JPH0795955B2 - 自律複製配列を有するｄｎａ断片、同断片を含有するハイブリツドプラスミド、同ハイブリツドプラスミドにより形質転換した大腸菌及び当該ｄｎａ断片の製造方法 - Google Patents

自律複製配列を有するｄｎａ断片、同断片を含有するハイブリツドプラスミド、同ハイブリツドプラスミドにより形質転換した大腸菌及び当該ｄｎａ断片の製造方法

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JPH0795955B2 JP60243781A JP24378185A JPH0795955B2 JP H0795955 B2 JPH0795955 B2 JP H0795955B2 JP 60243781 A JP60243781 A JP 60243781A JP 24378185 A JP24378185 A JP 24378185A JP H0795955 B2 JPH0795955 B2 JP H0795955B2
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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は組換DNAについての技術分野に関する。この
発明の一つの側面は、ピキア（Pichia）属の宿主におい
て染色体外要素として保持されるDAN断片に関する。こ
の発明の他の側面は、上述のDAN断片を組み込んだベク
ターの発現に関する。更にもう一つのこの発明の側面
は、上述の発現ベクターで形質転換した新規な微生物に
関するものである。更にもう一つの側面はこの発明に係
る新規のDAN断片を分離する方法に関する。
組換DNA技術において使用される基本的な技術は当業者
には既知のことである。組換DNA技術の実施に必要な宿
主微生物に望まれる要素としては次のものがあるが、こ
れのみに限定されるわけではない。
（１） ひとつ以上の所望のポリペプチドの遺伝情報を
暗号化して居り、かつ宿主微生物中で発現するに必要と
される適切な調節配列を有していること。
（２） ベクター、通常はプラスミドであるが、その中
に調節配列の挿入できること。このベクターは細胞中へ
の遺伝子の導入を可能にし、細胞中でDNA配列を保持す
るのに役立つ。そのベクター中に自律複製配列が生まれ
ている場合は、細胞あたり当該ベクターの多数のコピー
が得られ、上述の遺伝子の発現も高水準となる。
（３） 適切なる宿主微生物で、かつこの宿主は所望の
遺伝子を有するベクターで形質転換することができ、ま
たその宿主微生物は挿入された遺伝子により暗号化され
ている情報の発現を許す細胞質の器具を有しているこ
と。
組換DNA技術に使用される基本的要素はプラスミドであ
り、染色体外で、二重鎖のDNAで、ある種の微生物内で
見出されたものである。天然に微生物中に存在するとし
て見出されたプラスミドの場合、細胞１個あたりの多数
のコピーがしばしば存在することが見出されている。天
然に存在するプラスミドに加えて、種々の人工プラスミ
ドやハイブリツドベクターも作成されている。プラスミ
ドDNA中に暗号化されている情報中に含まれているもの
で、娘細胞中でプラスミドを再生するときに必要とされ
るもの、それは自律複製配列である。一つ又はそれ以上
の遺伝子表現型の選抜特性が、プラスミドDNA中に暗号
化されている情報中に含まれていなければならない。こ
の遺伝子表現型の選抜特性は、選抜培地中で細胞の優先
的成育により区別され、選抜されうる利益を有する当該
プラスミドを含有する宿主細胞のクローン化を可能とす
る。
プラスミドの利用性は、一種又は他の種類の制限エンド
ヌクレアーゼ又は制限酵素、いずれも当該プラスミド上
に定まつた特異的切断部位を認識するのであるが、その
酵素により特定の個所で切断されるという事実に存す
る。切断した後、同属、又は宿主以外の微生物由来の外
来性の、遺伝子、あるいは遺伝子断片を、切断部位又は
切断部位に隣接し再構築された部位で、切断されたプラ
スミドと所望の遺伝子材料との末端を結合させることに
より挿入する。生成した組換DNAはハイブリツドベクタ
ーと称することもできる。
DNA組換は宿主微生物の菌体外で行なわれる。生成した
ハイブリツドベクターは形質転換として知られている過
程により宿主微生物へと導入される。形質転換された微
生物を成育させることにより大量のハイブリツドベクタ
ーを得ることができる。遺伝子がそのDNA中に暗号化さ
れている情報の転写及び翻訳をつかさどるプラスミド中
の場所に関して正しく挿入された場合は、生成したハイ
ブリツドベクターは挿入遺伝子をコード化したポリペプ
タイド配列の生産を指示するために使用することができ
る。ポリペプチドのこの方法による生産を遺伝子発現と
いう。
現在まで、種々のポリペプチドを生産するために組換DN
A技術を商業的に使用しようとする試みは宿主生物とし
て大腸菌を用いるものに集中している。しかし、ある場
合には大腸菌は宿主として適切でないということが判明
している。例えば、大腸菌は医薬品として有用なポリペ
プチドから除外しなければならない有害な発熱因子を多
数含有している。この精製が良好に実施されるための効
率は、勿論、特定のポリペプチドにより異なる。更に、
大腸菌の蛋白分解能がある種の有用な製品の収率を著る
しく制限する。これら及びその他の点を配慮し、代替宿
主、特にポリペプチドの生産のために真核生物を使用す
ることに興味の対象が移りつつある。
真核性すなわち酵母におけるポリペプチド製品の生産の
手段が存在することは、組換DNAにより暗号化されたポ
リペプチドの生産に大腸菌などの原核系を使用すること
と比較して、顕著な利点を提供できることになつた。酵
