JPH0799965A - 凍害保護剤および凍結保存方法 - Google Patents
凍害保護剤および凍結保存方法Info
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- JPH0799965A JPH0799965A JP5274827A JP27482793A JPH0799965A JP H0799965 A JPH0799965 A JP H0799965A JP 5274827 A JP5274827 A JP 5274827A JP 27482793 A JP27482793 A JP 27482793A JP H0799965 A JPH0799965 A JP H0799965A
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- inulin
- freezing
- polymerization
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 イヌリン型フルクタンを有効成分として含有
することを特徴とする微生物または細胞のための凍害保
護剤並びにイヌリン型フルクタンを含む溶液中に微生物
または細胞を浸した後、凍結または凍結乾燥させること
を特徴とする微生物または細胞の凍結保存方法。 【効果】 本発明の凍害保護剤を用いれば、微生物や植
物、動物の細胞を凍結する際に、凍結障害を抑制し、そ
の生存率を向上させることができる。したがって、本発
明は食品工業，医薬品工業等の分野において有用性が高
い。
することを特徴とする微生物または細胞のための凍害保
護剤並びにイヌリン型フルクタンを含む溶液中に微生物
または細胞を浸した後、凍結または凍結乾燥させること
を特徴とする微生物または細胞の凍結保存方法。 【効果】 本発明の凍害保護剤を用いれば、微生物や植
物、動物の細胞を凍結する際に、凍結障害を抑制し、そ
の生存率を向上させることができる。したがって、本発
明は食品工業，医薬品工業等の分野において有用性が高
い。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、イヌリン型フルクタン
を有効成分とする凍害保護剤および凍結保存方法に関す
る。さらに詳細には、ビフィズス菌，乳酸菌，大腸菌等
のような微生物または植物，動物の培養細胞を凍結する
ときに起こる凍結障害を抑制し、生存率を向上させる凍
害保護剤および凍結保存方法に関する。
を有効成分とする凍害保護剤および凍結保存方法に関す
る。さらに詳細には、ビフィズス菌，乳酸菌，大腸菌等
のような微生物または植物，動物の培養細胞を凍結する
ときに起こる凍結障害を抑制し、生存率を向上させる凍
害保護剤および凍結保存方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】微生
物や細胞の貯蔵・保存は単に優れた系統の保存に用いら
れるのみならず、その利用範囲が拡大しつつある。例え
ば、微生物では、ビフィズス菌や乳酸菌等は、その凍結
乾燥菌体が整腸効果をもつ食品素材として繁用されてい
る。また、特定の遺伝子を導入された大腸菌等の保存は
遺伝子工学上重要な課題となっている。
物や細胞の貯蔵・保存は単に優れた系統の保存に用いら
れるのみならず、その利用範囲が拡大しつつある。例え
ば、微生物では、ビフィズス菌や乳酸菌等は、その凍結
乾燥菌体が整腸効果をもつ食品素材として繁用されてい
る。また、特定の遺伝子を導入された大腸菌等の保存は
遺伝子工学上重要な課題となっている。
【０００３】一般に、微生物や細胞などの生体液の長期
貯蔵・保存のために凍結保存が行われている。従来、こ
のような凍結保存においては、生理学的に受容可能な凍
害保護剤で希釈した後、凍結貯蔵・保存する方法が殆ど
である。しかしながら、凍結は生物にとって苛酷であ
り、凍結および融解工程で生ずる熱的衝撃や結晶生成の
ために、その生存率を低下させることが多い。従って、
凍結保存後の生存率をより高める凍害保護剤と凍結保存
方法の開発が切望されていた。
貯蔵・保存のために凍結保存が行われている。従来、こ
のような凍結保存においては、生理学的に受容可能な凍
害保護剤で希釈した後、凍結貯蔵・保存する方法が殆ど
である。しかしながら、凍結は生物にとって苛酷であ
り、凍結および融解工程で生ずる熱的衝撃や結晶生成の
ために、その生存率を低下させることが多い。従って、
凍結保存後の生存率をより高める凍害保護剤と凍結保存
方法の開発が切望されていた。
【０００４】微生物や細胞の凍害を抑制するために、生
理的に受容可能な保護剤で希釈する方法が検討され、グ
リセロールが有効であることが見出された（Polge,ネイ
チャー（Nature），１６４巻，６６６頁，１９４９
年］。その後も凍害を抑制するための保護剤の開発が行
われている。例えば、ビフィズス菌や乳酸菌の凍結乾燥
製剤化において、生存率を向上させるために添加する保
護剤としてラクチュロース（特開昭５２−１５１７８７
号公報）、ビタミンＥ類（特公昭５３−５７４７号公
報）、コーンスティープリカー（特開昭５８−１０４７
８７号公報）、生澱粉（特開昭５８−１４９６７５号公
報）およびサイクロデキストリン（特開昭６３−２５１
０８０号公報）を用いる方法が知られている。しかし、
これらの方法は、該保護剤を大量に使用するにはその物
質が高価であったり、嗜好性が好ましくない等の問題点
があった。また、動物細胞を凍結保存する場合、その凍
結培地中に血清の添加を必要とするか、あるいは血清の
代わりに保護剤として、メチルセルロースやトレハロー
ス（特表平４−５０１１１２号公報）あるいはトレハロ
ースとゼラチン（特開平５−７４８９号公報）を添加す
る方法も確立されている。しかしながら、これらの方法
も生存率の向上が課題となっている。
理的に受容可能な保護剤で希釈する方法が検討され、グ
