JPH0787783B2 - 新規エンド−β−ガラクトシダ−ゼ及びその製造法 - Google Patents

新規エンド−β−ガラクトシダ−ゼ及びその製造法

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JPH0787783B2
JPH0787783B2 JP19529986A JP19529986A JPH0787783B2 JP H0787783 B2 JPH0787783 B2 JP H0787783B2 JP 19529986 A JP19529986 A JP 19529986A JP 19529986 A JP19529986 A JP 19529986A JP H0787783 B2 JPH0787783 B2 JP H0787783B2
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【発明の詳細な説明】 ［発明の属する技術分野］ 本発明は、新規エンド−βガラクトシダーゼ及びその製
造法に関し、更に詳しくは、Clostridium属に属するエ
ンド−β−ガラクトシダーゼ生産菌由来のエンド−β−
ガラクトシダーゼ及びその製造方法に関する。
［従来の技術とその問題点］ 近年、種々の生体細胞の機能についての解明研究の進展
に伴い、細胞表面に存在する糖蛋白質や糖脂質と細胞機
能との係りについて、医学的、薬学的重要性が増大して
いる。これらの複合糖質を構成する糖鎖構造の解明手段
としてのエンドグリコシダーゼは、安価かつ簡便な手法
として注目されている。即ち、これらの複合糖質は、癌
細胞の異常増殖や正常細胞の増殖の促進、抑制に関連す
る機能を包含していることも知られている。そしてこれ
らの機能に重要な役割を示す因子の一つとして糖鎖の糖
組成及びその配列が挙げられる。これらの構造と機能の
関連を研究する手段として、極めて高い特異性を有する
グリコシダーゼを多数（多種）要求される。
エンド−β−ガラクトシダーゼについては、従来より以
下のタイプの基質特異性を有する酵素が知られている。
Escherichia freundii、Flavobacterium keratolyticus
及びBacteriodes fragilis由来のエンド−β−ガラクト
シダーゼは、ポリラクトサミノグリカン及びケラタン硫
酸を含む広い範囲に作用し、Diplococcus pneumoniae由
来の酵素（エンド−β−ガラクトシダーゼDII）はケラ
タン硫酸を切断せず狭い基質特異性を示す。Pseudomona
s属細胞由来の酵素は、ケラタン硫酸に極めて特異的で
ある。
これらの酵素に比し、Diplococcus pneumoniae由来の血
液型エンド−β−ガラクトシダーゼは、認識するガラク
トシル残基にFuc α１→２及びGalNAc（Gal）α１→３
の両残基の置換が必須である等の基質特異性を有するこ
とが知られている。
一方、Gal α１→3Gal β１→4GlcNAc配列を有する天然
基質が数多くの糖蛋白質や糖脂質の中に存在することが
知られており、これらヒト赤血球の血液型物質、レクチ
ン結合部位の抗原決定物質、マウスリンパ腫細胞、Frie
nd白血病ウイルスの複合糖質を構成している。これらの
天然基質の糖配列を特定の酵素を用いて変更できれば、
細胞の有する機能、例えば、分裂、増殖、分化等の作用
を増強、制御することが可能となると考えられるが、末
端に存在するGal α１→3Gal β１→4GlcNAc配列に作用
してGal β１→4GlcNAc結合を選択的に切断する酵素は
未だ見い出されていなかった。
そこで、本発明者らは、新規なエンド−β−ガラクトシ
ダーゼを見い出すべく鋭意研究を重ねた結果、Clostrid
ium属細菌の培養中から新規なエンド−β−ガラクトシ
ダーゼを採取することに成功し、本発明を完成するに至
った。
［発明の構成］ 本発明のエンド−β−ガラクトシダーゼは、次の理化学
的性質： 作用：エンド−β−ガラクトシダーゼ 基質特異性：末端に少なくともGal α１→3Gal β１→4
