JPH0782015B2 - Ｄ型バニリルマンデル酸の測定法およびそれに使用する試薬およびキット - Google Patents

Ｄ型バニリルマンデル酸の測定法およびそれに使用する試薬およびキット

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JPH0782015B2
JPH0782015B2 JP2514153A JP51415390A JPH0782015B2 JP H0782015 B2 JPH0782015 B2 JP H0782015B2 JP 2514153 A JP2514153 A JP 2514153A JP 51415390 A JP51415390 A JP 51415390A JP H0782015 B2 JPH0782015 B2 JP H0782015B2
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は生体試料中に含まれるＤ型バニリルマンデル酸
の測定法およびそれに使用する試薬およびキットに関す
るものである。
背景技術 カテコールアミン酸性代謝物を産生する腫瘍としては、
褐色細胞腫および神経芽細胞腫が知られている。神経芽
細胞腫は主に小児に発生し、日本におてはマススクリー
ニングの測定項目とされている。
生体内における神経芽細胞腫の存在の確認は尿中のカテ
コールアミン酸性代謝物であるバニリルマンデル酸（VM
A）およびホモバニリン酸（HVA）の含有量を測定するこ
とにより判断されている。
従来、尿中のVMAおよびHVAの測定に用いられている方法
としてはスポット法、ディップ法などの定性法、高速液
体クロマトグラフィー（HPLC）法、免疫学的測定法など
の定量法が報告されている。スポット法、ディップ法は
偽陽性の出現率が高く、必ずしも満足できる方法ではな
い。また、HPLC法は精度の点では信頼できる優れた方法
であるが、装置の維持、管理に熟練の専従者を必要と
し、かつ複数の検体を同時に処理できないという欠点を
有している。
これに対して、免疫学的測定法は上述の従来法の欠点を
克服できるものと期待されている（特開昭60−123765号
公報、特開昭62−11165号公報、Biogenic Amines,Vol.
4,No.3,pp229〜235（1987）、小児がん、24、250〜252
（1988）、改訂版神経芽細胞腫マス・スクリーニング、
第148〜152頁、1989年、社会福祉法人恩賜財団母子愛育
会発行、Journal of Immunological Methods,118,101〜
107（1989）など参照）。
VMAは下記式で示すように、その分子内に不斉炭素を有
し、光学活性の異なる二つの光学異性体（Ｄ型とＬ型）
が存在する。
〔式中、＊は不斉炭素を示す〕 しかし、従来報告されている免疫学的測定法では、Ｄ型
VMAを特異的に測定できるか否かに関してはまったく言
及されておらず、その示唆もされていない。
発明の開示 本発明者らはＤ型VMAを特異的に、しかも簡便に測定す
る方法を開発すべく研究を重ねた結果、抗Ｄ型VMA抗体
の取得に成功し、該抗体を用いて極めて簡便な方法によ
り生体試料中のＤ型VMAのみを特異的に測定する方法を
確立し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、生体試料中のＤ型VMAを下記の
（Ａ）〜（Ｄ）工程により測定する方法において、検量
曲線を作成するための標準物質としてＤ型VMAとＬ型VMA
の等量混合物（ラセミ混合物）を使用し、標識化抗VMA
抗体として標識化抗Ｄ型VMA抗体を使用し、下記（Ｄ）
工程において得られた値から生体試料中に含まれるＤ型
VMAの濃度を算出することを特徴とする生体試料中のＤ
型VMAの測定法に関するものである。
（Ａ） 固相にVMAを結合させて得た固相化VMAと標識化
抗VMA抗体を用い、生体試料中のVMAと固相化VMAとの標
識化抗VMA抗体に対して競合反応させる工程； （Ｂ） 液相部と固相部とを分離し、固相部を必要によ
り洗浄する工程； （Ｃ） 固相化VMAに結合した標識化抗VMA抗体の標識量
またはそれ以外の標識量を測定する工程；および （Ｄ） 生体試料の代わりに既知の濃度のVMA（標準物
質）を使用する以外は上記（Ａ）〜（Ｃ）工程と同様の
方法を実施することにより得られる標識量とVMA濃度と
の関係を示す曲線（検量曲線）を作成するか、あるいは
関係式を求め、該検量曲線または該関係式から上記
（Ｃ）工程で得られた標識量に対応するVMAの濃度を算
出し、該濃度を生体試料中に含まれるVMAの濃度とする
工程。
また、本発明は上記測定法で使用する下記の〜の特
性を有する抗Ｄ型VMA抗体試薬に関するものである。
親和性 Ｄ型VMAに特異的に反応する。
交差性 Ｄ型VMAへの反応性を100％とした場合のＬ型VMAへの反
応性は１％以下である。
クラス IgGに属する。
さらに、本発明は上記測定法を実施するための、下記の
およびの試薬から構成されるＤ型VMA測定用キット
に関するものである。
標識化された上記抗Ｄ型VMA抗体試薬 固相化VMA試薬 図面の簡単な説明 第１図は、VMAのラセミ混合物（DL−VMA）を標準物質と