リセロールが有効であることが見出された（Polge,ネイ
チャー（Nature），１６４巻，６６６頁，１９４９
年］。その後も凍害を抑制するための保護剤の開発が行
われている。例えば、ビフィズス菌や乳酸菌の凍結乾燥
製剤化において、生存率を向上させるために添加する保
護剤としてラクチュロース（特開昭５２−１５１７８７
号公報）、ビタミンＥ類（特公昭５３−５７４７号公
報）、コーンスティープリカー（特開昭５８−１０４７
８７号公報）、生澱粉（特開昭５８−１４９６７５号公
報）およびサイクロデキストリン（特開昭６３−２５１
０８０号公報）を用いる方法が知られている。しかし、
これらの方法は、該保護剤を大量に使用するにはその物
質が高価であったり、嗜好性が好ましくない等の問題点
があった。また、動物細胞を凍結保存する場合、その凍
結培地中に血清の添加を必要とするか、あるいは血清の
代わりに保護剤として、メチルセルロースやトレハロー
ス（特表平４−５０１１１２号公報）あるいはトレハロ
ースとゼラチン（特開平５−７４８９号公報）を添加す
る方法も確立されている。しかしながら、これらの方法
も生存率の向上が課題となっている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは凍結
過程における微生物や細胞の死滅を抑制するため種々検
討した結果、イヌリン型フルクタンを希釈液中の凍害保
護剤として使用することにより、凍結保存時または凍結
乾燥時においても微生物や細胞の死滅を著しく抑制でき
ることを見出し、本発明を完成させた。
過程における微生物や細胞の死滅を抑制するため種々検
討した結果、イヌリン型フルクタンを希釈液中の凍害保
護剤として使用することにより、凍結保存時または凍結
乾燥時においても微生物や細胞の死滅を著しく抑制でき
ることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】本発明は、イヌリン型フルクタンを有効成
分として含有することを特徴とする微生物または細胞の
ための凍害保護剤並びにイヌリン型フルクタンを含む溶
液中に微生物または細胞を浸した後、凍結または凍結乾
燥させることを特徴とする微生物または細胞の凍結保存
方法を提供するものである。
分として含有することを特徴とする微生物または細胞の
ための凍害保護剤並びにイヌリン型フルクタンを含む溶
液中に微生物または細胞を浸した後、凍結または凍結乾
燥させることを特徴とする微生物または細胞の凍結保存
方法を提供するものである。
【０００７】本発明が適用される微生物としては各種の
ものがあり、例えばビフィドバクテリウム・アドレスセ
ンテス，ビフィドバクテリウム・インファンテス，ビフ
ィドバクテリウム・ビフィダム，ビフィドバクテリウム
・ロンガム，ビフィドバクテリウム・ブレーベ等のビフ
ィズス菌、ストレプトコッカス・フェーカリス，ラクト
バチルス・アシドフィラス等の乳酸菌、エッシェリシア
・コリＫ−１２のような大腸菌、バチルス・ズブチリス
・マルブルグ１６８株のような枯草菌、サッカロミセス
・セレビシェのような酵母を挙げることができる。
ものがあり、例えばビフィドバクテリウム・アドレスセ
ンテス，ビフィドバクテリウム・インファンテス，ビフ
ィドバクテリウム・ビフィダム，ビフィドバクテリウム
・ロンガム，ビフィドバクテリウム・ブレーベ等のビフ
ィズス菌、ストレプトコッカス・フェーカリス，ラクト
バチルス・アシドフィラス等の乳酸菌、エッシェリシア
・コリＫ−１２のような大腸菌、バチルス・ズブチリス
・マルブルグ１６８株のような枯草菌、サッカロミセス
・セレビシェのような酵母を挙げることができる。
【０００８】また、動物細胞としては、ヒト，牛，馬，
山羊，羊，兎，ハムスター，ラット，マウスの胚，癌細
胞，Ｔ−ｃｅｌｌ白血病細胞，ハイブリドーマ，繊維芽
細胞，血管構成細胞，骨髄細胞，分散膵島細胞，魚類の
培養細胞等が挙げられる。植物細胞としては、イネ，コ
ムギ，ニチニチソウ，トウモロコシ，サトウキビ，タバ
コ，ラベンダー，リンゴ，ニンジン，ダイズ，ゼニゴ
ケ，イチゴ，バレイショ，カーネーション，エンドウ，
アスパラガス，メキャベツ，ナシ等の培養細胞やプロト
プラスト，茎頂および不定胚などを挙げることができ
る。
山羊，羊，兎，ハムスター，ラット，マウスの胚，癌細
胞，Ｔ−ｃｅｌｌ白血病細胞，ハイブリドーマ，繊維芽
細胞，血管構成細胞，骨髄細胞，分散膵島細胞，魚類の
培養細胞等が挙げられる。植物細胞としては、イネ，コ
ムギ，ニチニチソウ，トウモロコシ，サトウキビ，タバ
コ，ラベンダー，リンゴ，ニンジン，ダイズ，ゼニゴ
ケ，イチゴ，バレイショ，カーネーション，エンドウ，
アスパラガス，メキャベツ，ナシ等の培養細胞やプロト
プラスト，茎頂および不定胚などを挙げることができ
る。
【０００９】微生物は任意の培地で培養した後、遠心分
離等により集菌し、適当な洗浄液で洗浄を行った湿菌体
が利用され、細胞は振盪培養などの任意の方法で培養し
た細胞を用いることができる。得られた微生物または細
胞は、そのままもしくは少量の緩衝液を加えた懸濁液と
して用い、予め殺菌したイヌリン型フルクタンを含む希
釈液中に懸濁させる。
離等により集菌し、適当な洗浄液で洗浄を行った湿菌体
が利用され、細胞は振盪培養などの任意の方法で培養し
た細胞を用いることができる。得られた微生物または細
胞は、そのままもしくは少量の緩衝液を加えた懸濁液と
して用い、予め殺菌したイヌリン型フルクタンを含む希
釈液中に懸濁させる。
【００１０】希釈液の成分はイヌリン型フルクタンを有
効成分として含み、他の成分としてはスキムミルク，ジ
メチルスルフォキシド，グリセリン，ブドウ糖，ショ
糖，乳糖，ビタミン類などを単独で、もしくは適宜組み
合わせ、必要に応じて同時にまたは付加的に添加して用
いることができる。
効成分として含み、他の成分としてはスキムミルク，ジ
メチルスルフォキシド，グリセリン，ブドウ糖，ショ
