JPH0799855A - 木本性植物プロトプラストの培養方法 - Google Patents
木本性植物プロトプラストの培養方法Info
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- JPH0799855A JPH0799855A JP5267805A JP26780593A JPH0799855A JP H0799855 A JPH0799855 A JP H0799855A JP 5267805 A JP5267805 A JP 5267805A JP 26780593 A JP26780593 A JP 26780593A JP H0799855 A JPH0799855 A JP H0799855A
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 木本性植物のプロトプラストからのコロニー
形成率の高い培養方法。 【構成】 木本性植物のプロトプラストと分裂能の高い
草本性植物のプロトプラストとを、植物ホルモンとして
一種類のオーキシン類と複数種類のサイトカイニン類を
組み合わせて含有する植物組織培養用液体培地で培養し
て木本性植物のコロニーを作出する。
形成率の高い培養方法。 【構成】 木本性植物のプロトプラストと分裂能の高い
草本性植物のプロトプラストとを、植物ホルモンとして
一種類のオーキシン類と複数種類のサイトカイニン類を
組み合わせて含有する植物組織培養用液体培地で培養し
て木本性植物のコロニーを作出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、木本性植物プロトプラ
ストを培養する方法に関し、さらに詳しくは、木本性植
物のプロトプラストからコロニーを誘導する際、通常使
用されている植物組織培養用培地に一種類のオーキシン
類と複数種類のサイトカイニン類を組み合わせて培養す
ることにより、効率的にコロニーを形成させる方法であ
り、これによってさらに苗条原基を経て木本性植物体を
再生させることを可能にする方法に関するものである。
従って、変異体作出技術として重要な遺伝子組換えある
いは細胞融合によって得られた木本性植物のプロトプラ
ストから、新規で有用な木本性植物体を効率的に得る方
法に関するものである。
ストを培養する方法に関し、さらに詳しくは、木本性植
物のプロトプラストからコロニーを誘導する際、通常使
用されている植物組織培養用培地に一種類のオーキシン
類と複数種類のサイトカイニン類を組み合わせて培養す
ることにより、効率的にコロニーを形成させる方法であ
り、これによってさらに苗条原基を経て木本性植物体を
再生させることを可能にする方法に関するものである。
従って、変異体作出技術として重要な遺伝子組換えある
いは細胞融合によって得られた木本性植物のプロトプラ
ストから、新規で有用な木本性植物体を効率的に得る方
法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】植物細胞より作出したプロトプラストは
細胞壁を有しないために、細胞融合あるいは有用な外来
の遺伝子等の導入が可能である。このようなプロトプラ
ストから効率的にコロニーを作出しさらには植物体を再
生することが可能になれば、これまでになかった全く新
しい植物を作り出すことが容易となる。例えば、作物の
場合には収量の高い、味の良い、さらには病虫害や気象
的な被害にも耐えることが可能な品種あるいは植物種を
作り出すことが出来るようになる。
細胞壁を有しないために、細胞融合あるいは有用な外来
の遺伝子等の導入が可能である。このようなプロトプラ
ストから効率的にコロニーを作出しさらには植物体を再
生することが可能になれば、これまでになかった全く新
しい植物を作り出すことが容易となる。例えば、作物の
場合には収量の高い、味の良い、さらには病虫害や気象
的な被害にも耐えることが可能な品種あるいは植物種を
作り出すことが出来るようになる。
【０００３】プロトプラストを培養する培地は、表１に
示されているような種々の無機塩、有機塩類を組み合わ
せた基本培地(MS: Murashige & Skoog, Physiol.Plant.
15:473-497, 1962, B5: Gamborg et al., Exp.Cell Re
s.50:151-158,1968, WPM:Lloyd & McCown，Proc.Int.Pl
ant Prop.Soc.30:421-427,1980 など）と、これに添加
する種々の植物成長ホルモン類、炭素源（ショ糖など）
および浸透圧調節剤（マニトール、グルコース）などを
添加したものである。このような培地を使ってこれまで
にプロトプラストからコロニーを経て植物体を再生する
技術はタバコやペチュニアその他多くの草本性植物で確
立されている。
示されているような種々の無機塩、有機塩類を組み合わ
せた基本培地(MS: Murashige & Skoog, Physiol.Plant.
