JPH0779793A - Ｂ７０分子に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
Ｂ７０分子に対するモノクローナル抗体Info
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- JPH0779793A JPH0779793A JP5228540A JP22854093A JPH0779793A JP H0779793 A JPH0779793 A JP H0779793A JP 5228540 A JP5228540 A JP 5228540A JP 22854093 A JP22854093 A JP 22854093A JP H0779793 A JPH0779793 A JP H0779793A
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 活性化Ｂ細胞に特異的に発現する分子に対す
るモノクローナル抗体を得る。 【構成】 活性化Ｂ細胞に特異的に発現する分子であっ
て、分子量約７０kｄのタンパク質であり、ＣＤ２８ま
たはＣＴＬＡ−４と結合性を有する分子であって、Ｂ７
／ＢＢ１以外の分子である、Ｂ７０分子に対するモノク
ローナル抗体であり、ＣＤ２８依存性のＴ細胞の細胞障
害に対して阻害活性を有するモノクローナル抗体または
その活性フラグメント、およびそれを産生するハイブリ
ドーマ。 【効果】 移植における拒絶反応、自己免疫疾患、アレ
ルギー、癌等の免疫療法や診断に有用である。
るモノクローナル抗体を得る。 【構成】 活性化Ｂ細胞に特異的に発現する分子であっ
て、分子量約７０kｄのタンパク質であり、ＣＤ２８ま
たはＣＴＬＡ−４と結合性を有する分子であって、Ｂ７
／ＢＢ１以外の分子である、Ｂ７０分子に対するモノク
ローナル抗体であり、ＣＤ２８依存性のＴ細胞の細胞障
害に対して阻害活性を有するモノクローナル抗体または
その活性フラグメント、およびそれを産生するハイブリ
ドーマ。 【効果】 移植における拒絶反応、自己免疫疾患、アレ
ルギー、癌等の免疫療法や診断に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、モノクローナル抗体お
よびその活性フラグメントに関し、さらに詳しくは、活
性化Ｂ細胞膜表面に発現する分子であるＢ７０と特異的
に反応するモノクローナル抗体、その活性フラグメン
ト、該モノクローナル抗体の製造方法、および該モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。本発
明のモノクローナル抗体は、移植における拒絶反応、自
己免疫疾患、アレルギー、癌等の免疫療法や診断に有用
である。なお、モノクローナル抗体の「活性フラグメン
ト」とは、抗体の、抗原抗体反応活性を有するフラグメ
ントを意味し、具体的にはＦ(ab')2、Ｆab'、Ｆab、Ｆv
および組み換えＦv体などを含む。
よびその活性フラグメントに関し、さらに詳しくは、活
性化Ｂ細胞膜表面に発現する分子であるＢ７０と特異的
に反応するモノクローナル抗体、その活性フラグメン
ト、該モノクローナル抗体の製造方法、および該モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。本発
明のモノクローナル抗体は、移植における拒絶反応、自
己免疫疾患、アレルギー、癌等の免疫療法や診断に有用
である。なお、モノクローナル抗体の「活性フラグメン
ト」とは、抗体の、抗原抗体反応活性を有するフラグメ
ントを意味し、具体的にはＦ(ab')2、Ｆab'、Ｆab、Ｆv
および組み換えＦv体などを含む。
【０００２】免疫の応答機構は、多種類の細胞および調
節因子が複雑に相互作用することにより、機能してい
る。これはＴ細胞とＢ細胞との相互作用においても同様
である。Ｔ細胞とＢ細胞との主要な免疫応答は、Ｂ細胞
の細胞表面に発現される抗原／クラスＩＩＭＨＣ複合体
と、Ｔ細胞の細胞表面の、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）
／ＣＤ３複合体との結合を介した認識により行われてい
る。しかしながら、ＴＣＲと抗原／ＭＨＣ複合体との親
和力は強くなく、Ｔ−Ｂ細胞間の接着には種々の分子が
補助分子として使われており、そのような分子として、
それぞれ、ＴおよびＢ細胞表面に発現される、ＬＦＡ−
１とＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３；ＣＤ
２とＬＦＡ−３；ＣＤ４８、ＣＤ４またはＣＤ８とＭＨ
ＣクラスＩ、ＩＩ等が知られている。これらの分子は、
いずれもＴ−Ｂ細胞の相互作用のみならず、白血球と標
的細胞、組織あるいは血管内皮細胞との接着等において
も広く機能している。これら接着分子の機能を解明する
ことは、免疫学の研究のみならず臨床面で極めて重要と
考えられる。
節因子が複雑に相互作用することにより、機能してい
る。これはＴ細胞とＢ細胞との相互作用においても同様
である。Ｔ細胞とＢ細胞との主要な免疫応答は、Ｂ細胞
の細胞表面に発現される抗原／クラスＩＩＭＨＣ複合体
と、Ｔ細胞の細胞表面の、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）
／ＣＤ３複合体との結合を介した認識により行われてい
る。しかしながら、ＴＣＲと抗原／ＭＨＣ複合体との親
和力は強くなく、Ｔ−Ｂ細胞間の接着には種々の分子が
補助分子として使われており、そのような分子として、
それぞれ、ＴおよびＢ細胞表面に発現される、ＬＦＡ−
１とＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３；ＣＤ
２とＬＦＡ−３；ＣＤ４８、ＣＤ４またはＣＤ８とＭＨ
ＣクラスＩ、ＩＩ等が知られている。これらの分子は、
いずれもＴ−Ｂ細胞の相互作用のみならず、白血球と標
的細胞、組織あるいは血管内皮細胞との接着等において
も広く機能している。これら接着分子の機能を解明する
ことは、免疫学の研究のみならず臨床面で極めて重要と
考えられる。
【０００３】
【発明が解決すべき課題】最近、上記の分子のほかに、
従来はＴ細胞またはＢ細胞に特異的な分化抗原であると
考えられていた分子が、実は、Ｔ−Ｂ相互作用に重要な
役割を果していることが明らかにされてきた。そのよう
な分子にＣＤ２８−Ｂ７／ＢＢ１の系がある。ＣＤ２８
は、末梢Ｔ細胞に発現される９０kｄのホモダイマーで
あり、Ｂ７／ＢＢ１は免疫グロブリンスーパーファミリ
ーに属する膜分子であって、抗原提示細胞である活性化
Ｂ細胞やマクロファージ、樹状細胞により発現される。
これら接着分子の関与するＴ−Ｂ細胞間の作用機構の概
略を以下に示す。
従来はＴ細胞またはＢ細胞に特異的な分化抗原であると
考えられていた分子が、実は、Ｔ−Ｂ相互作用に重要な
役割を果していることが明らかにされてきた。そのよう
な分子にＣＤ２８−Ｂ７／ＢＢ１の系がある。ＣＤ２８
は、末梢Ｔ細胞に発現される９０kｄのホモダイマーで
あり、Ｂ７／ＢＢ１は免疫グロブリンスーパーファミリ
ーに属する膜分子であって、抗原提示細胞である活性化
Ｂ細胞やマクロファージ、樹状細胞により発現される。
これら接着分子の関与するＴ−Ｂ細胞間の作用機構の概
略を以下に示す。
【０００４】（１）Ｂ細胞を含む抗原提示細胞上のＭＨ
Ｃにより提示された抗原ペプチドをＴ細胞が、ＴＣＲを
介して認識すると、細胞内に第１のシグナルが入る。こ
れにより、Ｔ細胞が活性化され、ＣＤ２８の発現が増加
する。 （２）一方、ＩＬ−４や抗原レセプターの架橋によって
Ｂ細胞が活性化されるとＢ７／ＢＢ１が発現するが、そ
の発現は、ＭＨＣクラスＩＩを通してのシグナルにより
増強される。生体内では、Ｂ細胞がその細胞表面の抗原
レセプターにより抗原を認識すると、シグナルを細胞内