糖，乳糖，ビタミン類などを単独で、もしくは適宜組み
合わせ、必要に応じて同時にまたは付加的に添加して用
いることができる。
【００１１】本発明に用いられるイヌリン型フルクタン
の濃度は、凍結する微生物や細胞に適した濃度で使用す
ればよく、好ましくは１〜４０重量％の範囲で用いる。
また、本発明のイヌリン型フルクタンは、凍害保護剤の
組成の一部または全部として使用することができる。イ
ヌリン型フルクタンはショ糖にフルクトースが直鎖的に
結合している重合度３以上のフルクタンであり、通常は
重合度３〜１５、好ましくは重合度３〜６のものが単独
で、あるいは２種以上の混合物として使用される。
の濃度は、凍結する微生物や細胞に適した濃度で使用す
ればよく、好ましくは１〜４０重量％の範囲で用いる。
また、本発明のイヌリン型フルクタンは、凍害保護剤の
組成の一部または全部として使用することができる。イ
ヌリン型フルクタンはショ糖にフルクトースが直鎖的に
結合している重合度３以上のフルクタンであり、通常は
重合度３〜１５、好ましくは重合度３〜６のものが単独
で、あるいは２種以上の混合物として使用される。
【００１２】これらのイヌリン型フルクタンまたはその
混合物は、チコリーやキクイモ等から抽出することによ
り、あるいはショ糖にフルクトース転移能力を持つ酵素
を作用させることにより得ることができる。具体的なイ
ヌリン型フルクタンを例示すると以下のものが挙げられ
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。例え
ばキクイモの抽出により得られるイヌリン型フルクタン
は、重合度３〜６のもの（３０〜５０重量％）、重合度
７以上のもの（２０〜５０重量％）、単糖および２糖
（１０〜３０重量％）の糖組成を有し、ショ糖にアスペ
ルギルス・ニガー由来の酵素を作用させて得られるイヌ
リン型フルクタン（商品名：メイオリゴＧ；明治製菓社
製）は重合度３〜６のもの（５５〜６０重量％）、単糖
および２糖（４０〜４５重量％）の糖組成を有する。さ
らに、上記混合物をカラムクロマトグラフィーまたは膜
等を用いて部分精製することにより重合度３〜６の糖を
主成分とするフルクタン混合物を得ることができる。例
えば上記メイオリゴＧをカラムクロマトグラフィーを用
いて部分精製することにより重合度３〜６のものを９５
重量％以上の割合で含有するイヌリン型フルクタン（商
品名：メイオリゴＰ）を得ることができ、キクイモ抽出
物からも重合度３〜６（７０重量％以上）のイヌリン型
フルクタンを得ることができる。さらに、カラムクロマ
トグラフィーや晶析等を組み合わせることにより、単一
重合度を主成分とするイヌリン型フルクタン、例えば重
合度４（ニストース）、重合度５（フラクトシルニスト
ース）を得ることができる。
混合物は、チコリーやキクイモ等から抽出することによ
り、あるいはショ糖にフルクトース転移能力を持つ酵素
を作用させることにより得ることができる。具体的なイ
ヌリン型フルクタンを例示すると以下のものが挙げられ
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。例え
ばキクイモの抽出により得られるイヌリン型フルクタン
は、重合度３〜６のもの（３０〜５０重量％）、重合度
７以上のもの（２０〜５０重量％）、単糖および２糖
（１０〜３０重量％）の糖組成を有し、ショ糖にアスペ
ルギルス・ニガー由来の酵素を作用させて得られるイヌ
リン型フルクタン（商品名：メイオリゴＧ；明治製菓社
製）は重合度３〜６のもの（５５〜６０重量％）、単糖
および２糖（４０〜４５重量％）の糖組成を有する。さ
らに、上記混合物をカラムクロマトグラフィーまたは膜
等を用いて部分精製することにより重合度３〜６の糖を
主成分とするフルクタン混合物を得ることができる。例
えば上記メイオリゴＧをカラムクロマトグラフィーを用
いて部分精製することにより重合度３〜６のものを９５
重量％以上の割合で含有するイヌリン型フルクタン（商
品名：メイオリゴＰ）を得ることができ、キクイモ抽出
物からも重合度３〜６（７０重量％以上）のイヌリン型
フルクタンを得ることができる。さらに、カラムクロマ
トグラフィーや晶析等を組み合わせることにより、単一
重合度を主成分とするイヌリン型フルクタン、例えば重
合度４（ニストース）、重合度５（フラクトシルニスト
ース）を得ることができる。
【００１３】イヌリン型フルクタンを有効成分として含
有することを特徴とする微生物または細胞のための本発
明凍害保護剤は、従来知られている有効成分を含む既知
凍害保護剤に比べて、凍結保存後に微生物や細胞が生き
残る比率（生存率）の大幅な向上を示しており、微生物
または細胞の凍結過程における死滅を有効に防止するこ
とができる。
有することを特徴とする微生物または細胞のための本発
明凍害保護剤は、従来知られている有効成分を含む既知
凍害保護剤に比べて、凍結保存後に微生物や細胞が生き
残る比率（生存率）の大幅な向上を示しており、微生物
または細胞の凍結過程における死滅を有効に防止するこ
とができる。
【００１４】
【実施例】次に、本発明の実施例を示すが、これはあく
までも例示であって、本発明はこれに限定されるもので
はない。 実施例１ ビフィズス菌（ビフィドバクテリウム・ロンガム）をＢ
Ｌ培地で３７℃，２４時間嫌気培養し、培養後直ちに遠
心分離により培養液より菌体を分離した。集菌した菌体
を嫌気性リン酸緩衝液（pH7.０）で洗浄し、これを再び
遠心分離、集菌した。得られた湿菌体を等量３分し、以
下の実験に供した。 （イ）得られた湿菌体をニストース（重合度４のイヌリ
ン型フルクタン）6.７重量％のみを含む希釈液に均一に
懸濁させた後、−２５℃で凍結させ、２４時間保存後、
凍結・融解（−２５℃で凍結、３０℃で急速融解）を３
回繰り返した。その結果、凍結保存菌の生菌数は2.０８
×１０8 ／ｍｌで、生存率は４1.６％であった。
