JPH0782009B2 - 細胞融合方法及び装置 - Google Patents
細胞融合方法及び装置Info
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- JPH0782009B2 JPH0782009B2 JP63071658A JP7165888A JPH0782009B2 JP H0782009 B2 JPH0782009 B2 JP H0782009B2 JP 63071658 A JP63071658 A JP 63071658A JP 7165888 A JP7165888 A JP 7165888A JP H0782009 B2 JPH0782009 B2 JP H0782009B2
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、植物のプロトプラストの核を迅速に標識する
ことによって細胞融合を行った際に混合してくる同種及
び異種細胞融合物の識別マーカーとして使用する技術に
関する。
ことによって細胞融合を行った際に混合してくる同種及
び異種細胞融合物の識別マーカーとして使用する技術に
関する。
二種類の植物のプロトプラストを細胞融合し、新植物を
創製する方法は、よく知られている。
創製する方法は、よく知られている。
プロトプラストを用いて細胞融合を行うとき、同種・異
種融合体が同時に発生するため、それを選抜せずに融合
植物を再生すると、効率が大変悪い。
種融合体が同時に発生するため、それを選抜せずに融合
植物を再生すると、効率が大変悪い。
従来、植物の融合細胞の選別方法としては、タバコ細胞
の変異株（黄色）と正常株（緑色）の融合（長尾照義：
日本作物学会記事,47巻,491頁（1978））や、ハナキリ
ン（赤色）とセリバオウレン（黄色）の融合（山田康
之：細胞工学,1巻,220頁（1982））のように色による識
別法、栄養要求性を利用する識別法、ニュートラルレッ
ド色素で一方のプロトプラストを染色する識別法などが
ある。しかしながら、色及び栄養要求性を利用する選別
法は特定の植物については有効であるが、普遍的に全て
の植物に適用することはできない。
の変異株（黄色）と正常株（緑色）の融合（長尾照義：
日本作物学会記事,47巻,491頁（1978））や、ハナキリ
ン（赤色）とセリバオウレン（黄色）の融合（山田康
之：細胞工学,1巻,220頁（1982））のように色による識
別法、栄養要求性を利用する識別法、ニュートラルレッ
ド色素で一方のプロトプラストを染色する識別法などが
ある。しかしながら、色及び栄養要求性を利用する選別
法は特定の植物については有効であるが、普遍的に全て
の植物に適用することはできない。
より一般的な方法である、染色による識別法に関して
は、以下のような問題がある。すなわち、プロトプラス
トの細胞表面は澱粉粒で覆われているが、ニュートラル
レッド色素は、細胞表面の澱粉粒が多く残存していると
きには染まり難く、澱粉粒が少ないほどよく染まる欠点
がある。プロトプラスト表面の澱粉粉を分離すれば染色
性は向上するが、染色されたプロトプラストの生存率が
低下する。
は、以下のような問題がある。すなわち、プロトプラス
トの細胞表面は澱粉粒で覆われているが、ニュートラル
レッド色素は、細胞表面の澱粉粒が多く残存していると
きには染まり難く、澱粉粒が少ないほどよく染まる欠点
がある。プロトプラスト表面の澱粉粉を分離すれば染色
性は向上するが、染色されたプロトプラストの生存率が
低下する。
一方、澱粉粒によく染まるクリスタルバイオレットを使
用すると細胞の生存率の低下が見られた。
用すると細胞の生存率の低下が見られた。
本発明は、容易に異種融合したプロトプラストを選別で
きるプロトプラストの細胞融合方法及び装置を提供する
ことを目的とする。
きるプロトプラストの細胞融合方法及び装置を提供する
ことを目的とする。
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討を重ねた結果、２
種類の相異なる植物のプロトプラストの、一方をアクリ
ジン基を有する蛍光色素で電気パルスにて染色し、他方
をフェニルインドール基を有する蛍光色素で電気パルス
にて染色した後に細胞融合を行うことで、２種類の蛍光
色素を含む異種融合体の選抜が容易に行えることを見出
した。本発明で用いる蛍光色素で染色されたプロトプラ
ストは、細胞の生存率も高く、細胞融合を行う能力も十
分に保持している。
種類の相異なる植物のプロトプラストの、一方をアクリ
ジン基を有する蛍光色素で電気パルスにて染色し、他方
をフェニルインドール基を有する蛍光色素で電気パルス
にて染色した後に細胞融合を行うことで、２種類の蛍光
色素を含む異種融合体の選抜が容易に行えることを見出
