JPH0779792A

JPH0779792A - Ｎ−アセチルガラクトサミニル又はｎ−アセチルグルコサミニルの転移法

Info

Publication number: JPH0779792A
Application number: JP5236716A
Authority: JP
Inventors: Chi Huey Wong; ヒュイウォンチー
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1993-09-22
Publication date: 1995-03-28
Anticipated expiration: 2019-07-21
Also published as: JP3545785B2; US5516665A

Abstract

(57)【要約】【目的】単一容器内で、ウリジン二リン酸をリサイク
ルしながら、受容体をＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃで
それぞれグリコシル化する方法を提供する。【構成】（ａ）単一容器内の水性媒質中に以下の
（ｉ）〜（vi）の成分を混合して水性反応媒質を形成
し、（ｂ）前記水性反応媒質を、前記受容体がグリコシ
ル化されるのに十分な時間、約５〜約１０のｐＨ値、約
０〜約４０℃の温度に維持して、受容体をＧｌｃＮＡｃ
又はＧａｌＮＡｃでグリコシル化する。（ｉ）ＧａｌＮＡｃ−１−Ｐ又はＧｌｃＮＡｃ−１−
Ｐ；（ii）ピロホスホリラーゼ；（iii)トランスフェラ
ーゼ；（iv）エピメラーゼ；（ｖ）受容体；及び（vi）
(a) ＵＤＰ、ＵＴＰ又はその両方、(b) リン酸供与体、
及び(c) 該リン酸供与体からのリン酸基をＵＤＰに転移
してＵＴＰを形成するキナーゼを含むウリジン二リン酸
リサイクル系。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サッカライド化合物の
合成におけるグリコシル転移に関し、より特定的には、
エピマーであるＮ−アセチルグルコサミニル−１−リン
酸又はＮ−アセチルガラクトサミニル−１−リン酸を、
それぞれ、転移されるグリコシル基の源として使用す
る、対応するＵＤＰ−グリコシドの再生を伴う、受容体
への単一容器酵素触媒転移法に関する。

【０００２】

【従来の技術】より数多くのグリコシルトランスフェラ
ーゼ酵素が熟練した研究者に入手可能となってきたの
で、最近、当該技術分野において、オリゴサッカライド
含有分子の酵素合成の設計が目立ってきている。例え
ば、米国特許第 5,180,674号及び１９９１年３月１１日
に出願され、特許が認められた米国特許出願第 07/670,
701号を参照のこと。事実、米国特許第 5,180,674号で
議論されている２つのトランスフェラーゼ酵素は、Ｎ−
アセチルガラクトサミニル（ＧａｌＮＡｃ）基を転移す
るＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ及び
Ｎ−アセチルグルコサミニル（ＧｌｃＮＡｃ）基を転移
するＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼで
ある。グリコシル基であるＧａｌＮＡｃ及びＧｌｃＮＡ
ｃは、天然に存在する多くのオリゴサッカライド含有化
合物中に単独に及び一緒に存在している。例えば、ベー
ヤー(Beyer）ら、Adv. Enzymol.,52: 23-175 (1981)
は、ＧａｌＮＡｃについて８の、ＧｌｃＮＡｃについて
は１７の異なるタイプの結合を報告している。それら化
合物タイプはただ一つのオリゴサッカライドのみなら
ず、糖タンパク質及びグリコペプチド、プロテオグリカ
ン、糖脂質及びガングリオシドをも含む。

【０００３】血液型抗原は、両方のグリコシル基が存在
する３つの重要なオリゴサッカライド化合物の好例であ
る。例えば、Ａ血液型サッカライドの非還元性末端基は
ＧａｌＮＡｃα１→３（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ−
Ｒ’である。ここで、Ｒ’は１→３ＧｌｃＮＡｃ又は１
→３ＧａｌＮＡｃである。Ｏ血液型の末端サッカライド
はＦｕｃα（１→２）Ｇａｌβ−Ｒ’であるが、これに
対してＢ血液型末端サッカライドはＧａｌα（１→３）
（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ−Ｒ’である。ここで、Ｏ
及びＢ血液型の各々のＲ’は上記の通りである。Ｇａｌ
ＮＡｃ及びＧｌｃＮＡｃの各々は、受容体の構造及びグ
リコシル基の供与体型を認識するトランスフェラーゼ酵
素によって特異的受容体に転移される。その供与体型は
糖ヌクレオチド、即ち、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ又はＵＤ
Ｐ−ＧａｌＮＡｃである。Ｏ血液型抗原はＡ血液型抗原
に転化できるので、ＧａｌＮＡｃの反応及びそのＦｕｃ
α（１→２）Ｇａｌβ含有受容体への転移の反応は、最
も幅広く研究されたグリコシル転移反応の１つである。
事実、セノ（Seno）らに対する米国特許第4,569,909号
は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとＵ
ＤＰ−ＧａｌＮＡｃの平衡混合物にエピ化するためにウ
リジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン４−エピメラ
ーゼを使用することを教示している。その混合物は、煮
沸して酵素活性を停止し、変性した酵素を遠心分離で除
去した後に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの“粗製”試料を与
えた。これは“Ａトランスフェラーゼ”といわれるα−
Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼと共
に使用され、タイプＯ赤血球をタイプＡ赤血球に転化し
た。

【０００４】セノらは、エピメラーゼ及びトランスフェ
ラーゼをその相互の存在下で使用しなかった。セノら
は、また、それらのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（大量に調製
して保存するのが比較的難しい化合物である）との各々
の反応にも着手した。セノらは、また、ＵＤＰ−Ｇａｌ
ＮＡｃをリサイクルする再生工程の概念も持っていなか
った。ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃは、血液型抗原の
ほかに幾つかの他の重要なオリゴサッカライド化合物中
に存在している。例えば、ＧｌｃＮＡｃはシアリルルイ
ス^X（ＳＬｅ^X) 及びシアリルルイス^A（ＳＬｅ^A) の
両方に存在しており、ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃの
両方がムチンオリゴサッカライドに存在しており、そし
て、ＧａｌＮＡｃはＴ−抗原の一部として存在してい
る。このように、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃのＵＤＰ−Ｇａ
ｌＮＡｃへのエピ化及びその逆のエピ化というように、
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの個別
のグリコシル転移反応は研究されてきたが、ワンポット
系でＵＤＰ−グリコシドの再生を行いながら、ＧａｌＮ
Ａｃ−１−リン酸及びＧｌｃＮＡｃ−１−リン酸のうち
の一方又は他方を他のサッカライドの酵素触媒グリコシ
ル転移用の出発原料として受容体に対して使用すること
は、本発明者及びその協力者による最近公表された報
文、即ち、ウォン（Wong）ら、Pure & Appl. Chem., 65
(4): 803-808 (1993) を除いては教示されていない。本
発明は、かかる系を提供するものであり、その濃度がエ
ピメラーゼ反応の平衡位置によってコントロールされな
いＵＤＰ−グリコシル供与体を提供するものである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、単一容器内
で、ウリジン二リン酸をリサイクルしながら、受容体を
ＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃでそれぞれグリコシル化
する方法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＧａｌＮＡｃ
又はＧｌｃＮＡｃグリコシル基を受容体に転移する酵素
的方法を意図するものである。転移されたグリコシル基
のための出発原料は、そのエピマーの１−リン酸であ
る。本発明の方法は、また、グリコシル転移で形成され
たＵＤＰをリサイクルして更に多量のＵＴＰを形成し、
それによってＵＤＰ−グリコシドを再生するものであ
る。