までも例示であって、本発明はこれに限定されるもので
はない。 実施例１ ビフィズス菌（ビフィドバクテリウム・ロンガム）をＢ
Ｌ培地で３７℃，２４時間嫌気培養し、培養後直ちに遠
心分離により培養液より菌体を分離した。集菌した菌体
を嫌気性リン酸緩衝液（pH7.０）で洗浄し、これを再び
遠心分離、集菌した。得られた湿菌体を等量３分し、以
下の実験に供した。 （イ）得られた湿菌体をニストース（重合度４のイヌリ
ン型フルクタン）6.７重量％のみを含む希釈液に均一に
懸濁させた後、−２５℃で凍結させ、２４時間保存後、
凍結・融解（−２５℃で凍結、３０℃で急速融解）を３
回繰り返した。その結果、凍結保存菌の生菌数は2.０８
×１０8 ／ｍｌで、生存率は４1.６％であった。
【００１５】（ロ）キクイモより抽出したイヌリン型フ
ルクタン（組成：重合度３〜１０のもの５２％、重合度
１１以上のもの３４％）6.７重量％のみを含む希釈液に
湿菌体を均一に懸濁させた後、前記（イ）と同様の操作
を行った。その結果、凍結保存菌の生菌数は1.２５×１
０8 ／ｍｌで、生存率は２5.５％であった。 （ハ）対照例としてショ糖6.７重量％（モル濃度0.１
Ｍ）のみを含む希釈液に湿菌体を均一に懸濁させた後、
前記（イ）と同様の操作を行ったところ、凍結保存菌の
生菌数は6.３０×１０7 ／ｍｌで、生存率は１2.９％で
あった。
ルクタン（組成：重合度３〜１０のもの５２％、重合度
１１以上のもの３４％）6.７重量％のみを含む希釈液に
湿菌体を均一に懸濁させた後、前記（イ）と同様の操作
を行った。その結果、凍結保存菌の生菌数は1.２５×１
０8 ／ｍｌで、生存率は２5.５％であった。 （ハ）対照例としてショ糖6.７重量％（モル濃度0.１
Ｍ）のみを含む希釈液に湿菌体を均一に懸濁させた後、
前記（イ）と同様の操作を行ったところ、凍結保存菌の
生菌数は6.３０×１０7 ／ｍｌで、生存率は１2.９％で
あった。
【００１６】実施例２ ビフィズス菌（ビフィドバクテリウム・アドレスセンテ
ス）をＢＬ培地で３７℃、２４時間嫌気培養し、培養後
直ちに遠心分離により培養液より菌体を分離した。集菌
した菌体を嫌気性リン酸緩衝液（pH7.０）で洗浄し、こ
れを再び遠心分離、集菌した。得られた湿菌体を等量４
分し、以下の実験に供した。 （イ）得られた湿菌体を、ニストース（重合度４のイヌ
リン型フルクタン）３重量％およびスキムミルク１０重
量％を含む希釈液に重量比１：１で混合し、pH7.０（５
規定水酸化ナトリウム溶液）に調整した。混合液をシャ
ーレに分注し、−２０℃で凍結乾燥した。凍結乾燥後の
生菌数は1.１８×１０11／ｇであり、生存率は３3.５％
であった。
ス）をＢＬ培地で３７℃、２４時間嫌気培養し、培養後
直ちに遠心分離により培養液より菌体を分離した。集菌
した菌体を嫌気性リン酸緩衝液（pH7.０）で洗浄し、こ
れを再び遠心分離、集菌した。得られた湿菌体を等量４
分し、以下の実験に供した。 （イ）得られた湿菌体を、ニストース（重合度４のイヌ
リン型フルクタン）３重量％およびスキムミルク１０重
量％を含む希釈液に重量比１：１で混合し、pH7.０（５
規定水酸化ナトリウム溶液）に調整した。混合液をシャ
ーレに分注し、−２０℃で凍結乾燥した。凍結乾燥後の
生菌数は1.１８×１０11／ｇであり、生存率は３3.５％
であった。
【００１７】（ロ）イヌリン型フルクタンの混合物であ
るメイオリゴＰ（商品名、明治製菓社製、組成：重合度
３のもの４4.４％、重合度４のもの４2.９％、重合度５
のもの8.９％、重合度６のもの0.６％）３重量％および
スキムミルク１０重量％を含む希釈液と湿菌体を重量比
１：１で混合した後、前記（イ）と同様の操作を行っ
た。凍結乾燥後の生菌数は1.０８×１０11／ｇであり、
生存率は３0.６％であった。 （ハ）フラクトシルニストース（重合度５のイヌリン型
フルクタン）３重量％およびスキムミルク１０重量％を
含む希釈液と湿菌体を重量比１：１で混合した後、前記
（イ）と同様の操作を行ったところ、凍結乾燥後の生菌
数は1.０９×１０11／ｇであり、生存率は３0.８％であ
った。 （ニ）対照例として乳糖３重量％およびスキムミルク１
０重量％を含む希釈液に湿菌体を重量比１：１で混合し
た後、前記（イ）と同様の操作を行った。その結果、凍
結乾燥後の生菌数は5.８８×１０10／ｇであり、生存率
は１6.７％であった。
るメイオリゴＰ（商品名、明治製菓社製、組成：重合度
３のもの４4.４％、重合度４のもの４2.９％、重合度５
のもの8.９％、重合度６のもの0.６％）３重量％および
スキムミルク１０重量％を含む希釈液と湿菌体を重量比
１：１で混合した後、前記（イ）と同様の操作を行っ
た。凍結乾燥後の生菌数は1.０８×１０11／ｇであり、
生存率は３0.６％であった。 （ハ）フラクトシルニストース（重合度５のイヌリン型
フルクタン）３重量％およびスキムミルク１０重量％を
含む希釈液と湿菌体を重量比１：１で混合した後、前記
（イ）と同様の操作を行ったところ、凍結乾燥後の生菌
数は1.０９×１０11／ｇであり、生存率は３0.８％であ
った。 （ニ）対照例として乳糖３重量％およびスキムミルク１
０重量％を含む希釈液に湿菌体を重量比１：１で混合し
た後、前記（イ）と同様の操作を行った。その結果、凍
結乾燥後の生菌数は5.８８×１０10／ｇであり、生存率
は１6.７％であった。
【００１８】実施例３ 大腸菌（エッシェリシア・コリＫ−１２）をＬブロスで
３７℃、２４時間培養し、培養後直ちに遠心分離により
培養液より菌体を分離した。集菌した菌体をリン酸緩衝
液（pH7.０）で洗浄し、これを再び遠心分離、集菌し
た。得られた湿菌体を等量３分し、以下の実験に供し
た。 （イ）得られた湿菌体をニストース（重合度４のイヌリ
ン型フルクタン）１０重量％のみを含む希釈液に均一に
懸濁し、−２５℃で凍結した。２４時間保存後、凍結・
融解（−２５℃で凍結、３０℃で急速融解）を３回繰り
