JPH0794474B2 - 骨中のポリペプチド軟骨誘導因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は蛋白質化学、さらに詳しくは骨中に存在する軟
骨形成誘導用の因子で、β型形質転換成長因子（TGF−
β）アッセイにおいても活性な２種類の蛋白質のうちの
特定の一に関する。本明細書中においてはこれらのポリ
ペプチドを軟骨誘導因子（GIFs）と呼ぶことがある。

（技術的背景） ヒト血小板、ヒト胎盤、及びウシ腎臓由来のTGF−βが
国際特許出願明細書（PCT−US83/01460、1984年３月29
日公開No.WO 84/01106）及びEPA84450016.5（1984年12
月19日公開No.0128849）に記載されている。

米国特許第4,434,094にはカオトロピズム試剤での抽
出、カチオン及びアニオン交換カラムでの分画、及びpH
4.8でCMCに吸着されたフラクションからの活性の回復に
よる骨発生刺激性骨由来蛋白質因子の部分的精製が報告
されている。この新しい蛋白質フラクションは「骨形生
因子」（OF）と命名され、分子量約30,000ダルトン未満
で、上述の精製工程をたどることを特徴とする。本発明
の蛋白質は米国特許第4,434,094号記載の方法と部分的
に同様な精製手順を用いて均質に精製した。

（発明の開示） 本発明は骨中に豊富に存在する２種類のCIFs、並びにこ
れらのポリペプチドを骨から実質的に純粋な形で得るこ
とを基本的目的とする。いずれのCIFsも上皮成長因子
（EGF）と組み合わせると、軟寒天中での正常ラット腎
臓（NRK）細胞の固定（源）非依存性成長の生体外での
誘発に関するTGF−βアッセイに対しても活性を示す。
本明細書においてはこのアッセイを時にTGF−βアッセ
イと呼ぶ。こうした観点においては、TGF−βアッセイ
に活性な蛋白質の骨中での存在は、従来報告されていな
い。本発明のCIFsの一つはCIF−Ａといい、ヒト胎盤由
来のTGF−βについて文献で報告されているのと同様の
部分的（30個のアミノ酸）Ｎ末端配列を有する。また、
他のCIFはCIF−Ｂといい、ヒト胎盤由来のTGF−β配列
とは異なる部分的Ｎ末端配列を有する。本発明は、ポリ
ペプチド軟骨誘導因子として、このCIF−Ｂを提供す
る。

本発明は更にCIF−ＢとTGF−β活性化試剤を組み合わせ
て含む細胞増殖促進用組成物、軟骨形成及び骨形成誘発
用移植組成物、並びに、CIF−Ｂを含むがその活性化試
剤又は共同因子は含まない結合組織沈着促進用移植組成
物を提供することをも目的とする。

従って本発明の一つの態様は、（ａ）骨中に存在し、
（ｂ）軟骨形成を誘発するための共同因子で、（ｃ）TG
F−βアッセイに活性を有し、かつ（ｄ）SDS−PAGEによ
る測定で約26,000ダルトンの二量体であって、（ｅ）前
記二量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列 Ala−Leu−Asp−Ala−Ala−Tyr−Cys−Phe−Arg−Asn−
Val−Gln−Asp−Asn−Cys−Cys−Leu−Arg−Pro−Leu−
Tyr−Ile−Asp−Phe−Lys−Arg−Asp−Leu−Gly−Trp−
を有することを特徴とするポリペプチド軟骨誘発因子で
ある。

本発明の骨からのCIF−Ａ及びCIF−Ｂの前記二つの因子
の単離方法は、以下の工程から成ることを特徴とする。

（ａ）非繊維状蛋白質を可溶化するカオトロピズム性
（解離性）抽出剤を使って、無機成分を除去した骨（DM
B）から抽出し、 （ｂ）工程（ａ）からの抽出物をゲルろ過して分子量1
0,000〜40,000ダルトンの蛋白質を含むフラクションを
回収し、 （ｃ）工程（ｂ）によるフラクションをカルボキシメチ
ルセルロース・カチオン交換体にpH約4.5〜5.5の変位条
件下で吸着させ、 （ｄ）濃度勾配をつけた塩化ナトリウム溶液を用いて前
記カチオン交換体から吸着フラクションを溶出し、 （ｅ）濃度約150〜250mMのNaCl溶液で溶出された工程
（ｄ）からの溶出物を逆相高性能液体クロマトグラフィ
ー（RP−HPLC）又は非変性ゲル電気泳動に供し、 （ｆ）前記RP−HPLC又はゲル電気泳動から前記因子を回
収する。