して用い、作成した検量曲線を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態 I.D型VMAの測定法 本発明方法は上述の（Ａ）〜（Ｄ）工程で示される四工
程より構成される。
（Ａ）工程 （Ａ）工程で使用する生体試料としては、尿、血液、体
液、精液、髄液など試料中にＤ型VMAを含有する可能性
のあるものであれば特に制限されない。
たとえば、尿を生体試料として使用する場合には採取し
た原尿を必要により希釈液（たとえば、リン酸緩衝生理
食塩水（PBS）など）で２〜20倍に希釈したものを試料
として使用する。また、濾紙に吸収させた尿をPBSで抽
出して得た濾紙抽出尿も試料として使用することができ
る。
（Ａ）工程で使用する固相化VMAはハプテンの固相化法
として通常用いられている方法により調製することがで
きる。たとえば、VMAと高分子担体との複合体をマイク
ロプレートなどの固相に常法により結合させればよい。
高分子担体と結合させるVMAとしては、Ｄ型VMAまたはＤ
型VMAとＬ型VMAとの等量混合物（ラセミ混合物）を使用
することができる。
複合体を調製するために使用する高分子担体としては、
通常ハプテン抗原に対する抗体の作成にあたり常用され
ている天然の高分子担体を使用することができる。たと
えば、ウシ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ヒ
ト血清アルブミンなどの動物血清アルブミン類、ウシ血
清グロブリン、ウサギ血清グロブリン、ヒト血清グロブ
リン、ヒツジ血清グロブリンなどの動物血清グロブリン
類、ウシチログロブリン、ウサギチログロブリンなどの
動物チログロブリン類、ウシヘモグロビン、ヒツジヘモ
グロビン、ヒトヘモグロビンなどの動物ヘモグロビン
類、キーホールリンペットヘモシアニンなどのヘモシア
ニン類などを例示することができる。
高分子担体とVMAとの結合はマンニッヒ反応を応用する
ことにより実施することができる（特開昭61−11152号
公報参照）。
上述のようにして得られた複合体を結合させるための固
相の形状、大きさおよび材質は特に制限されない。すな
わち、マイクロプレート、ディスク、チューブ、ビー
ズ、ラテックスなどの固相として常用されているものを
使用すればよい。
固相と上記複合体との結合は、吸着法、共有結合法、イ
オン結合法、架橋法、包括法などいずれも適用すること
ができる。具体的に、このような結合法は固定化酵素の
調製に利用されている方法を応用すればよく、たとえば
「固定化酵素」（昭和50年、（株）講談社発行）第９〜
75頁などの成書を参照することができる。
（Ａ）工程で標識化抗Ｄ型VMA抗体として使用する抗Ｄ
型VMA抗体は、たとえば上述のVMAと高分子担体との複合
体を免疫抗原とし、該免疫抗原を動物に投与して生体内
にＤ型VMAを認識する抗体を産生させ、これを取得する
方法に従って調製することができる。
免疫抗原を投与する動物としては、ウシ、ウマ、ヒツ
ジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ブタ、
ウサギ、サル、ハト、ニワトリなどいずれであってもよ
く、特にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギな
どが好都合である。
このような動物への免疫抗原の投与は常法に従って行え
ばよく、たとえば、完全フロイントアジュバント、不完
全フロイントアジュバント、ミョウバンアジュバント、
水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳菌アジュバン
トなどの各種アジュバントと上述の免疫抗原との懸濁液
を調製し、これを上記動物の静脈内、腹腔内、皮下また
は皮内に投与すればよい。
投与量は、動物としてウサギ、モルモットを使用する場
合には複合体の量として0.01〜10mg/匹、またはマウ
ス、ラットを使用する場合には、0.001〜1mg/匹程度が
好適である。
初回投与後、１〜４週間おきに１〜５回程度の上記と同
様の追加免疫を行うことで、Ｄ型VMAを認識する抗体を
産生させることができる。
このようにして産生された抗体は、最終免疫の１〜２週
間後に採血し、これを遠心分離することにより抗血清と
して取得することができる。抗体の精製が必要とされる
場合には、さらに、溶解度差を利用した選択的分別法
（たとえば、塩析、アルコール沈殿など）、電荷の差を
利用した分別法（たとえばイオン交換クロマトグラフィ
ー、電気泳動など）、分子量の差を利用した分別法（た
とえば超遠心法、ゲル濾過法など）などの常法を適宜組
み合わせて抗血清中に存在する抗体を抗体のクラスごと
に分別精製してもよい。特に、免疫抗原として使用した
Ｄ型VMAと高分子担体との複合体を固定化して得た固定
化抗原を利用すると、Ｄ型VMAを認識する抗体のみを分
別精製しうる。
次に、モノクローナル抗体の調製について説明すれば、
該モノクローナル抗体は公知の細胞融合法、EBウイルス
などによるトランスフォーメーション法などを適宜応用
することにより調製することができる。
モノクローナル抗体の大量生産により好適な細胞融合法
を例に挙げ説明すれば、たとえば以下の手順でＤ型VMA
を認識するモノクローナル抗体を取得することができ
る。
ａ） 抗体産生細胞の調製 前記免疫抗原を動物、好ましくはマウス、ラットなどに
