JPH0783713B2 - 酵素の溶解法 - Google Patents

酵素の溶解法

Info

Publication number
JPH0783713B2
JPH0783713B2 JP61116325A JP11632586A JPH0783713B2 JP H0783713 B2 JPH0783713 B2 JP H0783713B2 JP 61116325 A JP61116325 A JP 61116325A JP 11632586 A JP11632586 A JP 11632586A JP H0783713 B2 JPH0783713 B2 JP H0783713B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
salt
amine
enzyme
isomerase
resin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP61116325A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS626680A (ja
Inventor
イー ロイド ノーマン
エル アントリム リチヤード
エイ ジヨンソン リチヤード
Original Assignee
スタブラ アーゲー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by スタブラ アーゲー filed Critical スタブラ アーゲー
Publication of JPS626680A publication Critical patent/JPS626680A/ja
Publication of JPH0783713B2 publication Critical patent/JPH0783713B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は水性グルコースイソメラーゼの精製法に関し、
特に該溶液をアミンで処理して該酵素を含有する不溶性
錯体をつくり、そこからのグルコースイソメラーゼの再
可溶化法に関する。
グルコースイソメラーゼはグルコースをフラクトースに
変換する酵素である。種々の微生物がグルコースイソメ
ラーゼを生産することが知られている。たとえばアクチ
ノプランス（Actinoplanes）、エアロバクター（Aeroba
cter）、アンプラリエラ（Ampullariella）、アースロ
パクター（Arthrobacter）、パシルス（Bacillus）、ラ
クトパシルス（Lactobacillus）及びストレプトマイセ
ス（Streptomyces）属の微生物がグラコースイソメラー
ゼを生産する。一般にグルコースイソメラーゼは主に細
胞内で主に生産され、従つてイソラーゼの要部は微生物
の細胞壁内及び又はその上に見出される。それ故、可溶
性酵素をつくるには微生物細胞から酵素を抽出する必要
がある。抽出操作は少なくとも一部の細胞外皮の破壊を
もたらし、酵素その他の細胞質物質が微生物酵素抽出液
中に拡散する。それ故酵素抽出液は可溶及び不溶の両不
純物を含む。不溶性不純物は、過や遠心分離といつた
公知の方法で容易に分離しうる。しかし、たとえば核
酸、非酵素性蛋白又は細胞壁成物、たとえばポリ尿酸
等、のような生物学的オリゴマーと考えられる可溶性不
純物は、それらがしばしば目的物に類似した化学的又は
物理的性質を有するが故に、除去が困難で且つ高価につ
く。
微生物的酵素抽出物から望ましくない可溶性物質を除去
又は分離する方法は知られている。最近それら方法の要
約が、「メソツト イン エンザイモロジー」（Method
s in Enzymology）、Vol.XXII,273〜287頁及び476〜556
頁（ニユーヨーク、Academic Prees社、W.E.Jakoby著）
に紹介されている。溶解度に基づく分離、特異的親和性
に基づく分離、クロマトグラフイーによる分離等の種々
の方法が述べられている。
酵素の精製については多くの特許もある。米国特許第3,
769,168号（増田）はベータアミラーゼの精製法として
該酵素を吸着、洗浄、イオン性溶液を用いて溶離する方
法を開示している。米国特許第3,912,595号（Philipp
等）は加水分解酵素の精製法として、カラム中の粒状支
持体に酵素を可逆的に錯体化してからバツフアーでの溶
離によつて回収する方法を開示している。米国特許第3,
972,777号（山田等）はβ−ガラクトシダーゼの精製法
として酸カチオン交換樹脂に選択吸着してからバツフア
ーで溶離する方法を開示している。これらの方法はいづ
れも不純な酵素溶液を酵素を吸着又は結合するマトリツ
クスと接触させ、次いでイオン性溶液を添加してマトリ
ツクスから精製酵素を溶離するものである。
