JPH0780902B2

JPH0780902B2 - ペプチド誘導体

Info

Publication number: JPH0780902B2
Application number: JP61196179A
Authority: JP
Inventors: 宏治鈴木
Original assignee: 第一化学薬品株式会社; 旭化成工業株式会社
Priority date: 1986-08-21
Filing date: 1986-08-21
Publication date: 1995-08-30
Anticipated expiration: 2010-08-30
Also published as: JPS6351400A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規なペプチド誘導体に関し、更に詳細には血
液中の凝固系蛋白のひとつであるプロテインＣを測定す
るための新規な発色性もしくは蛍光性合成ペプチド基質
に関する。

〔従来の技術〕プロテインＣ（以下「PC」と略称する）は、血液の凝血
系蛋白の一つであり、固系の抑制及び線溶系の賦活に関
係している。また、本蛋白の遺伝的欠損患者は血栓症に
かかりやすいことが知られていて、血中濃度の測定は臨
床上極めて重用である。

これまでの本蛋白の測定は、部分トロンボプラスチン時
間法と言われる血液凝固時間の測定でなされてきた。し
かしながら、近年血液の凝固・線溶検査に酵素特異的合
成ペプチド基質が導入され、PCの測定においても、その
活性型であるプロテインＣ（以下「APC」と略称する）
の酵素反応を受けるＨ−Ｄ−Phe−Pip−Arg−pNA、Pyro
−Glu−Pro−Arg−pNA、BOC−Leu−Ser−Thr−Arg−MCA
等の合成基質の利用が紹介・導入されている。

〔本発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、これらの合成基質は、例えば、既に他の
酵素に特異的であるとして臨床的に使用されているもの
の転用であり、そのために充分にPCに特異的ではなかつ
たり測定系に交叉反応を防止する特殊な薬剤を添加する
ことによつて測定を可能にするなど非経済的・煩雑な操
作を必要とする。従つて臨床的には他の酵素との交叉反
応性が小さい、すなわち特異性の高い合成基質が要望さ
れていた。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者は種々のペプチドを合成し、その特異性につい
て検討をおこなつていたところ、特定のアミノ酸配列を
有するペプチドはAPCに特異的であることを見出し、本
発明を完成した。

すなわち、本発明は次の一般式（Ｉ） R₁−Phe−Thr−Phe−Arg−R₂ （Ｉ）（式中、R₁は水素原子又はアミノ保護基を示し、R₂はを示す）で表わされるペプチド誘導体を提供するものである。

本発明のペプチド誘導体（Ｉ）は、ペプチド合成の常法
に従つて合成することができる。例えばアミノ酸を式
（Ｉ）で示される順序に反応させる方法及びいくつかの
アミノ酸からなるオリゴマーを調製し、これらを最終的
に結合させる方法等により製造される。具体的に本発明
のペプチド誘導体を合成する方法を挙げれば次の通りで
ある。すなわち、グアニジノ基を保護または無保護のア
ルギニルｐ−ニトロアニリドもしくは７−アルギニルア
ミノ−４−メチルクマリンと、アミノ基を保護し、水酸
基を保護または無保護のフエニルアラニルスレオニルフ
エニルアラニンとを反応させ、その反応生成物の保護基
を脱離することによつて目的とする化合物を製造する。
この反応を実施するには、アルギニルｐ−ニトロアニリ
ド二塩酸塩もしくは７−アルギニルアミノ−４−メチル
クマリン二塩酸塩とアミノ基を保護したフエニルアラニ
ルスレオニルフエニルアラニンとを適当な不活性溶媒た
とえばテトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドなど
に溶解せしめ、適当な縮合材、例えばジシクロヘキシル
カルボジイミドなど、望ましくはジフエニルリン酸アジ
ドを用いれば良い。この際の反応温度は−20℃ないし＋
40℃が適当であるが、望ましくは０℃ないし室温であ
る。反応終了後粗生成物は通常の精製手段である、再結
晶、再沈澱、カラムクロマトグラフイー、プレパラテイ
ブ薄層クロマトグラフイーなどの方法により精製を行
い、前記一般式で表わされるアミノ基を保護した化合物
が得られる。

これらの化合物のアミノ基の保護基は、保護基の通常の
脱離手段を用い除去することが出来る。例えばｔ−ブチ
ルオキシカルボニル基は有機溶媒中塩化水素あるいはト
リフルオロ酢酸などで処理することにより除去しうる。
また、水酸基、グアニジノ基が保護されている場合、例
えばベンジル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基は
フツ化水素あるいは、トリフルオロメタンスルホン酸な
どの処理により除去しうる。