本発明の軟骨形成／骨形成誘発用移植組成物は、前記CI
F−Ｂを有効量含むことを特徴とする。更に、CIF−Ａを
同時に配合させることもできる。

本発明の正常な動物細胞の増殖促進用組成物は、（ａ）
前記CIF−Ｂ並びに（ｂ）TGF−β活性試剤を有効量含む
ことを特徴とする。更に、CIF−Ａを同時に配合させる
こともできる。

本発明の結合組織沈着促進用移植組成物は、実質的に活
性化試剤又は軟骨形成共同因子を含まない、前記CIF−
Ｂを有効量含むことを特徴とする。更に、CIF−Ａを同
時に配合させることもできる。

発明の実施態様 本発明のポリペプチドは骨から単離され、この時点で単
一の特定の分子配列を有する。このため、またTGF−β
の完全なアミノ酸配列はまだ報告されていないことか
ら、本発明のCIFsとTGF−βとの間の主要な構造的関係
は完全には判っていない。

本発明のポリペプチドは軟骨形成を誘発するための共同
因子である。これらのポリペプチドの軟骨形成活性及び
軟骨末端からの骨形成様式から考えて、これらは骨形成
においても役割を果たすものと期待される。本発明のポ
リペプチドはTGF−βアッセイにも活性で、TGF−β活性
化試剤を伴わずに結合組織の沈着を促すことが判ってい
る。ヒト、サル、ウシ、及びラットからの骨誘発性蛋白
質は、異種移植物として使用する場合、軟骨末端からの
骨形成能力に種による特異性がなく（サンパス他,Sampa
th,T.K.,etal,Proc Natl Acad S c i（USA）（1983）8
0:6591）、ヒト血小板、ヒト胎盤、及びウシ腎臓起源の
TGF−βはげっ歯類、ウシ類、及び人類の間で種非特異
性であることからして、本発明のポリペプチドは哺乳類
間での維持性が極めて高いものと考えられる。（つま
り、種の異なる哺乳類間のポリペプチドのアミノ酸配列
には、例えあったとしても分子の非種特異的な活性は維
持できる程度の１個以上のアミノ酸残基の付加、欠落、
又は置換といった変化しかない）。こうした観点から、
本発明のポリペプチド軟骨誘導因子は、種又は由来には
無関係であって、また天然のものに限らず合成品であっ
ても構わない。更に、本発明のポリペプチド軟骨誘導因
子には、CIFと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドを含むのは勿論のこと、アミノ酸配列が異なる場合で
も、その相違は少数のアミノ酸残基の付加、欠落、又は
置換といった程度であって、非種特異的な活性は維持し
ているようなポリペプチドをも含むこととする。ここで
『非種特異的な活性』とは、ポリペプチドが誘発する細
胞増殖作用や軟骨形成又は骨形成作用は、ポリペプチド
に由来する種の組織に限らないということである。従っ
て、本発明のポリペプチドは骨や恐らくは多様な動物の
組織からも得られるし、或いは組換え体DNA技術によっ
ても得ることができる。ブタ又はウシの長骨は入手し易
く高濃度のペプチドを含むため天然のCIFs源として好ま
しい。

骨からCIFsを単離する方法は次の通りである。骨をまず
機械的に又は研摩して清浄にしてから粉砕し、さらに、
例えば希酸水溶液を使って好ましくは低温で洗浄する。
次に、エーテル又は酢酸エチル等の脂肪親和性溶媒で抽
出して脱脂する。この骨を通常はより強酸を使って抽出
して種々の形態で存在するリン酸カルシウムを除去して
無機質を除く。こうして生成した製剤（無機質を除去し
た骨）が本発明のポリペプチド製剤の出発物質になる。

最初の抽出は無機質を除去した骨から非繊維状（例え
ば、非コラーゲン質）蛋白質を除去するために行う。こ
の処理は（少なくとも約４モルの）グアニジンハイドロ
クロライド、（８モルの）尿素＋塩、又は、（少なくと
も1vol％の）ドデシル硫酸ナトリウム等のカオトロピズ
ム試剤を使用して行う。抽出された蛋白質の消化又は変
性の可能性を減少させるため、抽出は好ましくはプロテ
アーゼ抑制因子の存在下に低温で実施する。プロテアー
ゼ抑制因子の例としては、フェニルメチルスルホニルフ
ルオライド（PMSF）、アジ化ナトリウム、Ｎ−エチルマ
レイン酸イミド（NEM）、ベンズアミジン、及び６−ア
ミノヘキサン酸がある。抽出媒体のpHは用いる抽出剤の
種類により、抽出工程には通常約４時間から１日を要す
る。