米国特許第4,347,322号（Johnson等）はクロマトグラフ
的な酵素精製法として可溶性不純物をイオン交換樹脂に
より優先的に吸着する方法を開示している。米国特許第
4,106,992号（Vairel等）はDEAE−セルロース樹脂を用
いる除外クロマトグラフイーによるウロキナーゼの精製
法を開示している。この方法は特にウロキナーゼからの
発熱性物質の除去を対象としている。
いくつかの特許が微生物的酵素抽出物の沈澱による精製
法を開示している。米国特許第3,728,244号（Borglum）
は４級アンモニウム化合物による不純物の沈澱を開示し
ている。米国特許第4.055,469号（Snoke等）は合成高分
子電解質を用いる不純物の沈澱を開示している。英国特
許第1,411,503号（Morisi等）はカチオン界面活性剤に
よる不純物の精製を開示している。これらの特許はいづ
れも活性酵素を溶液中に残存させながら不純物を沈澱し
除去するものである。
少なくとも１つの長鎖炭化水素Ｎ−置換基を持つ４級ア
ンモニウム化合物は溶液中に凝集体又はミセルをつくり
うる界面活性電解質である。これらの化合物は親水性４
級アミノ基と疏水性炭化水素鎖を持つている。多くの４
級アンモニウム化合物はそれらの微生物を不活性化又は
阻害する能力に基づく抗菌剤として広く用いられてい
る。この性質は陽性に荷電した４級アミンと陰性に荷電
した微生物表面間でのアニオン−カチオン錯体の形成に
基づいていると考えられる。
４級アンモニウム化合物はまた蛋白質等の種々の陰性に
荷電した高分子と不溶性アニオン−カチオン錯体をつく
る。沈澱、不活性化、変性、再分散及び錯体形成はいづ
れも蛋白と４級アンモニウム化合物の相互作用に基づく
とされている。
ある種のアミン化合物がグルコースイソメラーゼ精製法
で用いうることが以外にも見出された。かかる化合物は
1985年９月30日発行のベルギー特許第902,048号に開示
されている。
本発明方法で用いうる３級及び４級アミン化合物は次式
で示される： ここでR1は炭素原子少なくとも６個を持つヒドロカルビ
ル基であり、 R2は炭素原子約８〜20個を持つヒドロカルビル基であ
り、 R3は低級アルキル基であり、 R4は水素又は低級アルキル基である。
上記において好ましいヒドロカルビル基はアルキル、シ
クロアルキル、アルケン、アリール及びアラルキルであ
り、これらはクロロ、ブロモの如きハロゲン、ヒドロキ
シ、アルコキシ、その他の基で置換されていてもよい。
またヒドロカルビル基はエーテルやチオエーテル結合に
おけるように酵素又は硫黄原子が介在する炭化水素基、
たとえばジイソブチルフエノキシエトキシエチル基、ジ
イソブチルクレゾキシエトキシエチル基等、も含むもの
である。
Ｘは適宜の無機又は有機アニオンであり、たとえばハラ
イド、硝酸塩、硫酸塩、ベンゾスルホネート、酢酸塩等
がある。このアニオンは酵素に不活性である。
本発明で用いうる上記式で示されるアミン基の例には、
ジメチルベンジルドデシルアンモニウム、ステアリルジ
メチルベンジルアンモニウム、ジステアリルジメチルア
ンモニウム、ジエチルジオクタデシルアンモニウム、ジ
メチルジドデシルアンモニウム、ジメチルドデシルナフ
チルメチルアンモニウム、ジメチルヘキサデシルジクロ
ロベンジルアンモニウム、ジメチルジイソブチルフエノ
キシエチルベンジルアンモニウム塩等がある。
一旦不溶性アミン−イソメラーゼ錯体が形成されると、
該錯体は過、遠心分離等の通常の手段で分離しうる。
粗製抽出物から錯体を除去して後、イソメラーゼを再溶
解する。ベルギー特許第902,048号記載の有用な方法は
イオン化した塩溶液を添加を含む。一旦酵素が溶解する
と塩とアミン化合物が除かれる。
再可溶化混合物にカチオン交換樹脂を含めることにより
アミン化合物が効果的に該樹脂に移行するだけでなく再
可溶化に必要なイオン性塩溶液の濃度を大巾に減少させ
うるという意外な事実を見出した。
本発明は不溶性グルコースイソメラーゼ−アミン錯体の
可溶化法を提供するものである。この可溶化は可溶化混
合物にカチオン交換樹脂を加えることによつて達成され
る。
本発明は不溶性グルコースイソメラーゼ−アミン錯体を
カチオン交換樹脂を含有する水性媒体中で反応させるこ
とによる該錯体からのグルコースイソメラーゼの可溶化
法を提供するものである。
本発明によれば、上記のアミン化合物の少なくとも１つ
を、精製すべきグルコースイソメラーゼ水性抽出物に、
該アミンがグルコースイソメラーゼと反応して沈澱する
不溶性イソメラーゼ−アミン錯体を生成する条件下に加
える。次いで不溶性イソメラーゼ−アミン錯体を過、
遠心分離等の通常の手段で分離する。この沈澱物から酵
素を除くために、イソメラーゼ−アミン錯体をカチオン
交換樹脂を含有するイオン化した塩溶液に加え、該錯体
を解離しイソメラーゼを再溶解させる。アミン化合物は
