel P2 column］（バイオ−
ラッド、カリフォルニア州リッチモンド）0.6×16.0cm
上で精製され、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液、pH9.0を
用いて溶出された。10滴分画が集められた。それぞれの
分画のアリコートが、EA23二量体および０−ニトロフェ
ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの存在における相補
活性に関して検定された。分画10および11が最も高い相
補活性を含んでおり、そしてこれらがプールされた。
この実施例は、酵素ドナーとしてのH6−チロキシン結合
体、酵素アクセプターとしてのEA23、抗チロキシン抗
体、および一連の濃度のチロキシンを用いる、検体とし
てのチロキシンに対する免疫検定を例示するものであ
る。
該検定のための試薬は、以下のように調製された。
Ｌ−チロキシン標準:2.6mgL−チロキシン（シグマケミ
カル、ミズーリー州セントルイス）が無水エタノール20
0μｌに溶解された。次に0.15M NaHCO3800μｌが添加さ
れそして混合物は25℃で保存された。チロキシンの２倍
希釈が、エタノール:0.15M NaHCO3（1:4）で調製され
た。
Ｌ−チロキシン抗体−チロキシン（T4）に対する抗血清
がウェスタン ケミカル リサーチ コーポレーション
［Western Chemical Research Corp.］、コロラド州デ
ンバーから購入された。いくつかのロットが力価に関し
て試験され、そして平衡定数がIgM Sorb（エンザイムセ
ンター［Enzyme Center］、マサチューセッツ州マルデ
ン）を用いてのラジオイムノアッセイにおいて決定され
た。ロット群は、1:100から1:8000の力価で変化した。
平衡定数は4.5×108LMから１×1010L/Mで変化した。力
価1:8000（ゼロ結合＝67％）で、Keq＝２×1010L/Mであ
るロットナンバーA420が用いられた。
EA23アクセプター酵素：保存緩衝液中の6.3×10-7Ｍ。
基質:0−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
（ONPG）は2.5×Ｚ緩衝液に溶解され最終濃度10mg/ml溶
液とされた。
検定は、微小力価プレート（ダイナテック カタログナ
ンバー001−012−9200 アメリカン サイエンティフィ
ック プロダクツ、カリフォニア州サニーヴェール［Dy
natech Cat＃ 001−012−9200 American Scientific P
roducts,Sunnyvale CA）中で行なわれ、そして414nmフ
ィルターを備えたティタータック マルチスキャン微小
力価プレート リーダー［Titertak Multiscan microti
terplate reader］（フロウ ラボラトリーズ、メリー
ランド州ロックビル［Flow Laboratories,Rockvill,M
D］）において読み取られた。それぞれのウェル（窪み
［well］）に対し0.05％トウイーン 20［Tween 20］
（ポリオキシエチレン ソルビタン モノラウレート）
（シグマケミカルカンパニー、ミズーリー州リセントル
イス）を含むPM2緩衝液が添加された。それぞれのウェ
ルに対して、連続的に、H6−チロキシン結合体2.5μ
ｌ、抗チロキシン抗体2.5μｌ、チロキシン標準2.5μｌ
およびEA2340μｌが添加された。結果は第３表に示され
る。
8.実施例:B型肝炎ウィルス表面抗原検定 この実施例は、酵素ドナーとしてＮ−末端あるいはＣ−
末端融合タンパク質を用いての、Ｂ型肝炎ウィルス表面
抗原（HBV−SAg）を測定するための免疫検定法を例示す
るものである。
8.1.N−末端融合体 非反復のEcoRI部位において挿入されたHBVの完全ゲノム
を含むpBR322がHincIIで開裂された。フラグメントＢ
（スニンスキーら［Sninskey et al.］、上記）は、pUC
13の非反復のHincII部位中にクローニングされた（メッ
シング［Messing］1983年，上記）。このクローンか
ら、HBV−SAg遺伝子のほとんどを含むBamHI−AhaIIIフ
ラグメントが、BamHIおよびSmaＩで消化されたpUC13中
に挿入された。この組換え型DNAプラスミドp122がエシ
ェリキア・コリのJM83株中へ形質転換され、そしてHBV
−SAg酵素−ドナーによる生体内相補を示す、Xgalプレ
ート上のライトブルーのコロニーが選択された。このク
ローンMG122は、アボット アウスザイム II（１）試
験［Abbott Auszyme II（１）test］（アボット ラボ
ラトリーズ，［Abbott Laboratories］，イリノイ州シ
カゴ）における交差反応によってHBV−SAgを含むことが
明らかにされた。このHBV−SAgα−ドナ−融合体は、大
量の融合体を生成するために他の発現ベクター中へ移入
されることができる。
8.2.C−末端融合体 例えば、Ｂ型肝炎表面抗原（HBV−SAg）は、酵素ドナ−
ポリペプチドのカルボキシ末端でクローニングされ得
る。用いられ得る一つの処方は、例示的実施例として以
下に簡単に概要される。
1.2kb FnuDIIフラグメントが、完全HBVゲノムのクロー
ンから単離されそしてpBR322中に挿入された。S1ヌクレ
アーゼおよび子ウシ腸ホスファターゼで処理された、p1
25のPvuＩ部分消化物が次に、完全な長さの線状分子を
得るためにアガロースゲル精製された。P125の線状DNA
へのFnuDIIフラグメントの連続に続き、このDNAはエシ
ェリキア・コリ（例えばJM83）中へ形質転換される。Xg
alプレートにおいて30℃で白色でかつ42℃で青色のアン
ピリシン耐性のコロニーが次に選択され、HBV−SAgにお
ける産生に関してスクリーニングされた（例えば、アボ
ット アウスザイム II試験）。融合タンパク質は、次
に相補性に関し検定する標準的イオン交換およびアフィ
ニティカラム技術によって精製された。
8.3.HBV−SAgに関する酵素免疫検定 試料中のHBV−SAgの存在あるいは量を測定するための免
疫検定法が、関心の試料中の未知のHBV−SAgをα−HBV
−SAg融合タンパク質と、対応抗原に関して競合させる
ことにより作成された。活性なβ−ガラクトシダーゼを
生成するようにEA23を相補するのに有効な遊離α−HBV
−SAgタンパク質の量は、計測される未知の遊離HBV−SA
gの量に逆比例するであろう。
9.実施例：肝炎Ｂ型ウィルス コア抗原検定法（アッセ
イ） 肝炎Ｂ型ウィルス（HBV）ゲノムDNAを制限酵素BamHIお
よびEcoRIで切断して２個の大きなDNAフラグメントを産
生した。これらの大きなフラグメントの１つは、コア抗
原をコードするコア遺伝子を運搬する（HBV−CAg）。こ
のフラグメントをM13 mp10RF DNAの多クローニング部位
に挿入した。このHBV挿入物を運搬するM13ファージの選
択およびスクリーニング後、小量のファージを精製し
た。コア遺伝子の（−）極性鎖（メッセンジャーRNAの
反対極性）を運搬する一重鎖DNAをファージから単離し
た。
大部分の遺伝子のように、コア遺伝子はATGコドン（遺
伝暗号）から始まる。コア遺伝子がクローニングされた
発現ベクターは、すでにATGコドンを与えられているの
で第２コアコドンから始まるDNAフラグメントを得るこ
とが必要であった。このことは、コア遺伝子のコドン２
−５の（＋）鎖（メッセンジャーRNAと同一極性）を示
す12個の塩基対。一重鎖オリゴマーを合成することによ
り達成された（GAGATTGACCCT）。このオリゴマーは一重
鎖M13ファージDNAへ交雑され、エシェリキア・コア（E.
