JPH08103276A - 組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質、その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質を
高発現することができるＣＨＯ細胞の提供。 【構成】ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質を
コードするＤＮＡを保持する発現ベクター、該発現ベク
ターを含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分、該Ｃ
ＨＯ細胞から製造される組換え型ヒト・インターロイキ
ン８レセプター蛋白質またはその部分ペプチド、該ＣＨ
Ｏ細胞または組換え型ヒト・インターロイキン８レセプ
ター蛋白質を用いるインターロイキン８レセプターアゴ
ニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法、該ＣＨ
Ｏ細胞または組換え型ヒト・インターロイキン８レセプ
ター蛋白質を含有するインターロイキン８レセプターア
ゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング用キット、
該スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを
用いて得られるアゴニストまたはアンタゴニスト、およ
び該アゴニストまたはアンタゴニストを含有する医薬組
成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト・インターロイキ
ン８レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを保持する発
現ベクター、該発現ベクターを含有するＣＨＯ細胞また
はその細胞膜画分、該ＣＨＯ細胞から製造される組換え
型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質またはそ
の部分ペプチド、該ＣＨＯ細胞または組換え型ヒト・イ
ンターロイキン８レセプター蛋白質を用いるインターロ
イキン８レセプターアゴニスト／アンタゴニストのスク
リーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリ
ーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得
られるアゴニストまたはアンタゴニストおよび該アゴニ
ストまたはアンタゴニストを含有する医薬組成物に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン８は、１９８７年に、
リポポリサッカライド（ＬＰＳ）で刺激した末梢血単球
より好中球走化性因子として単離、精製された分子量約
８,０００のサイトカインである（Yoshimura, T．et a
l．プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンシズ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA),84, 9233-9237,1987）。さらに、
１９８８年に、ｃＤＮＡがクローニングされた（Matsus
hima, K. et al. ジャーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メディスン（J. Exp. Med.） 167, 1883-1893(198
8)）。その後、Ｔリンパ球走化性因子が単離、精製さ
れ、好中球走化性因子と同一物質であることが明らかに
なった（Lasen, C. G. et al. サイエンス（Science）2
43, 1464-1466(1989)）。この因子は、好中球、リンパ
球のみならず好塩基球にも働き、インターロイキン１や
腫瘍壊死因子などほかの炎症性サイトカインによる刺激
で種々の細胞より生産され、急性炎症形成の重要なメデ
ィエーターと考えられることからインターロイキン８と
命名された。抗ヒト・インターロイキン８単クローン抗
体が、炎症の実験モデルとしてのウサギの肺虚血後再灌
流障害、関節炎モデル、ＬＰＳ皮膚炎における好中球浸
潤を抑制し、炎症反応を軽減することが示され、インタ
ーロイキン８の炎症における本質的な役割が明らかとな
った（Sekido, N. et al. ネイチャー(Nature) 365,654
-657(1993)）。また、インターロイキン８を局所産生す
ると、好中球の腫瘍組織への浸潤・活性化がみられ、腫
瘍細胞の増殖が抑えられ、インターロイキン８が抗腫瘍
作用を有することが示された（広瀬ら、第１５回日本炎
症学会（1994））。

【０００３】インターロイキン８の大腸菌による大量生
産（Furuta, R. et al. ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（J. Biochem.) 106, 436-441(1989)）によ
り、リコンビナント・インターロイキン８が簡単に入手
できるようになり、インターロイキン８レセプター蛋白
質の研究も進んだ。１９９１年には、二種類のヒト・イ
ンターロイキン８レセプター蛋白質（Holmes, W. E. et
al. サイエンス（Science）253，1278-1280(1991)、Mu
rphy, P.M. & Tiffany, H. L. サイエンス（Science）2
53, 1280-1283(1991)）およびウサギ・インターロイキ
ン８レセプター蛋白質のｃＤＮＡクローニングが相次い
で報告され、その構造が明らかになった。二種類のヒト
・インターロイキン８レセプター蛋白質タイプＡおよび
タイプＢのアミノ酸配列を比較すると、非常によく一致
するが、リガンドとの結合に関与するとされるＮ末端領
域に相同性が低い。タイプＡは、インターロイキン８と
のみ特異的に結合するが、タイプＢは、インターロイキ
ン８以外にもインターロイキン８とアミノ酸配列で高い
相同性を有するファミリーのＧＲＯ（Growth RelatedPr
otein）、ＭＩＰ-２（Macrophage Inflammatory Protei
n 2）などとも結合する。インターロイキン８レセプタ
ー蛋白質タイプＡとタイプＢのＮ末端領域を入れ換える
とレセプター蛋白質の結合特異性も入れ換わることよ
り、レセプター蛋白質Ｎ末端領域がリガンドとの結合に
関与することが示された（LaRosa, G.J.ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（ J. Biol. Che
m.）267, 25402-25406(1992)）。