【０００７】好ましい方法によれば、単一容器内の水性
媒質中に以下の成分を混合することによって水性反応媒
質を形成する：（ｉ）ＧａｌＮＡｃ−１−リン酸又はＧｌｃＮＡｃ−１
−リン酸の一方又は他方であるモノサッカライドリン
酸；（ii）ＵＴＰの存在下で（ｉ）のモノサッカライドリン
酸からのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡ
ｃの形成を触媒するＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃピロホスホリ
ラーゼ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの
一方又は他方；（iii)ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ又はＵ
ＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの一方又は他方
であるグリコシルトランスフェラーゼであって、存在す
るトランスフェラーゼが（ｉ）のモノサッカライド１−
リン酸としては存在しないＧａｌＮＡｃ又はＧｌｃＮＡ
ｃを転移させるトランスフェラーゼ；（iv）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを
相互転換するエピメラーゼ；（ｖ）（iii)のグリコシルトランスフェラーゼのための
受容体；及び（vi）(a) ＵＤＰ、ＵＴＰ又はその両方、(b) リン酸供
与体、及び (c)該リン酸供与体からのリン酸基をＵＤＰ
に転移してＵＴＰを形成するキナーゼを含むウリジン二
リン酸リサイクル系。（ii）、（iii)、（iv）及び（v
i）の各々の酵素は触媒量で存在する。このようにして
形成した水性反応媒質は、前記受容体がグリコシル化さ
れるのに十分な時間、約５〜約１０のｐＨ値、約０〜約
４０℃の温度に維持される。好ましくは、形成したグリ
コシル化受容体を回収する。

【０００８】略語本明細書で議論する種々のサッカライドは、通常使用さ
れるそれらの略語で議論されることが多い。それら略語
及びサッカライド名をモノサッカライドとして以下に掲
げた。Ｆｕｃ＝フコースＧａｌ＝ガラクトースＧａｌＮ＝ガラクトサミンＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミンＧａｌＮＡｃ−１−Ｐ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン１
−リン酸Ｇｌｃ＝グルコースＧｌｃＮ＝グルコサミンＧｌｃＮ−１−Ｐ＝グルコサミン１−リン酸ＧｌｃＮ−６−Ｐ＝グルコサミン６−リン酸ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミンＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ＝Ｎ−アセチルグルコサミン１−
リン酸ＧｌｃＵＡ＝グルクロン酸ＩｄＵＡ＝イズロン酸Ｍａｎ＝マンノース本発明は、適切なグリコシルトランスフェラーゼによっ
てＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ基を受容体に転移する
酵素触媒グリコシル転移法を意図するものである。Ｇａ
ｌＮＡｃ及びＧｌｃＮＡｃの両方は、グリコシルトラン
スフェラーゼによってその受容体と共に認識される供与
体分子としてのそれらの１−ＵＤＰ誘導体を経由して転
移される。本発明の方法によれば、転移されたグリコシ
ル基の源はエピマーのモノサッカライド１−リン酸であ
る。

【０００９】本発明の方法は、単一容器（ワンポット）
中に各酵素及び各反応体を含有する水性反応媒質を利用
して、グリコシル転移反応を行うものである。好ましい
方法によれば、以下の成分を水性緩衝液と共に単一容器
中で混合することによって水性反応媒質を形成する：（ｉ）ＧａｌＮＡｃ−１−リン酸（ＧａｌＮＡｃ−１−
Ｐ）又はＧｌｃＮＡｃ−１−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−１
−Ｐ）の一方又は他方であるモノサッカライド１−リン
酸；（ii）ＵＴＰの存在下で（ｉ）のモノサッカライド１−
リン酸からのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−Ｇｌｃ
ＮＡｃの形成を触媒するＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃピロホス
ホリラーゼ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラー
ゼの一方又は他方；（iii)ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ）トランス
フェラーゼ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃ）
トランスフェラーゼの一方又は他方であるグリコシルト
ランスフェラーゼであって、該水性反応媒質中に存在す
るグリコシルトランスフェラーゼが（ｉ）のモノサッカ
ライド１−リン酸としては存在しないＧａｌＮＡｃ又は
ＧｌｃＮＡｃを転移するトランスフェラーゼ；（iv）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを
相互転換するエピメラーゼ；（ｖ）（iii)のグリコシルトランスフェラーゼのための
受容体；及び（vi）ＵＤＰ、ＵＴＰ又はその両方、リン酸供与体、及
びリン酸供与体からのリン酸基をＵＤＰに転移してＵＴ
Ｐを形成するキナーゼを含むウリジン二リン酸リサイク
ル系。（ii）、（iii)、（iV）及び（Vi）の各々の酵素は触媒
量で存在する。このようにして形成した水性反応媒質
を、約５〜約１０のｐＨ値、約０〜約４０℃の温度に受
容体がグリコシル化されるのに十分な時間維持する。Ｇ
ａｌＮＡｃ−１−Ｐ及びＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐは両方と
も公知の化合物であり、文献に記載された多数の調製法
のいずれか１つから得ることができる。両方の原料もミ
ズーリ州セントルイスのシグマ化学社から市販されてい
る。

【００１０】特に有用な合成では、ヘキサアセチルガラ
クトサミン又はグルコサミンを出発原料として利用す
る。リパーゼ又はブチルアミンの如きアミンとＴＨＦ中
で反応させて１位アセチル基を除去した後、生成したペ
ンタアセチル化物をジベンジルN,Ｎ−ジエチルホスホラ
ミダイト(dibenzyl N,N-diethylphosphoramidite）の如
き３価の亜リン酸化試薬とトリアゾール又はテトラゾー
ルの存在下にジクロロメタンの如き乾燥溶媒中で反応さ
せて、対応する１位ジベンジル亜リン酸体を形成するも
のである。この亜リン酸体を過酸化水素又は類似の酸化
体で酸化すると対応するジベンジルリン酸体がナトリウ
ム塩として得られる。Ｐｄ／Ｃでの水素化に続く水酸化
ナトリウムでの処理によって、目的のリン酸体が得られ
る。これらの反応は、イチカワ（Ichikawa）ら、J. Or
g. Chem.,57: 2943 (1992) のほか、１９９２年１０月
１日に公開されたＰＣＴ出願 WO 92/16640で議論されて
いる。類似の反応がマーチン（Martin）ら、Tet. Lette
rs, 33: 6123-6126 (1992)に記載されている。