該樹脂に移行し、酵素溶液から過、遠心分離等によつ
て分離して高い比活性（たとえば蛋白mg当りの活性）を
持つ精製され、濃厚化したグルコースイソメラーゼ調合
物が得られる。
沈澱した酵素−アミン錯体の再溶解に要するイオン化し
た塩と樹脂の量は適宜の電解質の異なる濃度、即ちイオ
ン強度、の溶液を使う簡単な試験法で容易に決めること
ができる。電解質としては経済性及び入手容易性から塩
化ナトリウムが好ましい。グルコースイソメラーゼに対
して悪影響を及ぼすものでない限り種々の電解質を用い
うる。好ましい塩にはNa2SO4、KCl、K2SO4、KNO3、NaNO
3、NH4Cl、(NH4)2SO4、マグネシウム塩、マンガン塩、
コバルト塩、酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、ピリ
ジニウムクロライド、１価のアニオン及びカチオンの塩
等がある。塩の必要量は沈澱を溶解するに要する最小濃
度として決定しうる。塩化ナトリウムは酵素に対し特別
の効果を持つとは思えずまた沈澱の溶解を完全に行なう
べく濃度溶液で用いうるが、低い塩濃度での使用が好ま
しくそれでも酵素の効率的な可溶化が行なえる。可溶化
した酵素をDEAE−セルロースへ吸着させるときのように
固定化酵素系に用いる場合にはこのことは確かである。
事実、下記するように、塩の非存在下においてさえ（即
ち沈澱のを樹脂だけと接触させることにより）、ある程
度の再溶解は行なわれる。それ故、沈澱と樹脂との接触
を繰り返すことにより添加塩が存在しなくともイソメラ
ーゼの可溶化を行なうことは可能である。
本発明では種々のイオン交換樹脂を用いうる。好ましい
樹脂には、ポリスチレンスルホン酸樹脂、たとえばDowe
x AG 50W;Duolite C20;Amberlite IR−116、IR−118、I
R−120;Amberlite IRN−77;Ionac C−298;Ionac C−24
9;Zeocarb 225;Dianion SK 102、SK 103、SK 104、SK 1
06;Lewatit PN;Lewatit S−100;Imac C−22、Ｃ−12;Ka
stil C−300;Wofatit KPS−200;Allassion−CS;及びKat
ionite KO−2;微孔性ポリスチレン樹脂、たとえばDowex
MPC−1;Duolite C−25D、ES−26;Amberlite 200;Imac
C−169;及びLewtit 5−115;フエノール系樹脂、たとえ
ば微孔性Duolite C−3;Kationite KO 1;Lewatit KSN;Wo
fatit F;及びZeocarb 215;カチオン性セルロース系樹
脂、たとえばCyclase−SE;及びデキストラン樹脂、たと
えばSP Sephadex（スルホプロピルフアデツクス）等が
ある。これらの樹脂はそれぞれ次のところで入手しう
る。
Allassion …フランス、ダイア−プロシム、 ビトリー−サー−セーヌ Amberlite …フイラデルフイア、ローム＆ハース Anionitte …ソ連 De−Acidite …ロンドン、パームチツト社 Diaion …東京、三菱 Duolite …CA、レツトウツドシテイ、ダイアモンド
シヤムロツク Imac …アムステルダム、インダストリール−ナ
ーツシヤツピ Ionac …NJ、バーミンガム、イオナツク ケミカ
ル社 Kastel …ミラノ、モンテカチニ Kationite …ソ連 Lewatit …西独、バイエル Wofatit …東独、ウオヘン ダイ フアクトリー Zeo−Karb …ロンドン、パームチツト社 Dowex …MI、ミドランド、ダウケミカル社 Cyclose …ロスアンジエルス、シクロケミカル社 Sephadex …アプサラ、フアルマシア 特に好ましい樹脂は AG 50−Ｗ−X4（カリホルニア、リ
ツチモンド、バイオーラツド ラボ）である。用いる樹
脂量は樹脂濃度を種々変えた簡単な試験法で決定しう
る。
ある場合には、酵素を回収すべき水性酵素溶液は目的と
する酵素を沈澱する前に、加えたアミン化合物で沈澱を
形成する不純物を含有しうる。この場合には、アミン添
加は数段階、通常２段階に行なうべきであり、最初の段
階で不純物を沈澱して、第２段階での酵素の最終的な沈
澱の前にこれを除く。最初の段階で必要なアミンの量
は、元の酵素溶液を分割して段階的な量のアミン化合物
を加えるという簡単な方法で決定しうる。各添加で形成
した沈澱について既に検知された酵素活性を試験する。
この酵素活性は最初の段階の沈澱に必要な沈澱剤の量を
示している。
本発明の実施において、上記一般式で、R2が炭素原子約
８〜約18個を持つアルキル基であり、R1が炭素原子約６
〜約10個を持つ基であり、R3とR4が低級アルキル基であ
り、Ｘがハロゲンアニオンである４級アミンを用ること