抗血清の場合と同様に免疫し、免疫を獲得した動物から
の脾細胞、リンパ節細胞、末梢血リンパ球などの抗体産
生細胞を常法により取得する。
ｂ） ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒトなどの
種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細
胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を
有し、未融合の状態では選択培地で生存できず、抗体産
生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するも
のが好ましい。通常、８−アザグアニン耐性株が用いら
れ、この細胞株はヒポキサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ（Hypoxanthine guanine phosp
horibosyl transferase）を欠損し、ヒポキサンチン・
アミノプテリン・チミジン（HAT）培地に生育できな
い。また細胞の性質として免疫グロブリンを分泌しな
い、いわゆる非分泌型の細胞株であることが好ましい。
ミエローマ細胞株の具体例としては、P3X63Ag8（ATCC
TIB−９）（Nature,256,495−497（1975））、P3X63Ag8
U.1（P3U1）（ATCC CRL−1597）（Current Topics in
Microbiology and Immunology,81,1−７（1978））、P3
X63Ag8.653（ATCC CRL−1580）（J.Immunology,123,15
48−1550（1979））、P2/NSI/1−Ag4−１（ATCC TIB−
18）（European J.Immunology,６,511−519（1976）、S
p2/O−Ag14（ATCC CRL−1581）（Nature,276,269−270
（1978））などのマウスミエローマ細胞株、210.RCY.Ag
1.2.3（Y3−Ag1.2.3）（ATCC CRL−1631）（Nature,27
7,131−133（1979））などのラットミエローマ細胞株、
Ｕ−266−AR1（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,5429（1
980））、GM1500（Nature,288,488（1980）、KR−４（P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,79,6651（1982））などのヒ
トミエローマ細胞株を例示することができる。
ｃ） 細胞融合 細胞融合にあたっては、抗体産生細胞に適合したミエロ
ーマ細胞を選定する。細胞融合は、イーグルの最少必須
培地（MEM）、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、R
PMI1640培地などの動物細胞培養用培地中で107〜108/ml
のミエローマ細胞と抗体産生細胞を混合比1:4〜10に混
合し、37℃で１〜10分間細胞同士を接触させることによ
り効率よく融合を行うことができる。細胞融合を促進さ
せるために、平均分子量1000〜6000のポリエチレングリ
コール（PEG）、ポリビニールアルコール、センダイウ
イルスなどの融合促進剤を使用することができる。
また、電気パルスを利用した市販の細胞融合装置を用い
て抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させることもで
きる。
ｄ） 選択培地におけるハイブリドーマの選別 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを
選別する手段としては、選択的培地における細胞の選択
的増殖を利用する方法を用いることができる。たとえ
ば、細胞懸濁液を15％ウシ胎児血清（FCS）含有RPMI164
0培地などで適当に希釈後、マイクロプレート上に105〜
106/ウエル程度まき、各ウエルに選択培地（たとえば、
HAT培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して
培養を行う。ミエローマ細胞として８−アザグアニン耐
性株、選択培地としてHAT培地を用いた場合は、未融合
のミエローマ細胞は培養10日目ぐらいまでに死滅し、正
常細胞である抗体産生細胞もインビトロ（in vitro）で
は長期間生育できないので、培養10〜14日目から生育し
てくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
ｅ） Ｄ型VMAを認識するモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマの検索 Ｄ型VMAを認識するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマの検索は、酵素免疫測定法（ELA、ELISA）、
ラジオイムノアッセイ（RIA）などによって行うことが
できる。たとえば、前記の免疫抗原（特にＤ型VMAと高
