JPH0796558B2

JPH0796558B2 - 修飾ポリペプチド

Info

Publication number: JPH0796558B2
Application number: JP1079748A
Authority: JP
Inventors: 基生山崎; 義春横尾; 眞森本; 正実岡部
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 1988-03-31
Filing date: 1989-03-30
Publication date: 1995-10-18
Anticipated expiration: 2010-10-18
Also published as: JPH01316400A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下hG−CSF
と略記する）活性を有するポリペプチドの分子中の少な
くとも１個のアミノ基を化学修飾して得られる化学修飾
hG−CSFポリペプチドおよびその製造法に関する。

hG−CSFは、造血幹細胞を増殖・分化させ種々の血球を
形成させる際に必須なポリペプチドの１種で、主として
顆粒球、なかでも好中球の増加を促進する効果をもつ。
好中球は生体の感染防御において重要な役割を担ってい
るが寿命が短く、前駆細胞の恒常的な増殖・分化によっ
て常に補給されていなければならない。近年広く行われ
ている増殖性腫瘍に対する治療は、同時に好中球前駆細
胞の増殖を阻止するため、担癌患者の感染防御機能を低
下させるという重篤副作用をもつ。hG−CSFは、好中球
の増加を促進することにより、この副作用を軽減し、他
方、感染症を予防・治療する効果を持つものと期待され
る。さらに、hG−CSFには、白血病細胞株をin vitroに
おいて分化させる活性があり、白血病に対する治療薬と
なる可能性もあるものとみられる。本発明の化学修飾hG
−CSFポリペプチドは、既知のhG−CSFよりすぐれたhG−
CSF活性を有しており、医薬品としての利用が期待され
る。

従来の技術近年急速に発展してきた組換えDNA技術により、血球の
増殖・分化に係わるタンパク質性の因子の遺伝子が次々
と単離されてきた。それらの因子は、微生物や動物細胞
を利用して遺伝子工学の手法で生産されている。

hG−CSFは、長田らがヒト扁平上皮癌細胞株CHU−IIより
cDNAを単離してその塩基配列を決定し、COS細胞での発
現を報告している〔長田ら：ネイチャー（Nature）319,
415（1986）〕。また、スーザ（Souza）らはヒト膀胱癌
細胞株5637よりcDNAを単離してその塩基配列を決定し、
大腸菌での発現を報告している〔スーザら：サイエンス
（Science）232,61（1986）〕。

このようにして得られたhG−CSFは、生体内に投与した
場合、効果の持続には連続投与が必要であり、投与を中
止すると効果はすみやかに消失するという報告がある
〔ジャーナル・オブ・エックスペリメンタル・メディス
ン（J.Exp.Med.）165,941−948（1984）〕。これは、hG
−CSFの血中における持続性が低いためと考えられる。

また、アスパラギナーゼ〔Inada,Y.,et al.,トレンズ・
イン・バイオテクノロジー（Trends in Biotechnolog
y），4,68−73（1986）〕，アルギナーゼ〔Savoca,K.
V.,et al.,バイオケミカ・エト・バイオフィジカ・アク
タ（Biochemica et Biophysica Acta），578,47−53,
（1979）〕，バトロキソビン〔Nishimura,H.,et al.,ラ
イフ・サイエンス（Life Science），33,1467−1473,
（1983）〕などの酵素類について、ポリエチレングリコ
ールで化学修飾を行うことにより血中持続性の向上、抗
原性の減弱が認められている。

一般にタンパク質を医薬として用いる場合、凍結乾燥剤
として供給されることが多い。ところが、凍結乾燥時あ
るいは凍結乾燥後に温度、湿度、酸素、紫外線等の外的
因子により影響を受け、会合、重合あるいは酸化などの
物理的、化学的変化を受け、活性の低下を招く場合があ
る。いくつかの添加剤による凍結乾燥時の安定化が試み
られている（hG−CSFについては、例えば特開昭63−146
826、特開昭63−146829等に添加剤の例がある）が、実
用上更に安定化された製剤が望まれている。

発明が解決しようとする課題医薬品としてhG−CSFを用いる場合、生体内に投与され
たhG−CSFが、その活性を保持したまま、血中での安定
性が高く、高い持続性を有し、さらにその抗原性が減弱
されたものであることが望ましい。また、hG−CSFを医
薬として用いる場合、通常凍結乾燥製剤として供給され
るので、凍結乾燥時ならびに凍結乾燥後に安定性を向上
させることは有用である。しかしながら、そのような性
質を有するhG−CSFおよびその製造法は開発されていな
い。