Coli）DNAポリメラーゼＩ（クレノウ フラグメント）
により試験管内で［in vitro］拡張された。この調製
物を、コア遺伝子３′の外部のHBV DNAを翻訳終結コド
ンに切断するHincDIIで消化した。その後に、ヌクレア
ーゼS1は、一重鎖DNA5′をコア遺伝子の第２コドンに消
化するために使用された。これは、686の塩基対フラグ
メントおよび多数の小さな種々の長さの二重鎖フラグメ
ントを残す。686の塩基対フラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動法により精製された。使用されたプラスミド
発現ベクターは、PrプロモーターおよびATG出発コドン
を制限酵素BamHIの次に運搬した。ベクターをBamHIで消
化し、ヌクレアーゼS1で処理し、鈍い末端とした（ブラ
ント エンド化）ベクターとした。
ブラント エンド化発現ベクターおよびコア遺伝子フラ
グメントをT4 DNAリガーゼを使用して結合し合わせ、そ
して受容能力のあるバクテリアに移入した。得られたコ
ロニーをスクリーニングし、プラスミドを同定し、通常
の配向性でコア遺伝子を挿入した。ザ アボット コア
アンチゲン イーエルアエスエイ テスト（the Abbo
t Core Antigen ELISA test）（アボット ラボラトリ
ーズ）により、コロニーは細胞溶解産物中の抗原タンパ
ク質の存在に関し試験された。プラスミドp152を含有す
るMG152として呼称される強力な免疫反応陽性クローン
が選択され、DNA配列はマキサム−ギルバート（Maxam−
Gilbert）DNA配列法により確認された。コア抗原は精製
され、抗体を生殖するために使用された。
pF29のα領域のアミノ末端における制限部位のいずれも
がα領域とコア遺伝子との融合に適さないために、α遺
伝子のアミノ末端において多クローニング領域中の異な
る制限部位を有する第２プラスミドを構成することが必
要であった。pUC13をEcoRIで消化し、粘着性末端をDNA
ポリメラーゼ ラージ フラグメント（クレノウフラグ
メント）に全ての４つのdNTPsを加えたもので満たし
た。PvuII8bp（GCAGCTGC）リンカーDNAはこの部位に結
合した。この修飾プラスミドを、BamHIとPvuIIで消化
し、多クローニング部位にPvuIIリンカーを加えたα−
断片のＮ−末端を単離した。pF29プラスミドDNAを同様
にBamHIとPvuＩで消化し、pF29α−領域を除去し、α領
域のＮ−末端の多クローニング領域中に新規配列を含む
α−領域と置換した。この新しいプラスミドは、p154と
呼称された。
コア−α融合たん白質を構成するために、Pr制御下のp1
52からのコア遺伝子をp154のα−遺伝子の多クローニン
グ部位に挿入した。p154DNAを制限酵素BclＩとAvaＩで
消化した。この切断により生じた介在DNAフラグメント
は、大部分のCI遺伝子およびPrプロモーターにコア遺伝
子を加えたものを運搬するがコア遺伝子の４つの３′−
末端コドンを運搬しない。このDNAフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動法により精製した。プラスミドp154
を制限酵素BclＩおよびXmaＩで消化し、介在片を除去
し、p152からのBclＩ−AvaI DNAフラグメントと置換し
た。これゆえ、４つの末端３′コドンのないPr制御下の
コア遺伝子は、HBVコア抗原−α融合ペプチドを発現す
る枠内遺伝子融合を生成するp154のα−領域の多クロー
ニング部位に挿入された。この新しいコア−αを発現す
るプラスミドをプラスミドp157と称する。融合ペプチド
を精製し、第8.3節の方法に類似する方法で肝炎コア抗
原用イムノアッセイ（immunoassay）を抗体とともに構
成するために使用可能である。
10.実施例：ヒト絨毛性ゴナドトロピンのための免疫検
定 10.1.製剤 組換法によるヒト絨毛性ゴナドトロピン酵
素ドナー融合ペプチド類 この実施例は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（β−hCG）
のための免疫検定に使用するβ−hCG融合ペプチド類の
構成を示す。
hCGは、α（16,000ドルトンMW）およびβ（22,000ドル
トンMW）と呼称される２つの非共有結合性結合サブユニ
ットから成る糖タンパク質である。αサブユニットは一
般にhCGおよび関連する糖タンパク質、ロイトロピン（L
H）、チロトロピン（TSH）およびフォリトロピン（FS
H）に共通である、これらホルモンのβサブユニット
は、別個のものであるけれども、高度のアミノ酸相同を
含んでいる。しかしながら、hCGのβサブユニットは、
カルボキシ末端に非反復の30のアミノ延長を含んでい
る。
この非反復配列は、組換えDNA技術により構成された。
４つのDNAフラグメントは、アプライド バイオシステ
ズ インコーポレーテッド（Applied Biosystems,Inc）
社のモデル380A DNAシンセサイザー（第6.1.4節で説明
した）で合成され、次の配列を有する： （ａ）hCGS1（62 mer） ５′AATTCCAGGACTCCTCTTCCTTCAAAGGCCCCTCCCCCCAGCCTTC
CAAGCCCATCCCGACTC3′ （ｂ）hCGS2（37 mer） ５′CCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCACAATAAG3′ （ｃ）hCGNI（62 mer） ５′CCCGGAGTCGGGATGGGCTTGGAAGGCTGGGGGGAGGGGCCTTTGA
GGAAGAGGAGTCCTGG3′ （ｄ）hCGN2（37 mer） ５′TCGACTTATTGTGGGAGGATCGGGGTGTCCGAGGGCC3′ DNAフラグメント（ａ）と（ｂ）が結合し、フラグメン
ト（ｃ）と（ｄ）が結合した。これら２つの相補的DNA
鎖は、アニーリングされて下に示されたβ−hGGサブユ
ニットの30アミノ酸カルボキシ末端延長をコードするDN
Aフラグメントを形成した： DNAフラグメントは、次の翻訳終止コドンTAAの３′端に
５′EcoRI制限酵素部位およびSalＩ制限酵素部位を含
む。
このDNAフラグメントを第９節で述べたプラスミドp154
に挿入した。プラスミドp154をEcoRIおよびSalＩで切断
し、酵素ドナー（ED）遺伝子からω−領域を除去し、ア
ガロースゲル精製した。EcoRI−SalＩβ−hCG DNAフラ
グメントをゲル精製p154ベクターと連結した。
得られたプラスミド、p166と称するは、ED−βhCGカル
ボキシ末端融合ペプチド（第20図参照）をコードする遺
伝子を含む。酵素ドナーペプチドED166は93のアミノ酸
を含む；下記のようにアミノ酸の１〜63番目はα−ドナ
ードメインをコード化し、アミノ酸の64（＊）〜93番目
はβ−hCGカルボキシ末端をコード化する。
第２β−hCG融合ペプチドを第１に次の配列のDNAフラグ
メントを合成することにより構成した： プラスミドp154をBamHIとPvuＩとで切断し、小さなα−
ドナー領域をゲル精製した。BamHI−PvuIフラグメント
をDNA合成フラグメントと連結した。このフラグメント
をBamHI−EcoRIで切断し、還元α−領域ドメインをp166
のBamHI−EcoRIα−ドメインで置換した。得られたプラ
スミド、p175と称するは、85アミノ酸の酵素ドナー（ED
175）をコード化する。下に示すように、アミノ酸の１
〜55番目はα−ドナードメインをコード化し、アミノ酸
の56（＊）〜85番目はβ−hCGペプチドのタンパク質を
コード化する： β−hCGカルボキシ末端配列に融合した他のα−ドナー
ドメインは、第6.1.4節および第11図に記載したH6 α
−ドナードメインと同じアミノ末端を共有する。ED H6
を含むプラスミドp169をBamHIとEcoRIで切断し、直線状
ベクターを精製した。合成DNAフラグメント、H6 pM、は
次の配列であり： プラスミドp169に挿入された。この合成DNAフラグメン
トの挿入はEcoRI部位を破壊したがアミノ酸配列を変化
させなかった。それゆえ、得られたプラスミドはEcoRI
部位を有しない。α−ドメインをBamHIおよびPvuIでの
消化によりこのプラスミドから除き、p154のBamHIおよ
びPvuＩでの消化（p175の構成で上記に記述）の後、p15
4中へ置換してp174を形成した。
プラスミドp174は、51アミノ酸のα−ドナードメインを
コード化し、酵素ドナーのαとω領域の間にEcoRI部位
を有する。α−ドナードメインをBamHIとEcoRIでの消化
によりp174から除き、ゲル精製した。プラスミドp166を
BamHIとEcoRIで消化し、p174からのα−ドナードメイン
をp166に挿入した。得られたプラスミドp177は、カルボ
キシ末端β−hCGDNA フラグメントに融合したα−ドナ
ードメインを含む。この酵素ドナーペプチドED177は81
のアミノ酸を含む。このように、ED177はED175より４つ
のアミノ酸だけ短いものである。
10.2.ヒト絨毛性ゴナドトロピン検定 この実施例は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）のた
めの高感度な均質系のクローン化酵素ドナー免疫検定を
示す。さらに、この実施例において第２抗体（ウサギ
抗−hCG）の付着はEA22との相補の抑制効果を高める
（下の第14節を参照）。
β−hCG酵素ドナーを第10.1節の記載のように構成し
た。この実施例において、ED175を酵素ドナーとして使
用した。
免疫検定は微小力価形態を使用して行なった。
50μｌの適切な濃度のhCG（１×103、３×103および５
×103mIU）;50μｌの1:100希釈ポリクローナルウサギ
抗hCG抗体（ロットナンバー 01−302−57,イムノサー
チ ニユージャージ州トムスリサーチ（Immunosearch,T
oms River,NJ））および50μｌのED175（１×108Ｍ）を
加えて免疫検定を行なった。全ての希釈度はPM2緩衝液
におけるものであった。反応混合物を37℃で30分間イン
キュベートした。50μｌの1:10希釈液のヤギ抗ウサギ抗
体を加え（アンチボディーズ インコーポレーテッド，
カリフォルニア州ディビス（Antibodies,Inc.,Davis,C
A））、そして反応混合物を37℃で30分間インキュベー
トした。そしてその混合物を50μｌの酵素アクセプター
EA22（１×10-7Ｍ）およびONPG基質（5mg/ml）と反応さ
せた。微小力価プレートを37℃でインキュベートしそし
てOD414を測定した。
結果を第21図に図面で示した。この実施例は、均質系の
免疫検定の使用に適する服用量−応答曲線を示す。この