本発明のペプチド誘導体を構成するアミノ酸は、Ｌ体、
Ｄ体、DL体のいずれであつても良い。また、本発明のペ
プチド誘導体（Ｉ）は、その製造条件により遊離形もし
くは酸付加塩として得られるが、所望に応じ遊離形のも
の又は酸付加塩のものにそれぞれ変換することが出来
る。この酸付加塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸
塩、リン酸塩などの無機酸塩、あるいは、酢酸塩、シユ
ウ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、ｐ−トル
エンスルホン酸塩などの有機酸塩が挙げられる。

〔作用及び効果〕

叙上の如くして得られた本発明のペプチド誘導体（Ｉ）
は、従来のPC測定用基質よりもpNA基質においてはトロ
ンビンとの交叉反応性がMCA基質においては加水分解速
度においてそれぞれ優れている。例えばpNA基質ではト
ロンビンとの交叉反応性が８〜10％に、またMCA基質で
は20％に低減した。

したがつて、本発明のペプチド誘導体（Ｉ）を用いるこ
とにより短時間で正確にPC量を測定することが可能とな
る。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を説明するが、これら実施例
のみに限定されるものではない。なお実施例中に記載の
略号は次の意味を有する。

BOC:t−ブチルオキシカルボニル Bzl:ベンジル Phe:L−フエニルアラニンＤ−Phe:D−フエニルアラニン Thr:L−スレオニン Arg:L−アルギニン DMF:N−N,−ジメチルホルムアミド TEA:トリエチルアミン DPPA:ジフエニルリン酸アジド DEPC:ジエチルリン酸アニド TsOH:トルエンスルホン酸 AcOEt:酢酸エチル Z:ベンジルオキシカルボニル pNA:p−ニトロアニリン MeOH:メタノール 0Me:メチルエステル 0Bzl:ベンジルエステル MCA:7−アミノ−４−メチルクマリン実施例１Ｈ−Ｄ−Phe−Thr−Phe−Arg−pNA・2HClの合成（１） BOC−Thr（Bzl）−Phe−OBzl B0C−Thr（Bzl）−OH21.65g及びＨ−Phe−OBzl・TsOH3
2.91gを DMF 150mlに溶解せしめ０℃に冷却する。攪拌
下その溶媒にDEPC 12.56g、次いでTEA15.58gを０℃で添
加し、０℃で４時間、その後室温にて一夜攪拌する。反
応液にAcOEt600ml、ベンゼン150mlを加え希釈した後、1
0％クエン酸水溶液150mlで２回、水150mlで１回、飽和
食塩水150mlで２回、飽和重そう水150mlで２回、水150m
lで１回、飽和食塩水150mlで２回洗浄し無水硫酸マグネ
シウムで乾燥する。溶媒を減圧留去して粗生成物を得
て、これをAcOEtより再結晶化してBOC−Thr（Bzl）−Ph
e−OBzl36.0g（収率94.0％）を得る。

融点138〜139℃、▲〔α〕²⁰ _D▼＋3.04° （Ｃ＝１、 DMF）（２）Ｈ−Thr（Bzl）−Phe−OBzl・HCl BOC−Thr（Bzl）−Phe−OBzl21.6gに19.5％塩化水素/Ac
OEt148mlを加え、１時間攪拌する。減圧濃縮し、残渣に
ベンゼンを加え再度濃縮する。この操作を３回繰り返し
粗生成物を得る。これをAcOEt−MeOHより再結晶化して
Ｈ−Thr（Bzl）−Phe−OBzl・HC17.2g（収率90.1％）
を得る。

融点164〜165℃、▲〔α〕²⁰ _D▼−5.02°（Ｃ＝１、MeO
H）（３） BOC−Ｄ−Phe−Thr（Bzl）−Phe−OBzl BOC−Ｄ−Phe−OH1.10g、Ｈ−Thr（Bzl）−Phe−OBzl・
HCl2.00gをDMF10mlに溶解し、DEPC0.744g、TEA0.921gを
使用し（１）のBOC−Thr（Bzl）−Phe−OBzl合成と同様
の操作により反応・後処理し粗生成物を得た。これをAc
OEtより再結晶化してBOC−Ｄ−Phe−Thr（Bzl）−Phe−
OBzl2.57g（収率89.2％）を得た。

融点118.5〜119.5℃、▲〔α〕²⁰ _D▼−4.60° （Ｃ＝１、MeOH）（４） BOC−Ｄ−Phe−Thr−Phe−OH BOC−Ｄ−Phe−Thr（Bzl）−Phe−OBzl2.00gをDMF10ml
に溶解し、５％パラジウム／炭素0.2gの存在下接触還元
した。触媒を除去し、減圧濃縮し、残渣をAcOEtより再
結晶化してBOC−Ｄ−Phe−Thr−Phe−OH1.10g（収率74.
3％）を得た。