課題を解決するための手段本発明者は、hG−CSF活性を有するポリペプチドの分子
中の少なくとも１個のアミノ基を化学修飾することによ
り、未修飾のhG−CSFに比して、血中における持続性を
向上させることができることおよび凍結乾燥時ならびに
凍結乾燥後において安定性を向上させることができるこ
とを見出し、本発明を完成した。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明は、hG−CSF活性を有するポリペプチドの分子中
の少なくとも１個のアミノ基に式 R₁−（OCH₂CH₂ _nX−R₂− （Ｉ）｛式中R₁はアルキル基またはアルカノイル基、ｎは任意
に変わりうる正の整数、ＸはO,NHまたはＳ、R₂は〔式中R₃はOH,Cl,O−（CH₂CH₂O）ｎ−R₁（式中R₁,nは前
記と同意義を表す）を表し、Ｙは存在しないか、または
Ｚ−（CH₂）pCO（式中ＺはO,SまたはNHを表し、ｐは任
意に変わりうる正の整数を表す）を表す〕または（CO）ｍ−（CH₂）_lCO（式中、ｍは０または１、ｌは任
意に変わりうる正の整数を表す）を表す｝で表される基
を結合してなる修飾ポリペプチドを提供する。

本発明に使用するhG−CSF活性を有するポリペプチド
は、第１表に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドや、第２表に代表されるような、第１表のアミノ酸配
列中で少なくとも１個のアミノ酸が他種のアミノ酸に置
換されたポリペプチドまたはＮ末端アミノ酸が１〜11個
欠失したポリペプチドでhG−CSF活性を有するものであ
ればよい。さらに特開昭63−299,特公表63−500636に記
載のhG−CSF誘導体も用いることができる。

本発明に用いられる化学修飾基に関し、R₁で示される末
端酸素の保護基としてのアルキル基、アルカノイル基と
しては、具体的にはアルキル基はＣ_１〜18（メチル，エ
チル，プロピルなど）のもの、アルカノイル基はＣ
_１〜18のもの（ホルミル，アセチル，プロピオニルな
ど）があげられる。

ｎで表される正の整数は、500以下である。とりわけ７
〜230が好ましい。

ｌで表される正の整数は、100以下であり、好ましく
は、０〜６である。ｐは表される正の整数は１〜18、好
ましくは１〜６である。本発明の化学修飾基の分子量
は、30,000以下であり、好ましくは300〜10,000の範囲
内にあるものである。

本発明の化学修飾hG−CSFは、例えばhG−CSFと（R₁,n,X,R₃は前記と同意義である）で示されるハロゲ
ン化物との縮合あるいはhG−CSFと、R₁−（OCH₂CH₂）_ｎ
−Ｘ−（CO）_ｍ（CH₂）_ｌ−COOH （III）（R₁,n,X,m,l
は前記と同意義である）で示されるカルボン酸との縮合
あるいはhG−CSFと（式中R₁,n,X,R₃,Z,pは前記と同意義である）で示され
るカルボン酸との縮合により製造される。

式（II）のハロゲン化物は、R₁−（OCH₂CH₂）ｎ−XH（R
₁,n,Xは前記と同意義である）と塩化シアヌルとの縮合
で得られる〔例えば、Matsushrma,A.,et al.,ケミスト
リイ・レターズ（Chemistry,Letters）,773−776,（198
0）,Abuchowski,A.,et al.,ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），252,（12）
3578−3581（1977）〕。このハロゲン化物は反応性を有
するので、hG−CSF活性を有するポリペプチドと直接反
応させることができる。

式（III）のカルボン酸は、R₁−（OCH₂CH₂）_ｎ−XH
（R₁,n,Xは前記と同意義である）とアルカンジカルボン
酸のカルボキシル基の脱水縮合によりカルボキシル基を
導入するか、ハロゲン化モノカルボン酸によりカルボキ
シル基を導入するか、あるいは末端の水酸基を酸化し、
カルボキシル基に変換することにより得られる。このカ
ルボン酸は反応性を有さないので、活性化して用いる必
要である。カルボン酸の活性化法としては、例えばＮ−
ヒドロキシコハク酸イミド,N−ヒドロキシフタル酸イミ
ド,1−ヒドロキシベンゾトリアゾール,p−ニトロフェノ
ールなどとの活性エステルとする方法、イソブチルクロ
ロホルメート，エチルクロロホルメートとの混合酸無水
物とする方法、または塩化チオニルなどのハロゲン化剤
を作用させて、酸ハロゲン化物とする方法〔いずれも
「ペプチド合成」（泉屋信夫ほか著、丸善刊）参照〕な
どがあげられる。