が好ましい。より好ましい化合物は、R2が炭素原子12〜
18個を持つアルキル基であり、R1が炭素原子７〜10個を
持つアラルキル基であり、R3とR4が低級アルキル基であ
り、Ｘがハロゲンであるものである。
最も好ましい化合物は次式で示されうる： ここでｎは12、14又は16でありＸはハロゲンである。こ
れらの化合物を含む製品はニユージヤージー州ジヤージ
ーシテイのオニツクスケミカル社からRTC−835の名で市
販されている。BTC−835は上記式においてｎが14の化合
物50％、上記式においてｎが12の化合物40％及び上記式
においてｎが16の化合物10％からなる混合物である。ま
たMaquat 1412の名で市販されている化合物（イリノイ
州シカゴ、メーソンケミカル社製、ｎ−アルキルジメチ
ルベンジルアンモニウムクロライド50％）も特に有用で
ある。
本発明を行なう条件はイソメラーゼ抽出物の純度、濃度
及び用いるアミン化合物によつて異なる。用いるアミン
の量は活性酵素の実質上すべてを沈澱するに十分な量で
あるべきであり、通常、重量／容量基準で、少なくとも
100ppmである。好ましい量は少なくとも約500ppm、通常
約500ppm〜約5,000ppmである。最も好ましくは約1,000p
pm〜約3,000ppmである。
pHは酵素の等電点（pI）より上約1pH単位と用いるアミ
ン化合物のpKaより下約1pH単位の間にあるべきである。
好ましいpHは約5.5〜約8.5、理想的には約6.0〜約8.0、
最も好ましくは約7.0〜約7.4である。
温度は０℃といつた低温から酵素の熱変性又は不活性化
が起るより低い温度という広範囲で変えうる。通常は周
囲温度で十分である。
本発明方法の機構は完全には判つていない。しかし、ア
ミンがグルコースイソメラーゼと反応して不溶性イソメ
ラーゼ−アミン錯体をつくることは確かと思われる。不
溶性イソミラーゼ−アミン錯体をカチオン交換樹脂を含
む十分にイオン化した溶液に加えることにより、アミン
が樹脂に移行しイソミラーゼを再度可溶化する。
本発明方法で出発物質として用いるグルコースイソメラ
ーゼ抽出物をつくる方法は公知である。たとえば、グル
コースイソメラーゼを生産することが知られている種の
微生物を培養し、培養液から酵素を抽出し公知の方法で
不溶性物質を除くことによつてグルコースイソメラーゼ
を含む酵素抽出物を得ることができる。
好ましいグルコースイソメラーゼ抽出物は、アクチノブ
ランス、アンブラリエラ、エアロバクター、アースバク
ター、バシルス、ミクロモノスポラ（Micromonospor
a）、ミクロビスポラ（Microbispora）、ミクロエロボ
スポラ（Microellobospora）、ノルカルデイア（Norcar
dia）又はストレプトマイセス属の微生物から得ること
ができる。グルコースイソメラーゼ抽出物はより代表的
には、ストレプトマイセス ルビゲノサス（Streptomyc
es rubigenosus）、ストレプトマイセス オリボクロモ
ゲネス（Streptomyces olivochromogenes）、バシルス
コアギユランス（Bacillus coagulans）又はバシルス
ステアロサーモフイラス（Bacillus stearothermophi
lus）種の微生物から得られる。
分析法 全蛋白 全蛋白は280mμの波長でベツクマンモデルDK−2A分光光
度計を用いて測定した。
イソメラーゼ活性−IGIU IGIUは国際グルコースイソメラーゼ単位の略号であり、
最初グルコースを１モル/l、MgSO4を0.02モル/l、CoCl2
を0.001モル/l含む溶液中で、pH6.84〜6.85（0.2Mマレ
イン酸ナトリウム、室温で測定したpH）、温度60℃で、
グルコース１マイクロモルを分当りクラクトースに変換
する酵素の量である。グクコースイソメラーゼの決定は
N.E.Lloyd等著、Cereal Chem.,49,No.5、544〜553頁（1
972）に記載の方法で行なつた。
次の例は本発明を例証するためのものである。
例 Ｉ この例は４級のアミン−イソメラーゼ錯体の可溶化に対
するカチオン交換樹脂の効果を示す。
42.2IGIU/mlのイソメラーゼ活性を持つストレプトマイ
セス種の細胞のない（セルフリー）抽出物の5lパツチを
pH7.2に調節した。この攪拌した抽出物にMaquat MC1412
−50％（ｎ−アルキルジメチルベンジルアンモニウムク
ロライド、イリノイ州シカゴ、メーソンケミカル カン
パニー）10gとHyflo Supercel（カリホルニア州ロムポ
ツク、ジヨーンズ−マンスビル）25gを加えた。この懸
濁物を30分攪拌し、実験室バキユームで過した。フイ
ルターケーキを200mlの水で洗い、約５分吸引して過剰
の湿分を除いた。
フイルターケーキ71.46gを混合しその10.0gを種々の濃