融点161〜162℃、▲〔α〕²⁰ _D▼＋6.73°（Ｃ＝１、MeO
H）（５） BOC−Ｄ−Phe−Thr−Phe−Arg−pNA・HCl BOC−Ｄ−Phe−Thr−phe−OH821.7mg、Ｈ−Arg−pNA・2
HCl587.6mgをDMF5.0mlに溶解し、DPPA484.4mg、TEA323.
8mgを使用し、実施例１（１）のBOC−Thr（Bzl）−Phe
−OBzl製造と同様の操作により反応、後処理を行い、粗
生成物を得た。これをAcOEt−ヘキサンより再結晶化し
てBOC−Ｄ−Phe−Thr−Phe−Arg−pNA・HC1.22g（収
率92.4％）を得た。

融点102℃、▲〔α〕²⁰ _D▼−28.5°（Ｃ＝１、MeOH）（６）Ｈ−Ｄ−Phe−Thr−Phe−Arg−pNA・2HCl BOC−Ｄ−Phe−Thr−Phe−Arg−pNA・HCl826.3mgに４％
塩化水素／ギ酸14mlを加え、室温にて１時間攪拌した。
反応液にエーテル300mlを加え、析出してきた沈澱物を
濾取し、エーテルで洗浄した。これをEtOHより再結晶化
してＨ−Ｄ−Phe−Thr−Phe−Arg−pNA・2HCl543.2mg
（収率71.2％）を得た。

融点196℃、▲〔α〕²⁰ _D▼−64.8°（Ｃ＝１、MeOH）実施例２ BOC−Phe−Thr−Phe−Arg−MCA・HClの合成（１） BOC−Phe−Thr（Bzl）−Phe−OBzl BOC−Phe−OH2.65g、実施例１（２）で合成したＨ−Thr
（Bzl）−Phe−OBzl・HCl4.83gをDMF25mlに溶解し、DEP
C1.79g、TEA2.23gを使用し、実施例１（１）のBOC−Thr
（Bzl）−Phe−OBzl合成と同様の操作により反応、後処
理を行い、粗生成物を得た。これをAcOEtより再結晶化
してBOC−Phe−Thr（Bzl）−Phe−OBzl、6.09g（収率8
7.8％）を得た。

融点144〜145℃、▲〔α〕²⁰ _D▼＋8.79°（Ｃ＝１、DM
F）（２） BOC−Phe−Thr−Phe−OH BOC−Phe−Thr（Bzl）−Phe−OBzl4.00gをDMF20mlに溶
解し、５％Pd/C0.4gを使用して、実施例１（４）のBOC
−Ｄ−Phe−Thr−Phe−OH合成と同様の操作によりBOC−
Phe−Thr−Phe−OH2.47g（収率83.5％）を得た。

融点146〜148℃、▲〔α〕²⁰ _D▼−32.3°（Ｃ＝１、MeO
H）（３） BOC−Phe−Thr−Phe−Arg−MCA・HCl BOC−Phe−Thr−Phe−OH83.7mg、Ｈ−Arg−MCA・2HCl6
5.9mgをDMF1.0mlに溶解し、DPPA49.3mg、TEA33.0mgを使
用して、実施例１（１）のBOC−Thr（Bzl）−Phe−OBzl
合成と同様の操作により反応を行つた。反応液にAcOEt5
0ml、ベンゼン12.5mlを加え、析出して来た沈澱物を
取し、水2ml×２、飽和重ソウ水2ml×２、飽和食塩水2m
l×２で洗浄した。これをシリカゲル（メルク社製ArtN
0.7734、10g、CHCl₃:MeOH＝5:1）カラムクロマトで精製
し、BOC−Phe−Thr−Phe−Arg−MCA・HCl、60.1mg（収
率48.3％）を得た。

融点153〜163℃（dec.）▲〔α〕²⁰ _D▼−24.8° （Ｃ＝１、DMF）実施例３Ｈ−Ｄ−Phe−Thr−Phe−Arg−MCA・2HClの合成（１） BOC−Ｄ−Phe−Thr−Phe−Arg−MCA・HCl 実施例１（４）で合成したBOC−Ｄ−Phe−Thr−Phe−OH
83.7mg及びＨ−Arg−MCA・2HCl65.9mgをDMF1.0mlに溶解
し、DPPA49.3mg、TEA33.0mgを使用して、実施例２
（３）のBOC−Phe−Thr−Phe−Arg−MCA・HClの合成と
同様にしてBOC−Ｄ−Phe−Thr−Phe−Arg−MCA・HCl60.
3mg（収率42.9％）を得た。