GlcNAc配列を有する部分に作用してGal β１→4GlcNAc
結合を切断するが、末端に少なくともGal α１→３（Fu
c α１→２）Gal β１→4GlcNAc配列を有する部分には
作用しない。
至適pH及び安定pH範囲： 至適pH:約7.5 pH5.0及びpH8.5で酵素活性が約50％低下する。
を有することを特徴とするものである。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明に用いる微生物としては、Clostridium属に属
し、かつ、エンド−β−ガラクトシダーゼを生産する能
力を有するものであれば如何なるものでもよい。このよ
うな菌株としては、Clostridium perfringens（ATCC 10
873としてAmericam Type Culture Collection;微工研菌
寄第8917号として微工研に寄託されている。）等が挙げ
られる。
また、微生物としては、前記菌株を、例えば、Ｘ線、γ
線、紫外線等の照射処理 、又は、エチルメタンスルホ
ネート、ニトロソグアニジン等の薬剤処理、形質転換、
形質導入、接合、遺伝子操作等の通常用いられる菌株変
異処理方法によってエンド−β−ガラクトシダーゼの生
産能を高めたものを用いてもよい。
本発明のエンド−β−ガラクトシダーゼは、例えば、Cl
ostridium属に属するエンド−β−ガラクトシダーゼ生
産菌又はその変異株を培養し、培養物からエンド−β−
ガラクトシダーゼを採取することにより製造することが
できる。
培養方法は一般的な嫌気性菌の培養方法に準ずれば、い
ずれの方法でもよいが、通常は液体培地による静置培養
法が有利である。
培養に用いる培地としては、前記エンド−β−ガラクト
シダーゼ生産菌が栄養源として利用できる培地成分であ
ればよい。
例えば、炭素源としては、グルコース、マンノース、澱
粉、糖蜜、液化澱粉、グリセリン等を用いることができ
る。
また、窒素源としては、例えば心臓エキス、肉エキス、
酵母エキス、ペプトン、ガゼイン加水分解物、ゼラチ
ン、コーンミール、大豆粉、リン酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、尿素等を用いることができる。
また、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウ
ム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、炭酸カルシウム、塩化マンガン、塩化マグネシウ
ム、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の各種無機塩
類も必要に応じて添加できる。
前記したような培地成分は適宜組合せても、また培養途
中で添加してもよい。
培養温度は37℃前後が適当であり、培養時間は10〜100
時間が適当である。
培養容量の増大に従って適宜種培養を行うと好結果が得
られる。
以上述べた培養条件は使用菌株の特性に応じてそれぞれ
最適の条件を選択して適用される。
このようにして培養し、得られた培養物からエンド−β
−ガラクトシダーゼを分離精製する。
該酵素は主に培養物中の菌体外に含有されているので、
過、遠心分離等の手段により、培養物を菌体と培養液
に分離し、一般酵素の精製法により該酵素を精製すれば
よい。
即ち、減圧濃縮、凍結乾燥、透析、硫安分別、限外
過、遠心分離、イオン交換体を使用するクロマトグラフ
ィー、ゲル過、有機溶媒を使用する分別沈殿等の酵素
の分離、精製手段を単独あるいは任意に組み合わせて、
また必要に応じて反復して用いることにより培養液か
らエンド−β−ガラクトシダーゼが分離、精製、採取さ
れる。
［発明の実施例］ 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。
実施例１ （１）Clostridium perfringens ATCC 10873株の培養 Clostridium perfringens ATCC 10873株のストック・カ