に伝達し、Ｂ７／ＢＢ１の発現が誘導される。 （３）さらにＢ細胞の細胞表面のＭＨＣ上に抗原を提示
する。これをＴ細胞がＴＣＲを介して認識すると、Ｂ細
胞内にＭＨＣからシグナルが伝わり、Ｂ７の発現が増強
されると考えられる。 （４）Ｔ細胞上のＣＤ２８とＢ細胞上のＢ７／ＢＢ１が
結合すると、第２の活性化シグナルがＴ細胞に伝達さ
れ、サイトカインのmＲＮＡの安定化を介してＩＬ−
２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αなどの産生
増加、さらには、細胞内では蛋白チロシンリン酸化が誘
導される。 （５）また、活性化Ｔ細胞上には、ＣＤ２８と構造上相
同性の高いＣＴＬＡ−４の発現も誘導される。ＣＴＬＡ
−４は、ＣＤ２８の数パーセントしか発現しないが、Ｂ
７／ＢＢ１とより強い親和力をもつ膜分子であり、ＣＤ
２８とともにＴ細胞活性化シグナルを伝達すると考えら
れている。また、ＣＤ２８を介したＴ細胞活性化は、Ｃ
Ｄ３／ＴＣＲを介した刺激とは異なり、免疫抑制剤に抵
抗性を示す。従って、ＴＣＲからのシグナルのみで、Ｃ
Ｄ２８を介したシグナルが伝達されない場合には、Ｔ細
胞はクローン麻痺(clonal anergy)に陥ると考えられて
いる。
Ｃにより提示された抗原ペプチドをＴ細胞が、ＴＣＲを
介して認識すると、細胞内に第１のシグナルが入る。こ
れにより、Ｔ細胞が活性化され、ＣＤ２８の発現が増加
する。 （２）一方、ＩＬ−４や抗原レセプターの架橋によって
Ｂ細胞が活性化されるとＢ７／ＢＢ１が発現するが、そ
の発現は、ＭＨＣクラスＩＩを通してのシグナルにより
増強される。生体内では、Ｂ細胞がその細胞表面の抗原
レセプターにより抗原を認識すると、シグナルを細胞内
に伝達し、Ｂ７／ＢＢ１の発現が誘導される。 （３）さらにＢ細胞の細胞表面のＭＨＣ上に抗原を提示
する。これをＴ細胞がＴＣＲを介して認識すると、Ｂ細
胞内にＭＨＣからシグナルが伝わり、Ｂ７の発現が増強
されると考えられる。 （４）Ｔ細胞上のＣＤ２８とＢ細胞上のＢ７／ＢＢ１が
結合すると、第２の活性化シグナルがＴ細胞に伝達さ
れ、サイトカインのmＲＮＡの安定化を介してＩＬ−
２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αなどの産生
増加、さらには、細胞内では蛋白チロシンリン酸化が誘
導される。 （５）また、活性化Ｔ細胞上には、ＣＤ２８と構造上相
同性の高いＣＴＬＡ−４の発現も誘導される。ＣＴＬＡ
−４は、ＣＤ２８の数パーセントしか発現しないが、Ｂ
７／ＢＢ１とより強い親和力をもつ膜分子であり、ＣＤ
２８とともにＴ細胞活性化シグナルを伝達すると考えら
れている。また、ＣＤ２８を介したＴ細胞活性化は、Ｃ
Ｄ３／ＴＣＲを介した刺激とは異なり、免疫抑制剤に抵
抗性を示す。従って、ＴＣＲからのシグナルのみで、Ｃ
Ｄ２８を介したシグナルが伝達されない場合には、Ｔ細
胞はクローン麻痺(clonal anergy)に陥ると考えられて
いる。
【０００５】上記のことをＴ細胞のＣＤ２８／Ｂ７相互
作用を介する細胞障害活性の発現について、さらに詳し
く述べる。ＣＤ２８陽性ヒト細胞株ＹＴ２Ｃ２は、ヒト
Ｂ細胞株であるＪＹをin vitroの細胞障害反応で殺すこ
とがわかっている。この反応は、抗ＣＤ２８抗体や抗Ｂ
７抗体により阻害される。このことは、Ｔ細胞の細胞障
害活性の発現にＣＤ２８／Ｂ７の相互作用が重要な役割
を果していることを示している。ところが、抗ＣＤ２８
抗体は、この細胞障害反応を完全に阻害するが、抗Ｂ７
抗体は部分的な阻害を示すにすぎない。このことは、活
性化Ｂ細胞表面にはＢ７／ＢＢ１以外の、Ｔ細胞表面の
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に結合性を持つ分子があ
り、それもまたＴ−Ｂ細胞間相互作用において重要な役
割を果たしていることを示唆している。従って、Ｔ−Ｂ
細胞相互の作用をさらに研究し、実際の治療に役立たせ
るためには、活性化Ｂ細胞の膜上で発現され、Ｔ細胞に
対してＢ７／ＢＢ１と副次的刺激（co−stimulatory si
gnal)を与える分子の機能を明らかにすることが必要で
ある。
作用を介する細胞障害活性の発現について、さらに詳し
く述べる。ＣＤ２８陽性ヒト細胞株ＹＴ２Ｃ２は、ヒト
Ｂ細胞株であるＪＹをin vitroの細胞障害反応で殺すこ
とがわかっている。この反応は、抗ＣＤ２８抗体や抗Ｂ
７抗体により阻害される。このことは、Ｔ細胞の細胞障
害活性の発現にＣＤ２８／Ｂ７の相互作用が重要な役割
を果していることを示している。ところが、抗ＣＤ２８
抗体は、この細胞障害反応を完全に阻害するが、抗Ｂ７
抗体は部分的な阻害を示すにすぎない。このことは、活
性化Ｂ細胞表面にはＢ７／ＢＢ１以外の、Ｔ細胞表面の
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に結合性を持つ分子があ
り、それもまたＴ−Ｂ細胞間相互作用において重要な役
割を果たしていることを示唆している。従って、Ｔ−Ｂ
細胞相互の作用をさらに研究し、実際の治療に役立たせ
るためには、活性化Ｂ細胞の膜上で発現され、Ｔ細胞に
対してＢ７／ＢＢ１と副次的刺激（co−stimulatory si
gnal)を与える分子の機能を明らかにすることが必要で
ある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そのためには、該物質に
対するモノクローナル抗体を得ることが重要である。本
発明者らは、活性化Ｂ細胞表面に発現されるＢ７／ＢＢ
１以外の、Ｔ細胞表面のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４と結合
性物質に対するモノクローナル抗体を得ることに成功
し、本発明を完成するに至った。この新しい分子は、Ｂ
７０と命名された。即ち、本発明は、ＣＤ２８、ＣＴＬ
Ａ−４と結合する、活性化Ｂ細胞膜上の分子であって、
Ｂ７／ＢＢ１以外の分子、即ちＢ７０に対するモノクロ
ーナル抗体およびその活性フラグメントに関する。さら
に本発明は、該モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマおよび該ハイブリドーマを用いるモノクローナル
抗体の製造方法に関する。
対するモノクローナル抗体を得ることが重要である。本
発明者らは、活性化Ｂ細胞表面に発現されるＢ７／ＢＢ
１以外の、Ｔ細胞表面のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４と結合
性物質に対するモノクローナル抗体を得ることに成功
し、本発明を完成するに至った。この新しい分子は、Ｂ
７０と命名された。即ち、本発明は、ＣＤ２８、ＣＴＬ
Ａ−４と結合する、活性化Ｂ細胞膜上の分子であって、
Ｂ７／ＢＢ１以外の分子、即ちＢ７０に対するモノクロ
ーナル抗体およびその活性フラグメントに関する。さら
に本発明は、該モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマおよび該ハイブリドーマを用いるモノクローナル
抗体の製造方法に関する。
【０００７】本発明のモノクローナル抗体は、Ｔ−Ｂ細
胞間相互作用の解析において、互いの細胞表面に発現さ
れるＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と、Ｂ７／ＢＢ１およ
びＢ７０との役割を研究し、それらを実際に応用する上
で有用である。また、本発明の抗体を用いてＴ−Ｂ細胞
の結合を阻害し、Ｔ細胞を抗原特異的にトレランスの状
態にすることができる。従って、本発明の抗体はまた、
移植の際の免疫反応の治療に有用である。同様に、該抗
体を用いれば、Ｂ７０を発現する細胞の検出を介して自
己免疫疾患の病状の診断を行うことができる。さらには