度の塩溶液（150ml）に懸濁した。20分攪拌後、各懸濁
部を過した。液の可溶性イソメラーゼ活性を分析し
た。
結果は次のとおりである。
0.5M以下の塩濃度においてはごくわずかの活性分が可溶
化しただけである。
酵素可溶化に対するカチオン交換樹脂の効果をしらべる
ために、AG50−Ｗ−X4樹脂（カリホルニア州、リツチモ
ンド、バイオーラツドラボラトリーズ）の1.5g（d.b.）
部分を最初の懸濁物のそれぞれに加え、60分攪拌した。
次に各懸濁物試料を遠心分離し上澄液の可溶性イソメラ
ーゼ活性を分析した。
結果は次のとおりである。
塩が存在しない場合には、出発活性の28.1％が可溶化し
た。最低塩濃度、0.05M、において、80％の活性が、15
7.4IGIU/mlの力価即ち出発酵素抽出物のほぼ４倍の力価
をもつ可溶性酵素として回収された。従つて、カチオン
交換樹脂はイソメラーゼの可溶化を大幅に促進すること
が判る。これは多分、アミン−イソメラーゼ錯体から４
級アミンを優先的に吸着することによるものと思われ
る。この場合、錯体を解離させるための高塩濃度の必要
を最小限化できる。
例 II この例は４級のアミンの優先的吸着のためにカチオン交
換樹脂を用い且つ過とアミンイソメラーゼ沈澱の洗浄
が不必要な例を示す。
例Ｉに示したイソメラーゼ抽出物の500ml部をMaquat MC
1412−50％の1.0gと混合した。このスラリーを１分攪
拌して重力で沈降させた。沈降60分後に、透明な上澄液
400mlをサイホンを用いて慎重に除き、可溶性イソミラ
ーゼ活性を分析した。このフラクシヨンは全体で460IGI
Uで、わずか1.15IGIU/mlを含んでいるだけつまり出発活
性の約２％だつた。
沈澱を含む残りのスラリー（約100ml）を水250mlで稀釈
し、約１分攪拌して沈降させた。沈降用に放置60分後、
透明上澄液260ml全量をサイホンで除いた。このフラク
シヨンは100IGIUより低いイソメラーゼ活性を含んでい
た。
沈澱を含むスラリー（約90ml）に、水90ml、0.5M NaCl
20ml（0.05M NaClをつくるため）及びAG 50−Ｗ−X4樹
脂1.4g d.b.を加えた。得られたスラリーを等分割して
１又は２時間のいづれかの時間攪拌した。次にこれらス
ラリーを過し、液の可溶性イソメラーゼ活性を分析
した。１時間及び２時間液の活性の全回収は20,370IG
IU又は出発活性の96.5％、平均力価77.2IGIU/mlだつ
た。１時間と２時間の可溶化処理時間には大きな差はな
かつた。
可溶化した酵素はDEAE−セルロースに1970IGIU/gのレベ
ルで吸着した。出発抽出物では970IGIU/gのレベルであ
る。
例 III この例は再溶解用のアミン−イソメラーゼ沈澱を集める
ために遠心分離を用い最小容量で濃縮した酵素抽出物を
つくる例を示す。
酵素抽出物を1000ml部を、前記２例に示すように、Maqu
atで処理した。沈澱を２時間放置して透明な上澄液800m
lを傾斜によつて除いた。スラリーの残り20mlを250mlの
遠心分離容器に移し、GSA回転機を具備するSorval RC−
2B遠心分離機を用いて8000rpmで簡潔に遠心処理した。
上澄液を傾斜し棄てた。沈澱、7.66gf.b.、を0.05M NaC
l 80mlに再懸濁し、AG 50樹脂2.0gを加えた。懸濁液を
１時間攪拌し、過した。液は436IGIU/mlの力価にお
いて全体で37,930IGIUの活性を含んでいた。それ故、回
収率は出発活性（サンプリングロス修正済）の92.4％で
あり、最初の抽出物に比し酵素濃度は10倍以上増加し
た。可溶化した酵素はまたDEAE−セルロースに2070IGIU
/gのレベルで吸着できた。出発抽出物では971IGIU/gの
レベルだつた。
例 IV この例は４級アミン−イソメラーゼ錯体の再溶解に対す
る異なるカチオン交換樹脂の効果を示すものである。
ストレプトマイセスのセルフリー抽出物（イソメラーゼ
活性35.7IGIU/ml）の４分割した各1000ml部のpHを7.2に
調節した。各部にMaquat MC 1412−50％の2gを加え、生
成スラリーを室温で20分攪拌した。沈澱を２時間放置し
て重力沈降させ各透明上澄液800mlを傾斜した。上澄液
は0.2IGIU/ml以下を含んでおりこれはほとんどのイソメ
ラーゼが４級アミンによつて沈澱したことを示してい
る。
各スラリーの残り200mlを例IIIと同様に遠心処理した。
上澄液を傾斜し除去した。各沈澱を0.05M NaCl 120mlに
再懸濁し、種々の樹脂2.0g d.b.を加えた。生成懸濁物
を２時間攪拌し、過した。各フイルターケーキを更な
る0.05M NaClで洗い、洗液と液と合せそれぞれの全容
量が200mlになるようにし、それぞれの試料をイソメラ
ーゼ分析と蛋白測定用に取つた。