【００１１】ヘイドラス(Heidlas）ら、J. Org. Chem.,
57: 146-151 (1992)も、最近、各々ＧｌｃＮ及びＧｌｃ
Ｎ−６−Ｐで始めるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの２つの合成
を報告した。両操作はＧｌｃＮから出発し、触媒量のヘ
キソキナーゼ（ＥＣ 2.7.1.1）及びアセテートキナーゼ
（ＥＣ 2.7.2.1）の存在下で、ＡＤＰ／ＡＴＰ及びアセ
チルリン酸を使用して、ＧｌｃＮ−６−Ｐに循環的にリ
ン酸化した。１つの方法においては、ＴＨＦ／水中でＮ
−アセチルコハク酸イミド（ＮＡＳ）を使用してＧｌｃ
Ｎ−６−Ｐをアセチル化し、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐを形
成した。無水酢酸も使用できる。そのＮ−アセチル化合
物をＮ−アセチルグルコサミンホスホムターゼ（ＥＣ
2.7.5.2）及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラー
ゼ（ＥＣ2.7.7.23）を含有するカンジダ・ユーチリス由
来の酵素試料で処理して、まずＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを
形成してからＵＴＰ及び無機のピロホスファターゼ（Ｅ
Ｃ 3.6.1.1）の存在下でＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを形成
し、生成した無機のピロリン酸を破壊した。第２の方法
においては、ＧｌｃＮ−６−Ｐをホスホグルコムターゼ
（ＥＣ 5.4.2.2）で処理してＧｌｃＮ−１−Ｐを形成
し、次いで、ＵＴＰの存在下でＵＤＰ−Ｇｌｃピロホス
ホリラーゼ（ＥＣ 2.7.7.9）と処理してＵＤＰ−Ｇｌｃ
Ｎを形成した。無機のピロリン酸は上記と同じく除去し
た。次いで、ＵＤＰ−ＧｌｃＮを上記のようにＮＡＳで
アセチル化してＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを形成した。な
お、この場合も無水酢酸を使用できる。

【００１２】ヘイドラスらによって開示された上記の第
１の方法は、本発明では、アセチル化工程後のＧｌｃＮ
Ａｃ−１−Ｐの現場製造に使用できる。かくして、Ｇｌ
ｃＮＡｃ−１−ＰよりむしろＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐから
出発することができる。後者の化合物はカンジダ・ユー
チリス試料を使用して前者に転化できるからである。Ｕ
ＴＰ及びモノサッカライド１−リン酸からＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを形成するピロホス
ホリラーゼも、該水性反応媒質中に存在する。ＧｌｃＮ
Ａｃ−１−Ｐが出発原料として存在する場合、ＵＤＰ−
ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを使用する。ＧａｌＮ
Ａｃ−１−Ｐが出発原料として存在する場合、ＵＤＰ−
ＧａｌＮＡｃピロホスホリラーゼを使用する。先に挙げ
たセノらの米国特許第 4,569,909号は、ピロリン酸ナト
リウム及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃピロホスホリラーゼを
添加してＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡ
ｃの平衡混合物を形成し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを分解
することを教示している。エピメラーゼが存在し活性で
ある間のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの損失は平衡を逆に向か
わせ目的のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを減少させるので、そ
の添加は、エピメラーゼ酵素を失活させて析出させる煮
沸工程の後に行われた。

【００１３】本法においては、ピロリン酸塩の添加はな
く、ピロホスホリラーゼは、ＵＤＰ−サッカライドを分
解するためよりもむしろＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＮＡｃをより多くするために、ＵＤＰ／ＵＴ
Ｐのリサイクルにおいて使用される。更に、本発明で
は、活性なピロホスホリラーゼは活性なエピメラーゼと
同じ溶液（水性反応媒質）中に存在する。ＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＮＡｃ及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃピロホスホリラーゼ
酵素は周知であり、公表されている手順によって容易に
得ることができる。例えば、セノらの米国特許第 4,56
9,909号は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ
が黄色ブドウ球菌又はパン屋で使用する酵母（サッカロ
ミセス・セレビシエ）から得られることを教示してい
る。ホワイトサイド研究グループは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮ
Ａｃピロホスホリラーゼ（ＥＣ2.7.7.23）にカンジダ・
ユーチリス（トルライースト）由来の試料を使用するこ
とを報告している（ヘイドラスら、J. Org. Chem.,57:
146-151 (1992)及びその引用文献）。マレイ(Maley）
ら、Biochem. J.,107: 637-644 (1968) は、彼らが調製
したラット肝臓抽出物中のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃピロホ
スホリラーゼを報告している。

【００１４】使用するグリコシルトランスフェラーゼ
は、転移されたグリコシル基及び該グリコシル基（Ｇａ
ｌＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃ）が転移される受容体の両方
に対して特異的である。天然に存在するサッカライド結
合を形成するトランスフェラーゼ酵素は公知であり単離
されている。これら酵素の幾つかは、ベーヤーら、Adv.
Enzymol.,52: 23-175 (1981) 中に引用されており、更
なる酵素がスリバスタバ（Srivastava）ら、Carbohyd.
Res., 207: 259-276 (1990) 及びヒンドスガウル(Hinds
gaul）ら、J. Biol. Chem., 266(27): 17858-17862 (19
91) においてヒンドスガウル及びその共同研究者によっ
て記載されており、ロップ（Ropp）ら、J.Biol. Chem.,
266: 23863 (1991) 及びバン・ハルビーク(Halbeek）
ら、Eur. J. Biochem., 127: 21 (1992)において記載さ
れている。ペプチド−グリコシル化酵素についての、ウ
ォンら、J. Biol. Chem., 267: 12709-12716 (1992) 及
びブライアン（Briand）ら、J. Biol. Chem., 156: 122
05-12207 (1981) 及びその引用文献も参照のこと。これ
らトランスフェラーゼの更なる編集物、即ち、それらの
一般名及びＥＣ名の幾らかは、ブロックハウゼン(Brock
hausen）、Crit. Rev.Clin. Lab. Sci., 39(2): 65-151
(1993)及びその引用文献に示されている。個々の望ま
しいグリコシルトランスフェラーゼは、上記の報文で議
論されているようにして調製することができ、細胞全体
及び細胞抽出物を利用することができるので、精製する
ことを要しない。

【００１５】好ましい態様において水性反応媒質中で利
用されるグリコシルトランスフェラーゼは、ＧｌｃＮＡ
ｃ−１−Ｐが水性反応媒質のモノサッカライドリン酸で
ある場合にＧａｌＮＡｃ基を転移させ、また、ＧａｌＮ
Ａｃ−１−Ｐが水性反応媒質のモノサッカライドリン酸
である場合にＧｌｃＮＡｃ基を転移させる酵素であると
いうことが理解されるべきである。かくして、水性反応
媒質中に存在するグリコシルトランスフェラーゼは、好
ましくは、該水性反応媒質のモノサッカライドリン酸と
しては存在しないＧａｌＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃを転移
させる。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡ
ｃを相互転換できる酵素も存在する。この酵素は、どち
らの環位がエピ化されるかを示すために、ＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＮＡｃ／ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃエピメラーゼと言って
もよい。幾らかの起源の酵素が文献に報告されている。