【０００４】これら二種類のインターロイキン８レセプ
ター蛋白質は好中球での発現、セカンドメッセンジャー
系は詳細に検討されているが、炎症時の局所への走化、
浸潤している好中球におけるそれぞれの発現量、機能性
の相違など炎症時におけるレセプター蛋白質機能につい
ては詳しい解析はまだなされていない。Site-directed
mutagenesis を用いたインターロイキン８リガンドおよ
びレセプター蛋白質タイプＡのアラニン・スキャンによ
りリガンド・レセプター蛋白質結合に重要な部位が、リ
ガンド（Herbert, C. A. et al. ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）266, 1
8989-18994(1991)）、レセプター蛋白質（Leong, S.R.
et al. ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J. Biol. Chem.）269, 19343-19348(1994)）で、
それぞれ明らかにされている。さらに、ヒト・インター
ロイキン８レセプターポリペプチドまたはその断片を用
いてインターロイキン−８レセプターアゴニストをスク
リーニングする方法が報告されている（特開平６−１０
０５９５）。しかしながら、ヒト・インターロイキン８
レセプターＤＮＡを高発現できる具体的なＣＨＯ細胞株
および該細胞株を用いるヒト・インターロイキン８レセ
プターのアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング
方法については記載されていない。

【０００５】近年、インターロイキン８およびそのレセ
プター蛋白質の研究が進み、炎症におけるインターロイ
キン８の本質的な関与が示唆されている。炎症局所への
好中球の走化、浸潤は、炎症局所で産生されたインター
ロイキン８が好中球膜上のインターロイキン８レセプタ
ー蛋白質に作用して惹起されることから、インターロイ
キン８レセプター蛋白質アンタゴニストは抗炎症剤とし
て期待される。一方、インターロイキン８による好中球
の活性化作用から、インターロイキン８レセプターアゴ
ニストは抗ガン剤、抗菌剤、抗かび剤、抗ウイルス剤な
どとして期待される。しかし、抗炎症などを目的とした
インターロイキン８レセプターアンタゴニストの報告や
抗ガン剤、抗菌剤、抗かび剤、抗ウイルス剤などを目的
としたインターロイキン８レセプターアゴニストの報告
がないのが現状である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒト・イン
ターロイキン８レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを
保持する発現ベクター、該発現ベクターを含有するＣＨ
Ｏ細胞またはその細胞膜画分、該ＣＨＯ細胞から製造さ
れる組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質またはその部分ペプチド、該ＣＨＯ細胞または組換え
型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質を用いる
インターロイキン８レセプターアゴニスト／アンタゴニ
ストのスクリーニング方法、該スクリーニング用キッ
ト、該スクリーニング方法またはスクリーニング用キッ
トを用いて得られるアゴニストまたはアンタゴニストお
よび該アゴニストまたはアンタゴニストを含有する医薬
組成物を提供する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題に鑑み、ヒトに有効なインターロイキン８レセプター
アゴニスト／アンタゴニストをスクリーニングする方法
につき鋭意研究した結果、ヒト・インターロイキン８レ
セプター蛋白質を高発現するＣＨＯ細胞株を製造するこ
とに成功し、そして該ＣＨＯ細胞株を用いることにより
効率よく確実にインターロイキン８レセプターアゴニス
ト／アンタゴニストをスクリーニングできることを見い
だした。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに
研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、（１）ヒト・インタ
ーロイキン８レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを保
持することを特徴とするｐＡＫＫＯ１．１１／ｈＩＬ８
ＲＡまたはｐＡＫＫＯ１．１１／ｈＩＬ８ＲＢで標示さ
れる発現ベクター、（２）第（１）項記載の発現ベクタ
ーを含有することを特徴とするＣＨＯ細胞またはその細
胞膜画分、（３）ＣＨＯ細胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子を欠損しているＣＨＯ細胞である第（２）項記載の
ＣＨＯ細胞、（４）第（２）項記載のＣＨＯ細胞を、ヒ
ト・インターロイキン８レセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡの発現が可能な条件下で培養することを特徴とす
る組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質
の製造法、（５）第（２）項記載のＣＨＯ細胞を、ヒト
・インターロイキン８レセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡの発現が可能な条件下で培養することにより製造さ
れ得る組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋
白質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分、