した。本発明で用いる蛍光色素で染色されたプロトプラ
ストは、細胞の生存率も高く、細胞融合を行う能力も十
分に保持している。
微生物や動物細胞、特に血液細胞を蛍光色素で染色し、
臨床検査や診断を行うことは公知である（例えば特開昭
60−22661号公報、特開昭61−135769号公報、特開昭53
−20479号公報、特開昭50−87395号公報、特開昭60−21
0997号公報参照）。しかしながら、これらの刊行物は、
単に微生物や採血した血液細胞、あるいは診断すべき組
織の細胞を蛍光染色し、計数などを行うことを開示する
のみであり、染色さえ行えれば蛍光染色後の細胞が死滅
していてもよく、非常に激しい染色条件を用いることも
できる。まして蛍光染色が細胞融合にどのような影響を
与えるかについては全く記載されていない。
臨床検査や診断を行うことは公知である（例えば特開昭
60−22661号公報、特開昭61−135769号公報、特開昭53
−20479号公報、特開昭50−87395号公報、特開昭60−21
0997号公報参照）。しかしながら、これらの刊行物は、
単に微生物や採血した血液細胞、あるいは診断すべき組
織の細胞を蛍光染色し、計数などを行うことを開示する
のみであり、染色さえ行えれば蛍光染色後の細胞が死滅
していてもよく、非常に激しい染色条件を用いることも
できる。まして蛍光染色が細胞融合にどのような影響を
与えるかについては全く記載されていない。
本発明者は、他の蛍光色素であるルシフェラーCHでも検
討を行ったが、該蛍光色素はプロトプラスト表面にかす
かに色素が付着する程度で色が鮮明ではなかった。
討を行ったが、該蛍光色素はプロトプラスト表面にかす
かに色素が付着する程度で色が鮮明ではなかった。
本発明は、以下の細胞融合方法及び装置を提供するもの
である。
である。
（１） ２種類の相異なる植物のプロトプラストの細胞
融合方法において、一方のプロトプラストの細胞核をア
クリジン基を有する蛍光色素で電気パルスにて染色し、
他方のプロトプラストの細胞核をフェニルインドール基
を有する蛍光色素で電気パルスにて染色した後に細胞融
合を行い、２種類の蛍光色素を含む異種融合体の選抜に
供することを特徴とする方法。
融合方法において、一方のプロトプラストの細胞核をア
クリジン基を有する蛍光色素で電気パルスにて染色し、
他方のプロトプラストの細胞核をフェニルインドール基
を有する蛍光色素で電気パルスにて染色した後に細胞融
合を行い、２種類の蛍光色素を含む異種融合体の選抜に
供することを特徴とする方法。
（２） 上記項（１）に記載した２種類の植物プロトプ
ラストの作成ならびに細胞融合に使用するために、第１
プロトプラスト作成槽と第１電気パルス印加用染色槽を
接続すると共に、第２プロトプラスト作成槽と第２電気
パルス印加用染色槽を接続し、第１電気パルス印加用染
色槽と第２電気パルス印加用染色槽の間に細胞融合セル
を設けてなる装置。
ラストの作成ならびに細胞融合に使用するために、第１
プロトプラスト作成槽と第１電気パルス印加用染色槽を
接続すると共に、第２プロトプラスト作成槽と第２電気
パルス印加用染色槽を接続し、第１電気パルス印加用染
色槽と第２電気パルス印加用染色槽の間に細胞融合セル
を設けてなる装置。
プロトプラストは、細胞壁を溶解除去して得られるもの
であり、植物細胞にとって生存するのに不都合な状態に
ある。このため、プロトプラストの培養は、短時間にす
るのが、融合細胞の増殖能力を高く保つために好まし
い。
であり、植物細胞にとって生存するのに不都合な状態に
ある。このため、プロトプラストの培養は、短時間にす
るのが、融合細胞の増殖能力を高く保つために好まし
い。
試みに、ほうれん草（学名：スピナシア・オレラシア）
の発芽後30日目の幼葉をプロトプラスト化して、アクリ
ジンオレンジ色素で標識すると約10分で50％程度の細胞
が標識され、成葉由来のプロトプラストよりも速やかに
標識される。プロトプラストの標識される割合は、植物
の種族や成長過程のどの部位を用いるかによっての違い
があり、一概には言えないが、成葉由来のプロトプラス
トでは電気パルスなどの外的刺激を与えずに蛍光色素で
標識すると、標識率で１〜２％程度であった。標識率が
１〜２％であっても、標識されたプロトプラストは、未
標識のプロトプラストから容易に選別できるため、細胞
融合用には標識率が低くても問題はない。
の発芽後30日目の幼葉をプロトプラスト化して、アクリ
ジンオレンジ色素で標識すると約10分で50％程度の細胞
が標識され、成葉由来のプロトプラストよりも速やかに
標識される。プロトプラストの標識される割合は、植物
の種族や成長過程のどの部位を用いるかによっての違い
があり、一概には言えないが、成葉由来のプロトプラス