抽出後、抽出剤は（必要であれば限外ろ過して濃縮
後、）水に対して透析する等の適当な方法で除去するこ
とができる。塩類も制御条件下での電気泳動又は分子ふ
るいによって除去できる。蛋白質の変性を最小限にする
ためこの工程の間も低温を維持するのが好ましい。

別法として、抽出剤を除去せずに、例えば限外ろ過によ
って単に溶液を濃縮するだけでも良い。

カオトロピズム試剤に溶解又は再溶解した抽出物を限外
ろ過し分子量約40,000ダルトン未満のフラクションを得
る過程で純度が大きく高まる。ゲル・サイジングは標準
的な方法、好ましくはセファクリル（Sephacryl）カラ
ムを使って室温（10〜25℃）で行う。低分子量のフラク
ションは続いて、pH約4.5〜5.5好ましくは約4.8で尿素
等のカオトロピズム試剤の存在下にカルボキシメチルセ
ルロース（CMC）を用いてイオン交換クロマトグラフィ
ーに供する。ポリアクリルアミド及び架橋デキストラン
からの誘導体を始めとする他のカチオン交換体も使用で
きるが、セルロース性カチオン交換体が好ましい。もち
ろん、他のイオン交換手順と同様に、溶液中から競合イ
オンを除いてからカラムに供し、徐々に溶剤の塩濃度を
高めて溶出しなければならない。約150〜250mMのNaCl溶
液でCMCから溶出されるフラクション中にCIFsが含まれ
る。

カチオン交換クロマトグラフィーからの溶出フラクショ
ンを次に最終精製工程としてRP−HPLC又は非変性ゲル電
気泳動処理する。RP−HPLC及びゲル電気泳動は標準的な
方法を用いる。以下の実施例においては市販のRP−HPLC
カラムを用いた。この最終精製工程により２種類のポリ
ペプチドが実質的に純粋な形で得られる。「実質的に純
粋な」とはポリペプチドが約5wt％未満しか不純物を含
まないことを意味する。

（実施例） 以下に示す実施例は特定の試料に適用される精製工程を
説明するためのものであって、本発明を限定するための
ものではない。

A.無機成分を除去した骨の調製 屠殺場で屠殺したばかりの牛の中足骨を求めドライアイ
スで冷却して輸送した。この骨の骨髄及び非骨組織で洗
浄して除いてから直径1cm未満の小片に破砕後、ミル中
で４℃で粉砕した。粉砕した骨を骨1Kg当り9.4lの２回
蒸留水で各15分づつ２回洗浄し、続いて４℃の0.01NHCl
溶液で終夜洗浄した。洗浄した骨を容積３倍のエタノー
ルで３回、続いて容積３倍のジエチルエーテルで３回脱
脂した。各洗浄は全て室温で、それぞれ20分間かけて行
った。続いて、得られた脱脂骨粉から４℃の0.5N HCl溶
液中（25l/kg脱脂骨）で無機成分を除去した。酸をデカ
ンテーションで棄て、生成したDMBをpHが４を越えるま
で洗浄後、吸引ろ過して乾燥した。

B.非コラーゲン質蛋白質の抽出 項Ａで作製したDMBをDMB1kg当り3.3lの4Mグアニジン・H
Cl,10mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）,1mMPMSF,10mM
NEM,pH6.8を使って16時間抽出後、懸濁液を吸引ろ過
し、不溶物を再度４時間抽出した。可溶性のフラクショ
ンを合体してアミコン（Amicon）限外ろ過（10K）ユニ
ットを使って限外ろ過して少なくとも５倍に濃縮し、濃
縮物を35容量倍の脱イオン水を６回交換して４日間透析
後凍結乾燥した。この項の凍結乾燥以外の工程は全て４
℃で行い、凍結乾燥は標準的な凍結乾燥条件で実施し
た。