【０００９】（６）第（５）項記載の組換え型ヒト・イ
ンターロイキン８レセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細
胞から単離される組換え型ヒト・インターロイキン８レ
セプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、
（７）第（５）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画
分を用いることを特徴とするヒト・インターロイキン８
レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリー
ニング方法、（８）第（６）項記載の組換え型ヒト・イ
ンターロイキン８レセプター蛋白質、その部分ペプチド
またはそれらの塩を用いることを特徴とするヒト・イン
ターロイキン８レセプターアゴニストまたはアンタゴニ
ストのスクリーニング方法、（９）第（５）項記載のＣ
ＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分、または第（６）項記
載の組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩を含有するこ
とを特徴とするヒト・インターロイキン８レセプターア
ゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キッ
ト、（１０）第（７）項もしくは第（８）項記載のスク
リーニング方法または第（９）項記載のスクリーニング
用キットを用いて得られるヒト・インターロイキン８レ
セプターアゴニストまたはその塩、（１１）第（７）項
もしくは第（８）項記載のスクリーニング方法または第
（９）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られ
るヒト・インターロイキン８レセプターアンタゴニスト
またはその塩、（１２）第（１０）項記載のアゴニスト
またはその塩を含有することを特徴とする好中球の活性
化促進剤または好中球の遊走促進剤、および（１３）第
（１１）項記載のアンタゴニストまたはその塩を含有す
ることを特徴とする好中球の活性化抑制剤または好中球
の遊走抑制剤を提供する。

【００１０】より具体的には、本発明は、（１４）
（ｉ）標識インターロイキン８を、第（５）項記載のＣ
ＨＯ細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、
（ii）標識したインターロイキン８および試験化合物を
第（５）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に接
触させた場合における、標識インターロイキン８の該Ｃ
ＨＯ細胞またはその細胞膜画分に対する結合量を測定
し、比較することを特徴とする第（７）項記載のヒト・
インターロイキン８レセプターアゴニストまたはアンタ
ゴニストのスクリーニング方法、（１５）（ｉ）インタ
ーロイキン８を、第（５）項記載のＣＨＯ細胞またはそ
の細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）インターロイ
キン８および試験化合物を第（５）項記載のＣＨＯ細胞
またはその細胞膜画分に接触させた場合における、組換
え型ヒト・インターロイキン８レセプターを介した細胞
刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下、細胞遊走活性などを促進する活性または抑制
する活性など）を測定し、比較することを特徴とする第
（７）項記載のヒト・インターロイキン８レセプターア
ゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
（１６）（ｉ）第（６）項記載の組換え型ヒト・イン
ターロイキン８レセプター蛋白質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩およびインターロイキン８を接触させ
た場合と（ii）第（６）項記載の組換え型ヒト・イン
ターロイキン８レセプター蛋白質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩、インターロイキン８および試験化
合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とす
る第（８）項記載のヒト・インターロイキン８レセプタ
ーアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方
法、

【００１１】（１７）（ｉ）第（６）項記載の組換え
型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質、その部
分ペプチドまたはそれらの塩およびインターロイキン
８を接触させた場合と（ii）第（６）項記載の組換え
型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質、その部
分ペプチドまたはそれらの塩、インターロイキン８お
よび試験化合物を接触させた場合における、例えば該
組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質、
その部分ペプチドまたはその塩に対するインターロイキ
ン８の結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する
ことを特徴とする第（８）項記載のヒト・インターロイ
キン８レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのス
クリーニング方法、（１８）（ｉ）標識したインターロ
イキン８を第（６）項記載の組換え型ヒト・インターロ
イキン８レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩に接触させた場合と、（ii）標識したインター
ロイキン８および試験化合物を第（６）項記載の組換え
型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質、その部
分ペプチドまたはそれらの塩に接触させた場合におけ
る、標識インターロイキン８の該蛋白質、その部分ペプ
チドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較するこ
とを特徴とする第（８）項記載のヒト・インターロイキ
ン８レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスク
リーニング方法、（１９）第（１０）項記載のアゴニス
トまたはその塩を含有することを特徴とする抗ガン剤、
抗菌剤、抗かび剤または抗ウイルス剤、および（２０）
第（１１）項記載のアンタゴニストまたはその塩を含有
することを特徴とする炎症、リウマチ、痛風、好中球性
皮膚炎、喘息、成人呼吸窮迫症候群、敗血症、primary
fibrosis、クローン病、腎盂腎炎、心筋梗塞、多臓器障
害、ベーチェット病、Vogt-小柳病および肝炎から成る
群から選ばれる好中球浸潤を伴う疾患の予防・治療剤を
提供する。