トでは電気パルスなどの外的刺激を与えずに蛍光色素で
標識すると、標識率で１〜２％程度であった。標識率が
１〜２％であっても、標識されたプロトプラストは、未
標識のプロトプラストから容易に選別できるため、細胞
融合用には標識率が低くても問題はない。
本発明の装置は、２種のプロトプラスト作成槽と電気パ
ルス印加用染色槽を有しており、２種の異なる植物細胞
について、プロトプラスト化と電気パルスによる蛍光色
素染色を同時に短時間で行うことができる。
ルス印加用染色槽を有しており、２種の異なる植物細胞
について、プロトプラスト化と電気パルスによる蛍光色
素染色を同時に短時間で行うことができる。
以下に実施例を挙げて、本発明の内容を具体的に説明す
る。
る。
実施例−１ 植物細胞を培養する際に問題となる微生物による汚染を
避けるため、すべての操作はクリーンベンチ内で行える
ような器具が望ましい。それ故、第１図に示すような器
具を製作して試料の調整を行った。第１図の器具の用途
を説明すると、１はプロトプラスト作成セル、２は染料
標識および洗浄用セル、３は電気融合セルである。４は
プロトプラスト細胞と葉片残渣を分離するための２重に
したナイロンまたはステンレスの網で、上を100メッシ
ュ、下を30メッシュにして目づまりを防いでいる。細胞
の大きさによって網目のサイズを変更できるようにすれ
ば便利である。はじめにプロトプラスト細胞を作成する
ために、１のセルに細胞壁溶解酵素液と裏皮を剥いだ葉
を一緒に入れて一定時間静置する。細胞壁の固い試料で
は、はじめに10の気孔口から吸引操作を行うと分離に良
い結果を得る。しかし、静置処理だけで充分な場合は、
後処理においても細胞に傷がつかず、細片も少ない。２
のセルを傾斜させた理由はプロトプラスト細胞を下のセ
ルに移すとき、できるだけ壊れないようにするためであ
る。プロトプラスト細胞が分離してきたら、５のコック
を開いて２のセルに移送する。７より染料液を注入して
９の電気パルス発生器を用いて６の円筒型電極に直流パ
ルスを印加して染色を行う。その後、洗浄液で不用の酵
素と染料を洗い去る。もう一方の同型のセルには別の葉
を入れて同様の操作を行うことによって２種類の標識さ
れたプロトプラスト細胞を作成することができる。これ
を３の融合セルに送って細胞融合を行う。
避けるため、すべての操作はクリーンベンチ内で行える
ような器具が望ましい。それ故、第１図に示すような器
具を製作して試料の調整を行った。第１図の器具の用途
を説明すると、１はプロトプラスト作成セル、２は染料
標識および洗浄用セル、３は電気融合セルである。４は
プロトプラスト細胞と葉片残渣を分離するための２重に
したナイロンまたはステンレスの網で、上を100メッシ
ュ、下を30メッシュにして目づまりを防いでいる。細胞
の大きさによって網目のサイズを変更できるようにすれ
ば便利である。はじめにプロトプラスト細胞を作成する
ために、１のセルに細胞壁溶解酵素液と裏皮を剥いだ葉
を一緒に入れて一定時間静置する。細胞壁の固い試料で
は、はじめに10の気孔口から吸引操作を行うと分離に良
い結果を得る。しかし、静置処理だけで充分な場合は、
後処理においても細胞に傷がつかず、細片も少ない。２
のセルを傾斜させた理由はプロトプラスト細胞を下のセ
ルに移すとき、できるだけ壊れないようにするためであ
る。プロトプラスト細胞が分離してきたら、５のコック
を開いて２のセルに移送する。７より染料液を注入して
９の電気パルス発生器を用いて６の円筒型電極に直流パ
ルスを印加して染色を行う。その後、洗浄液で不用の酵
素と染料を洗い去る。もう一方の同型のセルには別の葉
を入れて同様の操作を行うことによって２種類の標識さ
れたプロトプラスト細胞を作成することができる。これ
を３の融合セルに送って細胞融合を行う。
実施例−２ オランダミツバ（学名：アピューム・グラベオレアス）
の成葉を滅菌して裏皮を剥ぎ、pH5.7に調整した0.6Mマ
ニトール液内に細胞壁溶解酵素を入れて、第１図の１の
セルで細胞壁を溶解してプロトプラスト細胞とする。こ
れを２のセルに移送して滅菌液で洗浄する。この懸濁液
をアクリジンオレンジ（AO）50〜250μＭ濃度および、
細胞濃度約103cells/mlの懸濁液に調整する。これに電
極両端からパルス幅0.1ms,パルス電圧300〜500Vを１〜
３回印加すると３〜５分内に標識されて蛍光顕微鏡で核
ないし細胞質を観察することができる。アクリジンオレ
ンジの蛍光波長域は520nmで黄色に光るから容易に分か
る。パルス電圧は試料の種類や調整を上手に行えば更に
下げることができる。
の成葉を滅菌して裏皮を剥ぎ、pH5.7に調整した0.6Mマ
ニトール液内に細胞壁溶解酵素を入れて、第１図の１の
セルで細胞壁を溶解してプロトプラスト細胞とする。こ