分子担体との複合体）および免疫抗原作製時に使用した
高分子担体をそれぞれ吸着させた96ウエルELISA用マイ
クロプレートにモノクローナル抗体を含む培養上清を添
加して免疫抗原および高分子担体と反応させ、次いで結
合した特異抗体に酵素標識抗免疫グロブリン抗体を反応
させるか、あるいはビオチン標識抗免疫グロブリン抗体
を反応させたのちアビジンＤ−酵素標識体を反応させ、
次いでいずれの場合とも各ウエルに酵素基質を加えて発
色させる。免疫抗原を固定したウエルにおいては発色
し、高分子担体を固定化したウエルで発色しない培養上
清を選別することにより、Ｄ型VMAと特異的に反応する
抗体を産生するハイブリドーマを検索することができ
る。
ｆ） クローニング ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天
法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法などに
より行うことができる。
ｇ） モノクローナル抗体の産生 このようにして取得したハイブリドーマからモノクロー
ナル抗体を産生する方法としては、通常の細胞培養法や
腹水形成法などが採用されうる。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを10〜15％FCS
含有RPMI1640培地、無血清培地などの動物細胞培養用培
地中で培養し、その培養上清液から抗体を取得すること
ができる。
腹水から回収する方法では、ハイブリドーマと腫瘍組織
適合性が一致する動物に、プリスタン（2,6,10,14−テ
トラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内に投与
した後、たとえばマウスの場合にはハイブリドーマを約
107/匹腹腔内投与する。ハイブリドーマは10〜18日ほど
で腹水腫瘍を形成し、血清および腹水中に高濃度に抗体
を生産する。
抗体の精製が必要とされる場合には、硫安塩析法、DEAE
セルロースなどの陰イオン交換体を利用するイオン交換
クロマトグラフィー、プロティンＡ−セファロースなど
を用いるアフィニティークロマトグラフィー、分子ふる
いクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択
し、組み合わせることにより精製することができる。
このようにして得られた抗体は標識化して本発明方法に
供する。
使用する抗体は抗体そのものであってもよいが、非特異
的な吸着を防止する意味から抗体の活性フラグメントを
使用するのが好ましい。
抗体の活性フラグメントは、抗体の特徴を保持するもの
（たとえば、Ｆ（ab′）２、Fab′、Fabなどの各種フラ
グメント）であればいずれのものであってもよい。これ
ら活性フラグメントの調製は、精製抗体をパパイン、ペ
プシン、トリプシンなどのフロテアーゼを用いて限定分
解する方法など公知の方法を適用して行うことができる
（たとえば「免疫生化学研究法（続生化学実験講座
５）」、日本生化学会編、89頁（1986年）参照）。
抗体に結合させる標識剤としては、放射性同位体（たと
えば38P、3H、5Cなど）、酵素（たとえば、β−ガラク
トシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ア
ルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼな
ど）、補酵素・補欠分子族（たとえば、FAD、FMN、AT
P、ビオチン、ヘムなど）、フルオレセイン誘導体（た
とえば、フルオレイセンイソチオシアナート、フルオレ
セインチオフルバミルなど）、ローダミン誘導体（たと
えば、テトラメチルローダミンＢイソチオシアナートな
ど）、ウムベリフェロンおよび１−アニリノ−８−ナフ
タレンスルホン酸などの蛍光色素、ルミノール誘導体
（たとえば、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（６−
アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノールなど）な
どを用いることができる。抗体またはその活性フラグメ
ントと標識剤との結合は、成書〔たとえば、「続生化学
実験講座５ 免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、
（1986年発行）第102〜112頁〕に記載されているような
公知の方法から適宜選択して実施すればよい。
（Ａ）工程においては、前述の固相化VMAと生体試料中
のVMAとを標識化抗Ｄ型VMA抗体に対して競合反応させ
る。反応は４〜50℃、好ましは20〜40℃で0.1〜10時
間、好ましくは0.5〜２時間程度接触させることにより
実施することができる。
（Ｂ）工程 本発明方法の（Ｂ）工程においては、（Ａ）工程終了
後、液相部と固相部を分離（B/F分離）し、必要に応じ
て固相部を洗浄する工程である。
B/F分離は固相から液相部を除去できる方法であればい
ずれの方法であってもよい。具体的には、マイクロプレ
ート、チューブ等を固相として使用した場合には固相部
を傾けたり、洗浄したり、反転または回転させることに
より液相を固相から物理的に除去することができる。ま