C.ゲルろ過 Ｂ項からの抽出物を4Mグアニジン・HCl溶液に再溶解
し、これを4Mグアニジン・HCl,0.02％アジ化ナトリウ
ム,10mMEDTA（pH6.8）で平衡させたセファクリルＳ−20
0カラムで分画した。各フラクションについて280nmでの
吸光度及びELISA（以下に説明する）による軟骨形成活
性を測定し、各フラクションを第１図に示す通りとし
た。第１図のフラクションF₂は低分子量（LMW;10,000〜
40,000ダルトン）蛋白質フラクションで、最大の活性を
有する。これを180容量倍の脱イオン水に対して水を６
回交換して透析後、凍結乾燥した。なお、凍結乾燥及び
透析（４℃）以外の全ての操作は室温で実施した。

D.イオン交換クロマトグラフィー Ｃ項からのフラクションF₂を6M尿素,10mM NaCl,1mM NE
M,50mM酢酸ナトリウム（pH4.8）中に溶解し、10,000rpm
で５分間遠心分離した。得られた上澄み液を上記の緩衝
液で平衡させたCM52（市販のCMC）カラムで分画した。
上記緩衝液中にNaClを10mM〜400mMの濃度で逐次量を増
やして溶解した溶出液を用いて上記カラムから結合して
いる蛋白質を溶出した。溶出液の流量27ml/hr、全量を3
50mlとした。第２図に示すように３個の主要なフラクシ
ョン、CM−1,CM−2,及びCM−３を補集した。CM−２及び
CM−３は約150〜250mM NaCl溶液で溶出された。各フラ
クションを容積110倍の脱イオン水に対して６回（４日
間）透析後、凍結乾燥した。上述の操作は、透析（４
℃）以外、全て室温で実施した。

E.RP−HPLC Ｄ項からの凍結乾燥したフラクションCM−２とCM−３を
合体して0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）に溶解し、この
溶液の一部をヴィダック（Vydac）C18 RP−HPLCカラム
（内径4.6mm,長さ25cm）に担持後、0.1％TFAを用いて1m
l/minの速度で５分間洗浄した。溶出溶媒としては0.1％
TFA溶液中に０〜60％のアセトニトリルを加えたものを
用い、溶出速度は２％/minとした。

CM−２とCM−３を合体したもののRP−HPLCから２個のピ
ークが得られた（ピークＡ約29.5分後，ピークB 約31.2
分後）。第３図にピークＡ及びＢの吸光度及び電気泳動
プロフィル（還元及び非還元状態）を示した。これらの
ピークの蛋白質をそれぞれCIF−Ａ及びCIF−Ｂと呼ぶ。

これらの蛋白質を使用時まで−20℃で0.1％TFA/アセト
ニトリル溶出液中に貯蔵した。

F.ゲル電気泳動法による別の精製方法 凍結乾燥したフラクションCM−２とCM−３を合体し、ペ
イニム等（Paynim,S.and Chalkley,R.,Arch Bioch Biop
hys（1969）130:337〜346）の一般法を用いて酢酸−尿
素ゲル上の電気泳動で分画した。

G.生体外での軟骨形成活性の測定 精製時にフラクション中に所望の蛋白質が存在すること
は軟骨特異性プロテオグリカン（PG）の産生の生体外測
定で確認し、ELISAで固定した。この測定はラット胎児
の筋肉から単離した間葉細胞を用いるアガロースゲル培
養モデルである。これにより試料のPG生産誘起能力が評
価される。生体外での軟骨誘発と生体内での骨形成の関
係はセイデン等（Seyedin,S.et al.J Cell Biol（198
3）97:1950〜1953）が示している。

細胞培養基は生後19日のスプラク・ダウリー（Spraque
Dawley）ラット胎児の上肢から無菌的に筋肉組織を切断
し、これを細かく切り刻んでから、イーグル最少必須培
地（MEM）中で10％ウシ胎児血清（FBS）並びに1ml当り
ペニシリン50unitとストレプトマイシン50μｇを使って
培養して作製した。細胞の成長は通常１週間以内で集密
に達するのでここで細胞をトリプシン処理し、1:2に分
割して最初の３継代以内に実験に用いた。