返した。その結果、凍結保存菌の生菌数は3.９９×１０
8 ／ｍｌで生存率は４1.６％であった。
３７℃、２４時間培養し、培養後直ちに遠心分離により
培養液より菌体を分離した。集菌した菌体をリン酸緩衝
液（pH7.０）で洗浄し、これを再び遠心分離、集菌し
た。得られた湿菌体を等量３分し、以下の実験に供し
た。 （イ）得られた湿菌体をニストース（重合度４のイヌリ
ン型フルクタン）１０重量％のみを含む希釈液に均一に
懸濁し、−２５℃で凍結した。２４時間保存後、凍結・
融解（−２５℃で凍結、３０℃で急速融解）を３回繰り
返した。その結果、凍結保存菌の生菌数は3.９９×１０
8 ／ｍｌで生存率は４1.６％であった。
【００１９】（ロ）１−ケストース（重合度３のイヌリ
ン型フルクタン）１０重量％のみを含む希釈液に湿菌体
を均一に懸濁させ、前記（イ）と同様の操作を行ったと
ころ、凍結保存菌の生菌数は2.４７×１０8 ／ｍｌで、
生存率は２5.８％であった。 （ハ）対照例としてトレハロース１０重量％のみを含む
希釈液に湿菌体を均一に懸濁させ、前記（イ）と同様の
操作を行ったところ、凍結保存菌の生菌数は1.８６×１
０6 ／ｍｌで生存率は２0.２％であった。 （ニ）対照例としてショ糖１０重量％のみを含む希釈液
に湿菌体を均一に懸濁させ、前記（イ）と同様の操作を
行った。その結果、凍結保存菌は生菌数1.７７×１０8
／ｍｌで生存率は１8.３％であった。
ン型フルクタン）１０重量％のみを含む希釈液に湿菌体
を均一に懸濁させ、前記（イ）と同様の操作を行ったと
ころ、凍結保存菌の生菌数は2.４７×１０8 ／ｍｌで、
生存率は２5.８％であった。 （ハ）対照例としてトレハロース１０重量％のみを含む
希釈液に湿菌体を均一に懸濁させ、前記（イ）と同様の
操作を行ったところ、凍結保存菌の生菌数は1.８６×１
０6 ／ｍｌで生存率は２0.２％であった。 （ニ）対照例としてショ糖１０重量％のみを含む希釈液
に湿菌体を均一に懸濁させ、前記（イ）と同様の操作を
行った。その結果、凍結保存菌は生菌数1.７７×１０8
／ｍｌで生存率は１8.３％であった。
【００２０】実施例４ 乳酸菌（ラクトバチルス・アシドフィラス）をＩＬＳ培
地で３７℃、２４時間培養し、培養後直ちに遠心分離に
よって培養液より菌体を分離した。集菌した菌体をリン
酸緩衝液（pH7.０）で洗浄し、これを再び遠心分離、集
菌した。得られた湿菌体を等量２分し、以下の実験に供
した。
地で３７℃、２４時間培養し、培養後直ちに遠心分離に
よって培養液より菌体を分離した。集菌した菌体をリン
酸緩衝液（pH7.０）で洗浄し、これを再び遠心分離、集
菌した。得られた湿菌体を等量２分し、以下の実験に供
した。
【００２１】（イ）湿菌体をニストース（重合度４のイ
ヌリン型フルクタン）6.７重量％のみを含む希釈液に均
一に懸濁し、−２５℃で凍結した。２４時間保存後、凍
結・融解（−２５℃で凍結、３０℃で急速融解）を３回
繰り返した。凍結保存菌の生菌数は4.０×１０8 ／ｍｌ
で生存率は４7.６％であった。 （ロ）対照例としてショ糖6.７重量％のみを含む希釈液
に湿菌体を均一に懸濁させ、前記（イ）と同様の操作を
行った。その結果、凍結保存菌の生菌数は1.３２×１０
8 ／ｍｌで生存率は１5.７％であった。
ヌリン型フルクタン）6.７重量％のみを含む希釈液に均
一に懸濁し、−２５℃で凍結した。２４時間保存後、凍
結・融解（−２５℃で凍結、３０℃で急速融解）を３回
繰り返した。凍結保存菌の生菌数は4.０×１０8 ／ｍｌ
で生存率は４7.６％であった。 （ロ）対照例としてショ糖6.７重量％のみを含む希釈液
に湿菌体を均一に懸濁させ、前記（イ）と同様の操作を
行った。その結果、凍結保存菌の生菌数は1.３２×１０
8 ／ｍｌで生存率は１5.７％であった。
【００２２】実施例５ 培養細胞として癌細胞由来のHela細胞を用い、１０％牛
胎児血清を添加したＭＥＭ培地で３７℃で培養した後、
0.２５％トリプシン液で処理して細胞を剥した。これを
遠心管に入れ、５００〜６００ｒｐｍで５〜１０分間遠
心して細胞を採集した。得られた細胞を等量３分し、以
下の実験に供した。 （イ）ニストース（重合度４のイヌリン型フルクタン）
を最終濃度１０重量％になるように血清を含む増殖培地
に加えてよく撹拌して凍結用培地を調製した。冷温状態
で、凍結用培地に細胞を加えて懸濁し１〜２時間静置
し、凍害保護剤を細胞内に浸透させた後、アンプルに封
入した。このアンプルを−８０℃で凍結し９日間保存し
た。３７℃の恒温槽で融解後、増殖培地で１０〜２０倍
程度希釈し、５００〜６００ｒｐｍで５〜１０分間遠心
して細胞を採集した。融解した細胞は、トリパンブルー
染色を用いて生死を確認し、生存率を算出した結果９３
％生存していた。
胎児血清を添加したＭＥＭ培地で３７℃で培養した後、
0.２５％トリプシン液で処理して細胞を剥した。これを
遠心管に入れ、５００〜６００ｒｐｍで５〜１０分間遠
心して細胞を採集した。得られた細胞を等量３分し、以
下の実験に供した。 （イ）ニストース（重合度４のイヌリン型フルクタン）
を最終濃度１０重量％になるように血清を含む増殖培地
に加えてよく撹拌して凍結用培地を調製した。冷温状態
で、凍結用培地に細胞を加えて懸濁し１〜２時間静置
し、凍害保護剤を細胞内に浸透させた後、アンプルに封
入した。このアンプルを−８０℃で凍結し９日間保存し
た。３７℃の恒温槽で融解後、増殖培地で１０〜２０倍
程度希釈し、５００〜６００ｒｐｍで５〜１０分間遠心
して細胞を採集した。融解した細胞は、トリパンブルー
染色を用いて生死を確認し、生存率を算出した結果９３
％生存していた。
【００２３】（ロ）対照例としてグリセリンを最終濃度
１０重量％になるように血清を含む増殖培地に加えてよ
く撹拌して凍結用培地を調製した。これを前記（イ）と
同様の操作を行ったところ、凍結・融解後の生存率は６
５％であった。 （ハ）対照例としてグルコースを最終濃度１０重量％に