た、ビーズ、ラテックスなどの粒状の固相を使用した場
合には濾過、遠心分離、吸引、洗浄などの手段により液
相と固相を分離することができる。
B/F分離後、固相の洗浄は、PBSなどの緩衝液または食塩
水などの塩溶液を用いて行うことができる。また、洗浄
はB/F分離と同時に行ってもよい。
（Ｃ）工程 本発明方法の（Ｃ）工程は固相に結合した標識化抗Ｄ型
VMA抗体の標識量またはそれ以外の標識量を測定する工
程である。
標識量の測定は、使用した標識の種類に応じてその標識
の測定に使用している通常の方法を用いて実施すればよ
い。
たとえば、放射性同位元素を標識として使用した場合に
は液体シンチレーションカウンター等を用いて測定する
ことができる。また標識としてペルオキシダーゼ、カタ
ラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、
アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼなど
の酸化還元酵素を用いた場合には、基質として過酸化水
素（H2O2）、呈色試薬としてｏ−フェニレンジアミン、
2,2′−アミノビス（３−エチルベンズチアゾリンスル
ホン酸）アンモニウム酸（ABTS）、3,3′,5,5′−テラ
メチルベンチジン（TMBZ）などを使用し、β−ガラクト
シダーゼを用いた時には基質としてフルオレセイン−ジ
−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を使用し、反応後の
溶液中の吸光度または蛍光強度を測定すればよい。
（Ｄ）工程 （Ｄ）工程においては、既知濃度のVMAラセミ混合物を
用いて作成した検量曲線から上述の（Ｃ）工程で測定し
た生体試料の標識量に対応するＤ型VMAの濃度を算出す
る工程である。
本発明方法で使用する標準曲線は基準物質としてVMAの
ラセミ混合物を使用して作成する。VMAは通常ラセミ混
合物の形で市販されており、このラセミ混合物は光学分
割することができるが、操作が煩雑で、かつ分割収率も
満足できるものではない。このため、ラセミ混合物自体
を標準物質として使用する方が好都合である。
（Ｄ）工程におけるＤ型VMAの算出の方法は、VMAのラセ
ミ混合物を用いて作成した検量曲線から得られる値を半
分にしてＤ型VMAの濃度とする方法が最も簡便な方法で
ある。しかし、本発明方法においては上記方法に限定さ
れるものではなく、たとえば、VMAのラセミ混合物を用
いて測定した標識量を縦軸に、VMAのラセミ混合物の半
分の濃度を横軸にして検量曲線を作成し、該検量曲線か
ら試料中のＤ型VMAの濃度を直接的に求める方法、VMAの
ラセミ混合物を用いて測定した標識量とVMAのラセミ混
合物中のＤ型VMAの濃度との関係式をコンピューターに
より求め、該関係式から試料中のＤ型VMAの濃度を求め
る方法など、VMAのラセミ混合物を標準物質として用い
た検量曲線または関係式からＤ型VMAの濃度を算出でき
る方法であればいずれの方法であっても採用することが
できる。
II.抗Ｄ型VMA抗体試薬 上記測定法で使用する抗体試薬としては、後述の実施例
で示されているような下記の性質を有するものが好まし
い。
親和性 Ｄ型VMAに対して特異的に反応する。
交差性 Ｄ型VMAへの反応性を100％とした場合のＬ型VMAへの反
応性は１％以下である。
クラス IgGに属する。
このような性質、特にＬ型VMAに対する交差性が１％以
下であるものを使用すれば、標準物質としてVMAのラセ
ミ混合物を使用しても、該標準物質中のＬ型VMAとの反
応性はほぼ完全に無視することができる。このため、上
記測定法の（Ｄ）工程で示したような極めて簡便な方法
でＤ型VMAの真の存在量を算出することができる、とい
う効果を有する。
上記抗体試薬を標識化する場合の標識の種類および標識
化方法は、既にＩ−（Ａ）工程の段で説明したとおりで
ある。
III.D型VMA測定用キット 本発明の測定法を実施するための測定用キットは少なく
とも下記の試薬を構成成分とする。
標識化された上記抗Ｄ型VAM抗体試薬 固相化VMA試薬 上記キットにおいての本発明の抗体試薬を標識したも
のを使用することによりＬ型VMAとの反応性を無視でき
るため、の固相化VMA試薬中のVMAとしてはＤ型VMAは
もとよりVMAのラセミ混合物を使用することもできる。
具体的には、酵素標識化した抗体試薬を用いる測定キッ
トは、例えば下記の試薬から構成される。
固相化VMA試薬（マイクロプレートにVMAラセミ混合
物を結合させたもの） ペルオキシダーゼで標識した上記抗Ｄ型VMA抗体試
薬 基質液（過酸化水素＋TMBZ） 酵素反応停止液（硫酸水溶液） 既知濃度の標準物質（VMAラセミ混合物） 上記各試薬の調製法およびこれら試薬から構成されるキ
ットを用いたＤ型VMAの測定法の詳細は、後述の実施例
に記載したとおりである。
以下、実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１ 標識化抗Ｄ型VMA抗体の調製 VMAのラセミ混合物（以下「DL−VMA」と記載する）0.3m
Mおよびヒト血清アルブミン（HSA）100mgを0.3M炭酸水
素ナトリウム溶液1.0mlに溶解させ、37％ホルマリン0.2
mlを加え、3M酢酸ナトリウム溶液でpH6〜７に調整し