検定は腫瘍マーカーとしてまたは妊娠の指示薬のいずれ
かとしてhCG用テストとして使用し得る。
11.実施例：ビオチンに対する検定 この実施例は、検体結合タンパク質として糖タンパク質
アビジンを使用するビオチンに関する競合的結合検定を
示す。
アビジン（MW＝67,000ダルトン）は、会合定数1015L/M
で、ビオチン（MW＝244ダルトン）と結合する。ビオチ
ンをH6の位置65のリジンおよびＮ−末端α−アミノ基と
結合させた。酵素ドナーにカップルリングしたアビジン
がEA23との相補を抑制したかどうかを決定するために、
検体結合タンパク質として溶液中のアビジンを使用し
た。
ビチオンと酵素ドナーH6とのカップリングを次のように
行なった。第６節の記載のように調製した凍結乾燥化H6
を0.15mlの0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.5で溶解し、室
温で攪拌した。N,N−ジメチルホルムアミド（DMF）中で
10mg/mlのＮ−ヒドロキシヌクシニミドビチオン（シグ
マ ケミカル，セントルイス，ミズーリー州（Sigma Ch
emical,ST.Louis,MO））の５μｌアルコート２つを加え
た。室温で１時間放置後、その溶液を遠心分離処理し、
上澄液をpH9.0の0.1Mホウ酸ナトリウムで平衡にしたバ
イオゲルＰ−２（Bio−Gel P−２）（0.6×16cm）サイ
ジング（バイオラッド ラブス，リッチモンド，カルフ
ォルニア（Bio−Rad Labs,Richmond,CA））に加え、同
じ緩衝液で溶出させた。10滴の分画を集め、ビオチニル
−H6結合体を含む分画（すなわち、相補活性）をプール
した。
予備実験において、相補性の抑制に必要なアビジン濃度
を決定するために滴定が行なわれた。PM2緩衝液、ビオ
チニレート化H6、アビジン、EA23および基質０−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを微小力価プレ
ートに加えた。37℃で15分間後、414nm（OD414）におけ
る光学密度を測定した。第４表は、それらの結果を示
す。このデータは、0.5μｇのアビジン（7.5×10-12モ
ル）が相補反応を75％抑制することを示す。
（ａ）記載のごとく調製された2.5μｌのビオチニレー
ト化H6;20μｌのEA23（3.6×107Ｍ）；および100μｌの
基質Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノサイ
ド（ONPG）（10mg/ml）を使用した（ウェル当り）。十
分なPM2緩衝液を最終容積200μｌになるように各ウェル
に加えた。
遊離Ｄ−ビオチン（シグマ ケミカル，セントルイス，
ミズーリー州（Sigma Chemical,St.Louis,MO））濃度を
変化させて加えて競合的結合曲線を描いた以外は、ビオ
チン用競合的結合検定を予備実験用に記載した方法で行
なった。これゆえ、各ウェルは５μｌのビチオン−H6:
0.5μｇのアビジン;20μｌのEA23（3.6×10-7Ｍ）;100
μｌのONPG（10mg/ml）基質、および１〜８μlD−ビオ
チン（１μg/ml）と十分なPM2緩衝液を加えて全容積約2
00μｌとしたものを含む。15分間後、光学密度（414n
m）を測定した。データを第６図の図面で示す。以上の
ようにこの検定系は、１〜8mgまたは４〜32×10-12Ｍの
ビオチン用の良好な検定を提供する。アビジン−ビオチ
ン系（Ka＝２×1015L/M）は、15分間検定以内で相補性
（Ka＝１〜２×105L/M）を制御するのに十分な親和性を
有する。
12.実施例：ビオチンのための不均質系の相補性検定 この実施例は、特異検体結合タンパク質としてアビジン
を使用するビオチンのための不均質系の検定系を示す。
酵素アクセプターはEA23であり、酵素ドナーはビオチン
にカップリングしたCNBr2である（以後、CNBr2−ビオチ
ン結合体と称する）。
CNBr2−ビオチン結合体を次のように合成した:900μｇ
の親水化CNBr2ポリペプチドをpH7.5の300μｌの0.1Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液に溶解させた。2.1mgの［Ｎ−ヒ
ドロキシ−（ｄ−ビチオン スクシミド エステル、ま
たはＮ−ヒドロキシスクシミドビオチン）スクシミド活
性化ビチオン（シグマ ケミカル コーポレーション、
セント ルイス，ミズーリー州［Sigma Chemical Co.,S
t.Louis,MO］）］を含む200μｌアリコートのN,N−ジメ
チルホルムアミド（DMF）を室温で攪拌しながら200μｌ
アリコートづつ加えた。２時間後、反応混合物をpH9.0
の0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液を使用するバイオゲル
Ｐ−２（Biogel P−２）カラムのグラマトグラフィーに
かけた。CNBr2−ビオチン結合体を含む分画をEA23との
相補反応により同定した。
アビジン固定化アガロース（アビジン−アガロース，シ
グマ ケミカル コーポレーション，セントルイス，ミ
ズーリー州［Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO］１μｌ
懸濁液当り17.5ユニット（１ユニットは１μｇのビオチ
ンを結合する。））仕入品を、低ゲル化温度アガロース
懸濁液（6mg/ml）で希釈して所定レベルのアビジン−ア
ガロースを得た。
12.1.アビジン−アガロースによるCNBr2−ビオチン相補
活性抑制 20μｌのCNBr2−ビオチン結合体貯蔵品（５×10
-7Ｍ）、90μｌのPM2バッファーおよび20μｌの各種希
釈度のアビジン−アガロースをエッペルドルフ（eppend
orf）バイアル（小びん）中で充分に混合し、室温で10
分間インキュベートした。その後、バイアルを５分間遠
心分離機にかけて100μｌの上澄液を各バイアルから除
いて各々10μlEA23貯蔵品（1.5×10-6Ｍ）を含む微小力
価ウェルに入れ、37℃で15分間インキュベートした。そ
の後、ONPG（10mg/mlのものを100μｌ）を加え、414nm
において各ウェルの吸収を37℃で30分間後測定した。そ
れらの結果を第７図の図面で示す。
12.2.固定化アビジンに関するCNBr2−ビオチン結合体と
ビオチンの競合 上記のごとく決定した力価を使用して、ビオチン投与量
応答曲線は、下記のように得られる。20μｌのアビジン
−アガロース懸濁液（全量0.35ユニット）および90μｌ
の各種レベルのビオチンを含有するPM2緩衝液をエッペ
ンドルフバイアル中で充分に混合し、室温で10分間イン
キュベートした。その後20μｌのCNBr2−ビオチン結合
体貯蔵品（５×10-7Ｍ）を加え、充分に混合し、室温で
10分間インキュベートした。バイアルを５分間遠心分離
機にかけ、100μｌの上澄液を各バイアルから除いて各
々10μlEA23貯蔵品（1.5×10-6Ｍ）を含有する微小力価
ウェルに入れ、37℃で15分間インキュベートした。基質
ONPG（10mg/mlのものを100μｌ）を加え、各ウェルの
吸収を414nmで、37℃で30分間インキュベートした後に
測定した。投与量応答曲線を第８図の図面で示す。その
ような曲線は、未知サンプル中のビオチン量を定量する
ために使用し得る。
13.実施例：ジゴキシンのための酵素免疫検定 この実施例は、検体が強心性ジギタリス グリコシドジ
ゴキシンであるエンザイム イムノアッセイ（酵素免疫
検定法）について示す。検体結合タンパク質は、ジゴキ
シンに特異な抗体である。さらにこの実施例は、検定の
作用機構がカストロおよびモンジ（Cartro and Monji）
により記載されたβ−ガラクトシダーゼを使用する立体
障害エンザイムイムノアッセイとは類似していないこと
を示す（1981,メソッドス イン エンザイモロジー73:
523−42（Methods in Enzymology 73:523−42））。
13.1.ジゴキシン−H6結合体の調製 下式で表わされるジゴキシゲニン、特に３−ｏ［ｍ−マ
レイミドフェニルカルバミル］ジゴキシゲニンのウレタ
ン誘導体 ［以後、「ジゴキシン−マレイミド付加物」と称する］
を次のように調製した。
マグネット攪拌装置、アルゴン入口および還流冷却器を
備えた、乾燥10ml丸底フラスコへ、３−カルボキシフェ
ニルマレイミド（67mgまたは0.307mモル）、乾燥ベンゼ
ン（3ml）および乾燥トリエチルアミン（0.043mlまたは
0.307mモル）を加えた。混合物を30分間還流した。アリ
コートの赤外線スペクトル分析（IR）はカルボニルアジ
ド（2150cm-1）への転化を示した。ジゴキシゲニン（80
mgまたは0.205mモル）および乾燥テトラヒドラフラン
（2ml）をその後反応混合物に加えた。3.5時間の還流
後、反応混合物を酢酸エチル（100ml）で希釈し、50ml
の冷却１％NaOH水で一度洗浄し、50ml飽和NaHCO3水で一
度洗浄した。その後、有機相を無水MgSO4上で乾燥し濾
過し、溶媒をロータリーエバポレータを使用して除い
た。残留物を約１〜2mlのアセトンに溶解し、２つの調
製用薄層クロマトグラフィー（TLC）プレート（1500
ミクロン シリカゲル アナルテック ユニプレート，
アナルテック，ネワーク，デラアェアー（1500 micron
silica gel Analtechuniplate,Analtech,Newark,D
E））にかけた。アセトンの蒸発後、プレートを80/20＝
酢酸エチル／ベンゼンで溶出した。未反応ジゴキシゲニ
ンをプレートから、プレートからの補正UV活性帯をこす
り取ることにより除き、30mlの酢酸エチルで３回洗浄し
た。この方法を上記ジゴキシゲニンの次の二つのスポッ
ト用に繰り返した。この精製は、ジゴキシゲニン（26m
g）、好適な産品ジゴキシン−マレイミド付加物（31mg
または未反応出発物質に対して37％の収率）および12−
ｏ−（ｍ−マレイミドフェニルカルバミル）−ジゴキシ
ゲニン（28mgまたは未反応出発物質に対して33％の収
率）を与えた。
薄層クロマトグラフィーは、2.5％MeOH-CH2Cl2中でジゴ
キシン−マレイミド付加物純度を確かめるために実施さ
れた。もしさらに精製が必要であれば、３％MeOH/CH2Cl
2（２溶離）を有する調製用TLCによって最高に達成され
る。ジゴキシン−マレイミド付加物は、次にスペクトル
特性を示した： IR（nujol mull）:3490,3350,1805,1760,1725,1700,161
5,1550,1460,1305,1240,1160,960,935,905,880,840,81
0,790,710cm-1．（NMR,核磁気共鳴 アセトン d6）:0.