母は、大腸菌の大規模醗酵が比較的最近になり到来した
のに比し、数世紀にもわたり大規模醗酵に使用されてき
ている。酵母は、最近に比較して一般的に高い菌体濃度
でも成長でき、連続醗酵工程にも応用されている。事
実、ピキア パストリス （Pichia pastoris）などの酵母は、極めて高い細胞濃
度、すなわち100g/を越える細胞濃度でも育成できる
ことが米国特許第4,414,329号（フイリルツプス石油
（株）所有）にウエグナーにより開示されている。酵母
宿主の別の利点の中には、生物の多くの臨界的機能、例
えば酸化的リン酸化反応が細胞機関の中に存在するの
で、そのため野生型の宿主細胞にとつては異物であるポ
リペプリドの当該生物による生産により、場合によつて
は起りうる恐ろしい作用にさらされることがないという
事実も含んでいる。真核生物として、酵母は発現された
ポリペプチド生産物をグルコール附加ができ、そのグル
コース附加はポリペプチド生産物の生物活性にとつては
重要である。真核生物として酵母は高等生物と同様のコ
ードン優位性を示し、哺乳動物の遺伝子又は例えば哺乳
動物のmRNAからの逆転写により得られた相補的DNA（cDN
A）由来の発現製品の効率的生産へと向うこともまた可
能である。
充分に特性が明らかにはされていない酵母類の宿主／ベ
クター系としての開発は形質転換条件についての知識の
欠如と適用なベクターが存在していないことによりずい
ぶんと妨害された。更に、栄養要求突然変異株はしばし
ば入手出来なく、このため栄養要求的補体により形質転
換体を直接選抜することを不可能としている。もしも、
組換DNA技術が充分にその約束をはたせたら、DNAの操作
を可能とし挿入したDNA配列の発現を適正化し、その結
果、所望のポリププチド製品が制御された条件下で、か
つ、高収率で調製出来ることとなる新しい宿主／ベクタ
ー系が発明されるにちがいない。
この発明により、本発明者は、染色体外要素として組換
DNA材料を１細胞あたり多数コピー保持することを助け
る自律複製配列の発見、分離及び特性を明らかにした。
更に、いかなる給源からのDNAでもピキア属の酵母中で
自律複製する能力を有するDNA配列を分離する方法を提
供するものである。
この明細書中では次の略号で使用した制限酵素を表わし
た。省略記号 制限酵素 Ａ Alu I Ah Aha III Av Ava I Ｂ BamH I B2 Bgl II Ｃ Cla I H2 Hind II H3 Hind III Md Mbo II Nr Nru I Ps Pst I Pv2 Pvu II Rs Rsa I R1 EcoR I Ｓ Sal I Sm Sma I Sp Sph I S3 Sau3A I Ｔ Taq I Xh Xho I 添付した図面の中で、DNAの操作に使用した制限部位で
リゲーシヨンの際破壊したところは、破壊部位に対応す
る省略記号をカツコで囲んで表示した。核酸配列により
予測しうる制限部位ではあるが、実際の制限酵素処理に
より立証されていない個所は、星印を当該制限部位につ
けて表示した。
この発明は、ピキア属の宿主中で染色体外要素としてプ
ラスミドを保持する、自律複製配列を含む新規なDAN断
片を提供するものである。
更にこの発明は、ピキア属の宿主中で自律複製力を有す
るDNAの配列を、給源のいかんをとわず、分離する方法
を提供するものである。
この発明の実施に使用することのできる宿主生物はピキ
ア属に属する様々な種を含む。有用な宿主のグループと
しては栄養要求性の突然変異株である。すなわち、成長
のために一つ以上のアミノ酸、ビタミン又は他の栄養素
を補充する必要のある変異株である。このような変異株
の形質転換体は、変異株宿主の形質転換に使用する組換
DNA材料の一部として、失われた遺伝子製品の生産を暗
号化しているDNA配列を使用することにより選抜でき
る。
最も好ましい宿主酵母は変異株ピキア パストリスGS11
5株であり、これはヒスチジンを生産する能力を欠く変
異株で、変異株遺伝子型his4を有していると同定されて
いる。GS115株はピキア パストリスNRRL Ｙ−11430よ
り誘導化されたもので、この発明が特許されたとき公衆
が自由に入手出来ることを確実とするため米国イリノイ
州ペオリア市にある米国農務省の北方地区研究センター
（Nothern Regional Research Center）に寄託してい
る。ピキア パストリスGS115株には1984年８月31日現
在、NRRL Y15851の寄託番号が付されている。この特異
な宿主は、ヒスチジン代謝経路における欠陥を有する栄
養要求性変異株であるので、有用である。勿論、当業者
にとつてはピキアの代謝経路において重要な他の多くの
遺伝子に関しての変異株が存在し、また分離することが
できることは容易に認めうるところである。それ故、他
の多くの宿主がピキア属の形質転換体として（使用）可
能であり、変異株宿主が欠損している遺伝子製品の生産
を暗号化している遺伝子が入手可能であるか、その遺伝
子を分離する能力を有しているかにより制限されるにす
ぎない。
ピキア パストリスNRRL Ｙ−15851はヒスチジノール
脱水素酵素の生産能を欠く変異株であると同定されてい
る。この同定は、ヒスチジノール脱水素酵素の基質、ヒ
スチジノールの存在下でNAAL Ｙ−15851の細胞からの
蛋白抽出物でニコチン酸アミド アデニ ジヌクレオチ
ド（NAD）の還元を測定することにより達成された。エ
ス・セレビシエ（S.cerevisiae）に使用されている命名
法にちなんで、NRRL Ｙ−15851における欠損をhis4C変
異と称する。
ピ・アストリスる Ｙ 11340株から全染色体DNAのSau3