【００１６】ＧａｌＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃのどちらが
転移されるかにかかわらず同じ酵素を使用できるという
ことが強調される。これは、そのエピ化生成物のうちの
１つがグリコシル転移によって平衡から定常的に除去さ
れ、それによって、形成されるべきその生成物がより多
く生じるからである。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメ
ラーゼは１つの例示的酵素であって、それは、セノらの
米国特許第 4,569,909号に記されているように、枯草菌
株ＩＦＯ３００９（ＩＦＯ＝日本の大阪の醗酵研究所）
から調製できる。該特許は、破壊した細胞の硫酸アンモ
ニウム分別を使用して細胞不含抽出物酵素試料をつくる
ことを教示している。そのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エ
ピメラーゼは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−Ｇｌｃ
ＮＡｃに転化しその逆も行う。セノらによれば、２つの
ＵＤＰ誘導型間の平衡は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの方が
多い約２：１のモル比でＵＤＰ誘導体を与える。従っ
て、ここではＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに転化されるＧａｌ
ＮＡｃ−１−Ｐで出発しても、この酵素についての平衡
はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの生成に有利である。一方、Ｇ
ｌｃＮＡｃ−１−Ｐで出発すると、ＧａｌＮＡｃの転移
は、特に、活性なエピメラーゼが活性なグリコシルトラ
ンスフェラーゼと共に存在しない場合には、不利である
と考えられる。しかしながら、活性なエピメラーゼとＵ
ＤＰ−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼが存在するの
で、該反応は進行する。

【００１７】他の有用なＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ４−エピ
メラーゼの好例が、マレイら、Biochem. J.,107: 637-6
44 (1968) によって報告されている。この酵素での平衡
はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対して約７：３のモル比であ
る。マレイら、Biochem. Biophys. Acta, 31: 557-563
(1959)も参照のこと。本発明の利点の１つは、活性なＵ
ＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ／ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃエピメラー
ゼの存在下でＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ
を利用することによって、酵素的エピ化平衡によって生
成するＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが、グリコシルトランスフ
ェラーゼを介して定常的に使用される結果、平衡の位置
が殆ど重要ではないことである。かくして、ＧａｌＮＡ
ｃ含有生成物の収率は増加し、セノらによって教示され
るような、平衡が成立し煮沸によってエピメラーゼ活性
が除かれる場合に予測される収率を越えることができ
る。勿論、同じことがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフ
ェラーゼがそのグリコシル転移のために存在する場合に
も当てはまる。更に、先に記したように、活性なエピメ
ラーゼ及び活性なグリコシルトランスフェラーゼの存在
下でのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ（又は
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃピロホスホリラーゼ）の反応媒質
中での存在は、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ（ＧａｌＮＡｃ−
１−Ｐ）から絶えずより多くのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ
（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）をつくる結果、トランスフェ
ラーゼがエピメラーゼによってつくられたＵＤＰ−Ｇａ
ｌＮＡｃ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を残らず使いきるの
で、転移に利用できるなおより多くのＵＤＰ−ＧａｌＮ
Ａｃ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）をつくりつつ、より多く
のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）がつ
くられる。

【００１８】利用する受容体は、オリゴサッカライド、
タンパク質、ペプチド、糖タンパク質又はグリコペプチ
ドの多様性に富んだもののいずれであってもよい。個々
の受容体の選択は、ＧａｌＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃのい
ずれが転移されるかという選択と使用するトランスフェ
ラーゼの選択によって決まる。大抵の場合、グリコシル
トランスフェラーゼ特異性は、非還元性末端サッカライ
ドだけか又は約１〜約４の隣接するサッカライドと結び
つけて決定される。かくして、熟練した研究者が、一
旦、使用する所定のトランスフェラーゼに適する構造的
要件を有する受容体を準備したなら、該受容体がトラン
スフェラーゼの作用を受ける水性反応媒質中で最小限の
溶媒性を有する限り、残りのサッカライド又はサッカラ
イド含有受容体の還元性末端に向かう他の構成基は該転
移反応に無関係である。同様に、ペプチド又はタンパク
質のセリン／スレオニン又はアスパラギンのいずれの側
のアミノ酸残基もグリコシル化の選択性に役割を演じて
ないようである。種々の受容体の、幾つかのＵＤＰ−Ｇ
ａｌＮＡｃ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラー
ゼとの反応によって形成される典型的な非還元性末端構
造は、先に議論したベーヤーら、Adv. Enzymol.,52: 23
-175 (1981) に記されており、ブロックハウゼン、Cri
t. Rev. Clin. Lab. Sci., 39(2): 65-151 (1993)は再
検討している。そして、それらは一般名及びＥＣ名を伴
って以下の表１及び２に示されている：

【００１９】

【表１】表１ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ構造ＥＣ名一般名 GalNAcα１→３(Fucα１→２)Galβ- 2.4.1.40 血液型Ａ α３-GalNAc-T GalNAcα１→Ser/Thr 2.4.1.41 ポリペプチド α-GalNAc-T GalNAcβ１→４Gal 血液型 Cad又は S^d β４-GalNAc-T GalNAcβ１→３Gal −−− コア５α３- GalNAc-T GalNAcα１→３GalNAc −−− −−− (GalNAc β１→４GlucUAβ１→３-)_n −−− −−− (GalNAc β１→４IdUAα１→３-)_n −−− −−−

【００２０】

【表２】表２ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ構造ＥＣ名一般名 GlcNAcβ１→４GlcNAc 2.4.1.119 オリゴサッカリル-T GlcNAcβ１→Asn −−− −−− GlcNAcβ１→２Man 2.4.1.101 GlcNAc-T I 2.4.1.143 GlcNAc-T II GlcNAcβ１→４Man 2.4.1.144 GlcNAc-T III 2.4.2.145 GlcNAc-T IV −−− GlcNAc-T VI GlcNAcβ１→６Man 2.4.1.155 GlcNAc-T V GlcNAcβ１→３Man −−− −−− GlcNAcα１→３Man −−− −−− GlcNAcβ１→３Gal 2.4.1.149 血液型 i 2.4.1.146 β３-GlcNAc-T 伸長β３-GlcNAc-T GlcNAcβ１→４Gal −−− −−− GlcNAcβ１→６Gal 2.4.1.150 血液型 I β６-GlcNAc-T GlcNAcα１→４Gal −−− −−− GlcNAcα１→４GlcNAc −−− −−− GlcNAcβ１→６GalNAc 2.4.1.102 コア２ β６-GlcNAc-T 2.4.1.148 コア４ β６-GlcNAc-T GlcNAcβ１→３GalNAc 2.4.1.147 コア３ β３-GlcNAc-T GlcNAcβ１→４GalNAc −−− −−− GlcNAcα１→４GlcUA −−− −−− GlcNAcα１→４IdUA −−− −−−