Ｂ細胞による自己抗体の産生を阻害することにより、自
己免疫疾患を治療することも可能である。
胞間相互作用の解析において、互いの細胞表面に発現さ
れるＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と、Ｂ７／ＢＢ１およ
びＢ７０との役割を研究し、それらを実際に応用する上
で有用である。また、本発明の抗体を用いてＴ−Ｂ細胞
の結合を阻害し、Ｔ細胞を抗原特異的にトレランスの状
態にすることができる。従って、本発明の抗体はまた、
移植の際の免疫反応の治療に有用である。同様に、該抗
体を用いれば、Ｂ７０を発現する細胞の検出を介して自
己免疫疾患の病状の診断を行うことができる。さらには
Ｂ細胞による自己抗体の産生を阻害することにより、自
己免疫疾患を治療することも可能である。
【０００８】本発明にかかわるモノクローナル抗体は、
当業者既知の方法を用い、以下のようにして作ることが
できる。すなわち、齧歯類動物に活性化Ｂ細胞株を免疫
感作し、その脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合し、
生成したハイブリドーマを、Ｂ細胞株に対するＴ細胞細
胞障害活性への阻害作用の強さを基準としてスクリーニ
ングし、最終的に、ＣＤ２８−Ｂ７０系の反応を完全に
阻害する抗体を選別し、該抗体を産生するハイブリドー
マの培養上清あるいは膜水中から、抗体を精製する。さ
らに詳しくは、本発明方法は以下の工程からなる。 齧歯類動物をヒトＢ細胞株(ＪＹ)で免疫感作し、 免疫感作した齧歯類動物から脾臓を摘出して、脾細胞
の懸濁液を調製し、 該脾細胞懸濁液をマウスのミエローマ細胞と融合促進
剤の存在下で混合して、両細胞を融合し、 融合した細胞、未融合のミエローマ細胞を支持しない
媒質中で希釈して培養することにより、抗体産生細胞と
ミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを選別し、 ハイブリドーマを含有する各培養ウェル中の上清液に
ついて、ＣＤ２８陽性の細胞株ＹＴ２Ｃ２（ＮＫ細胞）
のＪＹ(Ｂ細胞株)に対する細胞障害活性の完全な阻止を
指標として、抗Ｂ７０抗体の存在を確認し、 所望の抗体を生成するハイブリドーマを選択した後、
限界希釈法により単一クローンにし、 単一クローンのハイブリドーマの培養上清液から抗体
を回収する。 本発明は任意の齧歯類宿主動物を用いて行い得るが、Ｂ
alb／cマウスが好ましく、またマウスのミエローマ細胞
としては、Ｐ３Ｕ１が好適である。さらに、工程にお
ける未融合のミエローマ細胞を支持しない媒質として
は、例えばＨＡＴ培地を用いることができる。本発明の
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は既知
の方法を用いて行うことができる。
当業者既知の方法を用い、以下のようにして作ることが
できる。すなわち、齧歯類動物に活性化Ｂ細胞株を免疫
感作し、その脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合し、
生成したハイブリドーマを、Ｂ細胞株に対するＴ細胞細
胞障害活性への阻害作用の強さを基準としてスクリーニ
ングし、最終的に、ＣＤ２８−Ｂ７０系の反応を完全に
阻害する抗体を選別し、該抗体を産生するハイブリドー
マの培養上清あるいは膜水中から、抗体を精製する。さ
らに詳しくは、本発明方法は以下の工程からなる。 齧歯類動物をヒトＢ細胞株(ＪＹ)で免疫感作し、 免疫感作した齧歯類動物から脾臓を摘出して、脾細胞
の懸濁液を調製し、 該脾細胞懸濁液をマウスのミエローマ細胞と融合促進
剤の存在下で混合して、両細胞を融合し、 融合した細胞、未融合のミエローマ細胞を支持しない
媒質中で希釈して培養することにより、抗体産生細胞と
ミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを選別し、 ハイブリドーマを含有する各培養ウェル中の上清液に
ついて、ＣＤ２８陽性の細胞株ＹＴ２Ｃ２（ＮＫ細胞）
のＪＹ(Ｂ細胞株)に対する細胞障害活性の完全な阻止を
指標として、抗Ｂ７０抗体の存在を確認し、 所望の抗体を生成するハイブリドーマを選択した後、
限界希釈法により単一クローンにし、 単一クローンのハイブリドーマの培養上清液から抗体
を回収する。 本発明は任意の齧歯類宿主動物を用いて行い得るが、Ｂ
alb／cマウスが好ましく、またマウスのミエローマ細胞
としては、Ｐ３Ｕ１が好適である。さらに、工程にお
ける未融合のミエローマ細胞を支持しない媒質として
は、例えばＨＡＴ培地を用いることができる。本発明の
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は既知
の方法を用いて行うことができる。
【０００９】本発明の抗体は以下の特徴を示す。 １）活性化Ｂ細胞および末梢血単核球に特異的に発現す
る分子量約７０kｄのタンパク質であるＢ７０と免疫化
学的に結合するがＢ７／ＢＢ１とは反応しない。 ２）反応相手のＢ７０はＴ細胞等の表面に発現されるＣ
Ｄ２８またはＣＴＬＡ−４と結合し、Ｔ−Ｂ細胞の接着
に関与するタンパク質である。 ３）Ｂ７０と、ＣＤ２８あるいはＣＴＬＡ−４との結合
に対して阻害活性を有する。 ４）ＣＤ２８依存性のＴ細胞の細胞障害作用を阻害す
る。 ５）リンパ球混合反応を阻害する。 本発明のモノクローナル抗体は、既述のごとく、免疫化
学的な研究のみならず、様々な状況での免疫治療や診断
に有用である。このような目的を達成するには、必ずし
も抗体分子全体を用いる必要がなく、活性を有する限
り、分子の一部を用いることができ、場合によってはそ
の方が好ましいこともあるということは、当業者ならば
容易に理解できることである。従って、本発明は、抗Ｂ
７０モノクローナル抗体の活性フラグメントをも包含す
るものである。ここに、活性フラグメントという語句は
前記の定義に従う。
る分子量約７０kｄのタンパク質であるＢ７０と免疫化
学的に結合するがＢ７／ＢＢ１とは反応しない。 ２）反応相手のＢ７０はＴ細胞等の表面に発現されるＣ
Ｄ２８またはＣＴＬＡ−４と結合し、Ｔ−Ｂ細胞の接着
に関与するタンパク質である。 ３）Ｂ７０と、ＣＤ２８あるいはＣＴＬＡ−４との結合
に対して阻害活性を有する。 ４）ＣＤ２８依存性のＴ細胞の細胞障害作用を阻害す
る。 ５）リンパ球混合反応を阻害する。 本発明のモノクローナル抗体は、既述のごとく、免疫化
学的な研究のみならず、様々な状況での免疫治療や診断
に有用である。このような目的を達成するには、必ずし
も抗体分子全体を用いる必要がなく、活性を有する限
り、分子の一部を用いることができ、場合によってはそ
の方が好ましいこともあるということは、当業者ならば
容易に理解できることである。従って、本発明は、抗Ｂ
７０モノクローナル抗体の活性フラグメントをも包含す
るものである。ここに、活性フラグメントという語句は
前記の定義に従う。
【００１０】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明の詳細を述べる
が、これらの方法に限定されることはない。(１)免疫感作 ヒトのＥＢウイルス変異Ｂ細胞株であるＪＹ（順天堂大
学医学部免疫学教室より入手可能）を１×１０7個／ml
に生理食塩水で調製し、０．５ml／匹の割合で、雌性Ｂ
ＡＬＢ／cマウス（５週令)に腹腔内投与した。１週間
後、同様の操作を行い、毎週１回、合計４回免疫感作し
た。
が、これらの方法に限定されることはない。(１)免疫感作 ヒトのＥＢウイルス変異Ｂ細胞株であるＪＹ（順天堂大
学医学部免疫学教室より入手可能）を１×１０7個／ml
に生理食塩水で調製し、０．５ml／匹の割合で、雌性Ｂ
ＡＬＢ／cマウス（５週令)に腹腔内投与した。１週間
後、同様の操作を行い、毎週１回、合計４回免疫感作し
た。