前述の式（IV）のカルボン酸は式（II）の塩化物とHZ−
（CH₂）ｐ−CO₂H（Ｚ、ｐは前記と同義である）との縮
合により得られる。この式（IV）のカルボン酸は式（II
I）のカルボン酸と同様に、活性化して用いる。

これらのハロゲン化物あるいはカルボン酸活性化物を、
hG−CSF活性を有するポリペプチドの分子中に存在する
アミノ基の２〜100倍量（モル比）加え、４〜37℃、好
ましくは４〜10℃,pH7〜10で１時間〜２日間好ましくは
１〜24時間反応させることにより目的とする化学修飾hG
−CSFを製造することができる。

化学修飾hG−CSFまたは化学修飾hG−CSF誘導体におい
て、式IIのハロゲン化物との反応物をII型、式IIIのカ
ルボン酸との反応物をIII型、式IVのカルボン酸との反
応物をIV型と、それぞれ称する。

化学修飾の程度は遊離アミノ基の減少量をトリニトロベ
ンゼンスルホン酸で定量することにより、あるいは、ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法を用いて、化学修飾hG−CSFの移動度の変化を追う
ことにより確認される。

化学修飾hG−CSFおよび化学修飾hG−CSF誘導体は水また
は適当な緩衝液に溶解した液剤または凍結乾燥剤として
医薬用途に供される。

凍結乾燥の条件はとくに限定しないが、通常は−50℃以
下で１〜５時間凍結し、棚温−20℃〜０℃、真空度50〜
150mTorrで24〜48時間乾燥し、ついで棚温10〜30℃、真
空度50〜100mTorrで16〜24時間乾燥し、凍結乾燥品を得
る。

液剤はそのまま無菌過して注射剤として用い凍結乾燥
剤は水または適当な緩衝液に溶解した後無菌過して注
射剤として使用する。

なお、本発明において使用するhG−CSFは：通常の各種
製薬担体、賦形剤、希釈剤、安定化剤あるいは吸着防止
剤などを含むことができる。

本誘導体の投与量は、その対象となる疾患および患者の
病状にあわせて決められるが、通常の成人一人当り0.1
〜500μｇ、好ましくは0.5〜200μｇの化学修飾hG−CSF
および化学修飾hG−CSF誘導体含有製剤を１週間当り１
〜７回投与する。

化学修飾hG−CSFおよび化学修飾hG−CSF誘導体にはポリ
エチレングリコール誘導体が一分子〜三分子結合する。
したがって、本修飾hG−CSFならびに修飾hG−CSF誘導体
は一分子結合体〜三分子結合体の混合物で用いるか、あ
るいは一分子結合体〜三分子結合体をそれぞれ分離して
用いる。

本発明における蛋白質量の測定は以下に記載する実験方
法によって測定する。

実験方法1. オ・エッチ・ローリーの方法〔Lowry,O.H.,et al.,ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio
l.Chem.），193,265（1951）〕により行う。

実験方法2. レムリの方法〔U.K.Laemmli:ネイチャー（Nature）227,
680（1970）〕によりSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った後、クロマトスキャナー（CS−930 島津
製作所）で測定する。

本発明におけるＧ−CSF活性の測定は以下のように行っ
た。８〜12週令のC3H/He雄マウス（静岡実験動物協同組
合）の大腿骨より骨髄細胞を無菌的にとり出し、牛胎児
血清（FBS）を10％添加したα−Minimum Essential Med
ium（Flow Laboratories,以下α−MEM培地と略す）に懸
濁した。この細胞（約５×10⁷個）懸濁液1.5mlをナイロ
ン・ウール（Nylon woll）（和光純薬、Nylon Fiber 14
6−04231）をつめたカラム（0.3g）に浸漬し、５％CO₂
インキュベーター内にて37℃90分間反応させた。次いで
予め37℃に加温したα−MEM培地をカラムに流し、溶出
してくるナイロン・ウール非吸着性の骨髄細胞を得た。
この細胞をα−MEM培地で一回洗浄し、所定の濃度に調
製した。

次いで、岡部らの方法〔Okabe T.et al.,キャンサー・
リサーチ（Cancer Research）44,4503−4506（1986）〕
に準じて骨髄造血幹細胞コロニー形成能を測定した。す
なわち、α−MEM培地0.2ml,FBS 0.4mlおよび２段階希
釈した各サンプル0.2mlの混液に、上記の方法で調製し
た骨髄細胞（２×10⁶個/ml）の0.2mlを混和した。これ
に42℃に保温した0.6％寒天（Difco,Agar purified ＃
0560−01）溶液を等量（1.0ml）混和し、その0.5mlを24
穴マルチディッシュ（Nunc社製、＃ 143982）に播種し
た（５×10⁴個/well,n＝３）。５％CO₂インキュベータ
ー中で37℃７日間培養し、40個以上の細胞からなるコロ
ニーの数を顕微鏡（Olympus社製、×40）で計数した。
コロニー計数後、注意深くスライドグラス上にとり出
し、アセトン・ホルマリン混液で30秒間固定後、Kubota
らの方法〔Kubota K.,et al.,エックスペリメンタル・
ヘマトロジィ（Exp.Hematology）８,339−344（198
0）〕でエステラーゼ２重染色を施し、各コロニーの同
定を行った。