【００１２】本発明において、ヒト・インターロイキン
８レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを保持する発現
ベクターを作製する場合、ヒト・インターロイキン８レ
セプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、
ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質をコードす
るｃＤＮＡなどが用いられているが、ヒト・インターロ
イキン８レセプター蛋白質またはヒト・インターロイキ
ン８レセプター蛋白質と実質的に同等のリガンド結合活
性を有する部分ペプチドをコードする塩基配列を有する
ものであれば、必ずしもこれに制約されるものではな
い。例えば、ゲノムＤＮＡや合成ＤＮＡなどを用いても
よい。具体的には、配列番号：２で表わされるアミノ酸
配列を有するヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質タイプＡをコードする配列番号：１で表わされる塩基
配列を有するｃＤＮＡ〔図１〕、配列番号：４で表わさ
れるアミノ酸配列を有するヒト・インターロイキン８レ
セプター蛋白質タイプＢをコードする配列番号：３で表
わされる塩基配列を有するｃＤＮＡ〔図３〕などが用い
られる。これらのｃＤＮＡは公知のものであり、サイエ
ンス（Science）253，1278-1280(1991)、サイエンス（S
cience）253, 1280-1283(1991)などに記載されている。
これらｃＤＮＡは、それ自体公知の遺伝子工学的手法を
用いてクローニングすることができるし、あるいはヌク
レオチド合成装置を用いて製造することもできる。例え
ば、後述する参考例１および参考例２の方法あるいはそ
れらに準ずる方法に従ってクローニングすることができ
る。

【００１３】ベクターとしては、ｐＡＫＫＯ１．１１、
ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮ
ＡＩＮｅｏなどが用いられ、なかでもｐＡＫＫＯ１．１
１などが好ましい。プロモーターとしては、宿主となる
細胞で効率よく発現するものであれば何でもよく、ＳＶ
４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫ
プロモーター、ＳＲαプロモーターなどが挙げられ、な
かでもＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが
好ましく、特にＳＲαプロモーターが好ましい。発現ベ
クターには、以上の他にエンハンサー、スプライシング
シグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー等を含有
しているものを用いるのが好ましい。選択マーカーとし
ては、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと略称す
る場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐
性〕、ｎｅｏ遺伝子〔Ｇ４１８耐性〕等が挙げられ、な
かでもＤＨＦＲ遺伝子などが好ましい。特に、ＤＨＦＲ
遺伝子が欠損しているＣＨＯ細胞を用いて、ＤＨＦＲ遺
伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含
まない培地によっても選択できる。本発明のヒト・イン
ターロイキン８レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡ
を保持する発現ベクターとしては、具体的には、ヒト・
インターロイキン８レセプター蛋白質をコードするｃＤ
ＮＡの上流に前記のプロモーター（特に、ＳＲαプロモ
ーター）を挿入し、好ましくはヒト・インターロイキン
８レセプター蛋白質をコードするＤＮＡの下流にＳＶ
ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ＰｏｌｙＡ付加シグナルを挿入
し、さらにそのＰｏｌｙＡ付加シグナルの下流にＤＨＦ
Ｒ遺伝子または（および）アンピシリン耐性遺伝子を挿
入したものなどが好ましい。より具体的には、ｐＡＫＫ
Ｏ１．１１／ｈＩＬ８ＲＡで標示される発現ベクター
〔図５〕、ｐＡＫＫＯ１．１１／ｈＩＬ８ＲＢで標示さ
れる発現ベクター〔図６〕などが好適である。