【００２１】水性反応媒質中の最終成分は、ウリジン二
リン酸／ウリジン三リン酸（ＵＤＰ／ＵＴＰ）リサイク
ル（再生）系である。この系は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ
又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから受容体へのグリコシル転
移で形成されるＵＤＰをリサイクルし、ＵＴＰを再生
し、そして、その再生物を使用して、エピ化し、次い
で、転移されるより多くのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ又はＵ
ＤＰ−ＧａｌＮＡｃを形成する。該ＵＤＰ／ＵＴＰリサ
イクル系又は再生系は、３つの基本的な成分を含有す
る：(a) ＵＤＰ、ＵＴＰ又はその両方、(b) リン酸供与
体、及び (c)リン酸供与体からのリン酸基をＵＤＰに転
移するためのキナーゼ。ＵＤＰ及びＵＴＰのいずれか又
は両方は、ＵＤＰがＵＴＰに転化される限り存在するこ
とができ、グリコシル転移反応後にＵＤＰが再び形成さ
れる。ＵＤＰとＵＴＰは相互転換して再利用されるの
で、両方についての量というよりむしろその一方又は他
方の総量が通常議論される。

【００２２】再生系のリン酸供与体はリン酸化された化
合物であり、そのリン酸基はＵＤＰをリン酸化してＵＴ
Ｐを形成するのに使用され得る。リン酸供与体を選択す
る上での唯一の限定は、リン酸供与体のリン酸化型も脱
リン酸化型も、グリコシル化された受容体サッカライド
の形成に関連するいずれの反応をも実質的に妨害しない
ということだけである。好ましいリン酸供与体は、ホス
ホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びアセチルリン酸
（ＡｃＯＰ）である。特に好ましいリン酸供与体はＰＥ
Ｐであり、それはリン酸転移の後にピルビン酸（ＰＹ
Ｒ）を形成する。本発明に従って使用する個々のキナー
ゼの選択は、使用するリン酸供与体に依存する。リン酸
供与体としてアセチルリン酸を使用する場合には、キナ
ーゼはアセテートキナーゼ（ＥＣ 2.7.2.1）である。リ
ン酸供与体としてＰＥＰを使用する場合には、キナーゼ
はピルビン酸キナーゼ（ＰＫ；ＥＣ2.7.1.40）である。
当業者に周知であるように、他のキナーゼが他のリン酸
供与体と共に使用できる。キナーゼは市販されている
（ミズーリ州セントルイスのシグマ化学社；インディア
ナ州インディアナポリスのベーリンガーマンハイム
社）。上記の方法で利用する各酵素は、更にこの後に議
論するように、触媒量で存在する。Ｎ−アセチルアミノ
モノサッカライド１−リン酸とＵＴＰからのＵＤＰ−グ
リコシドの酵素触媒形成は、無機のピロリン酸も生ず
る。１つの好ましい態様においては、水性反応媒質中に
触媒量で存在してもよい無機のピロホスファターゼ（Ｐ
Ｐａｓｅ；ＥＣ 3.6.1.1）によって、形成した無機のピ
ロリン酸（ＰＰｉ）を触媒的に無機のリン酸（Ｐｉ）に
分解する。水性反応媒質中でのＰＰｉの存在は幾つかの
酵素を阻害し得る。

【００２３】本発明の方法の概略的な流れを以下のスキ
ーム１に例示し、完全を期すためＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ
及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの両方によるグリコシル転移
を示した。そのスキームにおいて、両転移のための受容
体をＲ−ＯＨとして一般化して示しており、アスパラギ
ン残基への転移も意図していることが理解できる。存在
してもよい６つの酵素をＥ₁〜Ｅ₆で示し、以下のスキ
ーム中に特定した。より平明なものとするため、ＰＰａ
ｓｅは示していない。Ｅ₆、即ち、エピメラーゼについ
てのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに向かう長い矢印は、平衡が
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに向いていることを示すものであ
る。好ましい方法においては、それら６つの酵素のうち
４つだけが存在するということが更に理解されるべきで
ある。かくして、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐが出発原料であ
る場合、Ｅ₂（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）と同
様に、Ｅ₄（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃピロホスホリラー
ゼ）は水性反応媒質に存在しない。同様に、ＧａｌＮＡ
ｃ−１−Ｐが出発原料である場合、Ｅ₅（ＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＮＡｃピロホスホリラーゼ）とＥ₁（ＧａｌＮＡｃト
ランスフェラーゼ）は水性反応媒質に存在しない。

【００２４】

【化１】

【００２５】以下のスキーム１Ａ及び１Ｂは、意図した
２つの方法のそれぞれの反応及び上記で議論した水性反
応媒質中に存在する物質を分離して描いたスキーム１の
分割型である。ここでも、ピロホスホリラーゼ触媒反応
によって形成されたＰＰｉは示されておらず、ＰＰａｓ
ｅによるその分解も示されていない。かくして、スキー
ム１Ａにおいて、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐは、Ｅ₅、即
ち、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ、ＰＰｉ
の放出を伴うＵＴＰの反応によって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮ
Ａｃに形成される。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、Ｅ₆、即
ち、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ／ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃエピ
メラーゼによってエピ化されてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを
形成し、これは、Ｅ₁、即ち、ＧａｌＮＡｃトランスフ
ェラーゼの存在下で受容体、即ち、Ｒ−ＯＨと反応して
グリコシル化生成物及びＵＤＰを形成する。その形成さ
れたＵＤＰは、該スキームの右側に示されているＵＤＰ
であって、Ｅ₃、ピルビン酸キナーゼ及びＰＥＰを介し
てリサイクルされてＵＴＰを形成する。それは、Ｅ₅を
介してより多くのＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐと反応してより
多くのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを形成し、このようにし
て、より多くのＧａｌＮＡｃ含有生成物が形成され得る
のである。

【００２６】スキーム１Ｂは第２の意図する方法を示す
ものであって、Ｅ₂、即ち、ＧｌｃＮＡｃトランスフェ
ラーゼを介してＧｌｃＮＡｃ基でグリコシル化された生
成物を形成するのに使用するＧａｌＮＡｃ−１−Ｐで始
まる方法である。ＧａｌＮＡｃ−１−Ｐは、Ｅ₄、即
ち、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃピロホスホリラーゼの存在下
でのＵＴＰとの反応によって、ＰＰｉを放出しながらＵ
ＤＰ−ＧａｌＮＡｃに形成される。ＵＤＰ及びＵＴＰで
のリサイクル工程又は再生工程は上記で議論したのと同
様であるが、Ｅ₆でのエピ化はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを
形成し、形成されたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃはＥ₂でのト
ランスフェラーゼ触媒反応に利用される。ＧａｌＮＡｃ
のグリコシル転移がＧａｌＮＡｃ−１−Ｐで開始して達
成できること及びＧｌｃＮＡｃについての類似の転移が
ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐから開始して達成できることも理
解されるべきである。かくして、上記のスキーム１及び
以下のスキーム１Ａ及び１ＢにＥ₆として示したエピメ
ラーゼは、ある態様においては存在する必要がなく、使
用するトランスフェラーゼは、ＧｌｃＮＡｃ基又はＧａ
ｌＮＡｃ基をエピ化なしで転移する。しかしながら、好
ましいグリコシル化反応はエピメラーゼを含み、以下の
スキーム１Ａ及び１Ｂのいずれかに例示されている。