Aによる一部消化及び引き続いての庶糖濃度勾配遠心法
によるHIS4遺伝子の分離を行なつた。エス・セレビシエ
−大腸菌シヤトルベクターYEp13（ATCC37115;第３図参
照）のBamH I切断部位に、５ないし20Kbpの断片をクロ
ーン化し、大腸菌を形質転換した。約53のコロニーを選
抜、一緒にし、全プラスミドDNAを抽出した。エス・セ
レビシエ5799−4D株（NRRL Ｙ−15859）、his4ABC変異
株のスフエロプラストを約１μｇのヒンネン等の方法に
よるYEp13ピキアDNAライブラリーと混合し、ヒスチジン
欠損培地で再生させた。全再生スフエロプラスト５×10
7個から、形質転換体としては、約１×103コロニーの原
栄養性酵母が得られた。DNAなしで培養した比較対照サ
ンプルではコロニーの発生はなかつた。20のHis+コロニ
ーから全酵母DNAを抽出し、大腸菌を逆形質転換させ
た。17の酵母DNA調製物がアンピシリン抵抗性コロニー
を形成した。これらのクローン化された断片は制限酵素
（切断物の）大きさ及び地図化並びに比較的厳格でない
条件下で標識されたエス・セレビシエHIS4断片とクロス
ハイブリダイゼーシヨン（ポストハイブリダイゼーシヨ
ン洗浄は55℃でSSCで２回実施）能により更に特性が明
らかとされた。このHIS4含有断片はそれぞれが１つ以上
のエス・セレビシエHIS4遺伝子とハイブリツド化した断
片を含有していた。そのうちの１つのHIS4含有プラスミ
ドを再びクローン化して、pYJ8と命名したHIS4含有プラ
スミドが得られたが、それは第４図に示している。プラ
スミドpYJ8はpBR325配列を含有し、この配列はクロラム
フエニコール及びアンピシリン抵抗性遺伝子と更にピキ
アHIS4遺伝子を含んでいる。
pYJ8からの6.0KbpピキアDAN断片をサブクローン化する
ことにより、この2.7KbpのDAN断片はピキア又はサツカ
ロミセスをHIS4A、HIS4B又はHIS4C遺伝子を暗号化させ
た活性に欠損を持つ菌株に形質転換する能力を保有して
いることが判明した。それ故、例えばhis4変異株である
ピキア パストリスNRRL Ｙ−15851（GS−115）株は、
プラスミドpYJ30及びpYJ32で形質転換するとヒスチジン
の添加されていない培地中でも成育できる。（第７図及
び第８図参照）。これらの二つのプラスミドは、ピキア
染色体DNAの2.7Kbp Bgl II断片をそれぞれ含有し、と
もにHIS4遺伝子機能を暗号化して保有している。
ピキア パストリアの形質転換操作の実験的操作は詳細
に以下に述べる（実施例Ｉ）。ピー・パストリアの形質
転換系の開発のために、栄養要求性変異株GS115（NRRL
Ｙ−15851）を分離し、当該菌株が検出しうるヒスチ
ジオール脱水素酵素活性を有していないことからヒスチ
ジン代謝系において欠点を有していることが判明した。
GS−155（NRRL Ｙ−15851）はスフエロプラストを生成
する細胞壁の酵素分解により形質転換することが出来
る。そのスフエロプラストは形質転換組換DNA材料と混
合し、カルシユウムイオンとポリエチレングリコールの
存在下でインキユベートし、ヒスチジンを欠く淘汰用培
地で再生させる。形質転換DNAはHIS4遺伝子を含有し、
宿主株は当該遺伝子を欠くため、使用した淘汰用培地上
では形質転換された細胞のみが生存する。
この発明のベクターはピキア由来の栄養要求性の複数の
自律複製配列（PARSs）を含有し、GS115（NRRL Ｙ−15
851）の形質転換頻度と共にピキア属の酵母中で安定な
染色体外要素としてのベクターの保持力を高める。これ
らの自律複製配列は、エス・セレビシエから分離した公
知の自律複製配列（ARS）はピキア属の宿主では機能し
ないために、有用である。それ故、酵母中でのポリペプ
チド製品の生産に使用可能な発現系としてピキアを開発
するためには、ピキア中でARS能を有するDNA配列を分離
することが必要となつた。
ピキア用ARSを探し出すため、Taq Iでピキア パストリ
スNRRL Ｙ−15851由来のDNAを一部消化し、５ないし10
Kbpの断片を分離し、pYJ8ΔCl aの特異的Cl a I部位へ
とクローン化した（第５図参照）。プラスミドDNAを大
腸菌内で増幅し、回収し、ピキア パストリスNRRL Ｙ
−15851の形質転換に使用した。プラスミドDNAを約10,0
00のHis+コロニーから回収し、大腸菌を再形質転換する
のに使用した。約10,000のアンピシリン抵抗性大腸菌コ
ロニーからプラスミドを分離し、ピー・パストリスNRRL
Ｙ−15851（GS115、his4）を逆形質転換した。このサ
ブライブライー形質転換内からの40のHis+酵母コロニー
を選抜用培地上に塗布し、それぞれ独立に淘汰培地上で
成育させた。これらの40の培養物から全酵母DNAを抽出
し、大腸菌を形質転換した。二つのプラスミド、PARS1
を含有するpYA63及びPARS2を含有するpYA90を更に解析
するために選抜した。これらのプラスミドは両者ともピ
キア パストリスNRRL Ｙ−15851（GS−115）を非常に
高い頻度で形質転換し、自律要素として保持され、それ
ぞれピー・パストリスDNAの新規断片を含有していた。
pYA63及びpYA90かららの新規な自律複製配列をプラスミ
ドpYM4の特異的Cl a I部位（第６図参照）へとサブクロ
ーン化したところプラスミドpYJ30及びpYJ32がそれぞれ
得られた。プラスミドpY30は第７図に詳細に示し、プラ
スミドpYJ32は第８図において同様に示してある。この
両プラスミドで大腸菌宿主を形質転換し、この出願が特
許されたとき大衆が自由に入手出来るようにするために
イリノイ州ペオリア市米国農務省北方地区研究センター