た。共栓試験管の空間部を窒素ガスで置換し、20±３℃
で70時間遮光下反応させた。反応後、10℃の蒸留水で数
回透析し、凍結乾燥してDL−VMA−HSA複合体を得た。
上述のDL−VMA−HSA（1mg/ml）を生理食塩水に溶解さ
せ、完全フロイントアジュバントと1:1で混合してエマ
ルジョンとしたものをBalb/cマウス（雌、６週齢）の腹
腔内に50μg/100μｌ投与して初回免疫とした。
初回免疫後、２週間おきに数回、同様の方法で免疫した
後、最終免疫として上記エマルジョン50μg/100μｌを
マウスの尾静脈に投与した。
最終免疫から３日後にマウスの脾細胞を摘出し、イーグ
ルの最少必須培地（MEM）で洗浄した。マウスミエロー
マP3×63Ag8U.1（P3U1）（ATCC CRL−1597）をMEMで洗
浄し、脾細胞とP3U1を10:1で混合したのち遠心分離して
得たペレットに50％ポリエチレングリコール（PEG）100
0含有MEM溶液1mlを徐々に加えて、細胞融合を行った。
さらに、MEM溶液を加えて10mlとし、遠心分離して得た
ペレットを10％ウシ胎児血清（FCS）含有RPMI1640培地
にP3U1として３×104cell/0.1mlとなるように懸濁さ
せ、96ウエルマイクロプレートに各ウエル0.1mlずつ分
注した。１日後、HAT培地を0.1ml添加し、その後３〜４
日ごとに培地の半分量を新しいHAT培地で交換し、ハイ
ブリドーマの生育が認められたウエル（1152株）の上清
100μｌを分取し、PBS200μｌで希釈した。あらかじめH
SAでコートした96ウエルマイクロプレートおよびＤ型VM
A−HSA（10μg/ml）でコートした96ウエルマイクロプレ
ートに上記の希釈した培養上清液をそれぞれ50μｇずつ
添加した。アビジンＤ−酵素結合体として、アビジンＤ
−ペルオキシダーゼ（ベクター社製）、基質および発色
剤として過酸化水素および４−アミノアンチピリン／フ
ェノールを用いたELISA法によりＤ型VMA−HSAと反応
し、HSAと反応しない抗体を産生するハイブリドーマ25
株（1152株中）を選択した（１次スクリーニング）。次
にＤ型VMA−HSA（0.1μg/ml）を１ウエルあたりで50μ
ｌ加えてコートしたプレートに、前述で選択したハイブ
リドーマの培養上清25μｌとDL−VMAの希釈液（160、3
2、6.4、1.28、0.256、0.05、０（μgDL−VMA/ml））を
それぞれ25μｌ加えた。室温下、１時間保持した後、発
色剤としてＯ−フェニレンジアミンを使う他は前述のEL
ISA法の場合と同じ試薬を用いて、競合法による酵素免
疫測定法を行った。
DL−VMA ０μg/mlでの吸光度と、各濃度の吸光度の差
を調べ、低濃度において吸光度の差が大きいモノクロー
ナル抗体を産生する４種のハイブリドーマ（V901株、V9
11株、V912株、V914株）を選別した（２次スクリーニン
グ）。
次に限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを
行った。クローニング後、細胞（ハイブリドーマ）を培
養して細胞数を増やし、あらかじめプリスタンを腹腔内
に投与して１ケ月位たったマウスの腹腔内へ一匹あたり
３×106細胞を投与した。
２週間後マウス１匹あたり約20mlの腹水を採取した。
腹水約40ml（２匹分）と同量のPBSを加えて希釈した
後、飽和硫安を加え、50％硫安飽和条件下にて沈殿する
画分を遠心分離した。この沈殿画分に約10mlの0.1モル
トリス−塩酸緩衝液（pH7.2）に加えて溶解させ、これ
を同緩衝液に対して２日間透析した。
次に、抗体溶液をDE52（ワットマン社製）を充填したカ
ラム（22mm×65cm）に添加し、素通り画分を集め、次に
この素通り画分をウルトロゲルAcA44（IBF社製）を充填
したカラム（22mm×65cm）に添加しゲル濾過することに
より、約600mgの精製抗体を得た。
２次スクリーニングによって選別した４株のハイブリド
ーマにより得られた抗Ｄ型VMA抗体の免疫学的性質を以
下に示す。
特異的親和性： いずれの抗体もＤ型VMAに対して特異的に反応するもの
であった。
交差性： Ｄ型VMAに対する結合性を100％とした時、他のカテコー
ルアミン酸性代謝物に対する抗体の交差性を調べた結果
を第１表に示す。
なお、交差性は、各カテコールアミン酸性代謝物につい
てそれぞれ標準曲線を描き、50％阻害時（点）における
各カテコールアミン酸性代謝物の濃度比を比較する方法
により求めた。
サブクラス・タイプ： 得られた抗体のサブクラスはIgG2a/κ（１株）とIgG1/
κ（３株）であった。
このようにして得たモノクローナル抗体液5ml（濃度10m
g/ml）を、0.1モル酢酸緩衝液（pH3.9）に対して透析し
た。透析して得たモノクローナル抗体液に5mlの酵素液
〔ペプシン2mg、塩化ナトリウム8.7mgを0.1モル酢酸緩
衝液（pH3.9）に溶解させたもの〕を加え、37℃で一晩
反応させた。反応液を0.1Mホウ酸緩衝液（pH8.0）に対
して透析後、ウルトロゲルAcA44を用いてゲル濾過し、
Ｆ（ab′）２画分を集めた。得られたＦ（ab′）２画分
溶液を4mg/mlとなるようにセントリーフロー（アミコン
社）を用いて濃縮した後、0.1モルりん酸緩衝液（pH6.