各サンプルの力価は、コロニー形成試験の２段階稀釈に
於ける計数結果から以下のように算出した。スタンダー
ドとして用いたインタクトＧ−CSFのコロニー形成の最
大値の1/2値を与える活性を50単位と定義し、これに各
サンプルの稀釈率および単位ml当りの活性に換算するた
め、20を乗じて力価（単位）とした。比活性は、単位蛋
白質（mg）当りの力価（単位/mg）で表示した。

以下に実施例，参考例，実験例を示す。

実施例1. 第１表のアミノ酸配列を有するhG−CSF186μg/mlを含む
0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）3mlに後述の参考例１で得ら
れたクロル化物56mgを添加し、撹拌しながら４℃で24時
間反応させた。

限外過（分画分子量３万）により、未反応のクロル化
物を除去後、YMC−PackAM−312ODS（栗田工業社製）を
用いるアセトニトリル０−70％の直線勾配による逆相HP
LCを行った。化学修飾hG−CSFポリペプチドは、アセト
ニトリル約50％の溶出分画に溶出された（収量30μg,収
率５％）。得られた化学修飾hG−CSFポリペプチドは、h
G−CSF1分子に対し、クロル化物１分子結合しているこ
とが、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認さ
れた。純度は90％以上であった。

実施例2. 第１表のアミノ酸配列を有するhG−CSF570μg/mlを含む
50mMリン酸緩衝液（pH7.2）50mlに、後述の参考例２で
得られた活性エステル240mgを添加し、撹拌しながら４
℃で６時間反応させた。

10mMトリス塩酸緩衝液−0.7M硫酸アンモニウム（pH8.
0）50mlを加えた後、10mMトリス・塩酸−0.35M硫酸アン
モニウム（pH8.0）で充たされたブチル−トヨパール650
M（東ソー製）（2.2cm×26cm）に100ml/hrの流速で通塔
した。次いで10mMトリス・塩酸−0.35M硫酸アンモニウ
ム（pH8.0）100mlを100ml/hrの流速で通塔して洗浄後、
10mMトリス・塩酸（pH8.0）系に直線勾配で0.35M硫酸ア
ンモニウムから0M硫酸アンモニウムを総量400mlかけて
加え、100ml/hrの流速で溶出を行った。目的物は、硫酸
アンモニウム50mMから130mMで溶出された。溶出画分130
mlを限外過〔分子量分画１万：膜YM10（アミコン社
製）〕し、7mlまで濃縮した。次いで、濃縮液を10mMリ
ン酸緩衝液−生理食塩水（pH7.2）（PBS）で充たされた
セファクリルＳ−200（ファルマシア社製）（2.8cm×70
cm）に120ml/hrの流速で通塔した。次いで、同流速でPB
Sを通塔した。

化学修飾hG−CSFポリペプチドはポリエチレングリコー
ル誘導体三分子結合体（Tri体）がPBSを流し始めて150m
lから160mlあたりに溶出された（収量2mg 収量７
％）。次いで、ポリエチレングリコール誘導体二分子結
合体（Di体）が165mlから185mlあたりに溶出された（収
量1.5mg 収率５％）。次いで、ポリエチレングリコー
ル誘導体一分子結合体（Mono体）が190mlから210mlあた
りに溶出された（収量4.5mg 収率16％）。得られたポ
リペプチドはMono体ではhG−CSF一分子に対し、ポリエ
チレングリコール誘導体のカルボン酸が一分子結合して
おり、Di体では二分子結合しており、Tri体では三分子
結合していることがSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で確認された。それぞれの純度は90％以上であっ
た。

実施例3. 後述の参考例３で得られたhG−CSF誘導体（570μg/ml）
を含む0.1Mホウ酸緩衝液（pH9）10mlに、後述の参考例
２で得られた活性エステル54mgを添加し、４℃で10時間
反応させた。

限外過膜YM30（アミコン社製）を用いて、未反応の活
性エステルおよびその分解物を除去後、同膜を用いて10
mMトリス・塩酸緩衝液（pH8）に内液の交換を行った。
残液を、10mMトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）で充たされ
たDEAE−トヨパール650M（東ソー製）（1.7cm×4.4cm）
に10ml/hrの流速で通塔した。次いで10mMトリス・塩酸
緩衝液（pH8）20mlを5ml/hrの流速で通塔して洗浄後、1
0mMトリス・塩酸（pH8）の緩衝液系に、直線勾配で0M
NaClから0.4M NaClを総量100mlかけて加え、5ml/hrの
流速で溶出を行った。化学修飾hG−CSFポリペプチドはN
aCl100〜120mMで溶出された（収量0.85mg,収率15％）。
得られたポリペプチドは、hG−CSF誘導体１分子に対
し、ポリエチレングリコール誘導体のカルボン酸１分子
結合していることが、SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で確認された。純度は90％以上であった。

実施例4. 参考例３で得られたhG−CSF誘導体（570μg/ml）を含む
50mMリン酸緩衝液（pH7.2）50mlに、参考例２で得られ
た活性エステル300mgを添加し、４℃で６時間反応させ
た。

10mMトリス塩酸緩衝液−0.7M硫酸アンモニウム（pH8.
0）50mlを加えた後10mMトリス塩酸緩衝液−0.35M硫酸ア
ンモニウム（pH8.0）で充たされたブチル−トヨパール6
50M（東ソー製）（2.2cm×26cm）に100ml/hrの流速で通
塔した。次いで10mMトリス塩酸緩衝液−0.35M硫酸アン
モニウム（pH8.0）100mlを100ml/hrの流速で通塔して洗
浄後、10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に直線勾配で0.3
5M硫酸アンモニウムから0M硫酸アンモニウムを総量400m
lかけて加え、100ml/hrの流速で溶出を行った。目的物
は、硫酸アンモニウム50mMから150mMで溶出された。溶
出画分150mlを限外過〔分子量分画１万:YM10（アミコ
ン社製）〕し、10mlまで濃縮した。ついで、濃縮液をPB
Sで充たされたセファクリルＳ−200（ファルマシア製）
（2.8cm×70cm）に120ml/hrの流速で通塔した。次い
で、同流速でPBSを通塔した。化学修飾hG−CSFポリペプ
チドはポリエチレングリコール誘導体三分子結合体（Tr
i体）がPBSを流し始めて150mlから160mlあたりに溶出さ
れた（収量1.5mg 収率５％）。次いで、ポリエチレン
グリコール誘導体二分子結合体（Di体）が165mlから185
mlあたりに溶出された（収量3mg 収率11％）。次い
で、ポリエチレングリコール誘導体一分子結合体（Mono
体）が190mlから210mlあたりに溶出された（収量4mg
収率14％）。得られたポリペプチドはMono体ではhG−CS
F一分子に対し、ポリエチレングリコール誘導体のカル
ボン酸が一分子結合しており、Di体では二分子結合して
おり、Tri体では３分子結合していることがSDS−ポアク
リルアミドゲル電気泳動で確認された。それぞれの純度
は90％以上であった。

実施例5. 参考例３で得られたhG−CSF誘導体（300μg/ml）を含む
50mMリン酸緩衝液（pH7.2）100mlに、参考例４で得られ
た活性エステル800mgを添加し、４℃で24時間反応させ
た。

10mMトリス塩酸緩衝液−0.7M硫酸アンモニウム（pH8.
0）100mlを加えた後、10mMトリス塩酸緩衝液−0.35M硫
酸アンモニウム（pH8.0）で充たされたブチル−トヨパ
ール650M（東ソー製）2.2cm×26cm）に100ml/hrの流速
で通塔した。次いで10mMトリス塩酸緩衝液−0.35M硫酸
アンモニウム（pH8.0）100mlを100ml/hrの流速で通塔し
て洗浄後、10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）系に直線勾
配で0.35M硫酸アンモニウムから0M硫酸アンモニウムを
総量400mlかけて加え、100ml/hrの流速で溶出を行っ
た。目的物は、硫酸アンモニウム0mMから250mMで溶出さ
れた。溶出画分250mlを限外過〔分子量分画１万:YM10
（アミコン社製）〕し、10mlまで濃縮した。ついで、PB
Sで充たされたセファクリルＳ−200（ファルアシア製）
（5.6cm×40cm）に160ml/hrの流速で通塔した。次い
で、同流速でPBSを通塔した。化学修飾hG−CSFポリペプ
チドはポリエチレングリコール誘導体三分子結合体（Tr
i体）がPBSを流し始めて360mlから400mlあたりに溶出さ
れた（収量2.1mg収率７％）。次いで、ポリエチレング
リコール誘導体二分子結合体（Di体）が420mlから450ml
あたりに溶出された（収量1.5mg収率５％）。次いで、
ポリエチレングリコール誘導体一分子結合体（Mono体）
が500mlから530mlあたりに溶出された（収量1.5mg 収
量５％）。得られたポリペプチドはMono体ではhG−CSF
一分子に対し、ポリエチレングリコール誘導体のカルボ
ン酸が一分子結合しており、Di体では二分子結合してお
り、Tri体では三分子結合していることがSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で確認された。それぞれの純度
は90％以上であった。