細胞をアガロースゲル培養基中に対照培地又は試験用試
料と共に入れた。手順は基本的にベニヤ等（Benya,et a
l,Cell（1982）30:215）に準じた。すなわち、細胞の単
分子層をトリプシン処理により採取して血球計で計数
し、試験用蛋白質フラクションが存在する又は存在しな
い培地に最終的な細胞濃度の２倍の濃度で再懸濁した。
対照培地はそれぞれ10％FBS及び抗生物質を含むHamsF−
12,Dulbecco′ｓ最小必須培地（DMEM）、又はCMRL1066
（Gibco）とした。0.01N HCl中の試験用蛋白質フラクシ
ョンを所望の蛋白質濃度まで直接的に希釈後、Ｆ−12中
の１％低融点アガロース（Bio−Rad,＃162−0017）を等
容量使って希釈し、この希釈溶液0.2mlを１％高融点ア
ガロース（Bio−Rad,＃162−0100）0.15mlで被覆した17
mmのウェルに塗布した。作製した培養基を37℃で５分間
培養後４℃で10分間冷却し、続いて1mlの相当する培地
（対照又は試験蛋白質）で覆った。次いで細胞をCO₂５
％，空気95％の湿度を高めた雰囲気中で培養し、その後
対照培地で完全に替えて３〜４日ごとに養分を供給し
た。７日後に培養基を凍結し、測定まで−80℃で保存し
た。

培養基を４℃で融解後、酢酸ナトリウム50nM,EDTA13mM,
NEM6mM、及びPMSF 3nMを含む4Mグアニジン・HCl溶液中
にpH5.8で均等に分散し、さらに４℃で終夜振とう抽出
して測定した。４℃、25,000×ｇで40分間遠心分離して
得た上澄み液を容積50倍の0.2M NaCl,50mM Tris溶液（p
H7.4）に対して４℃で終夜透析した。透析した上澄み液
をレナルド等（Renard,et al,Anal Biochem（1980）10
4:205,及び米国特許第4,434,094号）の記載に準じてPG
についてELISA測定した。

ELISAについて簡単に説明すると、ヒアルロン酸又はラ
ットの骨から抽出されたPGとの交差反応性を示さない標
準的な技術を用いてウサギ中でPGに対する抗血清を増大
させた。スォーム（Swarm）ラットの軟骨肉腫組織から
の精製PG（Seyedin,S.,et al,前掲）を標準抗原として
用いた。透析した試料をツィーン（Tween）20 0.05％，
ウシ血清アルブミン（BSA）1mg/mlを含む、リン酸塩で
緩衝した食塩水（PBS）（pH7.2）中に加えて1:1（容
量）に希釈して測定した。ホースラディッシュ・ペルオ
キシダーゼ抱合型（conjugated）ヤギ抗ウサギIgG（Tag
o）をｏ−フェニレンジアミンを基質とする第２の抗体
とした。

RP−HPLCで精製したCIF−Ａ及びCIF−ＢのELISAの結果
を第４図に示す。測定感度は培養基の１〜5ng/ml以内で
ある。

Ｆ項のゲル・スライスについてのELISAの結果を第５図
に示す。これらの結果はRP−HPLCにより得たCIF−Ａ及
びCIF−Ｂ（ゲル・スライス７と６に相当）の結果と対
応する H.精製CIF−Ａ及びCIF−Ｂの特性付け CIF−Ａはラエムリ等（Laemmli,U.K.,et al,Nature（19
70）227:680）の記載に準じてSDS溶液中の15％Laemmli
ポリアクリルアミドゲル中での蛋白質の易動度の測定
（第３図）から分子量25,800ダルトンで、還元すると分
子量14,800ダルトンのポリペプチドになることが判っ
た。この様にして求めた分子量は概数に過ぎず、これら
の値は測定方法によって変化するとはいうまでもない。
蛋白質の配座がこの系における易動度に影響するので、
得られる分子量は大体同程度になると考えられるが、他
の方法を用いた場合には必ずしも全く同一になるとは限
らない。還元した蛋白質のプロフィルに単一の帯域しか
存在しないことは、恐らくこの蛋白質がアミノ酸配列が
実質的に等しい２本のポリペプチド鎖から成る二量体
（つまり、ホモダイマー）であることを示している。二
量体の実測分子量と個々の鎖の実測分子量の矛盾は測定
方法によるものである。

てCIF−Ａは、PBS中での100℃、３分間の加熱、0.1M Tr
is,pH7.4,5mM CaCl₂,0.02mM PMSF中でのコラーゲナーゼ
による37℃、２時間の処理（コラーゲンと蛋白質の比は
400unitsコラーゲン/mg蛋白質とした），及び50mMTris,
pH7.4,10mM CaCl₂中でのトリプシンによる37℃,2時間の
処理（トリプシンと蛋白質の比は100unitsトリプシン/m
g蛋白質とした）の後でさえも、上記Ｇ項のELISA測定の
活性を維持した。しかしながら、ジチオトレイトール
（DTT）5mMを含むPBS中、室温で１時間処理すると蛋白
質は活性を失い、この試薬はジスルフィド結合を還元す
るものと考えられた。同様に、SDS処理するかSDS−PAGE
で分画すると蛋白質は失活し、これは恐らく変性のため
かSDSとの複合体形成のためと考えられる。CIF−Ａの部
分的なアミノ酸組成を第１表に示す。