【００２７】

【化２】

【００２８】本明細書で使用する“触媒量”とは、速度
が制限されることなしに酵素の基質が生成物に転化する
のを触媒するのに少なくとも十分なその酵素の量を意味
する。個々の酵素の触媒量は、温度、時間及びｐＨ値の
如き反応条件のほか、その酵素の基質の濃度に従って変
動する。予め選択した基質濃度及び反応条件下での所定
の酵素についての触媒量の決定手段は当業者に周知であ
る。混合とは、各々の成分を他の各々の成分と好適な水
性緩衝媒質（溶媒）中で混合して反応混合液又は水性反
応媒質を形成することを含む。水性反応媒質は、好まし
くは種々の成分の溶液又は分散液である。使用する酵素
がフリーであって固体支持体と結合していないことも好
ましい。かくして、好ましい実施においては、水性反応
媒質は実質的に均質である。使用する温度は、約０℃〜
第１の酵素が変性する温度の範囲であり得、容易に決定
することができる。通常は、この方法は１５℃〜約４０
℃の温度で行われる。好ましくは、温度は約２０℃〜約
４０℃、より好ましくは約２５℃〜約３７℃である。周
囲大気圧が好ましく使用される。

【００２９】ｐＨ値は約5.０〜約１0.０の範囲であり得
る。好ましくは、ｐＨ値は約6.５〜約8.５であり、より
好ましくは約7.０〜約7.５である。ｐＨ値は水性溶媒中
において緩衝液によって維持される。緩衝液は、Ｍｇ⁺²
又はＭｎ⁺²の如き酵素補因子に結合するキレート化剤を
含まず、水性溶媒から効率よく除去されるものである。
ＥＤＴＡの如きキレート化剤は存在してもよく、存在す
るのが好ましい。緩衝液の選択は、望ましいレベルでｐ
Ｈを維持する緩衝液の能力に基づく。ｐＨ値が約7.５で
ある場合、有用な緩衝液はＨＥＰＥＳである。ｐＨ値が
約7.０〜9.０である場合、トリス−ＨＣｌも使用でき
る。水性反応媒質のモル浸透圧濃度及びイオン組成は、
活性型にある反応混合物の諸成分を溶解し、かつ、該反
応混合物に含有される酵素に補因子を供給するよう設計
され選択される。緩衝液を含む水性溶媒のモル浸透圧濃
度は、好ましくは約１００mOsm〜約３００mOsmである。
反応を実質的に阻害しない少量（例えば、約１０容量％
まで）の有機溶媒も、受容体の溶解性を増大させるため
に存在してもよい。適した溶媒には、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ
及びアセトニトリルがある。トリトンＸ−１００、オク
チル−β−Ｄ−グルコピラノシド（カルビオケム社）、
ＭＥＧＡ−８−９又は−１０（カルビオケム社）、ＣＨ
ＡＰＳ又はＣＨＡＰＳＯ（カルビオケム社）又はツィー
ン−２０の如き酵素を変性しない可溶化洗浄剤も、酵素
及び受容体の溶解性を向上させるために存在してもよい
が、水性反応媒質はかかる洗浄剤を含まない方が好まし
い。

【００３０】グリコシル化反応の反応時間及び条件は、
ｐＨ値、反応温度、反応成分、それらの量、及び目的と
するグリコシル化体量の如き数パラメーターと共に変化
する。周囲室温（例えば、約２２℃）での典型的な反応
時間は、最小限の反応だけを望む場合の約１時間から受
容体を実質的に使い尽くして最終的な生成物の形成を望
む場合の約３日〜約５日の範囲である。本発明のグリコ
シル化法に使用する種々の反応体の濃度又は量は、温度
及びｐＨ値の如き反応条件及びグリコシル化する受容体
の量を含む数多くの要因に依存する。このグリコシル化
法は、触媒量の酵素の存在下でＵＤＰの再生を利用する
ので、該方法はモノサッカライド１−リン酸、リン酸供
与体及び受容体の濃度又は量によって制限される。本発
明の方法に従って使用できる反応体の濃度についての上
限は、それら反応体の溶解性によって決まる。好ましい
態様においては、モノサッカライド１−リン酸を現場で
つくった場合、グリコシル化は、出発モノサッカライド
１−リン酸又はその前駆体の濃度によって制限される。
かかる態様によれば、総ＵＤＰ、リン酸供与体、受容体
及び酵素の濃度は、出発モノサッカライド１−リン酸が
実質的に消費されるまでグリコシル化が進行するように
選択される。

【００３１】例として、ＧａｌＮＡｃ−１−Ｐ又はＧｌ
ｃＮＡｃ−１−Ｐの濃度が約５０ｍＭのときは、他の非
酵素反応体の好ましい濃度は、受容体については約５０
ｍＭ、総ＵＤＰについては約５００μＭであり、リン酸
供与体については約５０ｍＭである。これら反応体濃度
のモノサッカライドリン酸濃度に対する比率は、好まし
くは、受容体については約0.９〜1.２：１、ＵＤＰにつ
いては約５０〜１００：１であり、リン酸供与体につい
ては約1.０〜1.２：１である。このグリコシル化法は、
更に、好ましくはグリコシル化された受容体を単離又は
回収することを含む。単離はグリコシル化された受容体
を反応混合物から回収することを含む。グリコシル化さ
れた受容体を回収する手段には、周知のように、ゲル濾
過、カラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラ
フィー、アフィニティクロマトグラフィー、抽出、沈澱
等がある。好ましい態様においては、単離及び回収は、
反応混合液を凍結乾燥して該反応混合液の容量を減ら
し、該凍結乾燥した反応混合物を約２００〜４００メッ
シュのゲル濾過カラムに充填し、該濾過カラムからグリ
コシル化された受容体化合物を溶離することによって行
われる。次いで、該グリコシル化された受容体を通常の
周知技術を使用して更に精製及び単離し得る。

【００３２】グリコシル化された受容体は単離（回収）
されることを要さず、該水性反応混合液での他の合成工
程において、又は該グリコシル化された受容体生成物が
それ自体未だ回収されたことのない他の反応混合液にお
いて使用できるということが理解されるべきである。例
えば、本発明の方法を利用して、ＧｌｃＮＡｃトランス
フェラーゼ酵素ＧｌｃＮＡｃＴ−III （ＥＣ 2.4.1.14
4）でＭａｎ含有化合物にＧｌｃＮＡｃを加えてＧｌｃ
ＮＡｃβ１→４Ｍａｎ結合を形成する場合、更にＧａｌ
をその非還元性末端ＧｌｃＮＡｃ部分に加えてＧａｌβ
１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４Ｍａｎ構造を含有する化合
物を形成するのが有利であり得る。そうするには、目的
の誘導体を調製するために、ＵＤＰ−Ｇａｌ及びβ１→
４グリコシルトランスフェラーゼを反応混合液に添加す
ることだけが必要である。他の態様においては、水性反
応媒質中に存在する他の物質から酵素を変性、分離し、
次いで、次工程で必要な成分を添加するのが有用であり
得る。この変性及び分離は、水性反応媒質を、酵素を変
性するのに十分な時間、例えば、約５〜１０分間煮沸
し、続いて、遠心分離して得られた析出物をその上清か
ら分離することによって行うことができる。次いで、そ
の上清を上記した次反応に使用する。