に寄託してある。寄託した菌株は次の寄託番号が付与さ
れている。
プラスミド 宿主菌株 NRRL寄託番号 pYJ30 LE392 NRRL Ｂ−15890 pYJ32 LE392 NRRL Ｂ−15891 この発明の自律複製配列、PARS1及びPARS2はそれぞれpY
J30及びpYJ32から両プラスミドを制限酵素EcoR I及びHi
nd IIIで処理することにより簡単に回収可能である。所
望のARS要素は５′末端（R1部位の隣り）での約23個の
余分の塩基対と、３′末端での（H3部位の隣り）で約５
個の余分の塩基対と共に得られる。PARS1及びPARS2は、
当業者ならば第７図及び第８図に示した制限地図を検査
することにより容易に認識できるようにpYJ30及びpYJ32
を他の制限酵素を種々組合せて、当該プラスミドを処理
することによつても得ることができる。PARS1及びPARS2
挿入は制限酵母の地図化により特性が明らかとされてい
る。これらの二つのDAN断片は第１図及び第２図にそれ
ぞれ示してある。
これらのDNA断片は比較的小さいため、完全な配列が明
らかになつている。PARS1の核酸の配列は次の通りであ
ると決定されている。
PARS2の核酸配列も次の通りであると決定されている。
当該PARSがピキア中の自律要素としてプラスミドを保持
する能力を測定するために、プラスミドpYJ30及びpYJ32
で形質転換した酵母細胞の培養物を選抜用培地中で成育
させ、定期的にサンプルを採つた。細胞中でのプラスミ
ド配列の状態は放射能で標識したpBR322と制限酵素を作
用させてない酵母のDNAとサザンハイブリダイゼーシヨ
ンにより決定した。プラスミドpYJ30及びpYJ32は、選抜
用培地中で少くとも50世代ピキア中で自律要素として保
持されていた。
ピキア パストリスの細胞あたりの平均プラスミドコピ
ー数は、ピキアHIS4遺伝子のゲノムコピー数とプラスミ
ド由来のHIS4遺伝子のそれとの比から導びき出された。
pYA63及びpYJ30（それぞれPARS1を含有）とpYA90及びpY
J32（それぞれPARS2を含有）で形質転換したピキア パ
ストリス細胞の場合では、ピキアの染色体HIS4遺伝子の
コピーに対するピキアHIS4遺伝子を含むプラスミドの平
均コピー数の比は約10〜15であつた。ここに記載した如
く、誘導されたコピー数は、細胞あたりのプラスミドコ
ピー数に対する最小推定値を示すものであることは、当
業者には認識されている。
一般に、ピキア属の宿主中で自律複製能力を有するDNA
配列は、マーカー遺伝子を他のDNA配列の間に含有して
いるが、ピキア内でARS能を有するDNA配列を含まないベ
クター内に構築されたDAN断片のライブラリーで、ピキ
ア宿主を形質転換することにより分離できる。使用した
マーカー遺伝子は、宿主の酵母に選抜しうる遺伝表現型
を与える。当該ベクターでの宿主菌株の形質転換の発生
頻度は、ARS能を有するDNA配列がベクター中に存在する
ときに、修飾していないベクターでの形質転換の発生頻
度と比較して、１ないしそれ以上のオーダーで増加す
る。それ故、形質転換された宿主の選抜及び分離は、AR
S能を有する挿入DNA配列をもつプラスミドを保有する生
物を提供する。この方法で、ARS能をピキア内で有するD
NAはいかなる給源からのものでも容易に分離することが
できる。
実施例 以下の実施例で使用する緩衝液及び溶液は次の組成を有
する。
１モルトリス緩衝液： 800mlの水に121.1gのトリス塩基、pHを所望の値に濃塩
酸（35％）を加えて調整。
最終pH調整前に溶液を室温まで冷却し、最終液量を１
とする。
TE緩衝液： 1.0ミリモルEDTAを0.01モルのトリス緩衝液（pH＝7.0）
に添加 SSC: 0.15モルのNaCl 15ミリモルのクエン酸ソーダ pHをNaOHで7.0に調整 デンハート（Denhardt′ｓ）氏溶液： 5gのフアイルコール（Ficoll） 5gのポリビニルピロリドン 5gの牛の血清アルブミン（BSA:ペンタツクス フラクシ
ヨンＶ） 水で全量を500mlとする。
LB（LUria−Bertani）培地： 5gのバクトートリプトン 5gのバクトーイースト抽出物 2.5gのNaCl を１の水に含み、pHは7.5に NaOHで調整 YPD培地： １％のバクトーイースト抽出物 ２％のバクトーペプトン ２％のテキストローズ SD培地： 6.75gのアミノ酸を含まない酵母用窒素源（DIFCO製） ２％のデキストローズ を１の水に含む SED: １モルのソルビトール 25ミリモルのEDTA 50ミリモルのDTT SCE緩衝液： 9.1gのソルビトール 1.47gのクエン酸ソーダ 0.168gのEDTA 50mlのH2O pHをHClで5.8とする。
CaS: １モルのソルビトール １ミリモルのCaCl2 濾過後、滅菌 PEG溶液： 20％のポリエチレングリコール−3350 10ミリモルのCaCl2 10ミリモルのトリス塩酸塩（pH7.4） 濾過後、滅菌 SOS: １モルのソルビトール 0.3倍のYPD培地 10ミリモルのCaCl2 次の略号を実施例で使用しているが、以下の意味を有す
るものである。
EDTA＝エチレンジアミン テトラ酢酸 SDS＝ドデシル硫酸ソーダ DTT＝ジチオスレイトール（dithiothreitol） 数種類の操作手順をルーチン的に以下に詳細にのべる標
準手順にもとづき用いた。
遠心分離は澄明な上澄液が得られるに拾ぶな回転速度
で、充分な時間をかけて行なつた。一般には、酵母細胞
の遠心分離は少なくとも1,500Gで少なくとも５分間行な
つた。
核酸のフエノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ルでの抽出は、フエノール、クロロホルム及びイソアミ