結果を次表に示す。
Duolite C−３、フエノール性微孔性強酸性カチオン交
換樹脂（ナトリウム形）、及びSephadex SP−Ｃ−25、
架橋テキストランのスルホエチル誘導体（フアルマシア
フアイン ケミカルス社）は共に４級アミン−イソメラ
ーゼ錯体の可溶化にAG−50樹脂と同様有効であつた。

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】不溶性グルコースイソメラーゼ−アミン錯
    体をカチオン交換樹脂を含む水性媒体中で反応させるこ
    とを特徴とする不溶性グルコースイソメラーゼ−アミン
    錯体からグルコースイソメラーゼを可溶化させる方法。
  2. 【請求項２】該樹脂がポリスチレンスルホン酸樹脂、フ
    エノール−性スルホン酸樹脂又はデキストランスルホン
    酸樹脂である特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】該アミンが式 ここでR1は少なくとも６個の炭素原子を持つヒドロカル
    ビル基であり； R2は約８〜約20個の炭素原子を持つヒドロカルビル基で
    あり； R3は低級アルキルであり； R4はＨ又は低級アルキルであり； Ｘはアニオンである、 で示される化合物である特許請求の範囲第１項又は第２
    項記載の方法。
  4. 【請求項４】アミンがｎ−アルキルジメチルベンジルア
    ンモニウムクロライドである特許請求の範囲第３項記載
    の方法。
  5. 【請求項５】水性溶媒がイオン性塩を含有する特許請求
    の範囲第１項〜第４項のいづれか記載の方法。
  6. 【請求項６】イオン性塩がNaCl、Na2SO4、KCl、K2SO4、
    KNO3、NaNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、マグネシウム塩、マ
    ンガン塩、コバルト塩、酢酸塩、クエン酸塩、マレイン
    酸塩又はピリジニウムクロライドである特許請求の範囲
    第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】塩がNaClである特許請求の範囲第６項記載
    の方法。
  8. 【請求項８】不溶性酵素−アミン錯体を可溶化させる方
    法において、該錯体をカチオン交換樹脂及びイオン性塩
    を含有する水性媒体中で反応させることを特徴とする改
    良された可溶化方法。
JP61116325A 1985-05-22 1986-05-22 酵素の溶解法 Expired - Lifetime JPH0783713B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/736,921 US4663288A (en) 1985-05-22 1985-05-22 Process for purification of enzymes
US736921 1985-05-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS626680A JPS626680A (ja) 1987-01-13
JPH0783713B2 true JPH0783713B2 (ja) 1995-09-13

Family

ID=24961879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61116325A Expired - Lifetime JPH0783713B2 (ja) 1985-05-22 1986-05-22 酵素の溶解法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US4663288A (ja)
EP (1) EP0202678B1 (ja)
JP (1) JPH0783713B2 (ja)
CA (1) CA1251751A (ja)
DE (1) DE3683187D1 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0161245B1 (en) * 1983-11-07 1990-07-25 The Dow Chemical Company Low density, electromagnetic radiation absorption composition
US5169758A (en) * 1986-05-02 1992-12-08 Boehringer Mannheim Gmbh Stabilized, NAD(P)H-dependent, soluble nitrate reductase, a process for the preparation thereof and a reagent containing it