第１表 アミノ酸 測定値（Mols/100Mols） Asp 9.2 Gln 9.2 Ser 7.0 His 2.7 Gly 16.5 Thr 2.7 Arg 5.9 Ala 6.6 Tyr 3.2 Met 0.0 Val 7.5 Phe 3.0 Ile 3.9 Leu 8.6 Lys 13.9 Pro 検出されず Cys 検出されず Trp 検出されず CIF−Ａのアミノ酸配列分析の結果、次の様な単一のＮ
末端配列を持つことが判った。

このＮ末端配列はヒト胎盤由来のTGF−βについて報告
されているものと等しい。

CIF−Ｂは同一手順で測定した分子量が若干異なり26,00
0ダルトンだった。この差は分析方法に基づくものと考
えられる。従って、いずれの蛋白質もSDS−PAGEで測定
した分子量が約26,000ダルトンと見なすことができる。
この蛋白質のピークＢを還元すると分子量約14,200ダル
トンの単一の帯が認められ、この蛋白質も恐らくホモダ
イマーであることを示している。これは第２表に示すア
ミノ酸組成を有する。

第２表 アミノ酸 測定値（Mols/100Mols） Asp 12.0 Glu 8.5 Ser 10.6 His 0.9 Gly 22.0 Thr 0.0 Arg 4.3 Ala 6.7 Tyr 1.9 Met 0.0 Val 2.4 Phe 3.0 Ile 2.2 Leu 8.2 Lys 17.3 Pro 検出されず Cys 検出されず Trp 検出されず アミノ酸配列分析の結果、CIF−Ｂの単一のＮ末端配列
は以下の通りであることが判った。この蛋白質について
定性的に評価した他の特性は、 CIF−Ａについて上記したことと同様だった。

I.TGF−β活性の測定 CIF−Ａ及びCIF−Ｂをバイオアッセイで試験した。バイ
オアッセイは「血清を含まない動物細胞の培養に用いる
培地、サプリメイト、及び基質の作製方法」（Methods
for Preparation of Media, Supplements, and Substra
ta for Serum-free Animal Cell Culture（1984）,Alan
R.Liss, Inc.）の181〜914頁に記載の方法に準じて行
った。分析結果を第６図に示す。図示したように、いず
れの蛋白質もバイオアッセイで明瞭な投与応答を示し、
活性化には活性化試剤（EGF）の存在を必要とした。活
性水準はヒト血小板、ヒト胎盤，及びウシ腎臓由来のTG
F−βについての報告値とほぼ等しかった。

CIFsのトリプシン処理に対する活性維持能力ため、これ
らは無機成分を除去した骨粉から酵素消化によって単離
することができる。この工程においては、無機成分を除
去した骨粉をトリプシン及び／又は本発明の蛋白質を劣
化させないような他のプロテアーゼの水溶液で、これら
の酵素が活性化する条件下で消化する。この処理によっ
て骨粉中の他の蛋白質成分の大半が消化される。目的と
する蛋白質は消化後の液から、前述の分画方法（ゲルろ
過、イオン交換クロマトグラフィー、RP−HPLC,又は非
変性ゲル電気泳動）の幾つかを用いて精製することがで
きる。CIFsの骨基質からの遊離の程度、及び他の物質と
の複合対形成の程度によっては可溶化試剤を用いずに済
むこともある。なお、純粋な蛋白質は実質的に水溶性で
ある。

本発明CIFsは人間を含む動物の軟骨及び骨組織を補修、
代替、又は増大させるために軟骨や骨の成長を誘発する
効果がある。軟骨形成及び骨形成に有効な量のCIF−Ｂ
は骨中に存在する軟骨形成及び骨形成共同因子と組み合
わせて薬学的、生理学的に適当な液体又は移植用精製コ
ラーゲン等の固形担体と調合することができる。

また、活性蛋白質としてCIF−ＢにCIF−Ａを組合せて用
いることもできる。担体に対する活性蛋白質の重量比は
典型的には1:50〜1:1,000である。移植物は、活性成分
としての注入を含む、通常の外科技術で患者の予め定め
た部位に挿入することができる。活性成分としてCIFし
か含まない（つまり、活性化試剤や共同因子を全く含ま
ない）コラーゲン質移植物は、担体に対するCIFの比が
約1:6,000を越えると、コラーゲン質結合組織の沈着を
促進した。