れを２のセルに移送して滅菌液で洗浄する。この懸濁液
をアクリジンオレンジ（AO）50〜250μＭ濃度および、
細胞濃度約103cells/mlの懸濁液に調整する。これに電
極両端からパルス幅0.1ms,パルス電圧300〜500Vを１〜
３回印加すると３〜５分内に標識されて蛍光顕微鏡で核
ないし細胞質を観察することができる。アクリジンオレ
ンジの蛍光波長域は520nmで黄色に光るから容易に分か
る。パルス電圧は試料の種類や調整を上手に行えば更に
下げることができる。
実施例−３ チンゲン菜（学名：ブラシカ・パラチネンシス）の成葉
を滅菌して裏皮を剥いで、pH5.7に調整した0.7Mマニト
ール液内に細胞壁溶解酵素を入れて、細胞壁を溶解して
プロトプラスト細胞とする。以下の操作方法は実施例２
と殆ど同様である。この懸濁液を第１図の２のセルに移
して、４−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール
（DAPI）１〜2mM濃度液に調整する。電極両端からパル
ス幅0.1ms,パルス電圧300〜500Vを１〜５回印加すると
３〜５分内に標識されて光学顕微鏡で核を観察すること
ができる。DAPIの蛍光波長域は360nmで青色に光るからA
Oによって標識されたものとは容易に識別できる。
を滅菌して裏皮を剥いで、pH5.7に調整した0.7Mマニト
ール液内に細胞壁溶解酵素を入れて、細胞壁を溶解して
プロトプラスト細胞とする。以下の操作方法は実施例２
と殆ど同様である。この懸濁液を第１図の２のセルに移
して、４−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール
（DAPI）１〜2mM濃度液に調整する。電極両端からパル
ス幅0.1ms,パルス電圧300〜500Vを１〜５回印加すると
３〜５分内に標識されて光学顕微鏡で核を観察すること
ができる。DAPIの蛍光波長域は360nmで青色に光るからA
Oによって標識されたものとは容易に識別できる。
このように二種類の蛍光色素でそれぞれの細胞を染色す
れば、お互いの接触状態が分かりやすく選別に便利であ
る。
れば、お互いの接触状態が分かりやすく選別に便利であ
る。
本発明によって、細胞融合に用いる種々の植物プロトプ
ラスト細胞は電気パルスを印加することによって短時間
で蛍光色素を導入できるようになった。従って、単に色
素を細胞表面に付着させている場合に比べて、他方の細
胞に色移りを起こさせず、しかも微量の色素で標識でき
るため細胞に与える障害が少なく異種融合物の選別に有
利に作用する。そのため、他の方法で識別マーカーを付
ける場合よりも簡単で有効な手段を提供できる。
ラスト細胞は電気パルスを印加することによって短時間
で蛍光色素を導入できるようになった。従って、単に色
素を細胞表面に付着させている場合に比べて、他方の細
胞に色移りを起こさせず、しかも微量の色素で標識でき
るため細胞に与える障害が少なく異種融合物の選別に有
利に作用する。そのため、他の方法で識別マーカーを付
ける場合よりも簡単で有効な手段を提供できる。
第１図は植物プロトプラスト細胞の蛍光色素標識用器具
の原理構成図を示す。 １……プロトプラスト作成セル、２……染料標識および
洗浄用セル、３……電気融合セル、４……２重金網、５
……コック、６……円筒型電極、７及び８……洗浄液注
入口および出口、９……電気パルス発生器、10……気孔
口又は吸引口。
の原理構成図を示す。 １……プロトプラスト作成セル、２……染料標識および
洗浄用セル、３……電気融合セル、４……２重金網、５
……コック、６……円筒型電極、７及び８……洗浄液注
入口および出口、９……電気パルス発生器、10……気孔
口又は吸引口。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 (56)参考文献 特開 昭60−22661（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−135769（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−20479（ＪＰ，Ａ) 特開 昭50−87395（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−210997（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−70972（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】２種類の相異なる植物のプロトプラストの
細胞融合方法において、一方のプロトプラストの細胞核
をアクリジン基を有する蛍光色素で電気パルスにて染色