ルアルコールの、容量比で58:48:2の混合液を核酸を含
む溶液と等量接触させることを含む。クロロホルム／イ
ソアミルアルコールでの抽出は、クロロホルムとイソア
ミルアコールの容量比で48:2の混液を処理すべき液と等
量接触させることを含む。
ゲル、フイルターなどを特定の溶液で洗浄又は浸漬した
と記述している場合は、ゲル、フイルターなどの全体
を、当該ゲル、フイルター等の全表面を当該溶液に接触
させるために適当な容器（パン、皿、バイアルなど）の
なかにひたした。
エタノールによる核酸の沈澱はまず核酸を含む溶液の塩
類濃度を調整し、必要に応じ、二倍量の冷エタノールで
溶液を接触させ、次いで遠心分離により沈澱物を回収す
ることを含む。
実施例Ｉ ピキア パストリスの形質転換手順 A.細胞の成育 1.ypd培地約10ml中へピキア パストリスGS115（NRRL
Ｙ−15851）のコロニーを植えつけ、30℃で12−20時間
振とう培養する。
2.約12−20時間後、OD600で約0.01から0.1となるように
細胞を希釈し、YPD培地中で30℃で約６〜８時間細胞を
対数増殖期に保持する。
3.約６〜８時間後、OD600で約0.1（又はその相当量）の
縦培養0.5mlを、YPD培地100mlに植付ける。30℃で約12
−20時間振とう培養する。
4.OD600が約0.2−0.3となつたとき（約16−20時間後）
培養物を1500Gで５分間遠心分離し、回収する。
B.スフエロプラストの調製 1.細胞を１度10mlの滅菌水中で洗う（ステツプ１ないし
５の遠心分離は、すべて1500G、５分間である）。
2.新たに調製したSED10ml中で細胞を洗う。
3.滅菌１モルソルビトール溶液10ml中で細胞を２度洗
う。
4.10mlのSCE緩衝液に細胞を再分散する。
5.チモリアーゼ60,000（マイルズ ラボラトリーズ社
製）ml当り4mg含む溶液を５−10μ加える。約30−60
分、30℃で細胞をインキユベートする。
スフエロプラストの調製は形質転換手順においては、危
険をはらんだ工程であるため、スフエロプラストの形成
を次の如くモニターする必要がある。細胞（を含む液）
100μを900μの５％SDS及び900μの１モルのソル
ビトールに、チモリアーゼの添加前又は添加直後及びイ
ンキユベート期間中種々な間隔で加える。SDS中では細
胞が溶解するが、ソルビトール中では溶解しない点（通
常30から60分のインキユベーシヨン）でインキユベーシ
ヨを停める。
6.スフエロプラストを滅菌した１モルのソルビトール10
ml中で、1,000Gで５−10分遠心分離しながら二度洗浄す
る（遠心分離のための時間及び速度は変動する。スフエ
ロプラストがペレツト化するに充分なだけ遠心分離す
る、しかし、その力で破壊されるほどであつてはならな
い）。
7.滅菌したCaS10ml中で１度洗う。
8.全量で0.6mlのCaSに細胞を再分散させる。
C.形質転換 1.DNAのサンプル（20μの容量まで）を12×75mmの滅
菌したポリプロピレン管に加える（DNAは水又はTE緩衝
液中に分散されていること；少量のDNAで最大限の形質
転換頻度を上げるためには各サンプルに、超音波処理し
た大腸菌DNAを5mg/ml含む溶液１μを加えるのが好ま
しい）。
2.100μのスフエロプラストを各DNAサンプルに加え
て、室温で約20分間インキユベートする。
3.1mlのPEG溶液を各サンプルに1ml加え、室温で約20分
間インキユベートする。
4.サンプルを1500Gで５〜10分間遠心分離し、PEG溶液を
デカンテーシヨンにより除く。
5.サンプルを、SOS150μ中に再分散し、室温で30分間
インキユベートする。
6.滅菌した１モルのソルビトール溶液850μを加え、
以下に記載した様に少量のサンプルをとり平板培養す
る。
D.スフエロプラストの再生 1.再生用寒天培地の組成 a.寒天−ソルビトール培地;9gのバクト寒天、54.6gのソ
ルビトール、240mlの水、高温滅菌する。
b.グルコール10倍培地;20gのデキストローズ、100mlの
水、高温滅菌する。
c.SC10倍培地;6.75gのアミノ酸を含まない酵母窒素源、
100mlの水、高温滅菌する（所望のアミノ酸又は核酸を2
00μg/mlの濃度まで高温滅菌前又はその後に加える） d.30mlのグルコース10倍培地及び30mlのSC10倍培地を溶
解した寒天−ソルビトール溶液に加える300mlとする。
0.2mg/mlのビオチン液0.2ml、及び所望のアミノ酸又は
核酸を20μg/mlの濃度まで加える。溶解した再生用寒天
培地を55−60℃に保つ。
2.形質転換したサンプルの平板培養 形質転換サンプルが用意できる少なくとも30分前に、プ
レートあたり10mlの再生用寒天培地よりなる基底部寒天
層を注ぐ。試験管に再生用寒天培地10mlを、形質転換サ
ンプルがSOS中に入れてある間に、45−50℃のバス上
で、分散させる。再生用寒天培地の入つた試験管に適当
量の形質転換サンプルを加え、プレート内の基底部寒天
層上に注ぐ。45−50℃に保つた溶融状態の再生用寒天培
地10mlにそれぞれのサンプルを適当量加え、再生用寒天
培地よりなる固まつた10mlの基底部寒天層上にそれぞれ
を注ぐ。
3.スフエロプラスト調製品の品質の決定 １サンプル当り10μをとり、1Mのソルビトール990μ
を加えて100倍に希釈する。100倍希釈液を10μと
り、990μ量の1Mソルビトールを再び加えて更に100倍
希釈する。調製品中にスフエロプラスト化されずに残存
している完全細胞の濃度を測定するために、YPD寒天培
地上に上記二つの希釈液100μを塗布する。40μg/ml
ヒスチジンを加えた再生寒天10mlに、全再生可能なスフ