なるように血清を含む増殖培地に加えてよく撹拌して凍
結用培地を調製した。これを前記（イ）と同様の操作を
行ったところ、凍結・融解後の生存率は６２％であっ
た。
１０重量％になるように血清を含む増殖培地に加えてよ
く撹拌して凍結用培地を調製した。これを前記（イ）と
同様の操作を行ったところ、凍結・融解後の生存率は６
５％であった。 （ハ）対照例としてグルコースを最終濃度１０重量％に
なるように血清を含む増殖培地に加えてよく撹拌して凍
結用培地を調製した。これを前記（イ）と同様の操作を
行ったところ、凍結・融解後の生存率は６２％であっ
た。
【００２４】実施例６ 培養細胞としてチャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨ
Ｏ−Ｋ１細胞を用い、１０％牛胎児血清を添加したＨａ
ｍ's Ｆ１２培地にて３７℃で培養した後、0.２５％ト
リプシン液で処理して細胞を剥した。これを遠心管に入
れ、５００〜６００ｒｐｍで５〜１０分間遠心して細胞
を採集した。得られた細胞を等量３分し以下の実験に供
した。 （イ）ニストース（重合度４のイヌリン型フルクタン）
を最終濃度１０重量％になるように血清を含む増殖培地
に加えてよく撹拌して凍結用培地を調製した。冷温状態
で、凍結用培地に細胞を加えて懸濁し１〜２時間静置
し、凍害保護剤を細胞内に浸透させた後、アンプルに封
入した。このアンプルを−８０℃で凍結し９日間保存し
た。３７℃の恒温槽で融解後、増殖培地で１０〜２０倍
程度希釈し、５００〜６００ｒｐｍで５〜１０分間遠心
して細胞を採集した。融解した細胞は、トリパンブルー
染色を用いて生死を確認し、生存率を算出した結果、８
８％生存していた。
Ｏ−Ｋ１細胞を用い、１０％牛胎児血清を添加したＨａ
ｍ's Ｆ１２培地にて３７℃で培養した後、0.２５％ト
リプシン液で処理して細胞を剥した。これを遠心管に入
れ、５００〜６００ｒｐｍで５〜１０分間遠心して細胞
を採集した。得られた細胞を等量３分し以下の実験に供
した。 （イ）ニストース（重合度４のイヌリン型フルクタン）
を最終濃度１０重量％になるように血清を含む増殖培地
に加えてよく撹拌して凍結用培地を調製した。冷温状態
で、凍結用培地に細胞を加えて懸濁し１〜２時間静置
し、凍害保護剤を細胞内に浸透させた後、アンプルに封
入した。このアンプルを−８０℃で凍結し９日間保存し
た。３７℃の恒温槽で融解後、増殖培地で１０〜２０倍
程度希釈し、５００〜６００ｒｐｍで５〜１０分間遠心
して細胞を採集した。融解した細胞は、トリパンブルー
染色を用いて生死を確認し、生存率を算出した結果、８
８％生存していた。
【００２５】（ロ）対照例としてグリセリンを最終濃度
１０重量％になるように血清を含む増殖培地に加えてよ
く撹拌して凍結用培地を調製した。これを前記（イ）と
同様の操作を行ったところ、凍結・融解後の生存率は６
１％であった。 （ハ）対照例としてグルコースを最終濃度１０重量％に
なるように血清を含む増殖培地に加えてよく撹拌して凍
結用培地を調製した。これを前記（イ）と同様の操作を
行ったところ、凍結・融解後の生存率は４８％であっ
た。 （ニ）対照例としてジメチルスルフォキシドを最終濃度
１０重量％になるように血清を含む増殖培地に加えてよ
く撹拌して凍結用培地を調製した。これを前記（イ）と
同様の操作を行った。その結果、凍結・融解後の生存率
は７８％であった。
１０重量％になるように血清を含む増殖培地に加えてよ
く撹拌して凍結用培地を調製した。これを前記（イ）と
同様の操作を行ったところ、凍結・融解後の生存率は６
１％であった。 （ハ）対照例としてグルコースを最終濃度１０重量％に
なるように血清を含む増殖培地に加えてよく撹拌して凍
結用培地を調製した。これを前記（イ）と同様の操作を
行ったところ、凍結・融解後の生存率は４８％であっ
た。 （ニ）対照例としてジメチルスルフォキシドを最終濃度
１０重量％になるように血清を含む増殖培地に加えてよ
く撹拌して凍結用培地を調製した。これを前記（イ）と
同様の操作を行った。その結果、凍結・融解後の生存率
は７８％であった。
【００２６】実施例７ ニンジンの胚軸由来のカルスを適当な任意の液体培地で
培養し、0.７Ｍマンニトール中でメイセラーゼＰ−１
（商品名、明治製菓社製）で処理し、濾過・遠心・洗浄
し、プロトプラスト懸濁液を得た。得られたプロトプラ
ストを等量３分し以下の実験に供した。 （イ）ニストース（重合度４のイヌリン型フルクタン）
を最終濃度２０重量％、ジメチルスルフォキシドを最終
濃度１０％になるよう上記培地に加えてよく撹拌して濾
過・滅菌して凍結用培地とした。プロトプラスト懸濁液
に冷温状態で、この凍結用培地を少量ずつ穏やかに撹拌
しながら加えた。３０分〜１時間程度静置し、凍害保護
剤をプロトプラスト内に浸透させた後、液体窒素中−１
９６℃で凍結し９日間保存した。３７℃の恒温槽で急速
融解後、氷中で0.４Ｍマンニトールを含む液体培地で希
釈し、遠心してプロトプラストを採集した。融解したプ
ロトプラストは、エバンズブルー染色を用いて生死を確
認し、生存率を算出した結果５２％生存していた。
培養し、0.７Ｍマンニトール中でメイセラーゼＰ−１
（商品名、明治製菓社製）で処理し、濾過・遠心・洗浄
し、プロトプラスト懸濁液を得た。得られたプロトプラ
ストを等量３分し以下の実験に供した。 （イ）ニストース（重合度４のイヌリン型フルクタン）
を最終濃度２０重量％、ジメチルスルフォキシドを最終
濃度１０％になるよう上記培地に加えてよく撹拌して濾
過・滅菌して凍結用培地とした。プロトプラスト懸濁液
に冷温状態で、この凍結用培地を少量ずつ穏やかに撹拌
しながら加えた。３０分〜１時間程度静置し、凍害保護
剤をプロトプラスト内に浸透させた後、液体窒素中−１
９６℃で凍結し９日間保存した。３７℃の恒温槽で急速
融解後、氷中で0.４Ｍマンニトールを含む液体培地で希