JPH0228399A (ja) * 1988-07-18 1990-01-30 Shinwa Internatl Kk 電波吸収材及びその製造方法
CA2109085C (en) * 1991-04-25 2003-03-11 Keith E. Dionne Implantable biocompatible immunoisolatory vehicle for delivery of selected therapeutic products
US20070055013A1 (en) * 2005-02-21 2007-03-08 Noriho Kamiya Substrate and method of immobilizing protein
US20150275195A1 (en) * 2012-10-24 2015-10-01 Genzyme Corporation Elution of biomolecules from multi-modal resins using mes and mops as mobile phase modifiers

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3234199A (en) * 1958-12-18 1966-02-08 Allen F Reid Ion exchange process for separating proteins
DE2001902C3 (de) * 1970-01-16 1978-10-12 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen
CA1004613A (en) * 1970-10-22 1977-02-01 William P. Cotter Extraction of glucose isomerase from cells
US3769168A (en) * 1971-06-11 1973-10-30 Hayashibara Co Process for the purification of amylases
US3728324A (en) * 1971-09-07 1973-04-17 Firestone Tire & Rubber Co Process for the polymerization of conjugated dienes
US4106992A (en) * 1971-09-24 1978-08-15 Choay S.A. Purification of urokinase
CA986441A (en) * 1971-10-22 1976-03-30 Aslam Khwaja Enzyme treatment
US3912595A (en) * 1974-02-25 1975-10-14 Us Health Method of purifying enzymes using boronic acids covalently bonded to an insoluble support
JPS5322158B2 (ja) * 1974-05-02 1978-07-06
GB1589581A (en) * 1976-04-14 1981-05-13 Biotechnolog Forschung Gmbh Process for the separation of enzymes
US4055469A (en) * 1976-12-10 1977-10-25 Eastman Kodak Company Purification of microbial enzyme extracts using synthetic polyelectrolytes
US4347322A (en) * 1981-01-12 1982-08-31 Nabisco Brands, Inc. Chromatographic process for enzyme purification
US4634673A (en) * 1984-03-28 1987-01-06 Nabisco Brands, Inc. Enzyme purification process

Also Published As

Publication number Publication date
CA1251751A (en) 1989-03-28
US4663288A (en) 1987-05-05
EP0202678A2 (en) 1986-11-26
JPS626680A (ja) 1987-01-13
EP0202678B1 (en) 1992-01-02
EP0202678A3 (en) 1988-07-06