本発明のCIFsはヒト血小板、ヒト胎盤、及びウシ腎臓起
源のTGF−βと同様に使用して非種特異的細胞増殖を促
す（刺激又は支持する）こともできる。こうした用途で
は、CIF−ＢをEGF又はTGF−α等のTGF−β活性化試剤と
適当な化学量論比で組み合わせる。

また、活性蛋白質としてCIF−ＢにCIF−Ａを組合せて用
いることもできる。これらの組成物の細胞増殖活性の医
療上への応用方法としては、火傷や傷の治癒のための局
所的な投与、組織増強用の移植、及び内傷治療用の系統
的投与等がある。こうした用途ではCIF及び活性化試剤
を、特定の投与形態に適する薬学上妥当な担体と共に、
細胞の増殖を誘発するに十分な量調合する。局所的な投
与では、通常、スプレー、ゲル、又は軟こう等の形に製
材する。また、系統的投与のためには、腸内投与用（例
えば、液剤、ピル、錠剤）又は腸管外注入用製剤とす
る。これらの用途に用いる投薬量は、細胞増殖の性質並
びに傷等の傷害の多様性のため、特定することができな
い。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例Ｃ項のゲルろ過フラクションの光学密度
（吸光度（280nm））及び体外での軟骨形成活性を示
す、セファクリルＳ−200から抽出された蛋白質のクロ
マトグラム。 第２図は実施例Ｄ項のイオン交換クロマトグラフィーか
らの溶出フラクションの光学密度（280nm）を示す（セ
チルメチルセルロース上での低分子量蛋白質のクロマト
グラム）。 第３図は実施例Ｅ項のRP−HPLCのピークＡ（CIF−Ａ）
及びＢ（CIF−Ｂ）についてのUV吸光度並びに電気泳動
プロフィルを示す（HPLC逆相カラムでのウシOFの単
離）。 第４図は実施例Ｅ項のRP−HPLCで得られたCIF−Ａ及びC
IF−Ｂの生体外での軟骨形成に関する酵素結合（enzyme
−linked）イムノソルベント・アッセイ（ELISA）の結
果を示す（OFの精製、HPLCフラクションＡ及びＢ）。 第５図は実施例Ｆ項の酸−尿素ゲル電気泳動フラクショ
ンのELISAの結果を示す（酸−尿素ゲルからのOF活性成
分の溶出、軟骨プロテグリカンについてのELISA）。 第６図は実施例Ｉ項に記載のTGF−βアッセイの結果を
示す（軟質寒天培養基中におけるEGF及び、CIF−Ａ又は
Ｂで処理したNRK細胞による集落形成）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/26 1/34 (56)参考文献 特開 昭59−190919（ＪＰ，Ａ) 国際公開84−01106（ＷＯ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．258（1983) Ｐ．7155−7160 Ｓｃｉｅｎｃｅ 221（1983）Ｐ．1292 −1294