ルチャーをDifco社製クックドミート培地中、37℃で増
殖し、種培地とした。
酵素調製のための増殖培養は、培地１当り、 Difco Todd-Hewitt培地 35.6g 酵母エキス 1.0g NaCl 2.5g K2HPO4 1.8g フェニルメチルスルホニルフロリド 0.2g システイン塩酸塩 0.05g グルコース 1.5g の成分を含有する培地を用い、オートクレーブ下に無菌
処理後、2lのエルレンマイヤーフラスコ中、37℃で72時
間培養した。
菌の増殖は18〜24時間で定常期となるが、酵素の生成に
は更に48時間を要した。この段階の培養液を冷却し、約
４℃で10,000rpm、60分の遠心分離により培養上清を得
た。以下の操作は４℃で行った。
（２）エンド−β−ガラクトシダーゼの精製 （ｉ）硫安塩析 遠心上清を硫安80％飽和により塩析し、得られた沈殿物
を少量の水に溶解し、冷水に対して透析し酵素溶液とし
た。
（ii）ゲル過 酵素溶液をダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩液で平衡
化したセファデックスG-200カラム（2.7×100cm）にか
け、3mlずつ分取し、画分26〜32を集め、Amicon PM-10
膜による限外過により3mlに濃縮した。
ゲル過のクロマトグラムを第１図に示す。第１図にお
いて、実線は標識グリカンに酵素を作用し、遊離した放
射性二糖の壊変率を表わし、破線は280nmにおける吸光
度（蛋白質の吸収）を表わす。
（iii）ゲルイオン交換体クロマトグラフィー （ii）で得た濃縮液を0.01Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.
0;0.1mMジチオスレイトール含有）に対し透析し、次い
で、DEAE−セファデックスA-25カラム（1.0×10cm）に
吸着せしめ、トリス−塩酸緩衝液を用いて、０〜0.4M N
aClの直線的濃度勾配溶出を行った。３〜4mlずつ分取
し、画分９〜14（22.2ml）を集め、Amicon PM-10膜によ
る限外過により3.8mlに濃縮し、精製エンド−β−ガ
ラクトシダーゼ液とした。
ゲルイオン交換体クロマトグラムを第２図に示す。第２
図において、（▲）印はエンド−β−ガラクトシダーゼ
の活性を表わし、（○）印はβ−ガラクトシダーゼの活
性を表わし、（●）印はβ‐N-アセチルグルコサミニダ
ーゼの活性を表わす。
以上の（ｉ）〜（iii）における精製の結果を第１表に
示す。
（３）基質の調製 （ｉ）高分子量糖蛋白質は、奇形癌腫（teratocarcinom
a）F9株の幹細胞からの糖蛋白質調製法［J.Biochem.,9
4,799（1983）］に準じて奇形癌腫OTT 6050株の膜よりT
riton X-100による可溶化、パパイン消化、プロナーゼ
消化及びセファデックスG-50によるゲル過を経て調製
した。
セファデックスG-50素通り画分に近い溶出画分を1M NaB
H4、0.05N NaOH溶液中、50℃で15時間処理し、セファデ
ックスG-50による再クロマトグラフィー（0.5M CH3COON
H4緩衝液、pH6.0）により分子量5,000以上の高分子領域
の画分を集めた。
OTT 6050株200g→グリカン12.3mg 糖組成 （モル比） ガラクトース （1.0） マンノース （0.16） フコース （0.08） グルコサミン （0.81） ガラクトサミン（0.16） シアル酸 （0.21） このグリカンをFukudaの方法［B.B.A.,780,119（198
5）］に従って分析したところ、ポリーＮ−アセチルラ
クトサミン型糖配列を有していることが判明した。
（ii）ガラクトースオキシダーゼNaB3H4標識法Fukudaら
の方法［J.Biol.chem.,254,5458（1979）］に従って非
還元端のガラクトシル基及びＮ−アセチルガラクトサミ
ニル基をトリチウムで標識した。
（４）分析法 （ｉ）糖組成 各糖をメタノリシス後、Ｎ−アセチルノイラミン酸をシ
アル酸のスタンダードとして用い、Bhatti,T.らの方法