15:473-497, 1962, B5: Gamborg et al., Exp.Cell Re
s.50:151-158,1968, WPM:Lloyd & McCown，Proc.Int.Pl
ant Prop.Soc.30:421-427,1980 など）と、これに添加
する種々の植物成長ホルモン類、炭素源（ショ糖など）
および浸透圧調節剤（マニトール、グルコース）などを
添加したものである。このような培地を使ってこれまで
にプロトプラストからコロニーを経て植物体を再生する
技術はタバコやペチュニアその他多くの草本性植物で確
立されている。
【０００４】しかしながら、木本性植物においてはトロ
ビタオレンジ（小林省蔵「育種学雑誌」３４巻（別
２），３２〜３３，１９８４）、コウゾ（岡成美、大山
勝夫「育種学雑誌」３４巻（別２）２６〜２７，１９８
４）、ポプラ（伊藤一弥他 特開昭63-301784 、Russel
l,J.A.and B.H.McCown ，Plant Sci.46：133-142,198
6）、ユーカリ（立道良泰他 特開昭63-301784 ）、 Sa
ndal wood （Rao,P.S.andP.Ozias-Akina Protoplasma
，124 ： 80-86, 1985）、 ニレ(Sticklen ，M.B. et
al. 47： 29-34, 1986) など少数しか例がない。
ビタオレンジ（小林省蔵「育種学雑誌」３４巻（別
２），３２〜３３，１９８４）、コウゾ（岡成美、大山
勝夫「育種学雑誌」３４巻（別２）２６〜２７，１９８
４）、ポプラ（伊藤一弥他 特開昭63-301784 、Russel
l,J.A.and B.H.McCown ，Plant Sci.46：133-142,198
6）、ユーカリ（立道良泰他 特開昭63-301784 ）、 Sa
ndal wood （Rao,P.S.andP.Ozias-Akina Protoplasma
，124 ： 80-86, 1985）、 ニレ(Sticklen ，M.B. et
al. 47： 29-34, 1986) など少数しか例がない。
【０００５】その原因として、プロトプラストの培養過
程で培養物から培地の中に排出されるポリフェノール系
物質による阻害、あるいは培養期間が長期を要するため
に培地成分、植物成長ホルモン等がプロトプラストの分
裂やコロニ−形成に大きく関係していることなどが挙げ
られる。このために最近では分化能の高いカルスあるい
は実生の胚軸や子葉等を材料に用いて、これからプロト
プラストを単離した後、細胞の凝集回避のために液体培
地に代わって固形培地を使用したり、プロトプラストを
寒天に埋め込み、これを液体培地に浮遊させて培養する
ビートタイプカルチャー法、さらにＸ線や紫外線等で不
活性化したプロトプラストを寒天に埋め込んでその上で
培養するフィーダーレーヤー法等が報告されている。
程で培養物から培地の中に排出されるポリフェノール系
物質による阻害、あるいは培養期間が長期を要するため
に培地成分、植物成長ホルモン等がプロトプラストの分
裂やコロニ−形成に大きく関係していることなどが挙げ
られる。このために最近では分化能の高いカルスあるい
は実生の胚軸や子葉等を材料に用いて、これからプロト
プラストを単離した後、細胞の凝集回避のために液体培
地に代わって固形培地を使用したり、プロトプラストを
寒天に埋め込み、これを液体培地に浮遊させて培養する
ビートタイプカルチャー法、さらにＸ線や紫外線等で不
活性化したプロトプラストを寒天に埋め込んでその上で
培養するフィーダーレーヤー法等が報告されている。
【０００６】木本性植物であるユーカリにおいて、本発
明者らは、既に草本性植物であるケナフのプロトプラス
トを共存させて培養することによってプロトプラストか
らコロニーを経て植物体を再生する方法を提案している
（特開平2-128631号）。さらにプロトプラスト培養時の
植物組織培養用基本培地の変更によってコロニー形成率
を向上させ、次いで、得られたコロニーからの苗条原基
を誘導する際において、前記コロニー作出用とは別種の
基本培地に変更することによって再生率も向上させる方
法を提案している（特願平５−１７４６３１号）。
明者らは、既に草本性植物であるケナフのプロトプラス
トを共存させて培養することによってプロトプラストか
らコロニーを経て植物体を再生する方法を提案している
（特開平2-128631号）。さらにプロトプラスト培養時の
植物組織培養用基本培地の変更によってコロニー形成率
を向上させ、次いで、得られたコロニーからの苗条原基
を誘導する際において、前記コロニー作出用とは別種の
基本培地に変更することによって再生率も向上させる方
法を提案している（特願平５−１７４６３１号）。
【０００７】しかしながら、これらの新規で有効な方法
によっても、変異体作出技術である遺伝子組換えあるい
は細胞融合によって新規な植物体を作出する際には、コ
ロニーの形成率あるいは植物体の再生効率の点で十分に
満足できるものではなかった。本発明者等は、これらの
問題点を解決して木本性植物のプロトプラストを容易に