8（3H,s）,0.93（3H,S）,3.38（1H,brs）,3.40（1H,q,j
＝4.78Hz（,4.84（2H,t,j＝1.5Hz）,5.00（1H,m）,5.78
（1H,t,j＝1.5Hz）,6.98（s,2HO）,6.8−7.7（4H,m）,
8.75（1H,br s）．マススペクトル（CDI−NH3）:622
（Ｍ＋NH4 +）,605（Ｍ＋H+）,587（Ｍ＋H+−H2O）,391,
373,355,337,214,191,189. ジゴキシン−マレイミド付加物をベックマン モデル33
2高性能液体クロマトグラフィーシステム（ベックマン
インストルメンツ，インコーポレーテッド，パロ ア
ルト，カルフォルニア（Beckman Instrument,Inc.,Polo
Alto,CA）を使用するRP−８シンクロパック 250×10m
mI.D.（シンクロム，インコーポレーテッド，リンデ
ン，インジアナ（SynChrom,Inc.,Linden,ID））でさら
に精製した。勾配溶離を1.5ml/分の流速で60分以上かけ
てH2O中の０〜80％アセトニトリルで実施した。ジゴキ
シン−マレイミド付加物をプールし、凍結乾燥した。
その後、精製ジゴキシン−マレイミド付加物を上記のご
とく調製した酵素ドナーH6とカップリングさせ、酵素ド
ナー検体結合体であるジゴキシン−H6を形成した。H6
（1.5mg）をpH6.0で240μｌのアセトニトニル−50mMリ
ン酸ナトリウム（3:2）に溶解した。ジゴキシン−マレ
イミド付加物（1.0mg）を37℃で２時間保持した反応混
合物に直接加えた。カップリング反応が完了後、60μｌ
アリコート混合物をボンダパック フェニルカラム（Bo
ndapak Phenyl column）10×30cm（ウォーターズ ア
ソシエーツ，ミルフォード，エムエイ（Water Associat
es,Milford,MA））に注入した。カラムを60分間H2O中の
勾配０〜80％のアセトニトリル、0.1％トリフルオロア
セテックアシッドで展開した。酵素ドナー活性を含有す
るサンプルをプールした。
13.2.ジゴキシンのための免疫検定法 本発明の方法により調製された酵素免疫検定系におい
て、酵素アクセプターおよび酵素ドナー結合体（すなわ
ち、検体にカップリングした酵素ドナー）濃度の異なる
組合せは、相補プロセスにより与えられたβ−ガラクト
シダーゼ濃度を生じるために使用し得る。質量作用の法
則は、酵素アクセプターの比較的高濃度状態で、相補プ
ロセスにおける抗体の抑制効果が緩和されることを必要
とする。このことは、検体、例えばジゴキシンの変化す
る濃度に対し投用量応答特性が平坦またはないというこ
とにより明らかである。反対に、酵素ドナー結合体の比
較的高濃度状態（抗体に対して）で、相補プロセスにお
ける抗体の抑制効果も失なわれる。後者の状況は、投用
量応答特性が平坦またはないということにより、そして
高められたバックグラウンドによっても明らかである。
この実施例は、従来のエンザイムイムノアッセイの如く
酵素アクセプター、酵素ドナー、および特異抗体の相対
濃度が検体に関する診断学的検定の使用に好適な精度
（傾き）および感度を有する服用量応答特性を示す検定
をつくり出すために規定されなければならないことを示
す。微小力価形態を使用する一連の実験において、シス
テム感度をジゴキサン−H6酵素ドナーとEA23酵素アクセ
プター濃度の異なる組合せを使用して決定した。
各々50μｌのジゴキシン（検体）、酵素ドナーH6ジゴキ
シン結合体、ジゴキシンに特異な抗体（抗ジゴキシン）
および酵素、酵素アクセプター（EA23）および基質とし
てのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピイラノシ
ド（ONPG）5mg/lを含む溶液の４つを順次加えて検定を
行なった。全ての希釈はPM2緩衝液［0.5MNa2HP4、1mM M
gSO4、0.18mM MnSO4、1mM EDTA、0.02％ NaN3および0.
05％のトウーン20（Tween 20）（ポリオキシエチレン
ソルビタン モノラウレート，シグマ ケミカル コー
ポレーション，ミズーリー州セントルイス（polyoxyeth
ylene sorbitan monolaurate,Sigma Chemical Co.,St L
ouis,MO）］において行なった。ジゴキシン検体濃度
は、0,1,10,100,200,500および1000mg/mlであった。ジ
ゴキシンに特異な抗体は、ジゴキシン結合体を次のよう
にウサギ中に注入することにより得られた:2.0mlの完全
フロイント（Freund）アジュバント（補助薬）の全容積
中の50μｇの結合体を使用して初回の筋内注入を行なっ
た。ブースター（筋内）を1.0mlの完全フロイントアジ
ュバンドの全容積中の25μｇの結合体でもって４週間間
隔で投薬した。50mlの血を初回の注入から90日間、２週
間ごとに集めた。内側動脈の切開または耳周縁静脈の切
開により集めた。血液を凝結させ、30分間1000Xgで遠心
分離機にかけたのち上澄液として25ml血清/50ml血液を
回収した。
結果を第９図（ＡおよびＢ）に図面で示す。第9A図と第
9B図の投与量応答曲線を比較すると酵素アクセプターま
たは酵素ドナー結合体のいずれかの濃度を選択的に減少
すると急勾配となり、それゆえにさらに感度の高い投与
量応答曲線となることが判る。
13.3.ジゴキシン免疫検定の機構 抗ジゴキシン抗体と酵素ドナージゴキシン結合体との反
応が、重合したβ−ガラクトシダーゼ酵素による基質転
化よりも相補プロセスを妨害するかどうかを決定するた
めに、相補プロセスは一連の実験において抗体の添加前
にプロセスを完了させられた。
実験処方は次のようであった:300μｌのPM2緩衝液とジ
ゴキシン−H6結合体を60分間150μｌの酵素アクセプタ
ーEA23（4.1×10-6Ｍ）と反応させた。このことは相補
性が完了することが認められた。上記反応混合物のアリ
コート（125μｌ）を除き、ウサギ抗ジゴキシン抗体（P
M2緩衝液で1:100に希釈した）のアリコート（50μｌ）
に加えた。反応混合物をその後30分間インキュベートし
た。この期間の終了時にONPG基質（最終濃度1mg/ml）を
加え、反応混合物を37℃でインキュベートした。反応混
合物の光学密度を37℃でインキュベートし、７および16
分後に測定した。（PM2緩衝液）1:100に希釈した正常ウ
サギ血清またはPM2緩衝液のいずれかの50μｌをウサギ
抗ジゴキシン抗血清の代りに加えた以外は比較試験管を
同様に処理した。結果を第５表に示す。
第５表に示したように、あらかじめ重合したβ−ガラク
トシダーゼ（ジゴキシンH6およびEA23酵素アクセプター
の完全相補）による基質転化を抗体は抑制しない。この
ようにエンザイム アッセイを使用して観察された基質
転化の減少は抗体の抑制による相補の結果であり酵素基
質転化の減少ではない。それゆえに、本発明検定法の作
用機構は、カストロおよびモンジ（Castro and Monji）
により記載されたβ−ガラクトシダーゼを使用する立体
障害エンザイムイムノアッセイとは類似しない（1981,
メソッズ イン エンザイモロジー73:523−542（1981,
Methods in Enzymology 73:523:542））。
13.3.1.酵素アクセプターを変化させることによる抗ジ
ゴキシン抗体の相補性におよぼす効果 ある一連の実験において、ジゴキシンに対する特異抗体
の抑制効果を第7.2節および第13.1節の記載のごとく調
製した３つの酵素アクセプターおよび酵素ドナージゴキ
シン−H6を使用して測定した。
反応混合物を次のように調製した:50μlPM2緩衝液;50μ
ｌのPM2緩衝液中のジゴキシン−H6結合体の適切な希釈
度（1:20,1:40,1:80）;50μｌの適切な抗体（すなわち
抗ジゴキシン抗体または正常ラビット血清のいずれか）
および酵素アクセプター（１×10-7MEA14、EA20またはE
A22）および基質ｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラ
クトピイラノシド（ONPG）（5mg/ml）の50μｌの適切な
混合物を微小力価プレートに加えた。プレートを37℃で
特異化期間インキュベートした。414nmにおける光学密
度を５分間間隔で45分間測定した。
このシステムの抗体相補抑制効果は、酵素アクセプター
欠失の大きさに関係すると思われる。アミン酸の13−40
番目（第５図参照）を欠失し、かつこの実験で試験した
最も大きな欠失である酵素アクセプターEA22は、抗体に
より最も抑制されなかった。アミノ酸の30−37番目（第
５図参照）を欠失し、かつ試験されたグループの中で最
も小さな欠失である酵素アクセプターEA14は、抗体によ
り最も抑制された。アミノ酸の26−45番目（第５図参
照）から成り、大きさがEA22とEA14の中間であるEA20
は、相対的に適度に抑制された。しかしながら、EA20の
自然な相補効率は、EA14またはEA22のいずれのそれより
も少ない。酵素アクセプターは、２つの基準を満たさな
ければならない：（ａ）自然な相補効率（例えば、EA14
およびEA22は、等モル濃度において第５図に示された他
のものよりさらに効果がある）；および（ｂ）相補を抑
制する特異的検体結合タンパク質の能力。
14.実施例：第２抗体のジゴキシン酵素免疫検定におけ
る効果 上記第12.3節に示した結果は、抗ジゴキシン抗体の本発
明の酵素ドナージゴキシン結合体へのカップリングが酵
素アクセプターと酵素ドナー結合体の相補速度を遅くす
るということを示す。しかしながら、そのようなカップ
リングは、完全には相補を妨害しない。第13.3節で述べ
たように、このシステムは、酵素アクセプターと酵素ド
ナー結合体のほぼ15分間のインキュベーションで最も感
度が高くなる。
そのシステムは、約15分間で最大吸収差に達する。その
時抗ジゴキシン抗体が存在するシステムにおいてβ−ガ
ラクトシダーゼ濃度は、抗体が存在しないシステムまた
はジゴキシン抗体が中和されるシステムの濃度と同じで
ある（例えば、高ジゴキシンレベル）。β−ガラクトシ
ダーゼ濃度が同じであるため、基質転化率も同じであ
る。付加的な吸収差は生じない。抗体の相補効果を制限
する現象は、投与量応答曲線に対し狭い吸収範囲、平坦
な傾き特性およびある診断法に対して不十分な感度を示
す方法を提供する。
次の実施例は、抗ジゴキシン結合体抗体に特異な第２抗
体の付着が相補抑制を強めることを示す。
14.1.完全第２抗体の付着 一連の実験において、50μｌのウサギ抗ジゴキシン抗体
（1:1000に希釈）を、一組の微小力価ウエル中で50μｌ
のジゴキシン−H6（PH2緩衝液中で1:50に希釈）および
0,1,2.5,5,7.5,10,100mg/mlの範囲の50μｌのジゴキシ