実施例6. 化学修飾hG−CSF凍結乾燥標品の製造およびその保存安
定性実施例２と同様の方法で、hG−CSFと活性エステルとを
反応させ、限外過膜を用いて未反応の活性エステルお
よびその分解物を除去した。同膜を用いて、1M塩化ナト
リウム含有50mMリン酸緩衝液（pH7.2）で内液の交換を
行った。得られた修飾hG−CSF200μg/ml含有溶液を凍結
乾燥し凍結乾燥剤を製造した。対照としてhG−CSFとポ
リエチレングリコールとの混液の凍結乾燥を同様に行い
凍結乾燥剤を製造した。それぞれの凍結乾燥剤を65℃で
放置後、経時的に溶解し、hG−CSFの残存活性を前述の
活性測定法に従い測定した。結果を第３表に示す。

残存活性（％）は、凍結乾燥前の初期活性に対する相対
割合であり、以下の式で定義される。

凍結乾燥条件：未修飾hG−CSF溶液、修飾hG−CSF溶液と
も以下の条件で行う。hG−CSF溶液をガラスバイヤルに
入れ、−50℃以下で２時間凍結する。次いで、棚温−20
℃下真空度100Torrで24時間乾燥する。次いで、20℃下
真空度80mTorrで24時間乾燥し、凍結乾燥品を得る。

実施例7. 化学修飾hG−CSF誘導体の凍結乾燥標品の製造およびそ
の保存安定性実施例３と同様の方法で、hG−CSF誘導体と活性エステ
ルとを反応させ、限外過膜を用いて未反応の活性エス
テルおよびその分解物を除去した。同膜を用いて、1M塩
化ナトリウム含有50mMリン緩衝液（pH7.2）で内液の交
換を行った。得られた修飾hG−CSF誘導体200μg/ml含有
溶液を凍結乾燥し、凍結乾燥剤を製造した。また、対照
としてhG−CSF誘導体およびポリエチレングリコール添
加溶液の凍結乾燥を同様に行い凍結乾燥剤を製造した。
それぞれ凍結乾燥剤を37℃で７日間放置し、経時的に溶
液中のhG−CSFの残存活性を前述の活性測定法に従い測
定した。結果は第４表に示す。表中残存活性（％）およ
び凍結乾燥条件は実施例５と同じである。

参考例1. 2,4−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−
６−クロル−Ｓ−トリアジンの製造 10gを無水炭酸ナトリウムを含む100mlの無水トルエンに
平均分子量4000のモノメトキシポリエチレングリコール
（日本油脂社製）20gを溶解し、110℃で30分間加熱した
後、塩化シアヌル500mgを加え、24時間,110℃で加熱し
た。反応残留物を去し、石油エーテル300mlを加え
て、沈澱を生じさせ、その沈澱を数回石油エーテルで洗
浄し、2,4−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコー
ル）−６−クロル−Ｓ−トリアジンを10g取得した（収
率50％）。

参考例2. モノメトキシポリエチレングリコールサクシニル−Ｎ−
ヒドロキシサクシンイミドエステルの合成充分脱水した平均分子量5000のモノメトキシポリエチレ
ングリコール（Union Carbide社製）20g,無水コハク酸2
gを無水トルエン50mlに加え、150℃に加熱し５時間還流
した。トルエンを減圧下留去した残渣に塩化メチレン30
ml添加し、完全可溶化後、無水エチルエーテル400mlを
加えて、沈澱を生じさせた。この沈澱物を塩化メチレ
ン：エチルエーテル系（1:3容量比）で再結晶を行い、
サクシニル化モノメトキチポリエチレングリコール10g
（収率約50％）を得た。このサクシニル化物3.3gとＮ−
ヒドロキシコハク酸イミド100mgを無水塩化メチレン5ml
に可溶化し、氷冷下ジシクロヘキシルカルボジイミド
（DCC）200mgを添加後、室温下20時間撹拌した。生じた
ジシクロヘキシルウレア（DCU）を別し、液にエチ
ルエーテルを加えて沈澱を生じさせた。得られた沈澱物
を塩化メチレン：エチルエーテル系で再結晶を行い、モ
ノメトキシポリエチレングリコール−サクシニル−Ｎ−
ヒドロキシサクシンイミドエステル2.5g（収率72％）を
得た。