エロプラストを測定するため核希釈液を100μ加え
る。形質転換実験のための良好な値としては、ml当り１
−３×107の全再生可能なスフエロプラストとml当り約
１×103の完全細胞である。
4.平板培地を30℃で３−５日間培養する。
実施例II ピキア パストリス自律複製配列の分離及び特性決定 A.菌株 使用した菌株は次の通りである。
（ａ）ピキア パストリス NRRL Ｙ−11430株 （ｂ）ピキア パストリス NRRL Ｙ−15851（GS115−
his4）、及び （ｃ）大腸菌84株（F-met thi gal T1 Rφ80ShsdR-hsd
M+） B.プラスミド pYA2（第９図参照）は、pBR325のPst I部位に挿入され
た9.3Kb Pst I断片上のエス・セレビシエのHIS4遺伝子
より構成されて居り、それはエス・セレビシエHIS4遺伝
子断片の給源であり、大腸菌宿主に移入しであり、NRRL
Ｂ−15874として公衆が入手可能である。
pYJ8ΔCl a（第５図参照）はpYJ8の誘導体であり、pYJ8
のCl a I消化及びリゲーシヨンにより作り出されたもの
である。
C.培地 ピキア パストリスはYPD（富裕）培地又はIMG（最少）
培地で成育させた。IMG最少培地は次のものより構成さ
れている。
1.IM1塩類、最終濃度で36.7ミリモルのKH2PO4、22.7ミ
リモルの（NH4）2SO4、2.0ミリモルのMgSO4・7H2O、6.7
ミリモルのKCl、0.7ミリモルのCaCl2・2H2O;10倍の貯蔵
液として調製し、高温滅菌したもの 2.微量塩類、最終濃度で0.2マイクロモルのCuSO4・5H
2O、1.25マイクロモルのKI、4.5マイクロモルのMnSO4・
H2O、2.0マイクロモルのNaMoO4・2H2O、0.75マイクロモ
ルのH3BO3、17.5マイクロモルのZnSO4・7H2O、44.5マイ
クロモルのFeCl3・6H2O 400倍貯蔵液として調製し、濾
液を滅菌した。
3.0.4μg/mlのビオチン及び 4.2％デキストローズ 大腸菌はLB培地又は2B培地（0.2％NH4PO4、1.2％Na2PHO
4、0.013％MgSO4・7H2O、0.074％CaCl2・2H2O、ml当り
１マイクログラムのチアミン及び0.4％デキストリ
ン）、100μ/mlのトリプトフアン及び0.2％カザミノ
酸を追加添加したもので培養した。
D.DNA分離 1.酵素DNAの大規模調製 ピキア パストリス及びエス・セレビシエDNA調製物は
酵母細胞をA600が１−２となるまで最小培地100mlを成
育させ、次いで2,000Gで５分間遠心分離して細胞を回収
する。当該細胞を水、SED、１モルのソルビトール中で
それぞれ１度洗浄し、次いで1Mのソルビトールに分散し
た細胞を5mlの0.1モルのトリス−塩酸（pH＝7.0）に分
散した。細胞をチモラーゼ60,000（マイルズ ラボラト
リーズ社製）の4mg/ml溶液50−100/μと混合して、細
胞壁を消化するために１時間30℃でインキユベートし
た。スフエロプラスト調製品を1,000Gで５−10分間遠心
分離し、溶菌用緩衝液（0.1％SDS、10ミリモルのトリス
−塩酸（pH7.4）、５ミリモルのEDTA及び50ミリモルのN
aCl）に懸濁した。プロテナーゼＫ（ベーリンガーマン
ハイム社製）及びRNアーゼＡ（シグマ社製）をそれぞれ
100μ/mlの割合で加え、混合物を37℃30分間インキユ
ベートした。DNAは、イソアミルアルコールを含有する
クロロホルムを調製物と等量しずかに混合し、蛋白を除
き、各相を12,000Gで20分間遠心分離することにより分
離した。上の（水）相を新しい試験管に移し、当量のフ
エノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液
で抽出した。各相を前と同様分離し、最上相を２−３倍
量の冷100％エタノールを含む試験管に入れた。サンプ
ルをしずかに混合し、DNAをプラスチツク製棒の上にま
きつけて回収した。当該DNAをただちに1mlのTE緩衝液に
溶解し、100倍量のTE緩衝液で40℃で１晩透析した。
2.小規模酵母DNA調製物 A600で１−５でなるまで5mlの酵母の培養物を最少培地
で成長させ、次いで2,000Gで５分間遠心分離し、回収し
た。細胞を1mlのSEDに懸濁し、1.5mlの極小遠心管に移
し、１モルのソルビトール中で１度合等い、１モルのソ
ルビトールに分散させた細胞を0.1モルトリス塩酸（pH
7.4）0.5ml中に懸濁した。チモリアーゼ60,000（マイル
ラボラトリーズ社;4mg/mlの溶液を10μ）各サンプ
ルに加え、当該細胞を30℃で、30−60分間インキユベー
トした。細胞は次いで１分間遠心分離し、溶菌用緩衝液
中に懸濁し、65−70℃でインキユベートした。15分後に
サンプルを５モルの酢酸カリウム100μと混合し、氷
浴中に15分間保持し、５分間遠心分離した。上澄液を10
0％のエタノール1mlを含む新しい極小遠心管中へデカン
テーシヨンし、混合後ただちに10秒間遠心分離した。最
終的にペレツトを10−15分間風乾し、50μのTE緩衝液
に溶かした。
3.大規模大腸菌DNAの分離 大規模（0.5−１）のプラスミド調製物用の大腸菌の
培養物は、上述の如く補足され、かつ適当な抗生物質を
含む2B培地中で37℃で振とう培養により成育させた。pB
R322由来のプラスミドを含む細胞の場合には、A550で約
0.7まで培養し、その時点で100μg/mlとなるように充分
量のクロラムフエニコールを加え、細胞をおおよそ15時
間後に回収する。pBR325由来のプラスミドを含む菌株
は、補足された2Bの培地中に、当初のA550が約0.01−0.