ンと結合させた。50μｌアリコートの第２抗体製剤（ベ
チル ラボ，モントゴメリー，テキサス州，ヤギ抗ウサ
ギ血清1:50〜1:800（Bethyl Lab,Montgomery,TX,goat a
nti−rabbit serum 1:50−1:800））を各ウェルに加え
た。結果を第６および第７表に一覧表にする。
第６表に示されるように、第２抗体を抗体ジゴキシン−
H6結合体に付着することにより達成される相補抑制効果
は、第２抗体の1:50希釈またはそれ以下で最適である。
第２抗体の1:200〜1:300の希釈において、全ての相互抑
制が失なわれた。第２抗体ありまたはなしの相補抑制
は、この希釈においてまたはそれ以上においても同じで
ある。
第７表で示されるように、第２抗体なしでは基質転化率
（すなわち、β−ガラクトシダーゼ濃度）は30分間以内
で最大70％に達した。1:40の希釈で第２抗体を有する場
合には、基質転化率は最大約25％であった。第２抗体の
1:40希釈よりも大きい場合において、相補抑制効果は、
時間とともに基質転化率が増加することによって明らか
なように、減少した。
1:40またはそれ以上の希釈において、基質転化率が増加
するという効果がある。
試験した第２抗体の全濃度において基質転化率（すなわ
ちβ−ガラクトシダーゼ濃度）は、システムが許容する
β−ガラクトシダーゼの最大濃度以下のレベル（例えば
NRSは第２抗体に代わる）で直線状となった（すなわ
ち、新規β−ガラクトシダーゼを産生しない）。このこ
とは、第２抗体の結合が第１抗体の立体障害を高め、か
つ周囲を囲まれる酵素ドナー集団による相補を完全に妨
げるということを示す。
14.1.1.投与量応答:EA14とジゴキシン−P6 他の一連の実験において、エンザイムイムノアッセイの
感度を0,1,10,100,1000mg/ml範囲の濃度のジゴキシン
（検体）、酵素アクセプターEA14、ウサギ抗ジゴキシン
抗体および第２抗体としてのヤギ抗ウサギ抗体を使用し
て測定した。これらの実験においてジゴキシン−H6結合
体（第13節）およびEA14酵素アクセプター用に記載した
方法と類似方法で調製した異なる結合濃度の酵素ドナー
ジゴキシン−p6を使用した。各ケースにおいて次の方法
を使用した：微小力価形態において、各々50μｌのジゴ
キシン−p6、遊離ジゴキシン検体および抗ジゴキシン抗
体を順次加えた。その後、50μｌのヤギ抗ラビット（1:
80）を加えた。プレートを室温で10分間インキュベート
した。その後、各々50μｌの適切な希釈の貯蔵品EA14
（2.64×10-5Ｍ）およびｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピイラノシド（galactopyranoside）基質（5mg
/ml）を加えた。プレートを37℃で再びインキュベート
し、反応混合物の吸収を15分、30分に測定した。基質ブ
ランクの吸収を全サンプルから引いた。
第10図に示された図面の結果は、ジゴキシン検定使用に
適する服用量応答曲線を示す。
14.2.第２抗体フラグメントの付着 第２抗体が第１抗体−酵素ドナー結合体とカップリング
したときに観察された抑制の高揚が沈降素複合体中の酵
素ドナー結合体の立体障害またはエントラップメントに
帰するかどうか決定するために、ヤギ抗ウサギ免疫グロ
ブリンの単価Fabフラグメント（約50,000ドルトンMWの
抗原結合フラグメント）を第２抗体として使用した。Fa
bフラグメントが抗原と架橋できないために沈降または
凝集反応を誘導することはできない。この製剤で観察さ
れた相補のいかなる抑制も、相補に対する高められた立
体効果によるものであって結合体の高められたエントラ
ップによるものではない。
微小力価プレート形態において、各々50μｌのジゴキシ
ン（0,1,4,10,1000mg/ml）；ジゴキシン−H6結合体；ウ
サギ抗ジゴキシン第１抗体（1:4000）および1:80希釈の
第２ヤギ抗ウサギ抗体（ベチル ラブス，モントゴメリ
ー，テキサス（Bethyl Labs,Montgomery,TX））を５つ
等しく加えた。希釈はすべてPM2緩衝液中であった。第
２抗体を正常ウサギ血清（1:80）および1:10,1:20,1:4
0,1:80,1:160,1:320希釈のヤギ抗ウサギ血清のFabフラ
グメント（カッペル ラボラトリーズ，ウエストチェス
ター，ペンシルバニア（Cappel Laboratories,West Che
ster,PA））で置換した。10分間室温で放置後、50μｌ
の１×10-6M EA14および5mg/mlの基質ONPGを加え、37℃
で30分間インキュベートした。OD414を測定し、結合／
最大結合（B/Bmax）を決定した。
結果を第８表に示す。
第８表に示すようにヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（Fab
フラグメント）が第１抗体酵素ドナー結合体とカップリ
ングする際に明らかに相補性が減少する。Fabフラグメ
ントにより誘導される相補の抑制は、抗体全部を使用す
る際に観察された抑制とほぼ同等である。
第８表に示されるように第２抗体は、高投与量（すなわ
ち、過剰の遊離検体により引き起こされるより少ない抗
体酵素ドナー相互作用）より小投与量（すなわち、より
大きな抗体／酵素ドナー相互作用）において大きな相補
抑制効果を示した。
Fab濃度が減少すると、相補抑制が直線的に減少した第
６表でそのままの分子は、1:40より大きな希釈で有効に
第２抗体を減少することを示した。同様に、Fab製剤の
1:40の希釈で同様の現象が始まることが判る。
14.3.検体特異抗体による相補抑制:ED−ジゴキシン結合
体の比較 特異的検体抗体による相補活性の特異的阻止に関して
の、各種ED−ジゴキシン結合体の比較を行なった。下に
示す実験においてEA22をカップリングした酵素ドナーの
相補活性を標準化した。各種EDのジゴキシン結合体を、
カップリング時のpHをpH9.5まで上昇させてED4（２−ジ
ゴキシン）がジゴキシン−マレイミドをα−アミノ基お
よびα−領域へのシステイン末梢の両方へカップルする
ことを除いては前記のように調製した。抗ジゴキシン抗
体およびヤギ抗ウサギ抗体濃度の両者を標準化した。そ
の結果を第９表に示す。第９表 検体特異抗体による相補の抑制 酵素ドナー 相補の抑制（％） ED5 66 ED4（２−ジゴキシン） 68 ED4 51 H6 37 15.第２抗体を使用する改良されたチロキシンおよびジ
ゴキシン検定 チロキシンおよびジゴキシン酵素相補性免疫検定を第２
抗体を使用して行なった。
さらにチロキシン（T4）検定をEA22およびED4を使用し
ベーカーインスツルメンツ（Baker Instruments）（ア
レンタウン，ペンシルバニア（Allentown,PA）製遠心分
離分析器、エンコアー（ENCORE ）で改良した。その検
定系は、10μｌの患者のサンプル、抗T4抗体およびサリ
チル酸塩を含んだ100μｌの酵素アクセプター試薬、お
よび第２ヤギ抗ウサギ抗体および基質ｏ−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピイラノサイド（ONPG）を含む29
0μｌの酵素ドナー試薬を含む。その最終システム濃度
は次のようであった： 酵素アクセプター（EA22） 0.625×10-7Ｍ 第1T4抗体 1/1200 サリチル酸塩 10mM 酵素ドナー（ED4−T4） 1/276 第２ヤギ抗ウサギ抗体 /200 ONPG 0.51mg/ml 900秒で読みとった。各患者のT4サンプルを使用する際
にはO.D./分の変化は、個々の患者のサンプルを分けて
O.D.405で±50mO.D.投入量によってプロットすべきであ
る。第18図は、すべてヒト血清中で調製された測定器を
用いるT4検定を示す。900秒での測定器間の吸収の変化
を血清T4濃度に対してプロットする。
ジゴキシン検定をED5およびEA22およびベーカーエンコ
リー（Baker ENCORE ）遠心分離分析器を用いて改善し
た。ジゴキシン標準がヒト血清において調製された。ア
ッセイは、30μｌの血清、200μｌのED5−ジゴキシン試
薬および100μｌのEA22試薬を含む。ED5−ジゴキシン試
薬は、基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノサイドおよびヤギ抗ウサギ抗体を含んでいた。EA22試
薬はウサギ抗ジゴキシン抗体を含んでいた。最終システ
ム濃度は次のようであった： 血清 9.1％ EA22 ２×10-7 ED5−ジゴキシン 1:1500 第１ジゴキシン抗体 1:59,400 第２ヤギ抗ウサギ抗体 1:200 ONPG 0.5mg/ml この検定の標準的な曲線を第19図に示す。
16.遺伝子工学的および化学的に合成された酵素ドナー
のジゴキシン免疫検定性能比較 化学的に合成された成分と遺伝子工学的な成分とを使用
した酵素免疫検定を比較するために、２つの類似酵素ド
ナー、すなわち１つは組換DNA技術によるものであり、
他は化学ペプチド合成によるもの、を調製した。遺伝子
工学により生産したED3（第6.1.4参照）およびポリペプ
チド合成により生産したED3（第6.1.5参照）のアミノ酸
配列を第14図に示す。これら２つのペプチドの顕著な特
徴は、検体への化学カップリングに使用され、第14図に
おいて星印を付した類似システイン残基（Cys）とED3の
アミノ酸数12と50の間に位置し、ED3Aのアミノ酸数５と
43間に位置するものを含み野生−タイプβ−ガラクトシ
ダーゼの対応するアミノ酸の６〜44番目を含む類似α−
ドナードメインである。
ジゴキシンED3およびED3Aへの結合を第13.1節に記載の
３−ｏ［ｍ−マレイミドフェニルカルバミル］ジゴキシ
ゲニンを用いて行なった。ED3、ED3A、ジゴキシン−ED3
およびジゴキシン−ED3A製剤を溶離液として0.1％TFAを
含む水中の０〜80％段階的なアセトニトリルを使用する
調製用HPLCヘニル カラム（henyl column）［ウォータ
ーズ μ ボンダパック，ウォーターズアソシエート，
ミルフォード，マサチューセッツ（Waters μ Bondapa
k,Water Assoc.,Milford,MA））を有する高性能液体ク
ロマトグラフィー（HPLC）にかけた。各酵素ドナーのカ
ラム分画を酵素アクセプターとしてM15を使用して第6.
2.1節に記載の相補性を検定した。ED3−ジゴキシンの相
対的な相補効率はED3A−ジゴキシンの４倍であった。
ジゴキシン−ED3およびジゴキシン−ED3Aに対応するカ
ラム分画を別々にプールし、ジゴキシンに関する競合的
酵素免疫検定を比較した。
96ウェル微小力価プレートを使用して検定した。検定
は、25μｌのヒト血清標準0,0.5,1,2,4,10,100および10
00mg/mlジゴキシン、４×10-7モルM15酵素アクセプター