参考例3. 第１表に示したアミノ酸配列を有するhG−CSFの１番目
のスレオニンをアラニンに、３番目のロイシンをスレオ
ニンに、４番目のグリシンをチロシンに、５番目のプロ
リンをアルギニンに、17番目のシスチンをセリンにそれ
ぞれ置換したhG−CSF誘導体を以下のようにして得た。

上記のhG−CSF誘導体をコードするDNAを含むプラスミド
pCfBD28を保有する大腸菌W3110 strA株（Escherichia c
oli ECfBD28 FERM BP−1479）をLG培地〔バクトトリプ
トン10g,酵母エキス5g,NaCl5g,グルコース1gを水１に
溶かし、NaOHにてpHを7.0とする。〕で37℃,18時間培養
し、この培養液5mlを25μg/mlのトリプトファンと50μg
/mlのアンピシリンを含むMCG培地（Na₂HPO₄0.6％,KH₂PO
₄0.3％,NaCl0.5％，カザミノ酸0.5％,MgSO₄1mM,ビタミ
ンB₁4μg/ml,pH7.2）100mlに接種し、30℃で４〜８時間
培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−インド
ールアクリル酸（３β−indoleacrylic acid,以下IAAと
略す）を10μg/ml加え、さらに２〜12時間培養を続け
た。培養液を8,000rpm,10分間遠心して集菌し、30mM N
aCl,30mMトリス・塩酸緩衝液（pH7.5）で洗浄した。洗
浄菌体を上記緩衝液30mlに懸濁し、０℃で超音波破砕
（BRANSON SONIC POWER COMPANY社SONIFIER CELL DISRU
PTOR 200,OUTPUT CONTROL2,10分間処理）した。これを
9,000rpm,30分間遠心して菌体残渣を得た。この菌体残
渣からマーストンらの方法〔F.A.O.Marstonら：バイオ
・テクノロジィ（BIO/TECHNOLOGY）２,800（1984）〕に
よりhG−CSF誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。

参考例4. 2,4−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−
６−（３−カルポキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジ
ン（IV a）のＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル
（IV b）の製造参考例１で得られた塩化物500mgを無水テトラヒドロフ
ラン9mlに溶解した。一方、γ−アミノ酪酸10mg、トリ
エチルアミン28μを無水ジメチルアミド1mlに溶解し
た液に上記溶液を添加後、室温下16時間撹拌した。次い
で、減圧乾固の後、塩化メチレン30ml、10mMリン酸緩衝
液（pH10）15mlを加え分配した。上層を2NHClでpH1にし
た後、塩化メチレン30mlを加え、再び分配した。下層を
分画し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、別し、減圧濃
縮を行い、上記カルボン酸（IV a）15mg（収率30％）を
得た。次いで乾燥したカルボン酸（IV a）150mgとＮ−
ヒドロキシサクシンイミド3mgを無水塩化メチレン1mlに
可溶化し、氷冷下ジシクロヘキシルカルボジイミド（DC
C）6mgを添加後、室温下12時間撹拌した。生じたジシク
ロヘキシルウレア（DCU）を別し、液にエチルエー
テルを加えて、沈澱を生じさせた。次いで、沈澱を別
後、減圧乾燥し、目的のエステル（IV b）100mg（収率6
7％）を得た。

実験例1. 化学修飾hG−CSF誘導体の比活性及びマウス白血病細胞N
FS60の増殖促進活性実施例３と同様の方法で、hG−CSF誘導体と活性エステ
ルを反応させ、限外過膜を用いて未反応の活性エステ
ルおよびその分解物を除去した。同膜を用いて、PBSに
内液の交換を行い、得られた残液中の化学修飾hG−CSF
誘導体のＧ−CSF活性及びNFS60細胞に対する増殖促進活
性〔K.L.Holmes,et al.,プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA）82,6687（1985）〕を測定し、結果を
第５表に示した。

化学修飾hG−CSF誘導体は、マウス骨髄幹細胞に対して
あきらかにCSF活性を保持していた。さらに、Ｇ−CSF依
存性の増殖を示すNFS60細胞に対しても増殖促進活性を
有していた。

実験例2. 白血球（顆粒球）増加効果実験例１で用いた化学修飾hG−CSF誘導体をC3H/Heマウ
ス（雄,n＝３）の皮下に単回または一日一回６日間投与
し、以下経時的に採血して末梢血中の白血球（WBC）を
計数した。その結果を第６表（単回投与）及び第７表
（連日投与）に示した。