し、他方のプロトプラストの細胞核をフェニルインドー
ル基を有する蛍光色素で電気パルスにて染色した後に細
胞融合を行い、２種類の蛍光色素を含む異種融合体の選
抜に供することを特徴とする方法。 - 【請求項２】請求項１に記載した２種類の植物プロトプ
ラストの作成ならびに細胞融合に使用するために、第１
プロトプラスト作成槽と第１電気パルス印加用染色槽を
接続すると共に、第２プロトプラスト作成槽と第２電気
パルス印加用染色槽を接続し、第１電気パルス印加用染
色槽と第２電気パルス印加用染色槽の間に細胞融合セル
を設けてなる装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63071658A JPH0782009B2 (ja) | 1988-03-24 | 1988-03-24 | 細胞融合方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63071658A JPH0782009B2 (ja) | 1988-03-24 | 1988-03-24 | 細胞融合方法及び装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01242962A JPH01242962A (ja) | 1989-09-27 |
| JPH0782009B2 true JPH0782009B2 (ja) | 1995-09-06 |
Family
ID=13466926
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63071658A Expired - Lifetime JPH0782009B2 (ja) | 1988-03-24 | 1988-03-24 | 細胞融合方法及び装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0782009B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107058075B (zh) * | 2017-06-20 | 2023-10-20 | 商丘师范学院 | 一种植物细胞原生质体纯化仪及纯化方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3916197A (en) * | 1973-11-28 | 1975-10-28 | Particle Technology Inc | Method and apparatus for classifying biological cells |
| GB1503828A (en) * | 1976-06-22 | 1978-03-15 | Univ Strathclyde | Method of enumerating bacteria |
| DE3238353A1 (de) * | 1982-10-15 | 1984-04-19 | Max Planck Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen | Verfahren zur simultanen quantitativen bestimmung der blutzellen und reagenz hierfuer |
| US4734372A (en) * | 1983-02-04 | 1988-03-29 | Brown University Research Foundation | Cell culturing methods and apparatus |
| JPS60210997A (ja) * | 1984-04-04 | 1985-10-23 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 微生物粒子数の計数法 |
| JPS61219386A (ja) * | 1985-03-26 | 1986-09-29 | Sanyo Electric Co Ltd | 分極性微粒体の集合方法および装置 |
| JPS62135769A (ja) * | 1985-12-10 | 1987-06-18 | Motohide Takahama | 細胞中の蛋白質とｄｎａの比率の測定法及び測定用試薬 |
-
1988
- 1988-03-24 JP JP63071658A patent/JPH0782009B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01242962A (ja) | 1989-09-27 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |