JPH0792166A - エンドセリン−１の化学発光免疫分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】血漿や血清中の微量エンドセリン−１を前処理
なく、容易・正確に定量できる。 【構成】(1) エンドセリン−１の或る特定部位を認識す
る抗エンドセリン−１抗体（第１抗体）を固相担体に固
定して第１抗体固定化担体とし、(2) これを蛋白質含有
液で処理し、(3) 洗浄液で洗浄し、(4) 検体を直接又は
水性溶媒とともに加え、インキュベートし、第１抗体固
定化担体／エンドセリン−１の複合体を形成させ、(5)
洗浄液で洗浄し、(6) 上記エンドセリン−１の或る特定
部位とは異なる別の部位を認識でき、かつパーオキシダ
ーゼで標識された第２抗体を、水性溶媒とともに加え、
第１抗体固定化担体／エンドセリン−１／第２抗体／パ
ーオキシダーゼの複合体を形成させ、(7) 洗浄液で洗浄
し、(8) 脱脂乳及び／又は卵白アルブミンを含有する水
性溶媒中、ルミノール、過酸化水素及び増感剤を加え、
(9) 生じた発光量を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エンドセリン−１（Ｅ
Ｔ−１ともいう。）の化学発光免疫分析法に関する。

【０００２】

【従来の技術】１９８８年に柳沢らによって発見された
エンドセリン（Nature, Vol.332, p.411-415, 1988）
は、それまで知られていた血管作動性物質のどれよりも
強い血管収縮活性と持続性を有するペプチドで、下記の
アミノ酸配列（アミノ酸残基数：２１個）から成るぺプ
チドである（このペプチドは、のちにエンドセリン−１
と命名された。）。 Cys-Ser-Cys-Ser-Ser⁵-Leu-Met-Asp-Lys-Glu¹⁰-Cys-Val
-Tyr-Phe-Cys¹⁵-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp²¹ （エンド
セリン−１） その後、エンドセリンには上記のエンドセリン−１とは
アミノ酸配列の一部異なるイソペプチド、すなわち、 Cys-Ser-Cys-Ser-Ser⁵-Trp-Leu-Asp-Lys-Glu¹⁰-Cys-Val
-Tyr-Phe-Cys¹⁵-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp²¹ （エンド
セリン−２） 及び Cys-Thr-Cys-Phe-Thr⁵ -Tyr-Lys-Asp-Lys-Glu¹⁰-Cys-Val
-Tyr-Tyr-Cys¹⁵-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp²¹ （エンド
セリン−３） も見つかった。

【０００３】上記のアミノ酸配列から分かるように、こ
の３つのエンドセリン（エンドセリンイソペプチドとい
う。）は、エンドセリンのＣ端側、すなわち１５番目の
システインから２１番目のトリプトファンまでのアミノ
酸配列が共通しており、エンドセリンのＮ端側、すなわ
ち１番目のシステインから１４番目のアミノ酸配列で一
部異なっている。

【０００４】また、このエンドセリンイソペプチドは２
１１個、１４５個及び２３８個のアミノ酸から成るエン
ドセリン前駆体から、それぞれ３８個、３７個及び４１
個のアミノ酸から成るビッグエンドセリンを経て生合成
（プロセシング）されることも知られている。なお、ビ
ッグエンドセリンはそれぞれのエンドセリン（イソペプ
チド）のＣ末端側にペプチドが付加したものであるが、
それ自体はエンドセリン特有の生理活性を持っていな
い。

【０００５】エンドセリン−１の血中濃度と疾患との関
連性については、本態性高血圧（New Engl. J. Med., V
ol.322, p.205, 1990）、急性心筋梗塞（Lancet 2, Vo
l.8653, p.53-54, 1989）、急性蜘膜下出血（Lancet 2,
Vol.8676, p.1402, 1989）、腎不全（Lancet 1, Vol.8
645, p.991-992, 1989）等で血中エンドセリン−１濃度
の上昇がみられることから、これら疾患と関連性が示唆
されている。

【０００６】エンドセリン−１の測定法としては、従
来、放射免疫測定法による方法（FEBSLett., Vol.245,
p.164-166, 1989；エンドセリン最新情報，p.171-174,
1990；Biochem. Biophys. Res. Comm., Vol.161, p.320
-326, 1989）あるいはサンドイッチ型酵素免疫測定法に
よる方法（J. Immunol. Method,Vol.118,p245-250,198
9；特開平２−２３８８９４号公報；ＷＯ ８９／１１０
９９号公報；特開平２−２９１２９９号公報）が知られ
ている。放射免疫測定法による方法は、抗エンドセリン
−１抗体に対し、既知量の放射性ヨード標識エンドセリ
ン−１及び非標識エンドセリン−１を競合反応させ、Ｂ
／Ｆ分離後、放射能を測定する方法である。サンドイッ
チ型酵素免疫測定法による方法で、特開平２−２３８８
９４号公報で開示された方法は、エンドセリン−１のＮ
端側（又は、エンドセリンのＣ端部共通配列）に特異結
合する抗体を固相に固定化させて検体中のエンドセリン
−１を捕捉後、エンドセリンのＣ端部共通配列(又は、
エンドセリン−１のＮ端側)に特異結合する酵素標識抗
体で挟み込み、標識酵素の活性を測定する方法である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかし、前者の放射免
疫測定法による方法では、エンドセリン−１以外の他の
エンドセリンイソペプチドも反応する（交叉反応あり）
ので、エンドセリン−１だけを正確に測定できず、ま
た、放射性物質を取り扱わなければならないので安全上
の問題がある。また、後者のサンドイッチ型酵素免疫測
定法による方法では、血漿や血清中のエンドセリン−１
を直接測定しようとすると、測定値がしばしばマイナス
値となり、これを防止するには血漿や血清を予め処理し
てエンドセリン−１を抽出したり濃縮しなければならな
いので、煩雑であった。本発明は、血漿や血清中の微量
エンドセリン−１を前処理（試料の濃縮処理等）なく、
容易・正確に定量できる方法を提供するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、サンドイ
ッチ型酵素免疫法であって、パーオキシダーゼ／ルミノ
ール／過酸化水素／増感剤系で反応を行う化学発光分析
法により、エンドセリン−１を感度良く、定量できる方
法を種々検討した結果、反応液中の発光量を検出・測定
する際に、反応液に脱脂乳及び／又は卵白アルブミンを
存在させると上記目的が達せられることを見出し、本発
明を完成した。

【０００９】すなわち、本発明は下記の（１）〜（３）
に関する。 （１）(ａ) エンドセリン−１の或る特定部位を認識す
る抗エンドセリン−１抗体（第１抗体）を、固相担体に
固定して、第１抗体固定化担体とし、(ｂ) これに検体
を反応させて、検体中のエンドセリン−１を捕捉して、
第１抗体固定化担体／エンドセリン−１の複合体を形成
させ、(ｃ)この第１抗体固定化担体／エンドセリン−１
の複合体に、水性溶媒中で、上記エンドセリン−１の或
る部位とは異なる別の部位を認識でき、かつパーオキシ
ダーゼで標識された抗エンドセリン−１抗体（第２抗
体）を反応させるか、又は、上記エンドセリン−１の或
る特定部位とは異なる別の部位を認識でき、かつ反応基
をもつ抗エンドセリン−１抗体（第２抗体）を反応さ
せ、次いで、反応基をもつパーオキシダーゼを反応させ
て、第１抗体固定化担体／エンドセリン−１／第２抗体
／パーオキシダーゼの複合体を形成させ、(ｄ) 脱脂乳
及び／又は卵白アルブミンを含有する水性溶媒中で、ル
ミノール、過酸化水素及び増感剤を加え、(ｅ) 生じる
発光量を測定する；エンドセリン−１の分析法。

【００１０】（２）第１抗体が、Cys-His-Leu-Asp-Ile-
Ile-Trp、又はその部分ペプチドをハプテンとして含む
蛋白質で免疫された動物の血清（抗血清）を、プロテイ
ンＡに吸着後脱着して得られる分画であって、エンドセ
リン−１、−２及び−３のいずれをも認識する免疫グロ
ブリンであり、第２抗体が、エンドセリン−１をハプテ
ンとして含む蛋白質で免疫された動物の血清（抗血清）
から得られる免疫グロブリンであって、エンドセリン−
１は認識し、エンドセリン−２及びエンドセリン−３は
いずれも認識しない免疫グロブリンである、上記（１）
又は（２）のいずれかの分析法。

【００１１】（３）検体が血漿又は血清、あるいは水性
溶媒で希釈された血漿又は血清である、上記（１）又は
（２）のいずれかの分析法。

【００１２】本発明のエンドセリン−１（分析対象物
質）分析法の手順を更に詳しく述べると、おおむね、次
のようになる。 手順： (1) エンドセリン−１の或る特定部位を認識する（結合
できる）抗エンドセリン−１抗体（第１抗体）を固相担
体に固定して第１抗体固定化担体とする。 (2) これを蛋白質含有液で処理する（ブロッキング処
理）。 (3) 洗浄液で洗浄する。 (4) 検体を直接又は水性溶媒とともに加え、インキュベ
ートし、第１抗体固定化担体／エンドセリン−１の複合
体を形成させる。 (5) 洗浄液で洗浄する。 (6) 上記エンドセリン−１の或る特定部位とは異なる別
の部位を認識でき、かつパーオキシダーゼで標識された
第２抗体を、水性溶媒とともに加え、第１抗体固定化担
体／エンドセリン−１／第２抗体／パーオキシダーゼの
複合体を形成させる。 (7) 洗浄液で洗浄する。 (8) 脱脂乳及び／又は卵白アルブミンを含有する水性溶
媒中、ルミノール、過酸化水素及び増感剤を加える。 (9) 生じた発光量を測定する。

【００１３】なお、上記(6)のかわりに、下記のように
操作してもよい。 (6-1) 上記エンドセリン−１の或る部位とは異なる別の
部位を認識でき、かつビオチン等の反応基をもつ抗エン
ドセリン−１抗体（第２抗体）を、水性溶媒中で反応さ
せる。 (6-2) 洗浄液で洗浄する。 (6-3) アビジン等の反応基をもつパーオキシダーゼを水
性溶媒中で反応させる。

【００１４】本発明において用いられる脱脂乳は、脂肪
分を除いたミルクで、別名、脱脂粉乳、スキムミルク等
とも呼ばれる。これは通常、市販品、例えば、「MILK D
ILUENT/BLOCKING SOLUTION」(ＫＰＬ社製、コード番
号：50-82-01)、「ブロックエース」（大日本製薬製、
コード番号：UK-B25）、「ブロックエース粉末」（大日
本製薬製、コード番号：UK-B80）等が容易に入手でき
る。

【００１５】卵白アルブミンは、卵白から分離される分
子量４万５千、等電点４．６のタンパク質で、これにつ
いても市販品、例えば、「アルブミン、卵白、５回結
晶」（生化学工業社製、コード番号：250440）、「オボ
アルブミン」（太陽化学社製、コード番号：300-0071
1）、「アルブミン、卵製」（和光純薬工業社製、コー
ド番号：018-09882）、「Albumin chicken egg」（シグ
マ社製、コード番号：A7641）等が容易に入手できる。

【００１６】これら脱脂乳又は卵白アルブミンの使用濃
度は、それぞれ、少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度と
する。通常、その濃度はそれぞれ、反応液の最終濃度で
０．０１〜０．５重量％、好ましくは０．０２〜０．２
重量％の範囲である。濃度が０．０１重量％未満ではＳ
／Ｎ比を向上させる効果が少なく、０．５重量％を超え
ると特異的発光反応を抑えるため好ましくない。なお、
以下本明細書で単に％とあるのは、特に断わらない限り
重量％を意味する。

【００１７】本発明において、固相担体に固定する第１
抗体は、エンドセリン−１の或る特定部位を認識する
（すなわち、エンドセリン−１の或る特定部位で結合で
きる）抗エンドセリン−１抗体である。この第１抗体
は、好ましくは、Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp、又は
その部分ペプチドをハプテンとして含む蛋白質で免疫さ
れた動物の血清（抗血清）を、プロテインＡに吸着後脱
着して得られる分画であって（エンドセリン−１固定化
担体等を用いるアフィニティー精製は行わないほうがよ
い。）、エンドセリン−１、エンドセリン−２もしくは
エンドセリン−３のいずれのＣ端部（１５番目のシステ
インから２１番目のトリプトファン）も認識するが、ビ
ッグエンドセリン−１のエンドセリン−１Ｃ端部相当領
域（１５番目のシステインから２１番目のトリプトファ
ンの間）、及びエンドセリン−１、エンドセリン−２も
しくはエンドセリン−３のいずれのＮ端側（１番目のシ
ステインから１４番目のアミノ酸の間）も認識しない抗
体が好適である。そのような抗エンドセリン−１抗体は
市販品〔免疫生物研究所社製、抗エンドセリン^15-21特
異的抗体（ウサギＩｇＧ）、コード番号:１６１５５〕
が入手できる。

【００１８】第２抗体は、第１抗体の認識部位とは異な
る部位でエンドセリン−１を認識する抗体で、好ましく
は、第１抗体の認識部位とは異なる部位でエンドセリン
−１を認識するがエンドセリン−２及びエンドセリン−
３のいずれをも認識しない抗体で、更に好ましくは、エ
ンドセリン−１のＮ端側（１番目のシステインから１４
番目のフェニルアラニンの間）を特異的に認識し、エン
ドセリン−１、エンドセリン−２及びエンドセリン−３
のいずれのＣ端部（１５番目のシステインから２１番目
のトリプトファンまで）も認識しない抗体である。その
ような抗体は、エンドセリン−１をハプテンとして含む
蛋白質で免疫された動物の血清（抗血清）から、プロテ
インＡカラム、アフィニティーカラム、吸収等、慣用の
抗体精製手段を用いて得ることができる。また、Cys-Se
r-Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu¹⁰-Cys-Val-Tyr-Ph
e¹⁴、又はその部分ペプチドをハプテンとして含む蛋白
質で免疫された動物の血清（抗血清）から、上記と同様
に精製して得ることもできる。このような抗エンドセリ
ン−１抗体として市販品（免疫生物研究所社製、抗エン
ドセリン−１特異的抗体（ウサギＩｇＧ）、コード番
号:１６１５６）も入手できる。

【００１９】固相への第２抗体の非特異的吸着を減らす
ために第２抗体は、酵素処理でＦｃ領域を除去したＦａ
ｂ断片、Ｆ（ａｂ')₂断片、又はその単量体としたのち
これを用いてもよい。抗体のＦａｂ断片は、抗体をパパ
インで消化したのち分子ふるいクロマトグラフィーにか
け、また、Ｆ（ａｂ')₂断片は抗体をペプシンで消化し
たのち分子ふるいクロマトグラフィーにかけて得ること
ができ、Ｆａｂ'断片はＦ（ａｂ')₂断片のヒンジ部位の
ジスルフィド結合を還元して得ることができる。

【００２０】第２抗体をパーオキシダーゼで標識するに
は、マレイミド・ヒンジ法、サクシンイミド法等により
直接両者を結合させることができる（直接標識法）。こ
のようなパーオキシダーゼ標識エンドセリン−１特異的
抗体は、市販品（免疫生物研究所社製、コード番号：１
６１６５）も入手できる。

【００２１】また、第２抗体をパーオキシダーゼで標識
するには、第２抗体にビオチニル基等の化学基を有せし
めたのち、これと反応するアビジン、ストレプトアビジ
ン等の化学基を有するパーオキシダーゼを反応させる
（間接標識法）。第２抗体をビオチニル化するには、ビ
オチン分子をそのカルボキシル基を介してカルボジイミ
ド法で抗体分子中のアミノ基と化学結合させる方法や、
ビオチン分子中のカルボキシル基を活性エステル化（サ
クシニイミド化）後、それを抗体分子中のアミノ基と化
学結合させる方法がある。ビオチン化を容易にするた
め、ビオチン分子のサクシニイミド誘導体（Ｐｉｅｒｃ
ｅ社製、ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、コード番号：２０２１
７；ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、コード番号：２１３
３５）も市販されており、これらを利用することもでき
る。

【００２２】なお、ビオチン標識抗エンドセリン−１抗
体として、市販品の「抗エンドセリン−１（ウサギＩｇ
Ｇ）抗体ビオチン標識」（免疫生物研究所社製、コード
番号：１７１２６）を利用することもできる。アビジン
等の化学基を有するパーオキシダーゼとしては、ピアー
ス（Pierce）社製のImunopure Avidin Horseradish Per
oxidase Conjugate(コード番号:21123)等の市販品が入
手可能である。

【００２３】パーオキシダーゼとしては、西洋ワサビ由
来の塩基性アイソザイムが好適である。塩基性アイソザ
イムにはＢ、Ｃ、Ｄ及びＥの型が知られているが、これ
らの中ではＣ型が最も好ましい。

【００２４】用いる固相担体としては、マイクロタイタ
プレートのほかに、ポリスチレンビーズ、磁性体を包埋
させたポリスチレン粒子等も利用できる。マイクロタイ
タプレートの市販品としては、ブラックモジュールプレ
ート（Nunc社製）、マイクロフルオロプレート黒（ダイ
ナテク社製）、マイクロフルオロリモーバウェル黒（ダ
イナテク社製）等がある。場合によっては、隣接ウェル
からの迷光を防止する白色系のマイクロタイタプレート
を使用することもできる。このようなマイクロタイタプ
レートとしては白色顔料を含む、マイクロフルオロプレ
ート白（ダイナテク社製）、マイクロフルオロリモーバ
ウェル白（ダイナテク社製）、あるいは白色プレート
（住友ベークライト社製）等がある。

【００２５】第１抗体を固相担体に固定するには、固相
担体表面上に官能基がない場合は、蛋白成分不含の生理
的緩衝液もしくは弱アルカリ性緩衝液中で物理吸着させ
る。固相担体表面上にアミノ基がある場合は、それと抗
体分子のカルボキシル基とのあいだをカルボジイミド法
等で結合させるか、抗体分子のアミノ基とのあいだをグ
ルタルアルデヒドやバイファンクショナルなジサクシン
イミド化合物を用いて結合させる。

【００２６】第１抗体を固定した固相は、検体や試薬中
の種々の成分が非特異的に吸着するのを防止するため、
固相（第１抗体分子上の易吸着性部位を含む。）を蛋白
質等でブロッキングして用いる。ブロッキングに用いる
蛋白質等としては脱脂乳、ウシ血清アルブミン、ヒト血
清アルブミン、卵白アルブミン、ラクトアルブミン、カ
ザミノ酸等が使用でき、これら蛋白質に更にグリセリ
ン、エチレングリコール、トリメチレングリコール、ト
リエチレングリコール等を共存させてブロッキングして
もよい。第１抗体を固定した固相担体を乾燥状態で保存
するため、第１抗体を固定後直ちに、あるいは蛋白質等
でブロッキングし、イムノアッセイスタビライザ（アド
バンスド・バイオテク社製）でコーティングしてもよ
く、また、所定濃度の糖液をコーティングしたのち乾燥
してもよい。

【００２７】本発明において、固相の洗浄に用いる洗浄
液は、水又は緩衝液に非イオン性界面活性剤を０．０１
〜２．０％含有させた液を用いることができる。ここで
緩衝液としては、リン酸緩衝液、カルシウム不含ダルベ
ッコ燐酸緩衝化生理食塩液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝
液等がある。

【００２８】非イオン性界面活性剤としては、アシルソ
ルビタン、ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシ
エチレンソルビタンエステル類等があり、アトラスパウ
ダー社製造のスパン２０（ソルビタンモノラウレー
ト）、スパン４０（ソルビタンモノパルミテート）、ス
パン６０（ソルビタンモノステアレート）、スパン８０
（ソルビタンモノオレエート）、スパン８５（ソルビタ
ントリオレエート）、ツイーン２０（ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノラウレート）、ツイーン４０（ポリオ
キシエチレンソルビタンモノパルミテート）、ツイーン
６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレー
ト）、ツイーン８０（ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノオレエート）、ツイーン８５（ポリオキシエチレンソ
ルビタントリオレエート）、ブリッジ３５（ポリオキシ
エチレンラウリルエーテル）、ブリッジ５８（ポリオキ
シエチレンセチルエーテル）等、ロームアンドハース社
製造のトリトンＸ−１００（ポリオキシエチレン（１
０）オクチルフェニルエーテル）、トリトンＸ−４０５
（ポリオキシエチレン（４０）オクチルフェニルエーテ
ル）等、シグマ社のノニデットＰ−４０（オクチルフェ
ノールエチレンオキサイド）等、旭電化工業社製造の
「アデカトールＳＯシリーズ」（第２級直鎖アルコール
エトキシレート）等、市販品が入手できる。

【００２９】本発明において用いる水性溶媒は、水又は
緩衝液である。ここで緩衝液としては、リン酸緩衝液、
カルシウム不含ダルベッコ燐酸緩衝化生理食塩液、ホウ
酸緩衝液、グッド緩衝液等がある。これら緩衝液のｐＨ
はそれぞれの反応に好適なｐＨを選ぶ。通常、ｐＨは５
〜１２、好ましくは７〜１１とする。ｐＨが５未満であ
ると、パーオキシダーゼの最適ｐＨから外れて発光量が
弱くなり、ｐＨが１２を超えると、パーオキシダーゼ活
性に依存しない発光（ノイズ）が強くなる。この水性溶
媒には、通常、前記した非イオン性界面活性剤を０．０
１〜２．０％含有させておくのがよい。

【００３０】発光反応に用いられるルミノールは、通常
入手できる試薬グレードのものには製造原料であるヒド
ラジン及び硫化物イオンが混入している場合が多いの
で、再結晶を繰り返し、精製したものを用いる。また、
溶解性の高いルミノールナトリウム塩（和光純薬工業
製）を使用することもできる。

【００３１】過酸化水素は、最終濃度で０.４〜５.０ｍ
Ｍの濃度で使用する。過酸化水素を溶解させる緩衝液の
ｐＨは、過酸化水素の安定性を考慮してｐＨ７.０前後
が好ましい。

【００３２】本発明に用いられる増感剤は、ルミノール
の一電子酸化を助けて増感作用を有するもので、４−ヨ
ードフェノール、４−ブロモフェノール、４−クロロフ
ェノール、４−フェニルフェノール、２−クロロ−４−
フェニルフェノール、４−（２’−チエニル）フェノー
ル、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、４−〔４’−
（２’−メチル）チアゾリル〕フェノール、４−〔２’
−（４’−メチル）チアゾリル〕フェノール、４−
（２’−ベンゾチアゾリル）フェノール、３−（１０−
フェノチアジル）−ｎ−プロピル−スルホン酸塩等があ
る。

【００３３】これらの増感剤の存在下にパーオキシダー
ゼの触媒作用でルミノール／過酸化水素の発光反応を行
うと、増感剤が増感ラジカルとなり、これがルミノール
と反応し発光する。

【００３４】ルミノール、過酸化水素及び増感剤を加
え、発光反応させる際の水性溶媒（反応液）中には、安
定性等の性能を上げるために、グリセリン、マンニトー
ル、ソルビトール等の糖アルコール等を添加してもよ
い。

【００３５】以下実験例で、発光反応の際の水性溶媒
（反応液）中への、脱脂乳、卵白アルブミン、非イオン
性界面活性剤又は糖アルコール等の添加効果を示す。実験例１ 増感剤存在下の化学発光反応の、試薬ブラン
ク（ノイズ）に及ぼす脱脂乳、卵白アルブミン、糖アル
コール又は非イオン性界面活性剤の効果 添加剤無添加（対照）の試験は以下のように操作した。
すなわち、外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ
型マイクロウェルに５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ１０.０）１００μｌ、２ｍＭ ４−［４'−（２'
−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォ
キシド溶液８μl、４ｍＭ過酸化水素／５０ｍＭホウ酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０.０）５０μｌ及び２０ｍ
Ｍ ルミノール溶液(日立化成(株)社製)５０μｌをと
り、撹拌混合し、化学発光測定装置(コロナ電気(株)社
製、MLR-100)を用いて、化学発光量を２０分間経時的に
測定した。なお、脱脂乳は「MILK DILUENT/BLOCKING SO
LUTION」(ＫＰＬ社製、コード番号：50-82-01)を使用し
た（以下の実験例及び実施例において用いた脱脂乳も同
じ）。

【００３６】一方、添加剤添加の試験は、５０ｍＭホウ
酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ１０.０)１００μｌの代わり
に脱脂乳、卵白アルブミン、糖アルコール、又は非イオ
ン性界面活性剤を反応液の最終濃度で下記の表１に示す
濃度で含有する同緩衝液１００μｌを用い、上記と同様
に操作した。その結果、それぞれの試薬ブランクは反応
の間（２０分間）いずれもほぼ一定であった。反応時間
１０分におけるそれぞれの試薬ブランク（ノイズ）の発
光カウント値を表１に示す。

【００３７】

【表１】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 最終濃度 試薬ブランク ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ％ ルミカウント 無添加（対照） ─ ２４０ 脱脂乳 ０．０５ ５０ 〃 ０．１０ ３０ 卵白アルブミン ０．０５ １２０ 〃 ０．１０ １００ マンニトール ０．２５ １２０ ０．４５ ６５ ソルビトール ０．４５ ６５ ツィーン２０ ０．０５ ２３３ ツィーン８０ ０．０５ ２３６ トリトンＸ−１００ ０．０５ ２３４ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００３８】脱脂乳は試薬ブランクを著しく低減させ、
卵白アルブミン及び糖アルコールは試薬ブランクを中程
度に低減させ、ツィーン２０等の非イオン性界面活性剤
は試薬ブランクにほとんど影響を及ぼさなかった。

【００３９】実験例２ 増感剤及びマンニトール存在下
の化学発光反応の、試薬ブランクに及ぼす脱脂乳又は卵
白アルブミンの効果 外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロ
ウェルに脱脂乳又は卵白アルブミンを０.１０％（最終
濃度：０.０５％）又は０.２％（最終濃度：０．１％）
含有する５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０.
０）１００μｌ、２ｍＭの４−［４'−(２'−メチル)チ
アゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８
μｌ、１．０％マンニトール含有の４ｍＭ過酸化水素／
５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０.０）５０
μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液５０μｌをとり、以
下実験例１と同様に操作し、化学発光量を測光した(表
２)。

【００４０】

【表２】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 蛋白質 最終濃度 試薬ブランク ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ％ ルミカウント なし（対照） ０．０ ７０ 脱脂乳 ０．０５ ２０ 〃 ０．１０ １０ 卵白アルブミン ０．０５ ３０ 〃 ０．１０ ２４ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ マンニトール存在下においても、脱脂乳及び卵白アルブ
ミンはいずれも、（特に脱脂乳は）試薬ブランクを低下
させた。

【００４１】実験例３ 増感剤及びマンニトール存在下
の化学発光反応の、試薬ブランク、シグナル量及びＳ／
Ｎ比に及ぼす非イオン性界面活性剤の効果 外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロ
ウェルに、ＨＲＰ標識抗エンドセリン−１単クローン抗
体（ヤマサ醤油社製、コード番号：MCA ET-2）の１０万
倍希釈溶液（希釈液：表３に示す各非イオン性界面活性
剤を最終濃度で０．０２〜１．０％含有する５０ｍＭホ
ウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０.０）を使用）１００
μｌ、２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チアゾリ
ル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ、
１．０％マンニトールを含有する４ｍＭ 過酸化水素／
５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０.０）５０
μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液５０μｌを順次加
え、前記同様に化学発光量を測定し、シグナル（Ｓ）と
した。ノイズ（Ｎ）は、ＨＲＰ標識抗エンドセリン−１
単クローン抗体の１／１０⁵希釈液の代わりに、５０ｍ
Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を用い、同
様に測定した。表３に、反応時間１０分における試薬ブ
ランク（ノイズ）、シグナル量及びＳ／Ｎ比を示した。

【００４２】

【表３】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 界面活性剤 最終濃度 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ％ ルミカウント ルミカウント なし（対照） ─ ２７８ ４５０ １．６２ ツィーン２０ ０.０２ ２３８ １３１１ ５．５１ ０.０５ ３０２ １３６３ ４．５１ ０.１０ ３３４ １３０３ ３．９０ ツィーン８０ ０.０２ ３０３ １２９３ ４．２７ ０.０５ ４０２ １３５４ ３．３７ ０.１０ ３６２ １２５７ ３．４７ トリトンX-100 ０.０２ ３６６ １３３１ ３．６４ ０.０５ ３９０ １３５７ ３．４８ ０.１０ ２７０ １２３３ ４．５７ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００４３】ツイーン２０、ツイーン８０又はトリトン
Ｘ−１００を添加したものは、これらを添加しないもの
（対照）に比べ、（試薬ブランクにはほとんど影響を及
ぼしていないが）シグナル量が４〜５倍に増加し、Ｓ／
Ｎ比も無添加（対照）に比べ２〜４倍高くなった。

【００４４】実験例４ 増感剤存在下の化学発光反応
の、試薬ブランク、シグナル量及びＳ／Ｎ比に及ぼす非
イオン性界面活性剤及び脱脂乳の共存の効果（その１） 外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロ
ウェルに、ＨＲＰ標識抗エンドセリン−１単クローン抗
体の１０万倍希釈溶液〔希釈液：最終濃度０．０５％の
各非イオン性界面活性剤及び最終濃度０．０５％脱脂粉
乳を含有する５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１
０.０）を用いた〕１００μｌ、２ｍＭの４−［４'−
（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルス
ルフォキシド溶液８μｌ、１．０％マンニトールを含有
する４ｍＭ 過酸化水素／５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ１０.０）５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール
溶液５０μｌをとり、前記同様に化学発光量を測定し
た。

【００４５】

【表４】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 界面活性剤又は脱脂乳 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ルミカウント ルミカウント なし（対照） ２５４ ４６７ １．８４ ツィーン２０＋脱脂乳 ２７ １０７５ ３９．８１ ツィーン８０＋脱脂乳 ２７ ９９４ ３６．８１ トリトンX-100＋脱脂乳 ２７ １１７９ ４３．６７ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ツイーン２０、ツイーン８０もしくはトリトンＸ−１０
０と脱脂乳の組合せは、無添加（対照）に対し、シグナ
ル量が２〜３倍に増加し、更にＳ／Ｎ比は脱脂乳による
ノイズ低減の効果とも合わさって無添加(対照)の約２０
倍に高まった。

【００４６】実験例５ 増感剤存在下の化学発光反応
の、試薬ブランク、シグナル量及びＳ／Ｎ比に及ぼす非
イオン性界面活性剤及び脱脂乳の共存の効果（その２） 添加剤無添加の試験（無添加対照）は以下のように操作
した。ブラックモジュールプレートに、ＨＲＰ標識抗エ
ンドセリン−１抗体の１／１０⁵希釈液〔希釈用緩衝液
として５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．
０）を使用〕１００μｌを注入し、次いで２ｍＭ ４−
［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメ
チルスルフォキシド溶液８μl、４ｍＭ過酸化水素含有
の５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）５０μ
l及び２０ｍＭルミノール５０μlを添加し、ルミノメー
タで１０分後の発光量を測光し、シグナル（Ｓ）とし
た。ノイズ（Ｎ）の測定は、ＨＲＰ標識抗エンドセリン
−１抗体の１／１０⁵希釈液の代わりに、５０ｍＭホウ
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を使用した。

【００４７】非イオン性界面活性剤（アデカトール Ｓ
Ｏ-135）、脱脂乳及びその両者の添加試験は、使用する
ＨＲＰ標識化抗エンドセリン−１抗体希釈用の５０ｍＭ
ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）中に、予めそ
れぞれ０．１％含有させたほかは、上記と同様にして行
った（表５）。

【表５】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加（無添加対照） １，５８１ １，９６８ １．２４ アデカトール SO-135 １，１０５ ３，０４３ ２．７５ 脱脂乳 １３５ １，６５５ １２．２ アデカトール SO-135 ┐ １３１ ２，０８２ １５．９ ＋脱脂乳 ┘ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ アデカトール SO-135及び脱脂乳の両者の添加では、そ
れぞれ単独添加の場合に比べＳ／Ｎ比は更に改善され
た。

【００４８】実験例６ 増感剤及びマンニトール存在下
の化学発光反応の、シグナル量の安定的持続に及ぼす卵
白アルブミンの効果 黒色のマイクロフルオロリモーバウェル(ダイナテク社
製)に、ＨＲＰ標識抗エンドセリン−１単クローン抗体
の１０万倍希釈溶液〔希釈液：最終濃度０．０５％卵白
アルブミン及び最終濃度０．０５％のツィーン２０を含
有する５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．
０）を用いた。〕１００μｌ、２ｍＭの４−［４'−
（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルス
ルフォキシド溶液８μｌ、１．０％マンニトールを含有
する４ｍＭ 過酸化水素／５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ１０．０）５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノー
ル溶液５０μｌをとり、前記と同様にして２０分間、経
時的に化学発光量を測定した。比較として、卵白アルブ
ミンの代わりに同濃度（最終濃度０．０５％）の脱脂乳
を用いた。図１にシグナル量の経時的変化を示した。卵
白アルブミンの添加は脱脂乳に比べ、シグナル量が安定
し持続した

【００４９】

【実施例】以下、エンドセリン−１を測定した実施例
で、本発明を更に詳しく説明する。 実施例１ エンドセリン−１の検量線 標準となるエンドセリン−１（ＥＴ−１と略す。ヒト由
来、ペプチド研究所製、コード番号４１９８−ｓ）を
０．１％ツィーン２０及び０．１％脱脂乳含有ダルベッ
コリン酸緩衝生理食塩液（以下、希釈用緩衝液とい
う。）で希釈し、それぞれ２、５、１０、２０及び４０
ｐｇ／ｍｌの濃度のエンドセリン−１標準溶液を作成し
た。

【００５０】予め、抗エンドセリン抗体（免疫生物研究
所社製、抗エンドセリン^15-21特異的抗体、コード番号:
１６１５５）を５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
で希釈して５μｇ／ｍｌとし、ブラックモジュールプレ
ート（ヌンク社製、コード番号４７５５１５）の各ウェ
ルに２００μｌずつ分注し、４℃で一晩放置して、抗体
をプレートのウェルに吸着させた。イオン交換蒸留水で
２回洗浄後、ウェルに０．５％脱脂乳４００μｌを加
え、３７℃で６時間保温し（ブロッキング処理）、その
後０．１％ツイーン２０含有カルシウムフリーダルベッ
コ燐酸緩衝生理食塩液で３回洗浄して、抗体固定化プレ
ートとした。