［Biocim.Biophys.Acta.,222,339（1970）］に従い同定
した。
（ii）アミノ酸分析 試料を6N−塩酸を用いて、105℃で24時間加水分解後、
日立製アミノ酸分析機835型を用いて行った。
（iii）メチル化分析 箱守法［J.Biocem.,55,205（1964）］にて行い、部分メ
チル化糖は日立製ガス−マス スペクトロメーター80B
型を用いアルジトールアセテートとして検出した。
（iv）ペーパークロマトグラフィー ワットマンNo.1紙を用い、溶媒系Ｉ（酢酸エチル：ピ
リジン：水＝12:5:4）で展開した。
（ｖ）薄層クロマトグラフィー メルク製シリカゲルプレートを用い、溶媒系II（ｎ−プ
ロパノール：酢酸エチル：水＝7:2:1）又は溶媒系III
（クロロホルム：メタノール：水＝65:25:4）で展開し
た。
（vi）エキソグリコシダーゼ活性測定法 反応混合液0.2mlは、0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液（pH
6.0）中、各種ｐ−ニトロフェニルグリコシド0.2mgを含
む。反応は37℃で15分間行い、0.1M Na2CO3水溶液2mlで
停止させた。
（５）エンド−β−ガラクトシダーゼ活性測定法 （３）（ii）で調製した［3H］−標識グリカン（25,000
dpm,20μｇ）を精製酵素液及び0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.5;ガラクトノ−１−５−ラクトン50μｇ含有）25
μｇと合わせ37℃で30分間インキュベートした。エタノ
ール50μｌを添加して反応を停止させ、反応混合液をペ
ーパークロマトグラフィーにより分析した。二糖領域の
放射活性は酵素により遊離した放射性物質として示され
る（第３図参照）。第３図において、（●）印はエンド
−β−ガラクトシダーゼ消化の生成物の放射活性の推移
を表わし、Lac及びGalは、それぞれ標準物質として用い
たラクトース及びガラクトースが移動した位置を表わ
す。
酵素活性は、生成物の量が2,500dpm以下で反応時間が30
分以内の場合、酵素量及び反応時間に比例し、生成物量
2,500dpm/分を得るに要する酵素量を0.1単位とした。
（６）作用及び基質特異性 （ｉ）（３）（ii）で調製した［3H］−標識グリカンを
1N−塩酸を用いて100℃で４時間加水分解後、ペーパー
グロマトグラフィーにより分析したところ、標識物の90
％がガラクトース部位であり、残りがＮ−アセチルガラ
クトサミン部位であった。
（５）の活性測定法に準じて標識グリカンに本発明のエ
ンド−β−ガラクトシダーゼを作用させ、二糖領域の放
射活性移動度を確認した。基質としてはｐ−ニトロフェ
ニルグリコシドを用いた。精製エンド−β−ガラクトシ
ダーゼ中には、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ニダーゼ、α−マンノシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ
及びα−Ｌ−フコシダーゼの存在は認められなかった。
また、Fuc α１→2Gal β１→4Glcに作用するα−Ｌ−
フコシダーゼの存在も認められなかった。
以上のことから精製エンド−β−ガラクトシダーゼは基
質特異性の点で充分に純粋であることがわかった。
（ii）高分子量糖蛋白質に精製エンド−β−ガラクトシ
ダーゼを作用させたところ、以下の結果を得た。
（ａ）ペーパークロマトグラフィーでラクトースと同一
移動度の生成糖を遊離した。
（ｂ）バイオゲルP-4カラムによるゲル過によりヘキ
ソシル単位の二糖様物質が確認された。
（ｃ）生成二糖様物質はα−ガラクトシダーゼ（コーヒ
ー豆由来）により完全に加水分解された。
（ｄ）生成二糖様物質はβ−ガラクトシダーゼ（ジャッ
ク豆由来）によっては作用を受けなかった。
以上のことから、該生成二糖様物質は非還元端がα−ガ
ラクトシル残基を有することが判明した。
（iii）高分子量糖蛋白質（非標識）に精製エンド−β