05となるよう移植し、回収前20−24時間37℃で振とうイ
ンキユベートした。プラスミドをビルンボイム（Birnbo
im）及びドーリー（Doly）のアルカリ溶菌法（1979年）
により分離した。
4.小規模大腸菌DNA調製物 小量の迅速プラスミド分離のために、抗生物質を含み、
補充した2B培地中の2mlの培養物を37℃で振とう培養
し、1.5mlの極小遠心管中で遠心分離により回収した。
プラスミドはビルンボイム及びドーリーのアルカリ溶菌
法（1979年）により分離した。
E.DNAの制限（酵素）及び断片の分離 制限酵素はニユー・イングランドバイオラボズ及びベセ
スダ（Bethesda）リサーチラボアトリーズから入手し、
消化は常套手段により行なつた。制限（酵素）の地図化
は、挿入DNAを有するか又は有しないプラスミドの並行
消化物の比較により実施した。制限断片はアガロースゲ
ルから透析管材料でバツクアツプされたワツトマン3MM
紙片への電気溶出により純化した。断片は、紙及び管材
料から0.1モルのNaCl、50ミリモルのトリス−塩酸（pH
8.0）と１ミリモルのEDTAを含む溶液0.1ないし0.2mlを
用い、３〜４回洗浄し、回収した。最後に、断片をフエ
ノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出
し、エタノールで沈澱させ、少量のTE緩衝液に再溶解し
た。
F.ピー・パストリス自律複製配列ライブラリーの大腸菌
での構築 ピキア パストリスDNA−pYJBΔCl aライブラリー構築
のために、50μｇのpYJBΔCl aをCl a Iで完全に消化
し、仔牛の腸アルカリン フオスフアターゼで処理し、
DNAから末端の５′ホスフエートを除去した。ピキア
パストリスNRRL Ｙ−15851からのDNA100μｇを、全量
で1mlとし、20単位のTaq Iを用いて、65℃で５分間イン
キユベートすることにより一部消化を行なつた。５ない
し10Kbpの断片を0.5％アガロースゲルから電気溶出によ
り（本実施例、Ｅ項参照）大きさにより分離した。当該
ベクターの１μｇと２μｇのピキア Taq I断片とを、
総容量200μ中でT4DNAリガーゼ（ベセスダ リサーチ
ラボラトリーズ）の20単位と混合し、４℃で１晩イン
キユベートし。当該リゲートしたDNAで大腸菌を、同848
菌細胞液2mlに全リゲーシヨン反応混液を加え、０℃で1
5分間インキユベートすることにより形質転換した。混
合物を５分間で37℃までに加温し、その時間経過後LB培
地40mlを加え、37℃のインキユベーシヨンを更に１時間
つづけた。次いでアンピシリンを加え、全濃度で100μg
/mlとし、インキユベーシヨンを再び１時間つづけた。
最後に、細胞を3,000Gで10分間遠心分離し、新しいLB培
地1ml中に再び懸濁させ、100μg/mlのアンピシリンを含
む10個のLB寒天平板培地上に等量づつ広ろげた。結果と
して約10,000コロニーが発生したが、それを平板培地か
らかき取り、細胞の１部分を、当初のA550が約0.1とな
るまで500mlの補充した2B培地に植えた。培養物を成育
させ、プラスミドを上述の方法により抽出した。
G.サザンハイブリダイゼーシヨン ハイブリダイゼーシヨンはサザンの方法（1975年）によ
り実施した。大きい、又はスパーコイル型DNA分子のニ
トロセルローズへの転移には、アルカリ変性に先立つ
て、アガロースゲルを10分間0.25モルのHCl中に浸漬す
ることによりDNAをまず一部加水分解した。エス・セレ
ビシエのHIS4遺伝子由来の標識した断片の、ピキア パ
ストリス DNAへのハイブリダイゼーシヨンは50％のホ
ルムアミド、６倍のSSC、５倍のデンハルト氏液、0.1％
SDS １ミリモルのEDTA、100μg/mlの変性したニシンの
精子DNAの存在下で42℃で行なつた。ハイブリダイゼー
シヨン後の洗浄は、２倍のSSC、１ミリモルのEDTA、0.1
％のSDS及び1.0％のピロリン酸ソーダ中で55℃で行なつ
た。
H.32P−標識 ニツク翻訳はリグビイ（Rigby）らの方法（1977）で実
施した。
I.DNA配列の決定 DNA配列の決定はサンガー（Sanger）等のジデオキシヌ
クレオチドチエーン ターミナーシヨン法（1980年）に
よつた。
J.ピキアの自律複製配列 上記Ｆ項に記載した如く構築されたピキア ライブラリ
ーを用いてピキア パストリスNRRL Ｙ−15851を形質
転換した。プラスミドDNAを大腸菌内で増幅し、回収
し、ピキア パストリス NRRL Ｙ−15851を形質転換
するのに使用した。ベプラスミドは、次いで、約10,000
のHis+ピキア コロニーから回収し、大腸菌の形質転換
に用いた。
10,000のアンピシリン抵抗性大腸菌コロニーを分離し、
ピー・パストリスNRRL Ｙ−15851（GS115;his4）へと
逆形質転換した。このサブライブラリー形質転換体から
40のHis+酵母コロニーを選抜用培地に別々に塗布し、独
立して選抜用培地中で成育させた。全酵母DNAをこの40
の培養物の各々から抽出し、大腸菌を形質転換した。二
つのプラスミド、すなわち、PARS1を含むpYA63及びPARS
2を含むpYA90を更に解析するために選抜した。このプラ
スミドは両者ともピキア パストリアスNAAL Ｙ−1585
1（GS115）を高頻度で形質転換でき、自律要素として保
持され、それぞれピー・パストリスDNAの新規断片を含
有していた。
K.自律複製配列に関するピキア パストリス形質転換の
解析 ピキア ARS含有プラスミドをピキア パストリス細胞
中での自律要素として保持されうる能力について次の如
き方法で決定した。形質転換体のコロニーを再生寒天平
板培地からとり、SD寒天培地上に塗布し、液体IMG培地
へと移植した。そのSD平板培地を30℃で３日間培養し、
その時点で一つのコロニーを平板培地からつまみとり、
再びSD平板培地上に塗布し、IMG培地を含むフラスコへ
再度植え継いだ。この過程を３回繰返した。この３個の
IMG培養物を30℃でA600で約１−２となるまで振とうし
ながら育成させ、次いで遠心分離により収集した。この
酵母培養物からのDNAを上述の方法により抽出し、30ボ
ルト、30ミリアンペアで10ないし15時間0.8％アガロー
スゲルへと電気泳動し、次いでニトロセルロースへと移
転させ、上述の如く32P−標識のpBR322又はpBR325にハ
イブリダイゼーシヨンした。対照として大腸菌から分離
したプラスミド10ngを含むサンプルと形質転換してない
ピキア パストリスNRRL Ｙ−15851（GS115）DNAを１
−２μｇ含むサンプルを実験サンプルと一緒に電気泳動