分裂させて、コロニーを作出し、これから苗条原基を作
出し、次いで植物体を再生する方法について研究を重ね
た結果、本発明を完成するに至った。
によっても、変異体作出技術である遺伝子組換えあるい
は細胞融合によって新規な植物体を作出する際には、コ
ロニーの形成率あるいは植物体の再生効率の点で十分に
満足できるものではなかった。本発明者等は、これらの
問題点を解決して木本性植物のプロトプラストを容易に
分裂させて、コロニーを作出し、これから苗条原基を作
出し、次いで植物体を再生する方法について研究を重ね
た結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、プロトプラ
ストの有効な培養法を提供することを目的とする。
ストの有効な培養法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、木本性植物の
プロトプラストと分裂能の高い草本性植物のプロトプラ
ストとを、植物組織培養用基本培地に一種類のオーキシ
ン類と複数種類のサイトカイニン類を組み合わせた植物
ホルモン、炭素源、浸透圧調節剤を含有させた液体培地
で共存培養することにより木本性植物のコロニーを作出
する方法である。
プロトプラストと分裂能の高い草本性植物のプロトプラ
ストとを、植物組織培養用基本培地に一種類のオーキシ
ン類と複数種類のサイトカイニン類を組み合わせた植物
ホルモン、炭素源、浸透圧調節剤を含有させた液体培地
で共存培養することにより木本性植物のコロニーを作出
する方法である。
【００１０】このようにして得た木本性植物のコロニー
は、基本培地を前記コロニー作出用の基本培地とは別種
の基本培地に変更し、さらに植物ホルモン、炭素源およ
び浸透圧調節剤を含有させた液体培地に移植し、そし
て、従来の方法である光照射下での竪型回転培養を行う
ことによって苗条原基を作出し、さらに植物体へ再生す
ることができる。
は、基本培地を前記コロニー作出用の基本培地とは別種
の基本培地に変更し、さらに植物ホルモン、炭素源およ
び浸透圧調節剤を含有させた液体培地に移植し、そし
て、従来の方法である光照射下での竪型回転培養を行う
ことによって苗条原基を作出し、さらに植物体へ再生す
ることができる。
【００１１】本発明に使用する植物の種類は特に限定さ
れるものではない。共存培養に供試する分裂能の高い草
本性植物としては、ケナフ、タバコ、ペチュニア等の草
本性植物が挙げられる。一方再生を目的とする木本性植
物としては、ユーカリ、アカシア、マングローブ、パラ
ゴムノキ、コーヒー等の常緑広葉樹類、ポプラ、キリ、
コナラ、クヌギ、ウルシ等の落葉広葉樹類、マツ、ス
ギ、ヒノキ、トウヒ、モミ、カラマツ等の針葉樹類、柑
橘、ブドウ、アーモンド、マンゴー等の果樹類、バラ、
ウメ、サクラ、ツバキ、キョウチクトウ等の花木類等が
挙げられる。
れるものではない。共存培養に供試する分裂能の高い草
本性植物としては、ケナフ、タバコ、ペチュニア等の草
本性植物が挙げられる。一方再生を目的とする木本性植
物としては、ユーカリ、アカシア、マングローブ、パラ
ゴムノキ、コーヒー等の常緑広葉樹類、ポプラ、キリ、
コナラ、クヌギ、ウルシ等の落葉広葉樹類、マツ、ス
ギ、ヒノキ、トウヒ、モミ、カラマツ等の針葉樹類、柑
橘、ブドウ、アーモンド、マンゴー等の果樹類、バラ、
ウメ、サクラ、ツバキ、キョウチクトウ等の花木類等が
挙げられる。
【００１２】以下、本発明に用いるプロトプラストを単
離するために使用するカルス、無菌苗、苗条原基および
苗条の作出方法、プロトプラストの単離・調整方法、プ
ロトプラストの培養方法、コロニーからの苗条原基の作
出方法、さらに植物体の再生方法等について詳しく説明
する。
離するために使用するカルス、無菌苗、苗条原基および
苗条の作出方法、プロトプラストの単離・調整方法、プ
ロトプラストの培養方法、コロニーからの苗条原基の作
出方法、さらに植物体の再生方法等について詳しく説明
する。
【００１３】（カルス、無菌植物体、苗条原基の作出方
法）再生することを目的とする木本性植物およびこれと
共存させて培養するために用いる草本性植物からのカル
スの作出、および木本性植物の無菌植物体の作出に用い
る材料としては、種子を殺菌した後、植物の組織培養培
地、例えばB5培地あるいはMS培地等の寒天培地上に置床
して発芽させたものを用いる。
法）再生することを目的とする木本性植物およびこれと
共存させて培養するために用いる草本性植物からのカル
スの作出、および木本性植物の無菌植物体の作出に用い
る材料としては、種子を殺菌した後、植物の組織培養培
地、例えばB5培地あるいはMS培地等の寒天培地上に置床
して発芽させたものを用いる。
【００１４】次に、成長した茎頂を含む長さ0.5 〜２cm
の茎を切り取ってB5培地あるいはMS培地等に植物ホルモ
ン類、例えばナフタレン酢酸(NAA) 、2,4-ジクロロフェ
ノキシ酢酸(2,4-D) あるいはインドール酢酸(IAA) 等の
オーキシン類およびベンジルアデニン(6BA) 、カイネチ
ン、１−（２−クロル−４−ピリジル）−３−フェニル