およびジゴキシン抗体を含む100μｌの試薬Ｉ、および1
30μｌの試薬IIを含んでいた。試薬IIは、各種希釈され
たジゴキシン−ED3またはジゴキシン−ED3A、第２ヤギ
抗ウサギ抗体および1.1mg/mlのｏ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトピイラノシドを含んでいた。37℃におい
て30分間インキュベートした後の結果およびタイターテ
ック（Titertek）微小力価プレートリーダにおける405n
mの読みを第10表に示す。第10表にみられるように、競
争的免疫検定がジゴキシン−ED3とジゴキシン−ED3Aの
両者で生じた。ジゴキシン−ED3Aを使用するジゴキシン
に関する曲線を第17図に示す。ジゴキシン−ED3を使用
するジゴキシン免疫検定は、ジゴキシン−ED3Aより0.5
および1mg/mlの低投与量においてより良好な信号識別性
を与える。この差異は、HPLC分析中に検出されたED3A製
剤中の不純物の存在によるだろう。
これらの実験は、抗原抗体反応によるβ−ガラクトシダ
ーゼポリペプチドの相補に対して遺伝子工学的ポリペプ
チドと同様に合成ペプチドの適応性を示す。化学ポリペ
プチド合成は、高分子量タンパク質検出を目的とする酵
素ドナーを生産するために使用し得る。α−ドナードメ
インに融合した免疫学的に反応を富むポリペプチドエピ
トープをコードする遺伝子融合物も合成し得る。この解
決法の限界は、より大きなポリペプチドを合成する技術
の可能性の状況ばかりでなく必要としたα−ドナードメ
インおよび免疫学的反応性たん白質ドメインの両者の配
列に関する知識をもたないことである。
17.微生物の寄託 表に挙げられたプラスミドを運搬する次のエシェリキア
・コリ（E.Coli）菌株は、イン ビトロ インターナシ
ョナル，インコーポレーテッド，（IVI），アン アー
バー，ミシガン州（In Vitro International,Inc.（IV
I）,Ann Arbor,MI）またはザ アグリカルチュラル リ
サーチ カルチャー コレクション（NRRL），ペオリ
ア，イリノイ州（the Agricultural Reseach Culture C
ollection（NRRL）,Peoria,IL）に寄託され、次のアク
セッション ナンバーを指定された： エシェリキア・コリ（E.Coli）菌株E9001,IVI10034およ
び菌株JM83、IVI 10037は、それぞれプラスミドp122お
よびp157を含み、第8.1節および第９節で記載した一部
の肝炎Ｂ型ウィルス表面抗原およびα−ドナーの融合タ
ンパク質をコードする遺伝子を運搬する。エシェリキア
・コリ菌株E9001、IVI 10038および菌株JM83、IVI 1003
6は、それぞれプラスミドpF29およびp150を含み、第6.2
節の記載のようにp150が酵素アクセプターをコードする
遺伝子を運搬する。エシェリキア・コリ菌株AMA 1004、
IVI 10050は、アミノ酸の30〜37番目を欠失したβ−ガ
ラクトシダーゼタンパク質（酵素アクセプター）に関す
る遺伝子を運搬するプラスミドpMG14を含む。第５図参
照。エシェリキア・コリ菌株AMA 1004、IVI 10051は、
アミノ酸の13−40番目を欠失したβ−ガラクトシダーゼ
たん白質に関する遺伝子を運搬するプラスミドpMG22を
含む。第５図参照。エシェリキア・コリ菌株E9001、IVI
10052は、アミノ酸の62番目にシステイン残基、アミノ
酸の64番目にリジン残基を有するβ−ガラクトシダーゼ
のフラグメント（ED H6）をコードする遺伝子を運搬す
るp169プラスミドを含む。第6.1.2節参照。エシェリキ
ア・コリ菌株E9001、IVI 10053は、アミノ酸の３番目に
システイン残基を有するβ−ガラクトシダーゼのフラグ
メント（ED3）をコードする遺伝子を運搬するp183プラ
スミドを含む。第6.1.4節参照。エシェリキア・コリ菌
株E9001、IVI 10054は、アミノ酸の39番目にシステイン
残基を有するβ−ガラクトシダーゼのフラグメント（ED
5）をコードする遺伝子を運搬するp185プラスミドを含
む。第6.1.6節参照。エシェリキア・コリ菌株AMA 100
4、NRRL B−18006は、第11節および第20図に示したＢ−
hCGカルボキシ末端およびα−ドナーの融合タンパク質
をコードする遺伝子を運搬するプラスミドp175を含む。
本発明は、寄託された微生物による範囲に限定すべきで
はない。なぜならば寄託された実施態様は本発明のある
態様の一例を示そうとするものであり、かつ機械的に等
価などんな微生物も本発明の範囲内であるからである。
事実、さらにここに示しかつ記載する本発明の各種の変
形は当業者には前記および添付図面から明らかになるで
あろう。かかる変形は添付請求の範囲の範囲内に入るこ
とを意味する。
ヌクレオチド用に与えられた塩基対（bp）の大きさの全
ては概算であり、記述のために使用されることも理解さ
れる。

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）媒体中で（１）試料；（２）酵素ド
    ナーポリペプチド結合体；（３）検体に特異的な検体結
    合タンパク質；（４）酵素ドナー結合体との相互作用に
    よりβ−ガラクトシダーゼの触媒活性を有する活性酵素
    複合体を形成可能な酵素アクセプターポリペプチド；お
    よび（５）活性酵素による基質転化率を追跡し得るよう
    に活性酵素複合体と反応できる基質を組合せることによ
    り反応混合物を形成する段階において、上記酵素ドナー
    結合体は競合して検体結合タンパク質におよび酵素アク
    セプターに結合可能であり、上記検体結合タンパク質は
    検体の不存在下において活性酵素複合体の形成を阻害
    し、検体結合タンパク質、酵素アクセプターおよび酵素
    ドナー結合体の濃度はこのシステムで検出された検体量
    が基質の転化率によって直接変化するような段階であ
    る； （ｂ）反応混合物中の基質の転化率を測定する段階；お
    よび （ｃ）基質の転化率を既知濃度の検体を使用して得られ
    た基質の転化率と比較することによって試料中の検体量
    を測定する段階から成る試料中の疑わしき検体量を決定
    するための改良された酵素相補性検定法（enzyme compl
    ementationassay method）において、 （ｄ）反応性基が活性酵素複合体を形成する酵素ドナー
    結合体と酵素アクセプターとの相互作用によるまたは酵
    素ドナー結合体の検体結合タンパク質および酵素アクセ
    プターへの競合結合によるいずれかの妨害なしに検体ま
    たは検体誘導体に共有結合できるものである、スルフヒ
    ドリル、アミノおよびカルボキシル基から成る群から選
    ばれた反応性基を有するアミノ酸を挿入するまたはこの
    ようなアミノ酸で置換する組換えDNA技術により調製さ
    れた酵素ドナーポリペプチドを使用する段階からなるこ
    とを特徴とする改良された酵素相補性検定法。
  2. 【請求項２】（ａ）媒体中で（１）試料；（２）酵素ド
    ナーポリペプチド結合体；（３）検体に特異的な検体結
    合タンパク質；（４）酵素ドナー結合体との相互作用に
    よりβ−ガラクトシダーゼの触媒活性を有する活性酵素
    複合体を形成可能な酵素アクセプターポリペプチド；お
    よび（５）活性酵素による基質転化率を追跡し得るよう
    に活性酵素複合体と反応できる基質を組合せることによ
    り反応混合物を形成する段階において、上記酵素ドナー
    結合体は競合して検体結合タンパク質におよび酵素アク
    セプターに結合可能であり、上記検体結合タンパク質は
    検体の不存在下において活性酵素複合体の形成を阻害
    し、検体結合タンパク質、酵素アクセプターおよび酵素
    ドナー結合体の濃度はこのシステムで検出された検体量
    が基質の転化率によって直接変化するような段階であ
    る； （ｂ）反応混合物中の基質の転化率を測定する段階；お
    よび （ｃ）基質の転化率を既知濃度の検体を使用して得られ
    た基質の転化率と比較することによって試料中の検体量
    を測定する段階から成る試料中の疑わしき検体量を測定
    するための改良された酵素相補性検定法において、 （ｄ）反応性基が活性酵素複合体を形成する酵素ドナー
    結合体と酵素アクセプターとの相互作用によるまたは酵
    素ドナー結合体の検体結合タンパク質および酵素アクセ
    プターへの競争結合によるいずれかの妨害なしに検体ま
    たは検体誘導体に共有結合できるものである、スルフヒ
    ドリル、アミノおよびカルボキシル基からなる群から選
    ばれた反応性基を有するアミノ酸を挿入するまたはこの
    ようなアミノ酸で置換する化学的ポリペプチド合成技術
    により調製された酵素ドナーポリペプチドを使用する段
    階からなることを特徴とする改良された酵素相補性検定
    法。
  3. 【請求項３】さらに次の段階から成る請求の範囲第１項
    に記載の方法： 検体結合タンパク質に特異的な抗体または抗体フラグメ
    ントを反応混合物に加え、上記抗体または抗体フラグメ
    ントの効果が酵素ドナー結合体と酵素アクセプター間の
    相互作用の立体障害効果を高めることによって方法の感
    度を高める段階。
  4. 【請求項４】さらに次の段階から成る請求の範囲第２項
    に記載の方法： 検体結合タンパク質に特異的な抗体または抗体フラグメ
    ントを反応混合物に加え、上記抗体または抗体フラグメ
    ントの効果が酵素ドナー結合体と酵素アクセプター間の
    相互作用の立体障害効果を高めることによって方法の感
    度を高める段階。
  5. 【請求項５】転化率が分光定量的に測定されるものであ
    る請求の範囲第１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】転化率が分光定量的に測定されるものであ
    る請求の範囲第２項に記載の方法。
  7. 【請求項７】転化率が螢光定量的に測定されるものであ
    る請求の範囲第１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】転化率が螢光定量的に測定されるものであ
    る請求の範囲第２項に記載の方法。
  9. 【請求項９】検体結合タンパク質が抗体分子、レセプタ
    ー、輸送タンパク質、アビジンおよびレクチンから成る
    群から選ばれたものである請求の範囲第１項に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】検体結合タンパク質が抗体分子、レセプ