DE3683187D1 (de) 1992-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Laver The structure of influenza viruses: 3. Disruption of the virus particle and separation of neuraminidase activity
Davies et al. Separation, purification and properties of β-lactamase I and β-lactamase II from Bacillus cereus 569/H/9
US3912588A (en) Creatine amidohydrolase in the conversion of creatinine to creatine
US2961382A (en) Urokinase-a plasmiogen activator and methods of obtaining the same
Lebherz et al. A Class I (Schiff Base) fructose diphosphate aldolase of prokaryotic origin: Purification and properties of Micrococcus aerogenes aldolase
Leser et al. Reverse micelles in protein separation: the use of silica for the back‐transfer process
Fessenden-Raden Purification and properties of a new coupling factor required for oxidative phosphorylation in silicotungstate-treated submitochondrial particles
EP0092845B1 (en) Process for purifying enzyme
JPS6348515B2 (ja)
JPH0783713B2 (ja) 酵素の溶解法
JPH05500602A (ja) 微生物学的に生成されたキモシンの回収方法
US4451487A (en) Process for the purification or enrichment of biologically active proteins
JPS6219835B2 (ja)
Agutter et al. Variability of mammalian liver nuclear-envelope preparations
Engelhard et al. Subcellular location of adenylate cyclase in rat cardiac muscle
US4634673A (en) Enzyme purification process
US4690892A (en) Process for the recycle of phase-forming liquids of multi-phase aqueous systems
Shoaf III et al. Carbonic anhydrase of microorganisms: I. An enzyme from baker's yeast which catalyzes the formation of carbamate from ammonium bicarbonate solutions
Baudhuin et al. Hepatic Nucleases: 2. Association of Polyadenylase, Alkaline Ribonuclease and Deoxyribonuclease with Rat‐Liver Mitochondria
US4610965A (en) Adsorption-desorption purification of glucose isomerase
US3623955A (en) Purification and recovery of alkaline protease using cationic-exchange resin
EP0219031A2 (en) Method for the purification of calf rennet
US4268631A (en) Apoglucose oxidase preparation
US4343902A (en) Production of immobilized glucose isomerase
Lundgren Isozyme Variations in Human Cells Grown" in vitro": VII. Subcellular Distribution of Amino Acid Naphthylamidases