尿素(4-PU)あるいはゼアチン等のサイトカイニン類を添
加した寒天培地に置床あるいは挿し木をする。これを20
〜30℃の温度、2,000 〜5,000 ルクスの照度下で培養を
行って、カルスあるいは苗条を得る。また、苗条原基の
作出は本発明者等が既に提案した方法によって可能であ
る（特開昭62-55020号、特開昭63-7720号各公報）。
の茎を切り取ってB5培地あるいはMS培地等に植物ホルモ
ン類、例えばナフタレン酢酸(NAA) 、2,4-ジクロロフェ
ノキシ酢酸(2,4-D) あるいはインドール酢酸(IAA) 等の
オーキシン類およびベンジルアデニン(6BA) 、カイネチ
ン、１−（２−クロル−４−ピリジル）−３−フェニル
尿素(4-PU)あるいはゼアチン等のサイトカイニン類を添
加した寒天培地に置床あるいは挿し木をする。これを20
〜30℃の温度、2,000 〜5,000 ルクスの照度下で培養を
行って、カルスあるいは苗条を得る。また、苗条原基の
作出は本発明者等が既に提案した方法によって可能であ
る（特開昭62-55020号、特開昭63-7720号各公報）。
【００１５】（プロトプラストの単離・調整方法）上記
の方法で得た木本性植物および草本性植物のそれぞれの
カルス、無菌植物体あるいは苗条原基を材料にして、細
胞間物質であるペクチンを分解するペクチン分解酵素、
細胞壁を分解するセルロース分解酵素、そしてマニトー
ルおよびポリビニルピロリドン(PVP) を含む酵素液を加
えて20〜30℃の温度で6 〜24時間、20〜30rpm の振盪速
度で振盪処理をしてプロトプラストを単離する。この場
合、無菌植物体からプロトプラストを単離するための前
処理として、0.1 〜1%の界面活性剤(Tween) による洗浄
処理を行うことが望ましい。次に酵素液を除いてプロト
プラストを洗浄、遠心処理をしてそれぞれの植物のプロ
トプラストを調整する。
の方法で得た木本性植物および草本性植物のそれぞれの
カルス、無菌植物体あるいは苗条原基を材料にして、細
胞間物質であるペクチンを分解するペクチン分解酵素、
細胞壁を分解するセルロース分解酵素、そしてマニトー
ルおよびポリビニルピロリドン(PVP) を含む酵素液を加
えて20〜30℃の温度で6 〜24時間、20〜30rpm の振盪速
度で振盪処理をしてプロトプラストを単離する。この場
合、無菌植物体からプロトプラストを単離するための前
処理として、0.1 〜1%の界面活性剤(Tween) による洗浄
処理を行うことが望ましい。次に酵素液を除いてプロト
プラストを洗浄、遠心処理をしてそれぞれの植物のプロ
トプラストを調整する。
【００１６】（プロトプラストの混合）酵素処理後、洗
浄された木本性植物および草本性植物のプロトプラスト
をそれぞれ104 ないし105 個／mlの濃度に調整する。そ
して、両プロトプラストの混合割合を1:5 〜5:1 として
混合し、植物の組織培養培地、例えばWPM 、B5、MS培地
等好ましくはWPM に植物ホルモン類、たとえばNAA 、2,
4ーD 、IAA 等のオーキシン類のうちの一種類と6BA 、4-
PU、カイネチン、ゼアチン、チジアズロン等のサイトカ
イニン類のうちの複数種類を添加した液体培地ないし支
持体剤を含む培地で培養する。支持体剤としては、寒
天、アガロースまたはゲランガム( Keｌco division,Me
rck)などを用いる。この際支持体剤を低濃度で含有させ
ることも可能である。
浄された木本性植物および草本性植物のプロトプラスト
をそれぞれ104 ないし105 個／mlの濃度に調整する。そ
して、両プロトプラストの混合割合を1:5 〜5:1 として
混合し、植物の組織培養培地、例えばWPM 、B5、MS培地
等好ましくはWPM に植物ホルモン類、たとえばNAA 、2,
4ーD 、IAA 等のオーキシン類のうちの一種類と6BA 、4-
PU、カイネチン、ゼアチン、チジアズロン等のサイトカ
イニン類のうちの複数種類を添加した液体培地ないし支
持体剤を含む培地で培養する。支持体剤としては、寒
天、アガロースまたはゲランガム( Keｌco division,Me
rck)などを用いる。この際支持体剤を低濃度で含有させ
ることも可能である。
【００１７】（プロトプラストの培養方法）培養条件
は、初期には暗所で培養し、プロトプラストの生育にと
もなって徐々に明るくするのが好適である。また、培養
期間中の温度としては20℃ないし30℃が好ましいが、特
に25℃ないし28℃の温度が好ましい。
は、初期には暗所で培養し、プロトプラストの生育にと
もなって徐々に明るくするのが好適である。また、培養
期間中の温度としては20℃ないし30℃が好ましいが、特
に25℃ないし28℃の温度が好ましい。
【００１８】（竪型回転培養による苗条原基の形成方
法）基本培地をWPM 培地からB5培地あるいはMS培地に変
更し、さらに、これにオーキシン、サイトカイニン、炭
素源および浸透圧調節剤を添加した液体培地の中へ得ら
れたコロニーを移植し、竪型回転培養する。その際、好
ましくはB5の基本培地が望ましい。培養条件は1 〜10rp