    ター、輸送タンパク質、アビジンおよびレクチンから成
    る群から選ばれたものである請求の範囲第２項に記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】検体結合タンパク質が抗体である請求の
    範囲第１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】検体結合タンパク質が抗体である請求の
    範囲第２項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】抗体がモノクローナル抗体である請求の
    範囲第11項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】抗体がモノクローナル抗体である請求の
    範囲第12項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】検体結合タンパク質がアビジンである請
    求の範囲第19項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】検体結合タンパク質がアビジンである請
    求の範囲第10項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】基質がｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガ
    ラクトピラノシド;2′−Ｎ−（ヘキサデカノール）−Ｎ
    （アミノ−１′−ニトロフェニル）−β−Ｄ−ガラクト
    ピラノシド;4−メチルウムベリ−β−Ｄ−ガラクトピラ
    ノシド；ナプチル−AS−B1−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
    ド;1−ナプチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド;2−ナプ
    チル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドモノハイドレート;o
    −ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド;m−ニ
    トロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド;p−ニトロ
    フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド;2−フェニルエ
    チル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；フェニル−β−Ｄ
    −ガラクトピラノシド;5−プロモ−４−クロロ−３−イ
    ンドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；レゾルフィン
    −β−Ｄ−ガラクトピラノシド;7−ヒドロキシ−４−ト
    リフルオロメチルクマリン；ω−ニトロスチリル−β−
    Ｄ−ガラクトピラノシドおよびフルオレセイン−β−Ｄ
    −ガラクトピラノシドから成る群から選ばれる請求の範
    囲第１項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】基質がｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガ
    ラクトピラノシド;2′−Ｎ−（ヘキサデカノール）−Ｎ
    （アミノ−１′−ニトロフェニル）−β−Ｄ−ガラクト
    ピラノシド;4−メチルウムベリ−β−Ｄ−ガラクトピラ
    ノシド；ナプチル−AS−B1−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
    ド;1−ナプチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド;2−ナプ
    チル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドモノハイドレート;o
    −ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド;m−ニ
    トロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド;p−ニトロ
    フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド;2−フェニルエ
    チル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；フェニル−β−Ｄ
    −ガラクトピラノシド;5−プロモ−４−クロロ−３−イ
    ンドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；レゾルフィン
    −β−Ｄ−ガラクトピラノシド;7−ヒドロキシ−４−ト
    リフルオロメチルクマリン；ω−ニトロスチリル−β−
    Ｄ−ガラクトピラノシドおよびフルオレセイン−β−Ｄ
    −ガラクトピラノシドから成る群から選ばれる請求の範
    囲第２項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】検体が薬剤、薬剤代謝産物、生物学的活
    性分子、ステロイド、ビタミン、産物汚染物、農薬およ
    びそれらの代謝産物、食品添加物、除草剤およびそれら
    の代謝産物、風味剤、食品毒、病原体およびそれらの毒
    物から成る群から選ばれる請求の範囲第１項に記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】検体が薬剤、薬剤代謝産物、生物学的活
    性分子、ステロイド、ビタミン、産物汚染物、農薬およ
    びそれらの代謝産物、食品添加物、除草剤およびそれら
    の代謝産物、風味剤、食品毒、病原体およびそれらの毒
    物から成る群から選ばれる請求の範囲第２項に記載の方
    法。
  21. 【請求項２１】検体が約2,000ダルトンまたはそれ以上
    の分子量を有する分子である請求の範囲第１項に記載の
    方法。
  22. 【請求項２２】検体が約2,000ダルトンまたはそれ以上
    の分子量を有する分子である請求の範囲第２項に記載の
    方法。
  23. 【請求項２３】分子がタンパク質である請求の範囲第21
    項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】分子がタンパク質である請求の範囲第22
    項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】生物学的活性分子がチロキシンまたはそ
    の誘導体である請求の範囲第19項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】生物学的活性分子がチロキシンまたはそ
    の誘導体である請求の範囲第20項に記載の方法。
  27. 【請求項２７】生物学的活性分子がビオチンまたはその
    誘導体である請求の範囲第19項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】生物学的活性分子がビオチンまたはその
    誘導体である請求の範囲第20項に記載の方法。
  29. 【請求項２９】生物学的活性分子がジゴキシンまたはそ
    の誘導体である請求の範囲第19項に記載の方法。
  30. 【請求項３０】生物学的活性分子がジゴキシンまたはそ
    の誘導体である請求の範囲第20項に記載の方法。
  31. 【請求項３１】酵素ドナーポリペプチドが下記のアミノ
    末端で始まる、アミノ酸配列を有するED3である請求の
    範囲第１項に記載の方法： Met Asp Pro Ser Gly Asp Pro Arg Ala Cys Ser Asn Se
    r Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn
    Pro Gly Val Thr Glu Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pr
    o Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg
    Thr Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gl
    y Leu Glu Ser Arg Ser Ala Gly Met Pro Leu Glu。
  32. 【請求項３２】酵素ドナーポリペプチドが以下のアミノ
    末端で始まる、アミノ酸配列を有するED4である請求の
    範囲第１項に記載の方法： Met Asp Pro Ser Gly Asn Pro Tyr Gly Ile Asp Pro Th
    r Glu Ser Ser Pro Gly Asn Ile Asp Pro Arg Ala Ser
    Ser Asn Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Tr
    p Glu Asn Pro Gly Val Thr Glu Leu Asn Arg Leu Ala
    Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Gl
    u Ala Arg Thr Asp Cys Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser
    Leu Asn Gly Leu Glu Ser Arg Ser Ala Gly Met Pro Le
    u Glu。
  33. 【請求項３３】酵素ドナーポリペプチドが下記のアミノ
    末端で始まる、アミノ酸配列を有するED5である請求の
    範囲第１項に記載の方法： Met Asp Pro Ser Gly Asp Pro Arg Ala Ser Ser Asn Se
    r Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn
    Pro Gly Val Thr Glu Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pr