させた。
検査したピキア PARS含有プラスミド形質転換体の各々
とは、標識したプローブは、大腸菌から分離したプラス
ミドと同一のパターンで、ハイブリツド化した。対照と
して、 pYJ8ΔCl a（ピキア中ではARS活性を有する統合的形質
転換ベクター）で形質転換した場合、標識したプローブ
はピキア パストリスNRRL Ｙ−15851（GS115）からの
大きな分子量の染色体DNAにハイブリダイゼーシヨンす
ることが見出された。プローブは形質転換されていない
NRRL Ｙ−15851からのDNAとハイブリダイゼーシヨンし
ながつた。
ピキア中で自律要素としてプラスミドを保持するための
PARS活性のより定量的手段として、pYJ30及びpYJ32プラ
スミドで形質転換した酵母の培養株を選抜用培地で育成
させ、定期的にサンプル採取した。細胞中のプラスミド
配列の状態は、制限酵素未処理の酵母のDNAを放射能で
標識したpBR322にサザンハイブリダイゼーシヨンするこ
とにより、決定した。プラスミドpYJ30及びpYJ32は、ピ
キア中ですくなくとも50世代選抜用培地中で自律要素と
して保持された。
L.プラスミドコピー数の決定 ピー・パストリス細胞あたりの平均コピー数は、ピー・
パストリスHIS4のゲノムコピーの量とプラスミド由来の
HIS4遺伝子の量の比から導びき出された。検査対照菌株
は、ピキア HIS4遺伝子を含むプラスミドを含有してい
るので、DNAを抽出し、制限エンドヌクレアーゼで消化
し、ニトロセルローズフイルターに移転し、ピキア HI
S4遺伝子を含有する2.7Kbpの32P−標識のBgl III断片で
ハイブリダイゼーシヨンした。ポストハイブリダイゼー
シヨンの洗浄後、一連のＸ−線フイルムを一定時間フイ
ルターに曝露し、平板ゲルのためのコムプセツトモジユ
ール（Compuset Module）でプログラム化したベツクマ
ンDU−8Bスペクトロホトメーター上で走査した。結果は
表にまとめて示す。
下記の文献を本明細書中で引用した。
ビルボイム及びドーリー（1979年）核酸研究７巻、1513
−1523頁 ［Birnboim and Doly（1979）Nucl.Acids Res.７,1513
−1523;］ ヒンネン等（1978年）米国国立教養学会大会講演集、75
巻、1929−1933頁 ［Hinnen et al（1978）Proc.Nat.Acad.Sci.,USA 75,19
29−1933］ リグビイ等（1977年）分子微生物学誌、113巻、237頁 ［Rigby et al（1977）J.Mol.Biol.133,237］ サザン（1975年）分子微生物学誌、98巻503−517頁 ［Southern（1975）J.Mol.Biol.98,503−517］ サンガー等（1980年）分子微生物学誌、143巻、161−17
8頁 ［Sanger et al（1980）J.Mol.Biol.143,161−178］
【図面の簡単な説明】
第１図はこの発明の自律複製配列（PARS1）の制限酵素
地図を示す。 第２図はこの発明の自律複製配列（PARS2）の制限酵素
地図を示す。 第３図はプラスミドYEp13の制限酵素地図を、第４図は
プラスミドpYJ8の制限酵素地図を、第５図はプラスミド
pYJ8ΔCl aの制限酵素地図を、第６図はプラスミドpYM4
の制限酵素地図を、第７図はプラスミドpYJ30の制限酵
素地図を、第８図はプラスミドpYJ32の制限酵素地図
を、第９図はプラスミドpYA2の制限酵素地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:84）

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ピキア属の宿主内で、染色体外要素として
    １細胞あたり数多くのコピー数のプラスミドを保持する
    自律複製配列よりなり、かつピキア パストリス NRRY
    11430に由来するDNA断片であって、当該DNA断片を含
    むベクターでの当該宿主の形質転換頻度を当該DNA断片
    を含まないベクターでの当該宿主のそれと比較して増加
    させることができる下記の制限地図を有することを特徴
    とするDAN断片
  2. 【請求項２】当該断片が次のヌクレオチド配列か、機能
    的同等物又はそれらの合理的な変形である特許請求の範
    囲第１項に記載のDAN断片：
  3. 【請求項３】ピキア属の宿主を形質転換でき、当該宿主
    内に染色体外要素として保持されている自律複製配列を
    含むハイブリッドプラスミドであって、 当該自律複製配列はピキア パストリス NRRY 11430
    に由来するものであり、下記の制限地図を有することを
    特徴とするハイブリッドプラスミド
  4. 【請求項４】当該断片が次のヌクレオチド配列か、機能
    的同等物又はそれらの合理的な変形である特許請求の範
    囲第３項に記載のハイブリッドプラスミド：
  5. 【請求項５】当該プラスミドが第７図に示す制限地図
    （pYJ30）を有することを特徴とする特許請求の範囲第
    ４項記載のハイブリッドプラスミド
  6. 【請求項６】ピキア属に属する宿主を、ピキア属の宿主
    を形質転換でき、当該宿主内に染色体外要素として保持
    されている自律複製配列を含むハイブリッドプラスミド
    であって、 当該自律複製配列はピキア パストリス NRRY 11430
    に由来するものであり、かつ下記の制限地図を有するも
    のを含むハイブリッドプラスミドで形質転換したもので
    ある酵母菌株
  7. 【請求項７】当該断片が次のヌクレオチド配列か、機能
    的同等物又はそれらの合理的な変形である特許請求の範
    囲第６項に記載の酵母菌株：
  8. 【請求項８】第７図にあらわにした制限地図を有するプ
    ラスミドpYJ30で形質転換した特許請求の範囲第７項に
    記載の酵母菌株
  9. 【請求項９】ピキア属の宿主を形質転換でき、当該宿主
    内に染色体外要素として保持されている自律複製配列を
    含むハイブリッドプラスミドであって、 当該自律複製配列はピキア パストリス NRRY 11430
    に由来するものであり、下記の制限地図を有することを
    特徴とするハイブリッドプラスミドであるpYJ30で形質
    転換したものである大腸菌NRRL Ｂ−15890（LE 392−
    pYJ30）。
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