【００５１】先に準備したエンドセリン−１の標準溶液
をそれぞれ２００μｌずつプレートのウェルにとり、室
温で一晩放置した。その後、０．１％ツィーン２０含有
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（以下、洗浄用緩衝液
という。）で１０回洗浄し、希釈用緩衝液で２μｇ／ｍ
ｌに調整したパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化抗エン
ドセリン−１抗体（免疫生物研究所社製、コード番号１
６１６５）２００μｌずつを各ウェルに加え、３７℃で
２時間インキュベートした。洗浄用緩衝液で１０回洗浄
後、各ウェルに０．１％アデカトールＳＯ−１３５及び
０．１％脱脂乳を含む２ｍＭ過酸化水素含有５０ｍＭ
（ｐＨ１０）ホウ酸ナトリウム緩衝液（以下、発光基質
液Ａという。）１００μｌ、次いで２０ｍＭルミノール
と０．３２ｍＭ ４−［４'−(２'−メチル)チアゾリ
ル］フェノール含有５０ｍＭ（ｐＨ１０）ホウ酸ナトリ
ウム緩衝液との１：１（容量比）混合液（以下、発光基
質液Ｂという。）１００μｌを加えた。その１０分後
に、ルミノメータで発光量を測光した。なお試薬ブラン
クは、エンドセリン−１の標準溶液の代わりに希釈用緩
衝液を同じ容量とり、同様に操作したものとした。横軸
にエンドセリン−１の濃度をとり、縦軸に発光量（ルミ
カウント）をとり、グラフにプロットしてエンドセリン
−１の検量線とした（図２）。

【００５２】なお、発光基質液ＡとしてアデカトールＳ
Ｏ−１３５及び脱脂乳のいずれも含まない２ｍＭ過酸化
水素含有５０ｍＭ（ｐＨ１０）ホウ酸ナトリウム緩衝液
（比較１）、あるいは、０．１％アデカトールＳＯ−１
３５含有の２ｍＭ過酸化水素含有５０ｍＭ（ｐＨ１０）
ホウ酸ナトリウム緩衝液（比較２）を用い、同様に操作
して、これらを比較対照とした。図２から、発光反応時
に脱脂乳が存在すると、エンドセリン−１の検量線の傾
斜が大きく、測定感度が高いことが分かる。

【００５３】実施例２ 健常人の血漿中のエンドセリン
−１の測定 標準となるエンドセリン−１（ペプチド研究所製、コー
ド番号４１９８−ｓ）をエンドセリン−１不含血漿で希
釈し、それぞれ２、５、１０、２０及び４０ｐｇ／ｍｌ
の濃度のエンドセリン−１標準溶液を作成した。上記エ
ンドセリン−１標準溶液並びに検体（健常人の血漿：６
体）について、実施例１と同様にして操作し、発光量を
求めた。エンドセリン−１標準溶液の発光量（検量線）
から、検体のエンドセリン−１の濃度を求めた。

【表１０】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 検体番号 ＥＴ−１（pg／ml） 検体番号 ＥＴ−１（pg／ml） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １ １．４７ ４ ３．００ ２ ２．１２ ５ ２．７９ ３ １．８７ ６ １．５５ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００５４】

【発明の効果】本分析法により、血漿や血清中の微量の
エンドセリン−１を前処理（試料の濃縮処理等）なく、
容易・正確に定量できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】発光反応液中に卵白アルブミン又は脱脂乳が存
在するときの、シグナル量の時間的変化を示すグラフで
ある。

【図２】エンドセリン−１の検量線を示すグラフであ
る。

【符号の説明】

図１において、 □−□：卵白アルブミン ●−●：脱脂乳

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】(ａ) エンドセリン−１の或る特定部位を
   認識する抗エンドセリン−１抗体（第１抗体）を、固相
   担体に固定して、第１抗体固定化担体とし、(ｂ) これ
   に検体を反応させて、検体中のエンドセリン−１を捕捉
   して、第１抗体固定化担体／エンドセリン−１の複合体
   を形成させ、(ｃ)この第１抗体固定化担体／エンドセリ
   ン−１の複合体に、水性溶媒中で、 上記エンドセリン−１の或る部位とは異なる別の部位を
   認識でき、かつパーオキシダーゼで標識された抗エンド
   セリン−１抗体（第２抗体）を反応させるか、又は、 上記エンドセリン−１の或る特定部位とは異なる別の部
   位を認識でき、かつ反応基をもつ抗エンドセリン−１抗
   体（第２抗体）を反応させ、次いで、反応基をもつパー
   オキシダーゼを反応させて、第１抗体固定化担体／エン
   ドセリン−１／第２抗体／パーオキシダーゼの複合体を
   形成させ、(ｄ) 脱脂乳及び／又は卵白アルブミンを含
   有する水性溶媒中で、ルミノール、過酸化水素及び増感
   剤を加え、(ｅ) 生じる発光量を測定する；エンドセリ
   ン−１の分析法。
2. 【請求項２】第１抗体が、Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Tr
   p、又はその部分ペプチドをハプテンとして含む蛋白質
   で免疫された動物の血清（抗血清）を、プロテインＡに
   吸着後脱着して得られる分画であって、エンドセリン−
   １、−２及び−３のいずれをも認識する免疫グロブリン
   であり、 第２抗体が、エンドセリン−１をハプテンとして含む蛋
   白質で免疫された動物の血清（抗血清）から得られる免
   疫グロブリンであって、エンドセリン−１は認識し、エ
   ンドセリン−２及びエンドセリン−３はいずれも認識し
   ない免疫グロブリンである、請求項１又は請求項２のい
   ずれかの分析法。
3. 【請求項３】検体が血漿又は血清、あるいは水性溶媒で
   希釈された血漿又は血清である、請求項１又は請求項２
   のいずれかの分析法。