【００３３】

【実施例】

実施例１：ムチン−タイプオリゴサッカライドの合成ムチン−タイプオリゴサッカライドの還元性末端部分
は、オリゴサッカライド基Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→
３（β１→６ＧｌｃＮＡｃ）ＧａｌＮＡｃ（化合物１）
を含有する。そのオリゴサッカライドは、天然のムチン
ではセリン又はスレオニンにα結合している。ＧａｌＮ
Ａｃ−１−Ｐ（２５ｍｇ、７３μモル）、ＵＤＰ（３５
ｍｇ、７３μモル）、ＰＥＰＮａ₃塩（２０ｍｇ、８５
μモル）、ＥＤＴＡ（３ｍＭ）、及びＭｇＣｌ₂（５ｍ
Ｍ）をＨＥＰＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、５ｍＬ）中に含
有する水性媒質を調製し、ＮａＯＨで7.５のｐＨ値に調
節した。凍結乾燥したパン屋で使用する酵母細胞（５０
ｍｇ）及びピルビン酸キナーゼ（ＰＫ；２００Ｕ）を該
水性媒質に添加し、得られた混合液をアルゴン雰囲気下
で２３℃で約１０時間攪拌した。該酵母細胞はすぐに使
えるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃピロホリラーゼの源を与え
た。

【００３４】薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ；ｉＰ₂O
Ｈ／H₂Ｏ／ＮH₄ＯＨ；７：３：１ｖ／ｖ）で確認して、
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを認めた後、化合物２〔Ｇａｌβ
１→３ＧａｌＮＡｃ；ルック（Look）ら、J. Org. Che
m.,58(15): 4326-4330 (1993)に記載されているように
調製した〕（１０ｍｇ、２６ミリモル）、ロイペプチン
（0.５ｍｇ／ｍＬ）、ペプスタチン（0.７ｍｇ／ｍ
Ｌ）、ツィーン２０（５０μＬ）、ジチオトレイトール
（3.８ｍｇ）、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭ
ＳＦ）（0.２ｍＭ）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ４−エピメ
ラーゼ〔ルックら、J.Org. Chem.,58(15): 4326-4330
(1993)〕及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃβ１→６トランスフ
ェラーゼを含有する粗細胞抽出物〔ロップ（Ropp）ら、
J. Biol. Chem., 266: 23863 (1991);バン・ハルビーク
ら、Eur. J. Biochem., 127: 21 (1992)〕を該水性媒質
に添加して水性反応媒質を形成した。このようにして形
成した該水性反応媒質をアルゴン雰囲気下で室温で２日
間維持し、濃縮し、シリカゲルでカラムクロマトグラフ
ィー（ＥＴＯＡｃ／ＡｃＯＨ／H₂Ｏ，３：２：１ｖ／
ｖ）に付し、続いて、アノマーの混合物として凍結乾燥
した後、水でのバイオゲルＰ−２濾過により化合物３
（Ｇａｌβ１→３（β１→６ＧｌｃＮＡｃ）ＧａｌＮＡ
ｃ）を得た。

【００３５】ヒンドスガウルら、J. Biol. Chem., 266
(27): 17858-17862 (1991) に記載されているようにし
て化合物３を反応させた。即ち、スケールアップした合
成において、該報文で使用した放射線ラベルしたＧＤＰ
−フコース及び阻害剤は使用せずに、α（１→２）フコ
シルトランスフェラーゼ（ＥＣ2.4.1.69）を使用した。
該反応混合物は、ＮａＮ₃を含有するトリス緩衝液中で
ｐＨ7.０で化合物３、ＧＤＰ−Ｆｕｃ、ＭｎＣｌ₂、Ａ
ＴＰ及びα（１→２）フコシルトランスフェラーゼを利
用して、化合物１を形成した。上記で議論したように、
化合物３が、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐから出発して、エピ
メラーゼを除去し、パン屋で使用する酵母細胞をカンジ
ダ・ユーチリス由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホリラ
ーゼ含有試料と置き換えることによっても形成できると
いうことは明かである。次いで、前に議論したように、
化合物１が調製される。また、化合物２０（ＧｌｃＮＡ
ｃβ１→３（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮ
Ａｃ）は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃβ１→６トランスフェ
ラーゼを伸長（elongation）β−３−ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ
（ＥＣ 2.4.1.146）と水性反応媒質中で置き換えてＧｌ
ｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ（化合物
２１）を形成し、続いて、上記のフコシル化を行うこと
によって調製できるということも明かである。

【００３６】実施例２：血液型−Ａ抗原の合成血液型Ｈ抗原、即ち、化合物４は、構造Ｆｕｃα１→２
Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃを有し、上記で議論したよ
うに、ＧＤＰ−Ｆｕｃ及びα（１→２）フコシルトラン
スフェラーゼ（ＥＣ2.4.1.69）を使用して、Ｎ−アセチ
ルラクトサミンから調製することができる。非還元性末
端サッカライド（Ｇａｌ）の３位へのＧａｌＮＡｃ基の
付加は、Ｈ抗原をタイプ−Ａ抗原（ＧａｌＮＡｃα１→
３（Ｆｕｃα１→２）Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ、化
合物５）に変える。ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰをＧａｌＮＡ
ｃ−１−Ｐと置き換え、カンジダ・ユーチリス由来のＵ
ＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ含有試料及びマ
レイら、Biochem. J.,107: 637-644 (1968) に記載され
たＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ含有試料をパ
ン屋で使用する酵母試料に置き換えたことを除いては、
実施例１で議論した反応媒質と類似の反応媒質を準備し
た。前に示したＴＬＣによってＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを
認めた後、化合物４を化合物２に置き換え、（フコシル
α１→２）ガラクトシドα１→３Ｎ−アセチルガラクト
サミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ2.4.1.40）を実施例
１のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼに置き換
えることによって、実施例１のように水性媒質を調製し
た。この酵素は、ベーヤーら、Adv. Enzymol.,52: 23-1
75、68-70 (1981)で議論されているように、ブタの胃粘
膜、ブタ及びヒトの下顎腺、ヒトの乳汁、ヒトの胃粘
膜、ヒト血清及び他の源を含む種々の源から単離されて
いる。このようにして形成した水性反応媒質をアルゴン
雰囲気下で２日間維持した。目的の物質である化合物５
が、実施例１で議論したように、アノマーの混合物とし
て得られた。実施例１の議論に従い、化合物５も、Ｇａ
ｌＮＡｃ−１−Ｐから出発して、エピメラーゼ試料を除
去し、カンジダ・ユーチリス試料の代わりに実施例１の
ピロホリラーゼのパン屋で使用する酵母試料を使用する
ことによって、化合物４から形成できるということは明
かである。