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）哺乳類の骨に存在し、（ｂ）軟骨形
   成を誘発するための共同因子であり、（ｃ）TGF−βア
   ッセイで活性を示し、（ｄ）SDS−PAGEで測定した分子
   量が約26,000ダルトンの二量体であって、（ｅ）前記二
   量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列 Ala−Leu−Asp−Ala−Ala−Tyr−Cys−Phe−Arg−Asn−
   Val−Gln−Asp−Asn−Cys−Cys−Leu−Arg−Pro−Leu−
   Tyr−Ile−Asp−Phe−Lys−Arg−Asp−Leu−Gly−Trp− を有することを特徴とする、ポリペプチド軟骨誘導因
   子。
2. 【請求項２】前記骨が牛骨であることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項に記載の因子。
3. 【請求項３】（ａ）哺乳類の骨に存在し、（ｂ）軟骨形
   成を誘発するための共同因子であり、（ｃ）TGF−βア
   ッセイで活性を示し、（ｄ）SDS−PAGEで測定した分子
   量が約26,000ダルトンの二量体であって、（ｅ）前記二
   量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列 Ala−Leu−Asp−Ala−Ala−Tyr−Cys−Phe−Arg−Asn−
   Val−Gln−Asp−Asn−Cys−Cys−Leu−Arg−Pro−Leu−
   Tyr−Ile−Asp−Phe−Lys−Arg−Asp−Leu−Gly−Trp− を有するポリペプチド軟骨誘導因子を少くとも含むこと
   を特徴とする軟骨形成及び骨形成誘導用移植組成物。
4. 【請求項４】前記骨が牛骨であることを特徴とする特許
   請求の範囲第３項に記載の移植組成物。
5. 【請求項５】（ａ）哺乳類の骨に存在し、（ｂ）軟骨形
   成を誘発するための共同因子であり、（ｃ）TGF−βア
   ッセイで活性を示し、（ｄ）SDS−PAGEで測定した分子
   量が約26,000ダルトンの二量体であって、（ｅ）前記二
   量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列 Ala−Leu−Asp−Ala−Ala−Tyr−Cys−Phe−Arg−Asn−
   Val−Gln−Asp−Asn−Cys−Cys−Leu−Arg−Pro−Leu−
   Tyr−Ile−Asp−Phe−Lys−Arg−Asp−Leu−Gly−Trp− を有するポリペプチド軟骨誘導因子を少くとも含み、該
   因子の活性化試剤又は共同因子を含まないことを特徴と
   する結合組織沈着促進用移植組成物。
6. 【請求項６】前記骨が牛骨であることを特徴とする特許
   請求の範囲第５項に記載の移植組成物。
7. 【請求項７】（ａ）哺乳類の骨に存在し、軟骨形成を誘
   発するための共同因子であり、TGF−βアッセイで活性
   を示し、SDS−PAGEで測定した分子量が約26,000ダルト
   ンの二量体であって、前記二量体の各々の鎖が以下に示
   すＮ末端配列 Ala−Leu−Asp−Ala−Ala−Tyr−Cys−Phe−Arg−Asn−
   Val−Gln−Asp−Asn−Cys−Cys−Leu−Arg−Pro−Leu−
   Tyr−Ile−Asp−Phe−Lys−Arg−Asp−Leu−Gly−Trp− を有するポリペプチド軟骨誘導因子を少くとも含み、さ
   らに、 （ｂ）TGF−β活性化試剤を含むことを特徴とする、正
   常な動物細胞の増殖促進用組成物。
8. 【請求項８】前記骨が牛骨であることを特徴とする特許
   請求の範囲第７項に記載の組成物。
9. 【請求項９】（ａ）無機成分を除去した骨を非繊維状蛋
   白質を可溶化するカオトロピズム抽出剤で処理し、 （ｂ）工程（ａ）からの抽出物をゲルろ過して分子量1
   0,000〜40,000ダルトンの蛋白質を含むフラクションを
   回収し、 （ｃ）工程（ｂ）からのフラクションをpH約4.5〜5.5の
   変性条件下でカルボキシメチルセルロース・カチオン交
   換体に吸着させ、 （ｄ）前記吸着フラクションを濃度勾配をつけた塩化ナ
   トリウム溶液を使って前記カチオン交換体から溶出し、 （ｅ）塩化ナトリウム濃度約150〜250mMで溶出する工程
   （ｄ）の溶出物をRP−HPLC又は非変性ゲル電気泳動に供
   し、そして （ｆ）RP−HPLC又は非変性ゲル電気泳動からポリペプチ
   ド軟骨誘導因子を回収する工程から成ることを特徴とす
   る、哺乳類の骨に存在し、軟骨形成を誘発するための共
   同因子であり、TGF−βアッセイで活性を示し、SDS−PA
   GEで測定した分子量が約26,000ダルトンの二量体である
   ポリペプチド軟骨誘導因子を骨から単離する方法。
10. 【請求項１０】前記ポリペプチド軟骨誘導因子の前記二
    量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列 Ala−Leu−Asp−Thr−Asn−Tyr−Cys−Phe−Ser（Ser）
    Thr−Glu−Lys−Asn−Cys−Cys−Val−Arg−Gln−Leu−
    Tyr−Ile−Asp−Phe−Arg−Lys−Asp−Leu−Gly−Trp− を有することを特徴とする特許請求の範囲第９項記載の
    方法。
11. 【請求項１１】前記ポリペプチド軟骨誘導因子の前記二
    量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列 Ala−Leu−Asp−Ala−Ala−Tyr−Cys−Phe−Arg−Asn−
    Val−Gln−Asp−Asn−Cys−Cys−Leu−Arg−Pro−Leu−
    Tyr−Ile−Asp−Phe−Lys−Arg−Asp−Leu−Gly−Trp− を有することを特徴とする特許請求の範囲第９項記載の
    方法。