    o Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Cys Glu Glu Ala Arg
    Thr Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gl
    y Leu Glu Ser Arg Ser Ala Gly Met Pro Leu Glu。
  34. 【請求項３４】酵素ドナーポリペプチドが下記のアミノ
    末端で始まる、アミノ酸配列を有するED7である請求の
    範囲第１項に記載の方法： Met Asp Pro Ser Gly Asp Pro Arg Ala Cys Ser Asn Se
    r Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn
    Pro Gly Val Thr Glu Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pr
    o Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg
    Thr Asp Cys Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gl
    y Leu Glu Ser Arg Ser Ala Gly Met Pro Leu Glu。
  35. 【請求項３５】酵素ドナーポリペプチドが以下のアミノ
    末端で始まる、アミノ酸配列を有するED8である請求の
    範囲第１項に記載の方法： Met Asp Pro Ser Gly Asp Pro Arg Ala Ser Ser Asn Se
    r Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn
    Pro Cys Val Thr Glu Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pr
    o Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg
    Thr Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gl
    y Leu Glu Ser Arg Ser Ala Gly Met Pro Leu Glu。
  36. 【請求項３６】酵素ドナーポリペプチドが下記のアミノ
    末端で始まる、アミノ酸配列を有するED13である請求の
    範囲第１項に記載の方法： Met Asp Pro Ser Gly Asp Pro Arg Ala Lys Ser Asn Se
    r Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn
    Pro Gly Val Thr Glu Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pr
    o Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg
    Thr Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gl
    y Leu Glu Ser Arg Ser Ala Gly Met Pro Leu Glu。
  37. 【請求項３７】酵素ドナーポリペプチドが下記のアミノ
    末端で始まる、アミノ酸配列を有するED14である請求の
    範囲第１項に記載の方法： Met Asp Pro Ser Gly Asn Pro Tyr Gly Ile Asp Pro Th
    r Glu Ser Ser Pro Gly Asn Ile Asp Pro Arg Ala Ser
    Ser Asn Ser Leu Ala Val Val Len Gln Arg Arg Asp Tr
    p Glu Asn Pro Gly Val Thr Glu Leu Asn Arg Leu Ala
    Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Gl
    u Ala Arg Thr Asp Lys Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser
    Leu Asn Gly Leu Glu Ser Arg Ser Ala Gly Met Pro Le
    u Glu。
  38. 【請求項３８】酵素ドナーポリペプチドが下記のアミノ
    末端で始まる、アミノ酸配列を有するED15である請求の
    範囲第１項に記載の方法： Met Asp Pro Ser Gly Asp Pro Arg Ala Ser Ser Asn Se
    r Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn
    Pro Gly Val Thr Glu Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pr
    o Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Lys Glu Glu Ala Arg
    Thr Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gl
    y Leu Glu Ser Arg Ser Ala Gly Met Pro Leu Glu。
  39. 【請求項３９】酵素ドナーポリペプチドが下記のアミノ
    末端で始まる、アミノ酸配列を有するED17である請求の
    範囲第１項に記載の方法： Met Asp Pro Ser Gly Asp Pro Arg Ala Lys Ser Asn Se
    r Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn
    Pro Gly Val Thr Glu Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pr
    o Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg
    Thr Asp Lys Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gl
    y Leu Glu Ser Arg Ser Ala Gly Met Pro Leu Glu。
  40. 【請求項４０】酵素アクセプターがEA22である請求の範
    囲第３項に記載の方法。
  41. 【請求項４１】酵素、ドナーポリペプチドが下記のアミ
    ノ末端で始まる、アミノ酸配列を有するED3Aである請求
    の範囲第２項に記載の方法： Cys Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Ar
    g Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg
    Leu Ala Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Se
    r Glu Glu Ala Arg Thr。
  42. 【請求項４２】（ａ）媒体中で（１）試料；（２）酵素
    ドナーポリペプチド結合体；（３）検体に特異的な検体
    結合タンパク質；（４）酵素ドナー結合体との相互作用
    によりβ−ガラクトシダーゼの触媒活性を有する活性酵
    素複合体を形成可能な酵素アクセプターポリペプチド；
    および（５）活性酵素による基質転化率を追跡し得るよ
    うに活性酵素複合体と反応できる基質を組合せることに
    より反応混合物を形成する段階において、上記酵素ドナ
    ー結合体は競合して検体結合タンパク質におよび酵素ア
    クセプターに結合可能であり、上記検体結合タンパク質
    は検体の不存在下において活性酵素複合体の形成を阻害
    し、検体結合タンパク質、酵素アクセプターおよび酵素
    ドナー結合体の濃度はこのシステムで検出された検体量
    が基質の転化率によって直接変化するような段階であ
    る；（ｂ）反応混合物中の基質の転化率を測定する段
    階；および（ｃ）基質の転化率を既知濃度の検体を使用
    して得られた基質の転化率と比較することによって試料
    中の検体量を測定する段階から成る試料中の疑わしき検
    体量を決定するための改良された酵素相補性検定であっ
    て、 （ｄ）反応性基が活性酵素複合体を形成する酵素ドナー
    結合体と酵素アクセプターとの相互作用によるまたは酵
    素ドナー結合体の検体結合タンパク質および酵素アクセ
    プターへの競合結合によるいずれかの妨害なしに検体ま
    たは検体誘導体に共有結合できるものである、スルフヒ
    ドリル、アミノおよびカルボキシル基から成る群から選
    ばれた反応性基を有するアミノ酸を挿入するまたはこの
    ようなアミノ酸で置換する組換えDNA技術により調製さ
    れた酵素ドナーポリペプチドを使用する段階からなるこ
    とを特徴とする検体の検定の実施に使用するキットにお
    いて、 酵素ドナー結合体、検体結合タンパク質、酵素アクセプ
    ターおよび基質が検体の測定に相対的に十分な量存在す
    ることを特徴とする、下記の〜の成分から成る、キ
    ット： 反応性基が活性酵素複合体を形成する酵素ドナー結
    合体と酵素アクセプターとの相互作用によるまたは酵素
    ドナー結合体の検体結合タンパク質および酵素アクセプ
    ターへの競合結合によるいずれかの妨害なしに検体また
    は検体誘導体に共有結合できるものである、スルフヒド
    リル、アミノおよびカルボキシル基から成る群から選ば
    れた反応性基を有するアミノ酸を挿入するまたはこのよ
    うなアミノ酸で置換する組換えDNA技術を使用して調製
    された酵素ドナーポリペプチドを含む酵素ドナー結合
    体； 検体に特異的な検体結合タンパク質； 酵素ドナー結合体との相互作用によりβ−ガラクト
    シダーゼの触媒活性特性を有する活性酵素複合体を形成
    可能な酵素アクセプターポリペプチド；および 活性酵素による基質転化が検出できるように活性酵
    素複合体と反応可能な基質。
  43. 【請求項４３】検体に関して予想される濃度範囲に等し
    い濃度の１セットの標準検体溶液をさらに含む請求の範
    囲第42項に記載のキット。
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