【００１１】(２)融合 最終免疫３日後にマウスから脾臓を取り出した。取り出
した脾臓を細断後、メッシュで濾過し、ＲＰＭＩ１６４
０培地（ニッスイ製）に浮遊させ、脾細胞を１×１０3
個得た。この脾細胞とマウス由来のα−アザグアニン耐
性株(ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ欠損株)Ｐ３Ｕ１(２×１０7個)（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５９７）とを約５:１の割合で混合し、遠心
した(１５００rpm、５分)。得られた細胞のペレット
に、５０％ポリエチレングリコール４０００(メルク製)
／ＲＰＭＩ１６４０溶液２mlを、３７℃の温水中で撹拌
しながら１分間を要して加えた。これにＲＰＭＩ１６４
０液１５mlを撹拌しながら６分間を要して加え、細胞融
合を行った。融合後、大量(約４０ml)のＲＰＭＩ１６４
０液を加え、遠心分離(１５００rpm、５分)して上清を
除去した。次いで、ヒポキサンチン(１００μＭ)、アミ
ノプテリン(０．４μＭ)、チミジン(１０μＭ)を含む１
０％ ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地(ＨＡＴ培地)に
て、脾細胞が１×１０6mlになるように調製した。
した脾臓を細断後、メッシュで濾過し、ＲＰＭＩ１６４
０培地（ニッスイ製）に浮遊させ、脾細胞を１×１０3
個得た。この脾細胞とマウス由来のα−アザグアニン耐
性株(ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ欠損株)Ｐ３Ｕ１(２×１０7個)（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５９７）とを約５:１の割合で混合し、遠心
した(１５００rpm、５分)。得られた細胞のペレット
に、５０％ポリエチレングリコール４０００(メルク製)
／ＲＰＭＩ１６４０溶液２mlを、３７℃の温水中で撹拌
しながら１分間を要して加えた。これにＲＰＭＩ１６４
０液１５mlを撹拌しながら６分間を要して加え、細胞融
合を行った。融合後、大量(約４０ml)のＲＰＭＩ１６４
０液を加え、遠心分離(１５００rpm、５分)して上清を
除去した。次いで、ヒポキサンチン(１００μＭ)、アミ
ノプテリン(０．４μＭ)、チミジン(１０μＭ)を含む１
０％ ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地(ＨＡＴ培地)に
て、脾細胞が１×１０6mlになるように調製した。
【００１２】(３)ハイブリドーマの選択 上記（２）で調製した細胞浮遊液を９６ウェルマイクロ
プレート５枚に２００μlずつ分注し、３７℃、５％Ｃ
Ｏ2下にあるＣＯ2インキュベータで細胞を培養した。１
週間後には、ハイブリドーマのみがコロニーを形成し
て、増殖していることが確認できた。
プレート５枚に２００μlずつ分注し、３７℃、５％Ｃ
Ｏ2下にあるＣＯ2インキュベータで細胞を培養した。１
週間後には、ハイブリドーマのみがコロニーを形成し
て、増殖していることが確認できた。
【００１３】(４)抗体の検出 ハイブリドーマが十分に増殖していることが確認された
ので、その培養上清を用い、以下に示す方法で抗体の検
出を行った。細胞障害性ＣＤ２８+細胞株、ＹＴ２Ｃ２
（順天堂大学医学部免疫学教室より入手可能）のＪＹ細
胞に対する細胞障害を阻害する活性に基づいて抗体を検
出した。阻害実験は以下に示す方法で行った。
ので、その培養上清を用い、以下に示す方法で抗体の検
出を行った。細胞障害性ＣＤ２８+細胞株、ＹＴ２Ｃ２
（順天堂大学医学部免疫学教室より入手可能）のＪＹ細
胞に対する細胞障害を阻害する活性に基づいて抗体を検
出した。阻害実験は以下に示す方法で行った。
【００１４】エフェクター細胞の調製 ＣＤ２８陽性細胞障害性細胞株ＹＴ２Ｃ２の培養液から
細胞を回収し、１０％ＦＣＳ・ＲＰＭＩ１６４０液を用
い、濃度４×１０6個／mlの細胞懸濁液を２５ml調製し
た。
細胞を回収し、１０％ＦＣＳ・ＲＰＭＩ１６４０液を用
い、濃度４×１０6個／mlの細胞懸濁液を２５ml調製し
た。
【００１５】標的細胞の調製 ＪＹ細胞を回収し、１×１０7個／mlにＦＣＳで懸濁し
た。これに51Ｃrの放射活性を持つ、Ｎa2 51ＣrＯ4(ク
ロム酸ナトリウム)(第一化学製)１．８５ＭＢq（ベクレ
ル）(５０μl)を加え、３７℃で１時間インキュベート
してＪＹ細胞に51Ｃrを取り込ませた。１０％ＦＣＳ・
ＲＰＭＩ１６４０にて３回遠心洗浄した後、１０％ＦＣ
Ｓ・ＲＰＭＩ１６４０を用い、濃度２×１０5個／mlの
懸濁液２５mlを調製した。
た。これに51Ｃrの放射活性を持つ、Ｎa2 51ＣrＯ4(ク
ロム酸ナトリウム)(第一化学製)１．８５ＭＢq（ベクレ
ル）(５０μl)を加え、３７℃で１時間インキュベート
してＪＹ細胞に51Ｃrを取り込ませた。１０％ＦＣＳ・
ＲＰＭＩ１６４０にて３回遠心洗浄した後、１０％ＦＣ
Ｓ・ＲＰＭＩ１６４０を用い、濃度２×１０5個／mlの
懸濁液２５mlを調製した。
【００１６】細胞障害反応 ９６ウェルＵ型プレート(コーニング製)にエフェクター
であるＹＴ２Ｃ２を５０μl／wellの割合で入れ、さら
に51ＣrラベルしたＪＹを５０μl／wellの割合で入れ
た。次いで、１０％ＦＣＳ・ＲＰＭＩ１６４０中、２０
μg／mlの抗ヒトＢ７抗体（ベクトン・ディッキンソ
ン）（５０μl／well）および増殖したハイブリドーマ
の培養上清（５０μl／well）を加えた。各ウェルの内
容物をよく混合した後、１,０００rpm、１分で遠心分離
した後、３７℃で４時間反応させた。４時間後、培養上
清中に放出された51Ｃrを以下の方法で測定した。すな
わち、培養上清回収ストリップ(スカトロン製)を用いて
上清を回収した後、γ線カウンター(ファルマシア製)に
て51Ｃrの量を求め、それぞれの値を細胞障害活性に換
算した。その結果を基に、ＹＴ２Ｃ２がＪＹを障害する
活性を阻害する抗体を分泌するハイブリドーマを１ウェ
ル選択した。
であるＹＴ２Ｃ２を５０μl／wellの割合で入れ、さら
に51ＣrラベルしたＪＹを５０μl／wellの割合で入れ
た。次いで、１０％ＦＣＳ・ＲＰＭＩ１６４０中、２０
μg／mlの抗ヒトＢ７抗体（ベクトン・ディッキンソ
ン）（５０μl／well）および増殖したハイブリドーマ
の培養上清（５０μl／well）を加えた。各ウェルの内
容物をよく混合した後、１,０００rpm、１分で遠心分離
した後、３７℃で４時間反応させた。４時間後、培養上
清中に放出された51Ｃrを以下の方法で測定した。すな
わち、培養上清回収ストリップ(スカトロン製)を用いて
上清を回収した後、γ線カウンター(ファルマシア製)に
て51Ｃrの量を求め、それぞれの値を細胞障害活性に換
算した。その結果を基に、ＹＴ２Ｃ２がＪＹを障害する
活性を阻害する抗体を分泌するハイブリドーマを１ウェ
ル選択した。
【００１７】(５)クローニング (４)で選択したウエルで増殖しているハイブリドーマを
限界希釈法でクローニングした。希釈後の細胞濃度が１
個／wellとなるように１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０
培地で希釈し、９６ウエルプレートに２００μlずつ分
注し、３７℃、５％ＣＯ2下にて培養した。約１週間
後、ハイブリドーマの増殖が認められた。コロニーがあ
る程度の大きさになってから上記(４)の方法で再度抗体
の検出を行った。この操作を２回繰り返し、安定にＣＤ
２８、ＣＴＬＡ−４と結合するＢ７／ＢＢ１以外の分
子、Ｂ７０に対する抗体を産生するクローンを選択し
た。即ち、ＹＴ２Ｃ２はＪＹを阻害する。その際、抗Ｃ
Ｄ２８抗体では、その阻害を完全にブロックするが、抗
Ｂ７抗体では一部しか阻害しない。ここで得られた抗体