単回投与では、投与後８時間をピークとする白血球数の
増加が認められたが、その後hG−CSF誘導体では48時間
でほぼ正常レベルに低下したのに対して、化学修飾hG−
CSF誘導体では48時間においても有意に高値の白血球増
加の持続効果を示した。

連日投与では、特に低用量投与群において、化学修飾hG
−CSF誘導体はhG−CSF誘導体に比べてあきらかに有意な
白血球増加効果を示した。

実験例3. 血中濃度の推移実験例１で用いた化学修飾hG−CSF誘導体をC3H/Heマウ
ス（雄,n＝３）の皮下に単回または連日６回投与し、以
下経時的に採血し血漿中のＧ−CSF濃度を測定した。そ
の結果を第８表（単回投与）及び第９表（連日投与）に
示した。また、一部の実験では静脈内に単回投与（第10
表）した実験も行った。

単回投与（皮下）の場合、hG−CSF誘導体では１時間を
ピークとして以下急速に血中濃度が低下したのに対し、
化学修飾hG−CSF誘導体では５〜７時間にかけて徐々に
血中濃度が上がり24時間でも比較的高値を維持した（第
８表）。一方、連日投与の実験では、１時間後血中濃度
はいずれもhG−CSF誘導体の方が高値であったが、24時
間では低値であり、３日目以降は検出できなかった。こ
れに対して、化学修飾hG−CSF誘導体では24時間後でも
検出可能であり、かつhG−CSF誘導体よりも高値であっ
た。

一方、静脈内投与の場合は、第10表に示したように化学
修飾hG−CSF誘導体の方があきらかに高い血中濃度を示
した。

実験例4. 化学修飾hG−CSFおよび化学修飾hG−CSF誘導体の比活性
及びマウス白血病細胞NFS60の増殖促進活性（１）実施例２で得られた化学修飾hG−CSF（III型）
を用い、実験例１と同様の方法で比活性及び増殖促進活
性を測定した。結果を第11表に示す。

（２）実施例４で得られた化学修飾hG−CSF誘導体（I
II型）および実施例５で得られた化学修飾hG−CSF誘導
体（IV型）を用い、実験例１と同様の方法で比活性及び
増殖促進活性を測定した。結果を第12表に示す。

実験例５白血球（顆粒球）増加効果（１）実施例２で得られた化学修飾hG−CSF（III型）
（2.5μg/匹）をBALB/Cマウス（雄３匹，対照群は４
匹）の皮下に単回投与し、以下経時的に採血して末梢血
中の白血球（WBC）数を係数した。その結果を第13表に
示す。

（２）実施例４で得られた化学修飾hG−CSF誘導体（I
II型）および実施例５で得られた化学修飾hG−CSF誘導
体（IV型）を2.5μg/匹用い上記（１）と同様にして白
血球（WBC）数を計数した。その結果を第14表に示す。

発明の効果本発明の化学修飾hG−CSF及び化学修飾hG−CSF誘導体
は、末梢白血球（顆粒球）の増多効果が増大され、血中
での安定性及び持続性が向上しており、凍結乾燥製剤と
して安定性が向上しているので、治験薬として有利に使
用できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭57−192435（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−115280（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−60938（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−146828（ＪＰ，Ａ) 特公昭47−24679（ＪＰ，Ｂ１)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
ポリペプチドの分子中の少なくとも１個のアミノ基に式
（１）で表される基を結合してなる修飾ポリペプチド。式 R₁−（OCH₂CH₂）_ｎ−Ｘ−R₂− （Ｉ）式中R₁はアルキル基またはアルカノイル基、ｎは任意に
変わりうる正の整数、ＸはO,NHまたはＳ、R₂は〔式中、R₃はOH,Cl,O−（OCH₂CH₂）_ｎ−R₁ （式中、R₁,nは前記と同意義を表す）を表し、Ｙは存在
しないか、またはＺ−（CH₂）_pCO（式中ＺはO,SまたはN
Hを表し、ｐは任意に変わりうる正の整数を表す）を表
す〕または（CO）_ｍ−（CH₂）_lCO（式中、ｍは０または
1,lは任意に変わりうる正の整数を表す）を表す。
【請求項２】請求項１記載の修飾ポリペプチドを含有す
る凍結乾燥標品。
【請求項３】請求項１記載の修飾ポリペプチドを含む白
血球細胞増殖促進剤。
【請求項４】下式で示される新規カルボン酸（式中、R₁、ｎおよびＸは前記と同意義を表し、ＺはＯ
またはＳを表し、ｐは任意に変わりうる正の整数を表
す）