0）に対して透析した。次に２−メルカプトエチルアミ
ン11mgを5mMのEDTAを含む0.1Mりん酸緩衝液（pH6.0）に
溶解させ、この溶液100μｌをＦ（ab′）２液1mlに加え
て37℃で90分間反応させた。反応後、反応液をセファデ
ックスG25でゲル濾過し、素通りのたんぱく質画分を集
め、セントリーフローを用いて1mlまで濃縮し、抗Ｄ型V
MAモノクローナル抗体のFab′溶液を得た。
次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRPO:東
洋紡績（株）製）4mgを0.6mlの0.1モルりん酸緩衝液（p
H7.0）に溶解させた。Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート（EMCS）1.5mgに対し、N,N−ジメチルホルムアミド
（DMF）を加え、15.4mg/mlとなるように溶解させた。こ
の溶液60μｌと、先に調整したHRPO溶液とを混合し、室
温で２時間反応させた。次に、反応液をセファデックス
G25カラム（１×45cm）でゲル濾過を行い、溶出液の403
nmにおける吸収を測定し、HRPOに相当する素通り画分を
集めセントリーフローを用いて1mlまで濃縮してマレイ
ミド基を導入したHRPO溶液を得た。
上記のFab′溶液1mlとマレイミド基を導入したHBRPO溶
液1mlを混合し、４℃で一晩反応させた。次に反応液全
量をウルトロゲルAcA44カラム（1.5×45cm）を用いてゲ
ル濾過を行い、溶出液の280nmと403nmの吸収を測定し、
HRPOとFab′がほぼ1:1に結合していると推定される画分
を集めた。得られた画分をPBSに対して透析後、セント
リーフローで濃縮し、ペルオキシダーゼ標識化抗Ｄ型VM
A抗体溶液とした。
固相化抗原プレートの調製 で調製したDL−VMA−HSA複合体50μｇを5mlのPBSに溶
解して抗原液とし、これを96ウエルマイクロプレートに
１ウエルあたり50μｌ加え、室温に１時間放置して吸着
させた。残余の抗原液を除去したのち、各ウエルを３回
PBSで洗浄した。次に、ウエルの抗原未吸着部分をブロ
ックするため３％のゼラチンを含むPBSを１ウエルあた
り300μｌ加えて室温に１時間放置し、残余のゼラチン
含有PBSを除去後、減圧乾燥を行い、固相化抗原プレー
トとした。
Ｄ型VMAおよびＬ型VMAの調製 下記の移動相に溶解させたDL−VMA溶液（0.2〜2mg/ml:
シグマ社製）を光学分割クロマトグラフィー用充填カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法を用
いてＤ型VMAとＬ型VMAに分離した。HPLCの分離条件は以
下のとおりである。
・Ｄ型VMA、Ｌ型VMAの分離条件： カラム TSK gel Enantio L1（4.6mm×25cm:東ソー（株）製） 移動相 0.5mM硫酸銅水溶液 流 速 0.5〜1ml/分 検 出 254nm 分取したＤ型VMA画分およびＬ型VMA画分についてそれぞ
れ単一の吸収ピークが得られることを上述と同様のHPLC
法で確認した。
このようにして得られたＤ型VMA画分およびＬ型VMA画分
中のVMAは銅イオンとの錯体を形成しているため、それ
ぞれの画分0.7mlに対して2.6％塩酸溶液0.5mlを加えて
錯体を破壊した。次に、酢酸エチル3mlを加え、さらに
塩化ナトリウムを飽和状態になるまで加え、10分間振盪
後、それぞれのVMAを含有する酢酸エチル層を分取し、
窒素ガスで溶媒を留去し、得られた残渣をPBS300μｌに
溶解させてＤ型VMA溶液またはＬ型VMA溶液とした。
Ｄ型VMAの確認は、DL−VMAからArmstrongらの方法（Bio
chem.Biophys.Acta.,25,442（1957））により得られた
Ｄ型VMA溶液を上述のHPLC法に供し、保持時間を比較す
ることにより行った。
試料の測定 上述のＤ型VMA溶液またはＬ型VMA溶液50μｌおよびペル
オキシダーゼ標識抗Ｄ型VMA抗体溶液50μｌを各ウエル
に加え、室温で１時間静置反応させた。
上記反応後、各ウエルの液を捨て、0.9％食塩水を用い
て各ウエルを洗浄した。
上記洗浄後、基質液（1mMH2O2と0.25M TMBZを含有）10
0μｌを加えて25分間静置した。反応停止液（2N硫酸溶
液）100μｌを加え、450nmにおける吸光度を96穴マイク
ロプレートリーダーMPR−A4（東ソー（株）製）を用い
て測定した。
測定後、標準物質として既知濃度のDL−VMAを用いて作
成した検量曲線（第１図）から上記の吸光度に対応する
VMA量を求めた。
また、同様の試料をHPLC法により測定した。HPLC法の測
定条件は下記のとおりである。
・測定条件： カラム RP−18T（４×450mm:IRICA社製） 移動相 リン酸緩衝液（pH3.0、1.36Mアセトン、0.013mMEDTA含
有） 検 出 電気化学的検出器Σ−875（電圧850mV:IRICA社製） 流 速 0.8ml/分 測定結果を第２表に示す。
第２表から明らかなように、本発明方法はＤ型VMAを特
異的に測定できるのに対し、使用した標識化抗体がＬ型
VMAとはほとんど反応しないため、Ｌ型VMAを測定できな
いことが明確となった。
実施例２ Ｄ型VMA溶液を用いた検量曲線の作成 標準物質として既知の濃度のＤ型VMA溶液を用いて実施
例１と同様に反応させて検量曲線を作成した。
尿検体の測定 PBSで10倍に希釈した尿検体（Ａ、Ｂ、Ｃ）を試料とし
て実施例１に記載した方法で尿検体中のＤ型VMAを測定
した。450nmにおける吸光度もとにDL−VMAを用いて作成