を用いれば完全にブロックできるので、Ｂ７以外のＣＤ
２８結合分子に対する抗体であると考えられる。このこ
とは、後述するように、（９）に記載の免疫沈降により
確認された。このハイブリドーマは、ＩＴ−２と命名さ
れ、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る［受託番号: ＦＥＲＭ Ｐ−１３８２３、受託日 平成
５年８月２６日］。
限界希釈法でクローニングした。希釈後の細胞濃度が１
個／wellとなるように１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０
培地で希釈し、９６ウエルプレートに２００μlずつ分
注し、３７℃、５％ＣＯ2下にて培養した。約１週間
後、ハイブリドーマの増殖が認められた。コロニーがあ
る程度の大きさになってから上記(４)の方法で再度抗体
の検出を行った。この操作を２回繰り返し、安定にＣＤ
２８、ＣＴＬＡ−４と結合するＢ７／ＢＢ１以外の分
子、Ｂ７０に対する抗体を産生するクローンを選択し
た。即ち、ＹＴ２Ｃ２はＪＹを阻害する。その際、抗Ｃ
Ｄ２８抗体では、その阻害を完全にブロックするが、抗
Ｂ７抗体では一部しか阻害しない。ここで得られた抗体
を用いれば完全にブロックできるので、Ｂ７以外のＣＤ
２８結合分子に対する抗体であると考えられる。このこ
とは、後述するように、（９）に記載の免疫沈降により
確認された。このハイブリドーマは、ＩＴ−２と命名さ
れ、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る［受託番号: ＦＥＲＭ Ｐ−１３８２３、受託日 平成
５年８月２６日］。
【００１８】(６)抗体のサブクラスの決定 ハイブリドーマが産生する抗体のサブクラスの決定は、
酵素免疫測定法により行った。即ち、抗マウス抗体[抗
ＩgＧ２a、ＩgＧ２b、ＩgＧ３、ＩgＭ]および抗マウス
Ｌ鎖抗体[抗κ、λ] (ＭＡＢ−isotyping kit, Ｐharm
ingen)とハイブリドーマの培養上清中の抗モノクローナ
ル抗体とを反応させた。その結果、ＩgＧ1、κを入れた
ウェルのみに発色が認められ、該ハイブリドーマはＩg
Ｇ1、κ鎖のモノクローナル抗体を産生する株であるこ
とがわかった。
酵素免疫測定法により行った。即ち、抗マウス抗体[抗
ＩgＧ２a、ＩgＧ２b、ＩgＧ３、ＩgＭ]および抗マウス
Ｌ鎖抗体[抗κ、λ] (ＭＡＢ−isotyping kit, Ｐharm
ingen)とハイブリドーマの培養上清中の抗モノクローナ
ル抗体とを反応させた。その結果、ＩgＧ1、κを入れた
ウェルのみに発色が認められ、該ハイブリドーマはＩg
Ｇ1、κ鎖のモノクローナル抗体を産生する株であるこ
とがわかった。
【００１９】(７)ＩＴ−２抗体の細胞障害阻害効果 得られた抗体産生ハイブリドーマＩＴ−２が産生する抗
体をマウス腹水中から精製し、この精製抗体を用いて、
ＹＴ２Ｃ２細胞の細胞障害作用に対する阻害度を調べ
た。方法は、(４)の抗体の検出方法と同様である。９６
ウエルＵ型プレートにエフェクター細胞であるＹＴ２Ｃ
２（８×１０6個／ml）を５０μl／well分注した後、51
ＣrラベルＪＹ細胞（２×１０5個／ml）を５０μl／wel
l添加した。次いで、精製抗体、即ち、抗Ｂ７抗体（ベ
クトン・ディッキンソン）、抗ＣＤ２８抗体（ベクトン
・ディッキンソン）およびＩＴ−２抗体（それぞれ、２
０μg／ml）を５０μl／well加えた。４時間反応させた
後、培養上清中に放出された51Ｃrをγ線カウンターで
測定した。この値を細胞障害活性に換算して比較した。
結果を図１に示す。図１から明らかに、抗Ｂ７抗体とＩ
Ｔ−２抗体との共存下では、ＹＴ２Ｃ２細胞の細胞障害
活性が、抗ＣＤ２８抗体単独の場合と同程度に完全に阻
害された。
体をマウス腹水中から精製し、この精製抗体を用いて、
ＹＴ２Ｃ２細胞の細胞障害作用に対する阻害度を調べ
た。方法は、(４)の抗体の検出方法と同様である。９６
ウエルＵ型プレートにエフェクター細胞であるＹＴ２Ｃ
２（８×１０6個／ml）を５０μl／well分注した後、51
ＣrラベルＪＹ細胞（２×１０5個／ml）を５０μl／wel
l添加した。次いで、精製抗体、即ち、抗Ｂ７抗体（ベ
クトン・ディッキンソン）、抗ＣＤ２８抗体（ベクトン
・ディッキンソン）およびＩＴ−２抗体（それぞれ、２
０μg／ml）を５０μl／well加えた。４時間反応させた
後、培養上清中に放出された51Ｃrをγ線カウンターで
測定した。この値を細胞障害活性に換算して比較した。
結果を図１に示す。図１から明らかに、抗Ｂ７抗体とＩ
Ｔ−２抗体との共存下では、ＹＴ２Ｃ２細胞の細胞障害
活性が、抗ＣＤ２８抗体単独の場合と同程度に完全に阻
害された。
【００２０】(８)ＩＴ−２抗体によるＣＴＬＡ−４とＢ
７／ＢＢ１およびＢ７０との結合の阻害効果 ＩＴ−２抗体の、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４分子とＢ
７０分子との結合に対する阻害活性を、以下の実験で調
べた。即ち、Ｂ７／ＢＢ１分子に対し、ＣＤ２８よりも
強い親和力を持つＣＴＬＡ−４分子の細胞外ドメイン
と、ヒトのＩgＧ1のＦcとを融合させたＣＴＬＡ−４−
Ｉgキメラ分子（順天堂大学免疫学より入手可能）を用
い、ＪＹとＣＴＬＡ−４−Ｉgとの結合に対するＩＴ−
２抗体および抗Ｂ７抗体の阻害活性を試験した。まず、
ＪＹ細胞１×１０6個／１００μlをフィッシャーチュー
ブに入れ、これにＩＴ−２抗体１μg、あるいはＢ７抗
体１μg、あるいはＩＴ−２抗体１μｇおよび抗Ｂ７抗
体１μgを加え、４℃にて３０分間反応させた。ＰＢＳ
で２回遠心洗浄後、ＣＴＬＡ−４−Ｉg分子１μgを加
え、さらに４℃で３０分間反応させた。２回遠心した
後、抗ヒトＩgＧ・Ｆｄ−ＦＩＴＣ抗体(２次抗体:カペ
ル)を反応させ、その後、フローサイトメトリー(ＦＡＣ
Ｓ can; ベクトン・ディッキンソン製)にて解析した。
その結果、図２に示すように、ＪＹとＣＴＬＡ−４−Ｉ
gの結合をＩＴ−２抗体は、抗Ｂ７抗体共存下にて完全
に阻害することがわかった。このことから、ＩＴ−２抗
体が認識する分子はＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８と結合
することが確認された。図２において、各記号は以下の
意味を有する。 Ｌ３０７＝抗Ｂ７抗体 ＩＴ２．２３６＝ＩＴ−２抗体 コントロールＩｇＧ1のみ ：ＣＴＬＡ−４−ＩｇとＪＹとの反応 ：ＣＴＬＡ−４−ＩｇとＪＹとの反応を抗Ｂ７抗体で
阻害 ：ＣＴＬＡ−４−ＩｇとＪＹとの反応をＩＴ−２抗体
で阻害 ：ＣＴＬＡ−４−ＩｇとＪＹとの反応を抗Ｂ７抗体と
ＩＴ−２抗体で阻害
７／ＢＢ１およびＢ７０との結合の阻害効果 ＩＴ−２抗体の、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４分子とＢ
７０分子との結合に対する阻害活性を、以下の実験で調
べた。即ち、Ｂ７／ＢＢ１分子に対し、ＣＤ２８よりも
強い親和力を持つＣＴＬＡ−４分子の細胞外ドメイン
と、ヒトのＩgＧ1のＦcとを融合させたＣＴＬＡ−４−
Ｉgキメラ分子（順天堂大学免疫学より入手可能）を用
い、ＪＹとＣＴＬＡ−４−Ｉgとの結合に対するＩＴ−
２抗体および抗Ｂ７抗体の阻害活性を試験した。まず、
ＪＹ細胞１×１０6個／１００μlをフィッシャーチュー
ブに入れ、これにＩＴ−２抗体１μg、あるいはＢ７抗
体１μg、あるいはＩＴ−２抗体１μｇおよび抗Ｂ７抗
体１μgを加え、４℃にて３０分間反応させた。ＰＢＳ
で２回遠心洗浄後、ＣＴＬＡ−４−Ｉg分子１μgを加
え、さらに４℃で３０分間反応させた。２回遠心した
後、抗ヒトＩgＧ・Ｆｄ−ＦＩＴＣ抗体(２次抗体:カペ
ル)を反応させ、その後、フローサイトメトリー(ＦＡＣ
Ｓ can; ベクトン・ディッキンソン製)にて解析した。
その結果、図２に示すように、ＪＹとＣＴＬＡ−４−Ｉ
gの結合をＩＴ−２抗体は、抗Ｂ７抗体共存下にて完全
に阻害することがわかった。このことから、ＩＴ−２抗
体が認識する分子はＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８と結合
することが確認された。図２において、各記号は以下の
意味を有する。 Ｌ３０７＝抗Ｂ７抗体 ＩＴ２．２３６＝ＩＴ−２抗体 コントロールＩｇＧ1のみ ：ＣＴＬＡ−４−ＩｇとＪＹとの反応 ：ＣＴＬＡ−４−ＩｇとＪＹとの反応を抗Ｂ７抗体で
阻害 ：ＣＴＬＡ−４−ＩｇとＪＹとの反応をＩＴ−２抗体
で阻害 ：ＣＴＬＡ−４−ＩｇとＪＹとの反応を抗Ｂ７抗体と
ＩＴ−２抗体で阻害
【００２１】(９)免疫沈降（ＩＴ−２抗体によるＪＹ細
胞からのＢ７０分子の免疫沈降） ＪＹ細胞を７５cm2培養フラスコ中、１０％ＦＣＳ・Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地にて２×１０7個培養した。１,５０
０rpm、５分の遠心分離により、ＪＹを回収した後、Ｐ
ＢＳにて１回遠心洗浄した。その後、ＨＢＳＳ(ハンク
ス緩衝液)で３回遠心洗浄した。 (１)細胞のビオチン化 上澄液を吸引後、ペレットを０．１ＭのＨepes(ヘペス)
緩衝液、pＨ８．０(２ml)に懸濁した、次いで、１０mg
／mlのＮＨＳ−ビオチンを２０μl入れ、４０分間室温
でローテーターを用いて反応させた。その後、４℃に冷
したＲＰＭＩ１６４０溶液にて３回遠心洗浄した。 (２)細胞の溶解 ビオチン化した細胞のペレットに４００μlの溶菌緩衝
液(５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１５０mＭ ＮaＣl、１％
トリトンＸ−１００、５０mＭヨードアセトアミド、２m
Ｍ ＭgＣl2、２mＭ ＣaＣl2、０．１％アジ化ナトリ
ウム、１０μg／ml大豆トリプシン・インヒビター、１u
／mlアプロチニン、１mＭ ＰＭＳＦ(フェニルメチルス
ルホニルフロライド)、１μg／mlロイペプチン)を加
え、よく撹拌した後、氷上に３０分放置した。次いで、
１５,０００rpm、１０分遠心した後、上澄液を回収し
た。これを２００μlずつの２本に分けた。
胞からのＢ７０分子の免疫沈降） ＪＹ細胞を７５cm2培養フラスコ中、１０％ＦＣＳ・Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地にて２×１０7個培養した。１,５０
０rpm、５分の遠心分離により、ＪＹを回収した後、Ｐ
ＢＳにて１回遠心洗浄した。その後、ＨＢＳＳ(ハンク
ス緩衝液)で３回遠心洗浄した。 (１)細胞のビオチン化 上澄液を吸引後、ペレットを０．１ＭのＨepes(ヘペス)
緩衝液、pＨ８．０(２ml)に懸濁した、次いで、１０mg
／mlのＮＨＳ−ビオチンを２０μl入れ、４０分間室温
でローテーターを用いて反応させた。その後、４℃に冷
したＲＰＭＩ１６４０溶液にて３回遠心洗浄した。 (２)細胞の溶解 ビオチン化した細胞のペレットに４００μlの溶菌緩衝
液(５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１５０mＭ ＮaＣl、１％
トリトンＸ−１００、５０mＭヨードアセトアミド、２m
Ｍ ＭgＣl2、２mＭ ＣaＣl2、０．１％アジ化ナトリ
ウム、１０μg／ml大豆トリプシン・インヒビター、１u
／mlアプロチニン、１mＭ ＰＭＳＦ(フェニルメチルス
ルホニルフロライド)、１μg／mlロイペプチン)を加
え、よく撹拌した後、氷上に３０分放置した。次いで、
１５,０００rpm、１０分遠心した後、上澄液を回収し
た。これを２００μlずつの２本に分けた。
【００２２】(３)プレクリアー(preclear) 正常マウス血清をＣＮＢｒ活性化セファロース（ファル
マシア製）に結合させたものと、Ｂ７に対する抗体をＣ
ＮＢｒ活性化セファロースゲルに結合させたものに２０
０μlずつ入れた。４℃で一晩を反応させ、その後１
２，０００ｒｐｍ、１分の遠心によりゲルを沈殿させ、
上清を回収した。（尚、正常マウス血清およびＢ７に対
する抗体とＣＮＢｒ活性化セファロースとの結合は付属
のファルマシアの手順書に従った。） (４)免疫沈降 回収した上清をそれぞれ、ハイブリドーマＩＴ−２が産
生する抗体を結合したセファロースゲル１００μlに加
え、室温で２時間反応させた。洗浄液(５０mＭＴris−
ＨＣl(pＨ８．３)、０．６Ｍ塩化ナトリウム、０．５％
ＮＰ−４０、０．１％アジ化ナトリウム)で３回遠心洗
浄した後、ゲルに２％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)
を含むサンプル緩衝液(１０％グリセロール、５％２−
メルカプトエタノール、２．３％ＳＤＳ、０．６２５Ｍ
Ｔris−ＨＣl(pＨ６．８)、ＢＰＢ(ブロモ・フェノー
ル・ブルー)１mg／１００ml)２０μlを加え、５分間煮
沸した。次いで、４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
(第１化薬製)を用い、電気泳動した、電気泳動後、トラ
ンスプロットシステム(バイオラッド製)を用い、常法通
り、ニトロセルロース膜にトランスファーした。 (５)発色反応 ニトロセルロース膜を１％ＢＳＡ(牛血清アルブミン)−
ＰＢＳに浸して１時間放置し、ブロッキングした。その
後、ＡＢＣ溶液(アビジン−ビオチン化ペルオキシダー
ゼ混合液)(ベクター社)に浸し、３０分間反応させた。
０．０５％Ｔween（ツィーン）２０／ＰＢＳにて３回洗
浄(１０分間のインキュベーション×３)した。アマーシ
ャムのＥＣＬウエスタンブロッティングディテクション
システムの発色キットを用いて反応させた後、Ｘ線フィ
ルムで露光し、ハイブリドーマＩＴ−２と反応するタン
パク質を検出した。結果を図３に示す。図から明らかな
ように、約７０kｄのタンパク質が免疫沈降し、本発明
の抗体はＢ７／ＢＢ１以外の新規なＣＤ２８結合性タン
パク質に対する抗体であることが確認された。このタン
パク質をＢ７０と命名した。図３において、各記号は以
下の意味を有する。 ：正常マウス血清でプレクリアー ：抗Ｂ７抗体でプレクリアー
マシア製）に結合させたものと、Ｂ７に対する抗体をＣ
ＮＢｒ活性化セファロースゲルに結合させたものに２０
０μlずつ入れた。４℃で一晩を反応させ、その後１
２，０００ｒｐｍ、１分の遠心によりゲルを沈殿させ、
上清を回収した。（尚、正常マウス血清およびＢ７に対
する抗体とＣＮＢｒ活性化セファロースとの結合は付属
のファルマシアの手順書に従った。） (４)免疫沈降 回収した上清をそれぞれ、ハイブリドーマＩＴ−２が産
生する抗体を結合したセファロースゲル１００μlに加
え、室温で２時間反応させた。洗浄液(５０mＭＴris−
ＨＣl(pＨ８．３)、０．６Ｍ塩化ナトリウム、０．５％
ＮＰ−４０、０．１％アジ化ナトリウム)で３回遠心洗
浄した後、ゲルに２％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)
を含むサンプル緩衝液(１０％グリセロール、５％２−
メルカプトエタノール、２．３％ＳＤＳ、０．６２５Ｍ
Ｔris−ＨＣl(pＨ６．８)、ＢＰＢ(ブロモ・フェノー
ル・ブルー)１mg／１００ml)２０μlを加え、５分間煮
沸した。次いで、４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
(第１化薬製)を用い、電気泳動した、電気泳動後、トラ
ンスプロットシステム(バイオラッド製)を用い、常法通
り、ニトロセルロース膜にトランスファーした。 (５)発色反応 ニトロセルロース膜を１％ＢＳＡ(牛血清アルブミン)−
ＰＢＳに浸して１時間放置し、ブロッキングした。その
後、ＡＢＣ溶液(アビジン−ビオチン化ペルオキシダー
ゼ混合液)(ベクター社)に浸し、３０分間反応させた。
０．０５％Ｔween（ツィーン）２０／ＰＢＳにて３回洗
浄(１０分間のインキュベーション×３)した。アマーシ
ャムのＥＣＬウエスタンブロッティングディテクション
システムの発色キットを用いて反応させた後、Ｘ線フィ
ルムで露光し、ハイブリドーマＩＴ−２と反応するタン
パク質を検出した。結果を図３に示す。図から明らかな
ように、約７０kｄのタンパク質が免疫沈降し、本発明
の抗体はＢ７／ＢＢ１以外の新規なＣＤ２８結合性タン
パク質に対する抗体であることが確認された。このタン
パク質をＢ７０と命名した。図３において、各記号は以
下の意味を有する。 ：正常マウス血清でプレクリアー ：抗Ｂ７抗体でプレクリアー
【００２３】(１２)ＦＡＣＳによる種々の細胞株の染色 得られたＩＴ−２ハイブリドーマが産生する抗体を用い
て、Ｂ７／ＢＢ１以外のＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４結合分
子が発現している細胞の分布を調べた。即ち、種々の細
胞株、末梢血リンパ球および慢性扁桃炎の扁桃リンパ球
を用いてＦＡＣＳ(フローサイトメトリー)にて解析し
た。それぞれ細胞をＰＢＳで１×１０6個／mlに調製し
た。フィッシャーチューブに細胞を１×１０6個ずつ入
れ、ＩＴ−２抗体１μgを加え、氷上で３０分間反応さ
せた。次いで、ＰＢＳで遠心洗浄(３,０００rpm、１
分、２回)し、ＦＩＴＣ−抗マウスＩg's(オリンパス製)
(１００倍希釈)１００μlを加え、さらに氷上で２０分
間反応させた。反応後、ＰＢＳで遠心洗浄を２回行い、
ＰＢＳ２００μlに懸濁した後、ＦＡＣＳ can にて測定
した。その結果、図４、５および６に示すように、ＭＯ
ＬＴ−４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８２）、ＰＥＥＲ（順
天堂大学医学部免疫学から入手可能）、ＨＵＴ−７８
（ＡＴＣＣ ＴＩＢ １６１）、ＪＵＲＫＡＴ（順天堂
大学医学部免疫学から入手可能）等のＴ細胞株およびＴ
ＨＰ−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ２０２）、Ｕ９３７（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １５９３）等の単球様細胞株では発現
が認められないのに対し、ＪＹ、ＷＡ（いずれも順天堂
大学医学部免疫学より入手可能）、ＲＰＭＩ８８６６
（順天堂大学医学部免疫学から入手可能）等のＥＢＶ変
異Ｂ細胞株では強い発現が認められた。また、図７に示
すように、健常人末梢血リンパ球では発現が認められな
いものの、扁桃炎患者の扁桃リンパ球では強い発現が認
められた。以上のことからＩＴ−２ハイブリドーマが産
生する抗体が認識する分子は、活性化Ｂ細胞に特異的に
発現していることが判明した。
て、Ｂ７／ＢＢ１以外のＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４結合分
子が発現している細胞の分布を調べた。即ち、種々の細
胞株、末梢血リンパ球および慢性扁桃炎の扁桃リンパ球
を用いてＦＡＣＳ(フローサイトメトリー)にて解析し
た。それぞれ細胞をＰＢＳで１×１０6個／mlに調製し
た。フィッシャーチューブに細胞を１×１０6個ずつ入
れ、ＩＴ−２抗体１μgを加え、氷上で３０分間反応さ
せた。次いで、ＰＢＳで遠心洗浄(３,０００rpm、１
分、２回)し、ＦＩＴＣ−抗マウスＩg's(オリンパス製)
(１００倍希釈)１００μlを加え、さらに氷上で２０分
間反応させた。反応後、ＰＢＳで遠心洗浄を２回行い、
ＰＢＳ２００μlに懸濁した後、ＦＡＣＳ can にて測定
した。その結果、図４、５および６に示すように、ＭＯ
ＬＴ−４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８２）、ＰＥＥＲ（順
天堂大学医学部免疫学から入手可能）、ＨＵＴ−７８
（ＡＴＣＣ ＴＩＢ １６１）、ＪＵＲＫＡＴ（順天堂
大学医学部免疫学から入手可能）等のＴ細胞株およびＴ
ＨＰ−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ２０２）、Ｕ９３７（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １５９３）等の単球様細胞株では発現
が認められないのに対し、ＪＹ、ＷＡ（いずれも順天堂
大学医学部免疫学より入手可能）、ＲＰＭＩ８８６６
（順天堂大学医学部免疫学から入手可能）等のＥＢＶ変
異Ｂ細胞株では強い発現が認められた。また、図７に示
すように、健常人末梢血リンパ球では発現が認められな
いものの、扁桃炎患者の扁桃リンパ球では強い発現が認
められた。以上のことからＩＴ−２ハイブリドーマが産
生する抗体が認識する分子は、活性化Ｂ細胞に特異的に
発現していることが判明した。
【００２４】
【発明の効果】本発明に係る抗体は、免疫学の基礎研究
分野でＴ−Ｂ細胞間等の細胞間の相互作用の解析に有用
であるとともに、活性化Ｂ細胞が関与する自己免疫病、
慢性扁桃炎、疾患の診断等に有効である。また、抗Ｂ７
抗体と一緒になってＣＤ２８を介する細胞の副次的刺激
（co−stimulatory signal）効果を抑えることから、本
抗体を投与することにより、抗原特異的なトレランスを
誘導ができると考えられる。そのため、移植における免
疫抑制剤としても利用可能である。また、より効果を上
げるには、抗Ｂ７抗体の二機能性（Ｂispecific）抗体
を作製すれば、より効果的であると考えられる。
分野でＴ−Ｂ細胞間等の細胞間の相互作用の解析に有用
であるとともに、活性化Ｂ細胞が関与する自己免疫病、
慢性扁桃炎、疾患の診断等に有効である。また、抗Ｂ７
抗体と一緒になってＣＤ２８を介する細胞の副次的刺激
（co−stimulatory signal）効果を抑えることから、本
抗体を投与することにより、抗原特異的なトレランスを
誘導ができると考えられる。そのため、移植における免
疫抑制剤としても利用可能である。また、より効果を上
げるには、抗Ｂ７抗体の二機能性（Ｂispecific）抗体
を作製すれば、より効果的であると考えられる。
【図１】 ＩＴ−２抗体の、細胞障害活性抑制作用を示
すグラフである。
すグラフである。
【図２】 ＩＴ−２抗体により、ＪＹとＣＴＬＡ４−Ｉ
gとの反応を阻害した結果をＦＡＣＳで示した図であ
る。
gとの反応を阻害した結果をＦＡＣＳで示した図であ
る。
【図３】 ＩＴ−２抗体を用いて、ＪＹからＢ７０分子
を免疫沈降し、電気泳動を行ったときのパターンの模写
図である。
を免疫沈降し、電気泳動を行ったときのパターンの模写
図である。
【図４】 ＩＴ−２抗体を用いて、ヒトＴ細胞株におけ
るＢ７０分子の発現量をＦＡＣＳにより調べた結果を示
すグラフである。
るＢ７０分子の発現量をＦＡＣＳにより調べた結果を示
すグラフである。
【図５】 ＩＴ−２抗体を用いて、ヒト単球細胞株にお
けるＢ７０分子の発現量をＦＡＣＳにより調べた結果を
示すグラフである。
けるＢ７０分子の発現量をＦＡＣＳにより調べた結果を
示すグラフである。
【図６】 ＩＴ−２抗体を用いて、ヒトＢ細胞株におけ
るＢ７０分子の発現量をＦＡＣＳにより調べた結果を示
すグラフである。
るＢ７０分子の発現量をＦＡＣＳにより調べた結果を示
すグラフである。
【図７】 ＩＴ−２抗体を用いて、健常人の末梢血リン
パ球および慢性扁桃炎患者の扁桃リンパ球についてＢ７
０分子の発現量をＦＡＣＳにて調べた結果を示す図であ
る。
パ球および慢性扁桃炎患者の扁桃リンパ球についてＢ７
０分子の発現量をＦＡＣＳにて調べた結果を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＵ Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｑ Ｙ Ｓ Ｒ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 奥村 康 東京都文京区本郷２−１−１ 順天堂大学 医学部免疫学教室内
Claims (8)
- 【請求項１】 活性化Ｂ細胞に特異的に発現する分子に
対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメン
ト。 - 【請求項２】 活性化Ｂ細胞に特異的に発現する分子
が、分子量約７０kｄのタンパク質である、請求項１の
モノクローナル抗体またはその活性フラグメント。 - 【請求項３】 活性化Ｂ細胞に特異的に発現する分子
が、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４と結合性の分子であっ
て、Ｂ７／ＢＢ１分子とは別のＢ７０分子である、請求
項１のモノクローナル抗体またはその活性フラグメン
ト。 - 【請求項４】 Ｂ７０と、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４
との結合に対する阻害活性を有する、請求項３のモノク
ローナル抗体またはその活性フラグメント。 - 【請求項５】 ＣＤ２８依存性のＴ細胞の細胞障害に対
して阻害活性を有する請求項４のモノクローナル抗体ま
たはその活性フラグメント。 - 【請求項６】 齧歯類動物をヒトＢ細胞株(ＪＹ)で
免疫感作し、 免疫感作した齧歯類動物から脾臓を摘出して、脾細胞
の懸濁液を調製し、 該脾細胞懸濁液をマウスのミエローマ細胞と融合促進
剤の存在下で混合して、両細胞を融合し、 融合した細胞、未融合のミエローマ細胞を支持しない
媒質中で希釈して培養することにより、抗体産生細胞と
ミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを選別し、 ハイブリドーマを含有する各培養ウエル中の上清液に
ついて、ＣＤ２８陽性の細胞株ＹＴ２Ｃ２（ＮＫ細胞）
のＪＹ(Ｂ細胞株)に対する細胞障害活性の完全な阻止す
ることを指標として、抗Ｂ７０抗体の存在を確認し、 所望の抗体を生成するハイブリドーマを選択した後、
限界希釈法により単一クローンにし、 その単一クローンのハイブリドーマの培養上清液から
抗体を回収することを特徴とするＢ７０分子に特異的に
反応するモノクローナル抗体の製造方法。 - 【請求項７】 齧歯類動物がＢalb／cマウスであり、か
つ、マウスのミエローマ細胞がＰ３Ｕ１である請求項６
の製造方法。 - 【請求項８】 活性化Ｂ細胞表面上のＢ７０分子に特異
的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5228540A JPH0779793A (ja) | 1993-09-14 | 1993-09-14 | Ｂ７０分子に対するモノクローナル抗体 |
| EP94114434A EP0643077A1 (en) | 1993-09-14 | 1994-09-14 | Monoclonal antibody against B70 molecule |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5228540A JPH0779793A (ja) | 1993-09-14 | 1993-09-14 | Ｂ７０分子に対するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0779793A true JPH0779793A (ja) | 1995-03-28 |
Family
ID=16877997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5228540A Pending JPH0779793A (ja) | 1993-09-14 | 1993-09-14 | Ｂ７０分子に対するモノクローナル抗体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0643077A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0779793A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6319906B1 (en) | 1996-12-31 | 2001-11-20 | Isis Pharmaceuticals | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US7235653B2 (en) | 1996-12-31 | 2007-06-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US6077833A (en) * | 1996-12-31 | 2000-06-20 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US7897582B2 (en) | 2003-05-23 | 2011-03-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US7960355B2 (en) | 2003-05-23 | 2011-06-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4692405A (en) * | 1985-03-05 | 1987-09-08 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Monoclonal antibodies to antigen on activated human B-cells and assay therefor, protein antigenic determinant therefor and method of making same |
| US5066581A (en) * | 1987-02-25 | 1991-11-19 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Differentiation antigen, nda3, associated with the receptor for b cell growth factor |
| EP0537293A4 (en) * | 1990-07-02 | 1993-09-08 | Bristol-Myers Company | Ligand for cd28 receptor on b cells and methods |
| WO1992019755A1 (fr) * | 1991-04-24 | 1992-11-12 | Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha | ANTICORPS MONOCLONAL CONTRE LA β2 GLYCOPROTEINE I HUMAINE ET UTILISATION DE CET ANTICORPS |
-
1993
- 1993-09-14 JP JP5228540A patent/JPH0779793A/ja active Pending
-
1994
- 1994-09-14 EP EP94114434A patent/EP0643077A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0643077A1 (en) | 1995-03-15 |
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