融点180〜186℃（dec・）、▲〔α〕²⁰ _D▼−3.6° （Ｃ＝１、DMF）（２）Ｈ−Ｄ−Phe−Thr−Phe−Arg−MCA・2HCl BOC−Ｄ−Phe−Thr−Phe−Arg−MCA・HCl55.5mgにギ酸
0.2ml、20％塩化水素／ジオキサン0.35mgを加え、実施
例１（６）のＨ−Ｄ−Phe−Thr−Phe−Arg−pNA・2HCl
合成と同様にして粗生成物を得た。これをセフアデツク
スLH−20（φ１×20cm、MeOH:H₂０＝1:1）で精製してＨ
−Ｄ−Phe−Thr−Phe−Arg−MCA・2HCl45.3mg（収率88.
1％）を得た。

アモルフアス状、▲〔α〕²⁰ _D▼−60.5°（Ｃ＝１、DM
F）実施例４実施例１、２及び３で合成した基質並びに従来の基質に
ついて、次の条件で各酵素との交叉反応性を試験した。
この結果を表１に示す。

（１）基質液;2mM（但し、pNA基質は精製水、 MCA基質はジメチルスルホキサイドに溶解した）（２）緩衝液;APCの測定には50mM Tris−150mM NaCl
−2mMCaCl₂−0.1％牛血清アルブミン（pH8.0）を使用し
た。また、トロンビン及び凝固等Xa因子の測定には50mM
Tris−175mM NaCl−10mM EDTA（pH8.4）を使用した。

（３）使用酵素；すべてヒト由来のものを使用した。
なお、濃度は、APC 0.62単位/ml、トロンビン0.2単位/m
l、第Xa因子0.39単位/mlに調製した。

（４）反応停止液;pNA基質用50％酢酸。

MCA基質用10％酢酸。

（５）測定方法；緩衝液0.6mlと酵素試液0.1mlをプ
ラスチツク製試験管に採取し37℃恒温槽中で３〜５分、
予備加温した。ついで予め37℃に加温しておいた各々の
pNA基質液0.1mlを各試験管に加え37℃で正確に５分間酵
素反応を行わせた。５分後に反応停止液0.2mlを各々の
試験管に加え直ちに水をブランクにして405nmの吸光度
を各々測定した。

緩衝液0.8mlと酵素試液0.1mlをプラスチツク製試験管
に採取し37℃恒温槽中で３〜５分間予備加温した。つい
で予め37℃に加温しておいた各々のMCA基質液0.1mlを各
試験管に加え正確に37℃で５分間酵素反応を行わせた。
５分後に反応停止液2mlを各々の試験管に加え反応を停
止した。直ちに反応停止液をブランクにして励起波長38
0nm、蛍光波長460nmで蛍光強度を各々測定した。別に調
整しておいたMCAの希釈標準液で同様の操作を行い検量
線を作成し生成したMCAを検量した。

（４）反応停止液;pNA基質用50％酢酸、MCA基質用10
％酢酸（５）測定方法;a緩衝液0.6mlと酵素試液0.1mlをプラ
スチツク製試験管に採取し37℃恒温槽中で３〜５分、予
備加温した。ついで予め37℃に加温しておいた各々のpN
A基質液0.1mlを各試験管に加え37℃で正確に５分間酵素
反応を行わせた。５分後に反応停止液0.2mlを各々の試
験管に加え直ちに水をブランクにして405nmの吸光度を
各々測定した。

ｂ緩衝液0.8mlと酵素試液0.1mlをプラスチツク製試験管
に採取し37℃恒温槽中で３〜５分間予備加温した。つい
で予め37℃に加温しておいた各々のMCA基質液0.1mlを各
試験管に加え正確に37℃で５分間酵素反応を行わせた。
５分後に反応停止液2mlを各々の試験管に加え反応を停
止した。直ちに反応停止液をブランクにして励起波長38
0nm、蛍光波長460nmで蛍光強度を各々測定した。別に調
整しておいたMCAの希釈標準液で同様の操作を行い検量
線を作成し、生成したMCAを検量した。

単位:pNA基質Ｏ・Ｄ・₄₀₅×10³/ml MCA基質 μmol/ml なお、PCは、それ自体は非活性型であり、測定にはこれ
を活性型にする必要がある。その目的では活性化剤とし
てトロンビンを用いることが一般的である。従つて比較
する酵素活性としてはトロンビンが最も重要である。表
中、APC/トロンビンは、その比が大きければ大きいほど
基質として優位性が高く、pNA基質の本発明化合物が優
れていることを示している。また、本発明化合物を用い
ると活性化に使用したトロンビンの活性を特殊な操作で
除く必要性が極めて小さくなり、臨床的に使用する場合
の操作が簡易化される。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の一般式（Ｉ） R₁−Phe−Thr−Phe−Arg−R₂ （Ｉ）（式中、R₁は水素原子又はアミノ保護基を示し、R₂はを示す）で表わされるペプチド誘導体。