した実施例１の検量曲線（第１図）およびＤ型VMAを用
いて作成した上記検量曲線の２つの検量線からそれぞれ
のVMAの濃度を求めた。
また、実施例１に記載したHPLC法により上記尿検体のVM
A濃度を求めた。なおHPLC法の場合もDL−VMAとＤ型VMA
の２つの標準物質を使用して検体中のVMA濃度を算出し
た。
検体の測定結果を第３表に示す。
HPLC法ではＤ型とＬ型を区別できないので、標準物質と
してＤ型VMAおよびDL−VMAを用いてもほぼ同等の値を与
える。これに対して、本発明方法はＤ型VMAに特異的な
抗体を使用しているためにDL−VMAを標準物質として用
いた時には標準物質中の全VMAの半分量（Ｄ型VMAの含有
量）と反応する。したがって、DL−VMAを標準物質とし
て作成した検量曲線を用いて尿検体中のVMAの濃度を求
めると現実に存在するＤ型VMAの２倍の値が得られる。
このため、標識化抗体として標識化抗Ｄ型VMA抗体およ
び標準物質としてDL−VMAを使用する本発明において
は、測定により得られた値を半分にすることにより検体
中の真のＤ型VMAの値を求めることができる。
次に、コンピューターを用いてDL−VMAを用いて作成し
た検量曲線（第１図）の解析を行い、本発明方法により
得られる検体の吸光度（ｙ）と検体中のＤ型VMAの濃度
（ｘ）との間には下記の関係式が成立することを見出し
た。このため、検出曲線を作製しなくとも下記式より直
接的にＤ型VMAの濃度を求めることもできる。なお、下
記式の係数（ａ〜ｄ）は今回の測定系における係数であ
り、常に一定でないことは明らかである。
ａ＝1.478 ｂ＝0.9144 ｃ＝0.3631 ｄ＝0.02398 産業上の利用可能性 本発明方法は、Ｄ型VMAを特異的に測定できるため、神
経芽細胞腫のマススクリーニングに適用することができ
る。
また、本発明の抗体試薬は、Ｌ型VMAと交差性が１％以
下であるため、標準物質および固相化VMA試薬を調製す
るためのVMAとしてVMAのラセミ混合物を使用することが
できる。
さらに、上記抗体試薬を含む本発明の測定キットは本発
明方法を実施するのに最適の測定用キットである。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生体試料中のＤ型バニリルマンデル酸（Ｄ
    型VMA）を下記の（Ａ）〜（Ｄ）工程により測定する方
    法において、検量曲線を作成するための標準物質として
    Ｄ型バニリルマンデル酸とＬ型バニリルマンデル酸の等
    量混合物（ラセミ混合物）を使用し、標識化抗バニリル
    マンデル酸抗体として標識化抗Ｄ型バニリルマンデル酸
    抗体を使用し、下記（Ｄ）工程において得られた値から
    生体試料中に含まれるＤ型バニリルマンデル酸の濃度を
    算出することを特徴とする生体試料中のＤ型バニリルマ
    ンデル酸の測定法： （Ａ） 固相にバニリルマンデル酸を結合させて得た固
    相化バニリルマンデル酸と標識化抗バニリルマンデル酸
    抗体を用い、生体試料中のバニリルマンデン酸と固相化
    バニリルマンデル酸とを標識化抗バニリルマンデル酸抗
    体に対して競合反応させる工程； （Ｂ） 液相部と固相部とを分離し、固相部を必要によ
    り洗浄する工程； （Ｃ） 固相化バニリルマンデル酸に結合した標識化抗
    バニリルマンデル酸抗体の標識量またはそれ以外の標識
    量を測定する工程；および （Ｄ） 生体試料の代わりに既知の濃度のバニリルマン
    デル酸（標準物質）を使用する以外は上記（Ａ）〜
    （Ｃ）工程と同様の方法を実施することにより得られる
    標識量とバニリルマンデル酸濃度との関係を示す曲線
    （検量曲線）を作成するか、あるいは関係式を求め、該
    検量曲線または該関係式から上記（Ｃ）工程で得られた
    標識量に対応するバニリルマンデル酸の濃度を算出し、
    該濃度を生体試料中に含まれるバニリルマンデル酸の濃
    度とする工程。
  2. 【請求項２】抗Ｄ型VMA抗体が下記の〜の特性を有
    するものである、請求項１記載の測定法： 親和性 Ｄ型VMAに対して特異的に反応する； 交差性 Ｄ型VMAへの反応性を100％とした場合のＬ型VMAへの反
    応性は１％以下である；および クラス IgGに属する。
  3. 【請求項３】固相化VMAがVNAのラセミ混合物を固相に結
    合したものである、請求項１または２記載の測定法。
  4. 【請求項４】請求項１記載の測定法で使用する下記の
    〜の特性を有する抗Ｄ型VMA抗体試薬： 親和性 Ｄ型VMAに対して特異的に反応する； 交差性 Ｄ型VMAへの反応性を100％とした場合のＬ型VMAへの反
    応性は１％以下である；および クラス IgGに属する。
  5. 【請求項５】請求項１記載の測定法を実施するための、
    下記のおよびの試薬から構成されるＤ型VMA測定用
    キット： 下記のＡ〜Ｃの特性を有する標識化抗Ｄ型VMA抗体
    試薬： Ａ 親和性 Ｄ型VMAに特異的に反応する； Ｂ 交差性 Ｄ型VMAへの反応性を100％とした場合のＬ型VMAへの反
    応性は１％以下である；および Ｃ クラス IgGに属する； および 固相化VMA試薬。
  6. 【請求項６】固相化VMA試薬がVMAのラセミ混合物を固相
    に結合させたものである、請求項５記載の測定用キッ
    ト。
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