【００３７】実施例３：シアリルルイスＸ類縁体シアリルルイスＸ（ＳＬｅ^X）は、構造ＮｅｕＡｃα２
→３Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃを
有し、Ｅ−セレクチン媒介付着を阻害できる炭水化物で
ある。タイレル（Tyrell）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 88: 10372-10376 (1991)。化合物６（ＮｅｕＡｃ
α２→３Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡ
ｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＣH₃）は、好中球のＥ−セ
レクチンレセプターへの結合（付着）を阻害できるＳＬ
ｅ^Xの類縁体である。実施例１のものと類似の、Ｇａｌ
ＮＡｃ−１−Ｐを含有する水性媒質を調製した。ＴＬＣ
によってＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを認めた後、２つの例外
を除いては実施例１で調製したものと類似の水性反応媒
質を調製した。それら例外は、（１）実施例１のＵＤＰ
−ＧｌｃＮＡｃβ１→６トランスフェラーゼが、レロイ
ヤー（１loir）ら、Biochem. Biophys. Res. Common.,
52: 1285-1292 (1973)に記載されているように調製した
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃβ１→４トランスフェラーゼ（Ｅ
Ｃ 2.4.1.119）によって置き換えられている点、及び
（２）受容体化合物が化合物２の代わりにＧｌｃＮＡｃ
−ＯＣH₃である点である。

【００３８】該水性反応媒質をアルゴン雰囲気下で室温
で２日間維持した。次いで、その反応から得られたＧｌ
ｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＣH₃（化合物７）が
クロマトグラフィーを使用して得られた。化合物７は、
また、実施例２で議論したように、エピメラーゼ及び適
当なピロホスホリラーゼを使用せずに、ＧｌｃＮＡｃ−
１−Ｐを使用して直接に形成することができる。トリサ
ッカライドＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４Ｇｌｃ
ＮＡｃ−ＯＣH₃（化合物８）は、ウォンら、J. Biol. C
hem., 47: 5416-5418 (1982)に記載された環状ガラクト
シル転移反応に従い、ＧｌｃＮＡｃβ１→４ガラクトシ
ルトランスフェラーゼ（ＥＣ2.4.1.22）を使用して化合
物７から調製した。特許が許可された１９９１年３月１
８日出願の米国特許出願第 07/670,70号に記載されてい
る循環方法を使用する化合物８のシアリル化は、Ｎｅｕ
Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４Ｇｌ
ｃＮＡｃ−ＯＣH₃（化合物９）を与えた。その方法で使
用した特に有用なシアリルトランスフェラーゼは、ウェ
ン(Wen）ら、J. Biol. Chem., 267(29): 21011-21019
(1992) にポールソン(Paulson）グループによって記載
された組み換え体酵素である。デュマス(Dumas）ら、Bi
oorg. Med. Chem. Lett., 1: 425 (1991) 又はウォン
ら、J. Am. Chem. Soc.,114: 7321 (1992)でそれぞれ議
論されたα1,３フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.
4.1.152）又はα1,３／４フコシルトランスフェラーゼ
（ＥＣ2.4.1.65）での化合物９のフコシル化は、目的の
ＳＬｅ^X類縁体（化合物６）を与えた。

【００３９】実施例４：シアリルルイスＡ類縁体シアリルルイスＡ（ＳＬｅ^A）は、Ｅ−セレクチン媒介
付着を阻害するもう１つのリガンドである。そのＧａｌ
及びＦｕｃ基の位置は、ＳＬｅ^Aにおいては、ＳＬｅ^x
における位置に相対して転換している。ＳＬｅ^A類縁
体、即ち、化合物１０は、構造ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａ
ｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃβ１→４Ｇ
ｌｃＮＡｃ−ＯＣH₃によって表される。化合物１０を、
バス（Basu）ら、Fed. Proc., 30: 1133-1135 (1971)に
よって記載されたＧｌｃＮＡｃβ１→３ガラクトシルト
ランスフェラーゼを実施例３で使用したＧｌｃＮＡｃβ
１→４ガラクトシルトランスフェラーゼの代わりに使用
したこと、及び実施例３で記したフコシルα１→３／４
トランスフェラーゼを利用したこと以外は、化合物６と
同じ方法で調製した。かくして、実施例３の化合物７は
どちらの操作によっても調製され、上記のバスらのガラ
クトシルトランスフェラーゼを使用して、Ｇａｌ基をそ
の非還元性末端に加えて化合物１１（Ｇａｌβ１→３Ｇ
ｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＣH₃）を形成し
た。化合物１１を、実施例３におけるようにシアリル化
して化合物１２（ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌβ１→３Ｇ
ｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＣH₃）を形成し
た。次いで、化合物１２を、ウォンら、J. Am. Chem. S
oc.,114: 732 (1992) に記載されているように、α１→
３／４フコシルトランスフェラーゼを使用してフコシル
化し、ＳＬｅ^A類縁体化合物１０を形成した。上記の記
載及び実施例は説明することを意図したものであって、
限定するものと解されるべきではない。当業者にとっ
て、本発明の思想及び範囲内でなお他の変更を加えるこ
とは可能であり、それらを容易に提供することができ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｎ−アセチルガラクトサミン１−リン酸
（ＧａｌＮＡｃ−１−Ｐ）又はＮ−アセチルグルコサミ
ン１−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）をそれぞれ使用
して、ウリジン二リン酸をリサイクルしながら、受容体
をＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃでそれぞれグリコシル
化する方法であって、（１）単一容器内の水性媒質中に
以下の（ｉ）〜（vi）の成分を混合して水性反応媒質を
形成する工程；及び（２）前記水性反応媒質を、前記受
容体がグリコシル化されるのに十分な時間、約５〜約１
０のｐＨ値、約０〜約４０℃の温度に維持する工程、を
含む方法。（ｉ）ＧａｌＮＡｃ−１−リン酸又はＧｌｃＮＡｃ−１
−リン酸の一方又は他方であるモノサッカライドリン
酸；（ii）ＵＴＰの存在下で（ｉ）のモノサッカライドリン
酸からのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡ
ｃの形成を触媒するＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃピロホスホリ
ラーゼ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの
一方又は他方；（iii)ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ又はＧｌｃＮＡ
ｃトランスフェラーゼの一方又は他方であるグリコシル
トランスフェラーゼであって、存在するトランスフェラ
ーゼが（ｉ）のモノサッカライド１−リン酸としては存
在しないＧａｌＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃを転移させるト
ランスフェラーゼ；（iv）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを
相互転換するエピメラーゼ；（ｖ）（iii)のグリコシルトランスフェラーゼのための
受容体；及び（vi）(a) ＵＤＰ、ＵＴＰ又はその両方、(b) リン酸供
与体、及び(c) 該リン酸供与体からのリン酸基をＵＤＰ
に転移してＵＴＰを形成するキナーゼを含むウリジン二
リン酸リサイクル系。〔（ii）、（iii)、（iv）及び
（vi）の各々の酵素は触媒量で存在する。〕
【請求項２】グリコシル化された受容体を回収する工
程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】前記モノサッカライドリン酸がＧａｌＮ
Ａｃ−１−リン酸である、請求項１記載の方法。
【請求項４】前記モノサッカライドリン酸がＧｌｃＮ
Ａｃ−１−リン酸である、請求項１記載の方法。