m の回転速度、最高2,000 〜20,000ルクスの照度、20〜
30℃の温度として、14〜40日間隔で新鮮培地へ継代して
培養を継続する。このようにして竪型回転培養をはじめ
てから40〜120 日で苗条原基が得られる。
法）基本培地をWPM 培地からB5培地あるいはMS培地に変
更し、さらに、これにオーキシン、サイトカイニン、炭
素源および浸透圧調節剤を添加した液体培地の中へ得ら
れたコロニーを移植し、竪型回転培養する。その際、好
ましくはB5の基本培地が望ましい。培養条件は1 〜10rp
m の回転速度、最高2,000 〜20,000ルクスの照度、20〜
30℃の温度として、14〜40日間隔で新鮮培地へ継代して
培養を継続する。このようにして竪型回転培養をはじめ
てから40〜120 日で苗条原基が得られる。
【００１９】（植物体の再生方法）回転培養で培養して
得られた苗条原基を、苗条を再生するための培地、例え
ば、B5培地、MS培地等に植物ホルモン類として、例えば
NAA 、2,4ーD 、IAA 等のオーキシン類、6BA 、4-PU、カ
イネチン、ゼアチン、チジアズロン等のサイトカイニン
類および炭素源を添加した培地で培養する。培養は20〜
30℃の温度、2,000〜3,000 ルクスの照度で約60日間行
って苗条を再生させ、さらに、発根させて完全な植物体
を再生させる。
得られた苗条原基を、苗条を再生するための培地、例え
ば、B5培地、MS培地等に植物ホルモン類として、例えば
NAA 、2,4ーD 、IAA 等のオーキシン類、6BA 、4-PU、カ
イネチン、ゼアチン、チジアズロン等のサイトカイニン
類および炭素源を添加した培地で培養する。培養は20〜
30℃の温度、2,000〜3,000 ルクスの照度で約60日間行
って苗条を再生させ、さらに、発根させて完全な植物体
を再生させる。
【００２０】
【実施例】以下、実施例によって本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１ （供試植物）木本性植物としてユーカリ・カマルドレン
シス(Eucalyptus camaldulensis)を、また、これと共存
させて培養する草本性植物としてケナフ(Hibiscus cann
abinus) を使用した。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１ （供試植物）木本性植物としてユーカリ・カマルドレン
シス(Eucalyptus camaldulensis)を、また、これと共存
させて培養する草本性植物としてケナフ(Hibiscus cann
abinus) を使用した。
【００２１】（ユーカリの無菌植物体の作出方法）ユー
カリの種子を有菌状態において10倍に希釈したアンチホ
ルミンで1 時間殺菌し、さらに、無菌的に70% の濃度の
エタノールに15秒間、次いで５倍に希釈したアンチホル
ミンに20分間浸漬して殺菌した。これを植物の組織培養
培地であるB5培地にショ糖3%を加えた寒天培地上で無菌
的に発芽させた。発芽後1カ月経過した無菌植物体の茎を
茎頂を含む長さ約１cmに切断し、これをB5培地に植物ホ
ルモンとしてNAA 0.5mg/l とBA 0.1mg/lを添加し、pHを
5.6 に調整した寒天培地( 寒天0.6%添加) に挿し木し
た。これを28℃の温度、3,000 ルクスの照度で培養した
結果、培養後約60日で発根した幼植物体を形成した。こ
れをユーカリのプロトプラスト単離用の材料とした。
カリの種子を有菌状態において10倍に希釈したアンチホ
ルミンで1 時間殺菌し、さらに、無菌的に70% の濃度の
エタノールに15秒間、次いで５倍に希釈したアンチホル
ミンに20分間浸漬して殺菌した。これを植物の組織培養
培地であるB5培地にショ糖3%を加えた寒天培地上で無菌
的に発芽させた。発芽後1カ月経過した無菌植物体の茎を
茎頂を含む長さ約１cmに切断し、これをB5培地に植物ホ
ルモンとしてNAA 0.5mg/l とBA 0.1mg/lを添加し、pHを
5.6 に調整した寒天培地( 寒天0.6%添加) に挿し木し
た。これを28℃の温度、3,000 ルクスの照度で培養した
結果、培養後約60日で発根した幼植物体を形成した。こ
れをユーカリのプロトプラスト単離用の材料とした。
【００２２】（ケナフのカルスの誘導方法）ケナフの種
子を70% の濃度のエタノールで30秒、次いで10倍に希釈
したアンチホルミン液で10分間殺菌した後、無菌的にB5
培地にショ糖3%を加えた寒天培地上で発芽させた。約30
日間培養して得られた苗条の茎を先端から長さ約１cmに
切断し、これをB5培地に植物ホルモンとして、２，4ーD
2mg/l 、6BA 0.01mg/lを添加した寒天培地（ショ糖3%，
寒天0.6%）上に置床した。これを28℃の温度、3,000ル
クスの照度で培養した。培養開始後、約40日で黄白色の
カルスを得、これを1カ月ごとに同一組成の新鮮培地に植
え継いでプロトプラストの単離、調整用の材料とした。
子を70% の濃度のエタノールで30秒、次いで10倍に希釈