釈し、遠心してプロトプラストを採集した。融解したプ
ロトプラストは、エバンズブルー染色を用いて生死を確
認し、生存率を算出した結果５２％生存していた。
【００２７】（ロ）対照例としてグルコースを最終濃度
２０重量％、ジメチルスルフォキシドを最終濃度１０％
になるよう上記培地に加えてよく撹拌して濾過・滅菌
し、凍結用培地とした。これを前記（イ）と同様の操作
を行ったところ、凍結・融解後の生存率は４２％であっ
た。 （ハ）対照例としてシュークロースを最終濃度２０重量
％、ジメチルスルフォキシドを最終濃度１０％になるよ
う上記培地に加えてよく撹拌して濾過・滅菌し、凍結用
培地とした。これを前記（イ）と同様の操作を行ったと
ころ、凍結・融解後の生存率は２８％であった。
２０重量％、ジメチルスルフォキシドを最終濃度１０％
になるよう上記培地に加えてよく撹拌して濾過・滅菌
し、凍結用培地とした。これを前記（イ）と同様の操作
を行ったところ、凍結・融解後の生存率は４２％であっ
た。 （ハ）対照例としてシュークロースを最終濃度２０重量
％、ジメチルスルフォキシドを最終濃度１０％になるよ
う上記培地に加えてよく撹拌して濾過・滅菌し、凍結用
培地とした。これを前記（イ）と同様の操作を行ったと
ころ、凍結・融解後の生存率は２８％であった。
【００２８】
【発明の効果】本発明の凍害保護剤を用いれば、微生物
や植物、動物の細胞を凍結する際に、凍結障害を抑制
し、その生存率を向上させることができる。したがっ
て、本発明は食品工業，医薬品工業等の分野において有
用性が高い。
や植物、動物の細胞を凍結する際に、凍結障害を抑制
し、その生存率を向上させることができる。したがっ
て、本発明は食品工業，医薬品工業等の分野において有
用性が高い。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/00 // Ａ６１Ｋ 35/12 7431−4Ｃ 35/74 Ｚ 7431−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:23） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (8)
- 【請求項１】 イヌリン型フルクタンを有効成分として
含有することを特徴とする微生物または細胞のための凍
害保護剤。 - 【請求項２】 イヌリン型フルクタンが重合度３〜６の
混合物である請求項１記載の凍害保護剤。 - 【請求項３】 イヌリン型フルクタンが重合度３，４お
よび５のいずれかである請求項１記載の凍害保護剤。 - 【請求項４】 微生物または細胞がビフィズス菌，乳酸
菌，大腸菌，枯草菌，酵母または植物，動物の培養細胞
である請求項１記載の凍害保護剤。 - 【請求項５】 イヌリン型フルクタンを含む溶液中に微
生物または細胞を浸した後、凍結または凍結乾燥させる
ことを特徴とする微生物または細胞の凍結保存方法。 - 【請求項６】 イヌリン型フルクタンが重合度３〜６で
ある請求項５記載の凍結保存方法。 - 【請求項７】 イヌリン型フルクタンが重合度３，４お
よび５のいずれかである請求項５記載の凍結保存方法。 - 【請求項８】 微生物または細胞がビフィズス菌，乳酸
菌，大腸菌，枯草菌，酵母または植物，動物の培養細胞
である請求項５記載の凍結保存方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27482793A JP3509148B2 (ja) | 1993-10-07 | 1993-10-07 | 凍害保護剤および凍結保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27482793A JP3509148B2 (ja) | 1993-10-07 | 1993-10-07 | 凍害保護剤および凍結保存方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0799965A true JPH0799965A (ja) | 1995-04-18 |
| JP3509148B2 JP3509148B2 (ja) | 2004-03-22 |
Family
ID=17547130
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27482793A Expired - Lifetime JP3509148B2 (ja) | 1993-10-07 | 1993-10-07 | 凍害保護剤および凍結保存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3509148B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003086072A1 (fr) * | 2002-03-28 | 2003-10-23 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Composition pour le stockage d'organe et procede de stockage d'organe |
| US6841169B2 (en) * | 1999-06-11 | 2005-01-11 | Rijksuniversiteit Groningen | Stabilizer for pharmacons |
| KR100493354B1 (ko) * | 2002-08-26 | 2005-06-07 | 한국생명공학연구원 | 레반 및 알기네이트 비드로 코팅되어 생존율이 향상된유산균 분말 및 그의 제조방법 |
| JP2012235728A (ja) * | 2011-05-11 | 2012-12-06 | Univ Of Fukui | 細胞の凍結保存液および凍結保存方法 |