−ガラクトシダーゼを作用させて非標識二糖を得た。メ
タノリシスとガスクロマトグラフィーでガラクトースが
唯一の糖成分であることが確認された。メチル化分析で
2,3,4,6−テトラ−Ｏ−メチルガラクトースと2,4,6−ト
リ−Ｏ−メチルガラクトースが1:1の比率で検出され
た。
以上のことから、該二糖はGal α１→3Galの構造を有す
ることが判明した。
（iv）ウシチログロブリン由来の複合型グリコペプチド
（この基質中のトリマンノスルコアにGal α１→3Gal
β１→4GlcNAc配列が存在する。）に精製エンド−β−
ガラクトシダーゼを作用させたところ、該酵素2.24μｇ
により90％の放射活性を生成物中に認めた。この生成物
は、バイオゲルP-4カラムによるクロマトグラフィー及
びペーパークロマトグラフィーでGal α１→3Galと同一
の挙動を示し、α−ガラクトシダーゼにより完全に加水
分解され、Gal α１→3Galであることが確認された。
以上のことから、本発明のエンド−β−ガラクトシダー
ゼは、Gal α１→3Gal β１→4GlcNAc配列に作用してGa
l β１→4GlcNAc結合を切断することが判明した。
（ｖ）精製エンド−β−ガラクトシダーゼをペンタグリ
コシルセラミド（Gal α１→3Gal β１→4GlcNAcβ１→
3Gal β１→4Glc-Cer）に作用させたところ、完全にト
リグリコシルセラミド（GlcNAcβ１→3Gal β１→4Glc-
Cer）に変換された。
しかしながら、精製エンド−β−ガラクトシダーゼはヒ
トＢ型赤血球由来のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン型
グリカンやGal α１→３（Fucα１→２）Gal β１→4Gl
cNAcβ１→３ヘキセン−1,2,5,6テトロールには作用し
なかった。
以上のことから、本発明のエンド−β−ガラクトシダー
ゼは、血液型抗原Ａ及びＢに作用するエンド−β−ガラ
クトシダーゼとは異なること、並びにグロボトリオース
（Gal α１→4Gal β１→4Glc）は本発明の酵素の基質
とはなり得ないことが判明した。
［発明の効果］ 本発明によれば、新規エンド−β−ガラクトシダーゼを
提供することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はゲル過のクロマトグラムを、第２図はゲルイ
オン交換体クロマトグラムを、第３図はペーパークロマ
トグラフィーによる分析結果を示す。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の理化学的性質： 基質特異性：複合糖質の、末端に少なくともGal α１→
    3Gal β１→4GlcNAc配列を有する部分に作用してGal β
    １→4GlcNAc結合を切断するが、末端に少なくともGal
    α１→３（Fuc α１→２）Gal β１→4GlcNAc配列を有
    する部分には作用しない、 至適pH及び安定pH範囲： 至適pH:約7.5 pH5.0及びpH8.5で酵素活性が約50％低下する、 を有することを特徴とするエンド−β−ガラクトシダー
    ゼ。
  2. 【請求項２】Clostridium属に属するエンド−β−ガラ
    クトシダーゼ生産菌又はその変異株を培養し、培養物か
    ら次の理化学的性質を有するエンド−β−ガラクトシダ
    ーゼを採取することを特徴とするエンド−β−ガラクト
    シダーゼの製造法。 基質特異性：複合糖質の、末端に少なくともGel α１→
    3Gal β１→4GlcNAc配列を有する部分に作用してGal β
    １→4GlcNAc結合を切断するが、末端に少なくともGal
    α１→３（Fuc α１→２）Gal β１→4GlcNAc配列を有
    する部分には作用しない。 至適pH及び安定pH範囲： 至適pH:約7.5 pH5.0及びpH8.5で酵素活性が約50％低下する。
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