したアンチホルミン液で10分間殺菌した後、無菌的にB5
培地にショ糖3%を加えた寒天培地上で発芽させた。約30
日間培養して得られた苗条の茎を先端から長さ約１cmに
切断し、これをB5培地に植物ホルモンとして、２，4ーD
2mg/l 、6BA 0.01mg/lを添加した寒天培地（ショ糖3%，
寒天0.6%）上に置床した。これを28℃の温度、3,000ル
クスの照度で培養した。培養開始後、約40日で黄白色の
カルスを得、これを1カ月ごとに同一組成の新鮮培地に植
え継いでプロトプラストの単離、調整用の材料とした。
【００２３】（プロトプラストの単離・調整方法）上記
の方法で得られたユーカリの苗条を、0.1%の界面活性剤
(Tween) で洗浄処理した後ナイフで細断したもの0.1gに
対し、また、ケナフはカルス1gに対し各20mlの酵素液(1
% セルラーゼ・オノズカRS、0.1%ペクトリアーゼY-23、
13% マニトール、pH5.6)を加えて28℃の温度、30rpm の
振盪回数で６時間の酵素処理を行って、両植物のプロト
プラストを別々に単離した。得られたプロトプラスト懸
濁液をナイロンメッシュ(225メッシュ）で濾過して未消
化の細胞塊等を除き、さらに750rpmで３分間の遠心分離
処理をして酵素液とプロトプラストを分離し、洗浄液
（13％マニトール）で２回洗浄した後に培養に供した。
の方法で得られたユーカリの苗条を、0.1%の界面活性剤
(Tween) で洗浄処理した後ナイフで細断したもの0.1gに
対し、また、ケナフはカルス1gに対し各20mlの酵素液(1
% セルラーゼ・オノズカRS、0.1%ペクトリアーゼY-23、
13% マニトール、pH5.6)を加えて28℃の温度、30rpm の
振盪回数で６時間の酵素処理を行って、両植物のプロト
プラストを別々に単離した。得られたプロトプラスト懸
濁液をナイロンメッシュ(225メッシュ）で濾過して未消
化の細胞塊等を除き、さらに750rpmで３分間の遠心分離
処理をして酵素液とプロトプラストを分離し、洗浄液
（13％マニトール）で２回洗浄した後に培養に供した。
【００２４】（プロトプラストの培養）プロトプラスト
の培養培地はWPM にオーキシン類であるNAA を5mg/l 、
サイトカイニン類である4-PU 1mg/l 、 と6BA 0.2mg/l
を組み合わせて加えた。なお、この場合のＷＰＭは基本
培地のＷＰＭに、ショ糖 1% 、マニトール 9％を加えた
ものである。この培地にユーカリとケナフのプロトプラ
ストを3:1(ユーカリ3 、ケナフ1)の割合で、また５×10
4 個/ml の濃度になるように混合して直径６cmのシャー
レにプレートした。なお、プレート液量はシャーレ当た
り3ml とした。プレートしたプロトプラストを28℃の温
度条件下、暗条件下で培養した。この結果コロニー形成
率は1.07% となった（表−２）。
の培養培地はWPM にオーキシン類であるNAA を5mg/l 、
サイトカイニン類である4-PU 1mg/l 、 と6BA 0.2mg/l
を組み合わせて加えた。なお、この場合のＷＰＭは基本
培地のＷＰＭに、ショ糖 1% 、マニトール 9％を加えた
ものである。この培地にユーカリとケナフのプロトプラ
ストを3:1(ユーカリ3 、ケナフ1)の割合で、また５×10
4 個/ml の濃度になるように混合して直径６cmのシャー
レにプレートした。なお、プレート液量はシャーレ当た
り3ml とした。プレートしたプロトプラストを28℃の温
度条件下、暗条件下で培養した。この結果コロニー形成
率は1.07% となった（表−２）。
【００２５】（植物体の再生方法）次に得られたプロト
プラスト由来コロニーから従来技術によって苗条原基を
作出し、さらに植物体を再生した。すなわち、培養2カ月
経過したコロニーを、基本培地をWPM からB5に変え、こ
れにNAA 0.02mg/l、4-PU 0.2mg/l 、ショ糖1%、および
マニトール3%を添加した培地が入った１本の試験管に対
し、１個体の割合でコロニーを植え付けて竪型回転培養
した結果、培養1カ月後には苗条原基が得られた。（表−
４）
プラスト由来コロニーから従来技術によって苗条原基を
作出し、さらに植物体を再生した。すなわち、培養2カ月
経過したコロニーを、基本培地をWPM からB5に変え、こ
れにNAA 0.02mg/l、4-PU 0.2mg/l 、ショ糖1%、および
マニトール3%を添加した培地が入った１本の試験管に対
し、１個体の割合でコロニーを植え付けて竪型回転培養
した結果、培養1カ月後には苗条原基が得られた。（表−
４）
【００２６】さらにこの苗条原基を、B5培地にNAA 0.02
mg/l、BA0.2 mg/l、ショ糖1%、およびゲランガム0.2%を
加えた固形培地に移植した。その結果、移植後1カ月後に
は苗条の再生が認められた。得られた苗条をB5培地にNA
A 0.01mg/l、ショ糖1%およびゲランガム0.15% を加えた
発根培地に移植することによって、1カ月後には発根が認
められ完全な植物体となった。
mg/l、BA0.2 mg/l、ショ糖1%、およびゲランガム0.2%を