| JP2016501873A (ja) * | 2012-11-30 | 2016-01-21 | ファーマコスモス・アクティーゼルスカブＰｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ Ａ／Ｓ | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
| JP2017524379A (ja) * | 2014-06-30 | 2017-08-31 | テイト アンド ライル イングレディエンツ アメリカス リミテッド ライアビリティ カンパニーＴａｔｅ ＆ Ｌｙｌｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｌｌｃ | 消耗品用コーティング組成物 |
| JP2024048991A (ja) * | 2022-09-28 | 2024-04-09 | 株式会社アビー | 細胞凍結保存液、及び細胞凍結方法 |
-
1993
- 1993-10-07 JP JP27482793A patent/JP3509148B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6841169B2 (en) * | 1999-06-11 | 2005-01-11 | Rijksuniversiteit Groningen | Stabilizer for pharmacons |
| JP4570877B2 (ja) * | 2002-03-28 | 2010-10-27 | 明治製菓株式会社 | 臓器保存用組成物および臓器の保存方法 |
| JPWO2003086072A1 (ja) * | 2002-03-28 | 2005-08-18 | 明治製菓株式会社 | 臓器保存用組成物および臓器の保存方法 |
| AU2003236297B2 (en) * | 2002-03-28 | 2008-12-11 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Composition for storing organ and method of storing organ |
| US7476660B2 (en) | 2002-03-28 | 2009-01-13 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Composition and method for organ preservation |
| WO2003086072A1 (fr) * | 2002-03-28 | 2003-10-23 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Composition pour le stockage d'organe et procede de stockage d'organe |
| KR100493354B1 (ko) * | 2002-08-26 | 2005-06-07 | 한국생명공학연구원 | 레반 및 알기네이트 비드로 코팅되어 생존율이 향상된유산균 분말 및 그의 제조방법 |
| JP2012235728A (ja) * | 2011-05-11 | 2012-12-06 | Univ Of Fukui | 細胞の凍結保存液および凍結保存方法 |
| JP2016501873A (ja) * | 2012-11-30 | 2016-01-21 | ファーマコスモス・アクティーゼルスカブＰｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ Ａ／Ｓ | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
| JP2019004904A (ja) * | 2012-11-30 | 2019-01-17 | ファーマコスモス・アクティーゼルスカブＰｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ Ａ／Ｓ | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
| JP2021192625A (ja) * | 2012-11-30 | 2021-12-23 | ファーマコスモス・ホールディング・アクティーゼルスカブPharmacosmos Holding A/S | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
| US11484025B2 (en) | 2012-11-30 | 2022-11-01 | Pharmacosmos Holding A/S | Cryoprotecting agent, cryoprotecting and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation |
| JP2017524379A (ja) * | 2014-06-30 | 2017-08-31 | テイト アンド ライル イングレディエンツ アメリカス リミテッド ライアビリティ カンパニーＴａｔｅ ＆ Ｌｙｌｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｌｌｃ | 消耗品用コーティング組成物 |
| JP2024048991A (ja) * | 2022-09-28 | 2024-04-09 | 株式会社アビー | 細胞凍結保存液、及び細胞凍結方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3509148B2 (ja) | 2004-03-22 |
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