加えた固形培地に移植した。その結果、移植後1カ月後に
は苗条の再生が認められた。得られた苗条をB5培地にNA
A 0.01mg/l、ショ糖1%およびゲランガム0.15% を加えた
発根培地に移植することによって、1カ月後には発根が認
められ完全な植物体となった。
【００２７】比較例１ プロトプラストの培養培地としてWPM にNAA 5mg/l 、シ
ョ糖１% 、およびマニトール９% にサイトカイニン類で
ある4-PU 1mg/l を添加した培地と、6BA 0.2mg/lを添
加した培地のそれぞれを使用して実施例１に記載した方
法でプロトプラストの培養を行った。その結果コロニー
形成率は実地例１よりも低い値であった。（表−２）
ョ糖１% 、およびマニトール９% にサイトカイニン類で
ある4-PU 1mg/l を添加した培地と、6BA 0.2mg/lを添
加した培地のそれぞれを使用して実施例１に記載した方
法でプロトプラストの培養を行った。その結果コロニー
形成率は実地例１よりも低い値であった。（表−２）
【００２８】実施例２ （供試植物）木本性植物としてユーカリ・カマルドレン
シス(Eucalyptus camaldulensis)を、また、これと共存
させて培養する草本性植物としてケナフ(Hibiscus cann
abinus) を使用した。
シス(Eucalyptus camaldulensis)を、また、これと共存
させて培養する草本性植物としてケナフ(Hibiscus cann
abinus) を使用した。
【００２９】（ユーカリの苗条原基の作出方法）発芽後
１カ月経ったユーカリの無菌実生苗の茎頂を切り出し、
これをB5の基本培地に植物ホルモンとしてNAA 0.02mg/l
と4-PUを0.2mg/l の割合で添加し、pHを5.6 に調整した
液体培地に植え付けた。培養条件は堅型回転培養装置を
用い2rpm、27℃の温度、1,000 〜10,000ルクスの照度で
培養を行い苗条原基を誘導した。その結果培養30日後に
は苗条原基が作出された。それを１カ月間隔で継代しな
がらプロトプラストの培養の材料とした。
１カ月経ったユーカリの無菌実生苗の茎頂を切り出し、
これをB5の基本培地に植物ホルモンとしてNAA 0.02mg/l
と4-PUを0.2mg/l の割合で添加し、pHを5.6 に調整した
液体培地に植え付けた。培養条件は堅型回転培養装置を
用い2rpm、27℃の温度、1,000 〜10,000ルクスの照度で
培養を行い苗条原基を誘導した。その結果培養30日後に
は苗条原基が作出された。それを１カ月間隔で継代しな
がらプロトプラストの培養の材料とした。
【００３０】（プロトプラストの単離・調整方法）上記
の方法で得られたユーカリの苗条原基をピンセットで小
さくほぐした後、試料1gに対して20mlの酵素液を加えて
28℃の温度、30rpm の振盪回数で12時間の酵素処理を行
って、プロトプラストを単離した。得られたプロトプラ
ストは実施例１に記載した方法によって濾過、洗浄した
後培養に供した。また、ケナフのプロトプラストも実地
例１と同様にして得た後調整した。
の方法で得られたユーカリの苗条原基をピンセットで小
さくほぐした後、試料1gに対して20mlの酵素液を加えて
28℃の温度、30rpm の振盪回数で12時間の酵素処理を行
って、プロトプラストを単離した。得られたプロトプラ
ストは実施例１に記載した方法によって濾過、洗浄した
後培養に供した。また、ケナフのプロトプラストも実地
例１と同様にして得た後調整した。
【００３１】（プロトプラストの培養と植物体の再生方
法）プロトプラストの培養培地はWPM （基本培地ＷＰＭ
とNAA 5mg/l 、ショ糖1%、およびマニトール9%を加えた
もの）に、4-PU 0.8mg/l と6BA 0.2mg/lをさらに組み
合わせたものを使用した。この培地にユーカリとケナフ
のプロトプラストを3:1(ユーカリ3 、ケナフ1)の割合
で、また５×104 個/ml の濃度になるように混合して直
径６cmのシャーレにプレートした。なお、プレート液量
はシャーレ当たり３mlとした。プレートしたプロトプラ
ストを28℃の温度、暗条件下で培養した。培養開始後60
日後に形成されたコロニーを調査した。 結果コロニー
の形成率はサイトカイニン類を4-PU 0.8mg/lと6BA 0.2m
g/l を組み合わせたホルモン条件において０．１１％で
あった。（表−３）。それらのコロニーを用いて苗条原
基を誘導、さらには植物体の再生を試みた結果、実施例
１で記載した苗条からのプロトプラストの培養と同じよ
うに苗条原基が効率的に誘導され、さらに、植物体の再
生が認められた。
法）プロトプラストの培養培地はWPM （基本培地ＷＰＭ
とNAA 5mg/l 、ショ糖1%、およびマニトール9%を加えた
もの）に、4-PU 0.8mg/l と6BA 0.2mg/lをさらに組み
合わせたものを使用した。この培地にユーカリとケナフ
のプロトプラストを3:1(ユーカリ3 、ケナフ1)の割合
で、また５×104 個/ml の濃度になるように混合して直
径６cmのシャーレにプレートした。なお、プレート液量
はシャーレ当たり３mlとした。プレートしたプロトプラ
ストを28℃の温度、暗条件下で培養した。培養開始後60
日後に形成されたコロニーを調査した。 結果コロニー
の形成率はサイトカイニン類を4-PU 0.8mg/lと6BA 0.2m
g/l を組み合わせたホルモン条件において０．１１％で
あった。（表−３）。それらのコロニーを用いて苗条原
基を誘導、さらには植物体の再生を試みた結果、実施例
１で記載した苗条からのプロトプラストの培養と同じよ
うに苗条原基が効率的に誘導され、さらに、植物体の再
生が認められた。
【００３２】比較例２ プロトプラストの培養において、サイトカイニン類を4-
PU0.8mg/l と6BA0.2mg/lのそれぞれ単独に添加した以外
は実地例２と同様にしてコロニーを形成させた結果、実
地例２の場合と比較してコロニー形成率は低かった。
（表−３）
PU0.8mg/l と6BA0.2mg/lのそれぞれ単独に添加した以外
は実地例２と同様にしてコロニーを形成させた結果、実
地例２の場合と比較してコロニー形成率は低かった。
（表−３）
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】
【発明の効果】以上説明したように、プロトプラストを
培養する際に一種類のオーキシン類と複数種のサイトカ
イニン類を組み合わせて使用することによってコロニー
形成率を向上させた。
培養する際に一種類のオーキシン類と複数種のサイトカ
イニン類を組み合わせて使用することによってコロニー
形成率を向上させた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 伊藤 一弥 三重県亀山市能褒野町24−９ 王子製紙株 式会社会林木育種研究所亀山研究室内 (72)発明者 柴田 勝 三重県亀山市能褒野町24−９ 王子製紙株 式会社会林木育種研究所亀山研究室内
Claims (1)
- 【請求項１】 木本性植物のプロトプラストと分裂能の
高い草本性植物のプロトプラストとを、植物組織培養用
基本培地に植物ホルモン、炭素源そして浸透圧調節剤を
含有させた液体培地で培養して、木本性植物のコロニー
を作出する木本性植物のプロトプラストの培養方法にお
いて、植物ホルモンが一種類のオーキシン類と複数種類
のサイトカイニン類であることを特徴とする木本性植物
のプロトプラストの培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5267805A JPH0799855A (ja) | 1993-10-01 | 1993-10-01 | 木本性植物プロトプラストの培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5267805A JPH0799855A (ja) | 1993-10-01 | 1993-10-01 | 木本性植物プロトプラストの培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0799855A true JPH0799855A (ja) | 1995-04-18 |
Family
ID=17449850
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5267805A Pending JPH0799855A (ja) | 1993-10-01 | 1993-10-01 | 木本性植物プロトプラストの培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0799855A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002281961A (ja) * | 2001-03-26 | 2002-10-02 | Sumitomo Forestry Co Ltd | 植物プロトプラストの単離方法 |
| CN117243125A (zh) * | 2023-10-26 | 2023-12-19 | 烟台市森林资源监测保护服务中心(烟台沿海防护林省级自然保护区管理服务中心、烟台市林业科学研究所) | 一种海岸松的组织培养方法 |
-
1993
- 1993-10-01 JP JP5267805A patent/JPH0799855A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002281961A (ja) * | 2001-03-26 | 2002-10-02 | Sumitomo Forestry Co Ltd | 植物プロトプラストの単離方法 |
| CN117243125A (zh) * | 2023-10-26 | 2023-12-19 | 烟台市森林资源监测保护服务中心(烟台沿海防护林省级自然保护区管理服务中心、烟台市林业科学研究所) | 一种海岸松的组织培养方法 |
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