【００１４】このようにして作製したヒト・インターロ
イキン８レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを保持す
る発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、ヒ
ト・インターロイキン８レセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡを高発現できる細胞を作製することができる。宿
主細胞としては、動物細胞が好ましく、例えばＶｅｒｏ
細胞、ＣＨＯ細胞、Ｌ細胞、ミエローマ細胞、Ｃ１２７
細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｓｐ-２／Ｏ細胞など
が挙げられ、なかでもＤＨＦＲ遺伝子が欠損しているＣ
ＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞と略称す
る）、Ｓｐ-２／Ｏ細胞などが好ましく、特にＣＨＯ
（ｄｈｆｒ^-）細胞が好適である。発現ベクターの宿主
細胞への導入方法としては、公知の方法、例えばリン酸
カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J.
ヴィロロジー(Virology) 52, 456-467 (1973)〕、電気
穿孔法〔Neumann, E. et al. エンボ・ジャーナル(EMBO
J.) 1, 841-845 (1982)〕等が用いられる。ヒト・イン
ターロイキン８レセプター蛋白質を高発現できる細胞
は、上記の発現ベクターが染色体に組込まれた細胞をク
ローン選択によって選択することによって得ることがで
きる。具体的には、まず、上記の選択マーカーを指標と
して形質転換体を選択する。さらに、このようにして選
択マーカーを用いて得られた形質転換体に対して、繰り
返しクローン選択を行うことにより、ヒト・インターロ
イキン８レセプター蛋白質の高発現能を有する安定な細
胞株を得ることができる。また、ＤＨＦＲ遺伝子を選択
マーカーとして用いた場合、メソトレキセート（ＭＴ
Ｘ）の濃度を漸次上げて培養して耐性細胞を選択するこ
とにより、導入遺伝子を細胞内で増殖させて、さらに高
発現の細胞株を得ることもできる。

【００１５】ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質をコードするＤＮＡを高発現できる細胞としては、具
体的には、後述する実施例１で得られるｐＡＫＫＯ１．
１１／ｈＩＬ８ＲＡで標示される発現ベクターを含有す
るＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞、ｐＡＫＫＯ１．１１／ｈ
ＩＬ８ＲＢで標示される発現ベクターを含有するＣＨＯ
（ｄｈｆｒ^-）細胞などが挙げられる。これらのＣＨＯ
（ｄｈｆｒ^-）細胞は、天然のインターロイキン８レセ
プター蛋白質を含有する細胞（例えば、ヒト好中球な
ど）に比べて約１０〜３０倍、好ましくは約２０倍のレ
セプター活性（例えば、リガンド結合活性など）を有す
るものである。本発明のヒト・インターロイキン８レセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡを保持する発現ベクタ
ーを含有する細胞を、ヒト・インターロイキン８レセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡの発現が可能な条件下で
培養することにより組換え型ヒト・インターロイキン８
レセプター蛋白質を製造することができる。ヒト・イン
ターロイキン８レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを
保持する発現ベクターを含有する細胞を培養する際、培
地としては約０.５〜２０％のウシ胎児血清を含むＥＭ
ＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、α-
ＭＥＭ培地などが挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ
^-）細胞およびＤＨＦＲ選択マーカー遺伝子を用いる場
合、チミジンを含まない透析ウシ血清を含むＤＭＥＭ培
地あるいはα-ＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。ｐＨ
は約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常約３０〜
４０℃で、約１５〜７２時間行い、必要に応じて通気や
撹拌を加える。このようにして、ヒト・インターロイキ
ン８レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを保持する発
現ベクターを含有する細胞から組換え型ヒト・インター
ロイキン８レセプター蛋白質を含有する細胞を製造する
ことができる。

【００１６】組換え型ヒト・インターロイキン８レセプ
ター蛋白質を含有する細胞の細胞膜画分は、上記の組換
え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質を含有
する細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる
細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方
法としては、例えば、Potter−Elvehjem型ホモジナイザ
ーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリ
トロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破
砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズ
ルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細
胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法
などの遠心力による分画法が主として用いられる。例え
ば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐ
ｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清を
さらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で
通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とす
る。該膜画分中には、発現したヒト・インターロイキン
８レセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質な
どの膜成分が多く含まれる。本発明の組換え型ヒト・イ
ンターロイキン８レセプター蛋白質を含有する細胞やそ
の細胞膜画分中のヒト・インターロイキン８レセプター
蛋白質の量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるの
が好ましく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。
なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活
性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の
構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試
料を測定できるようになる。

【００１７】上記で得られた組換え型ヒト・インターロ
イキン８レセプター蛋白質を含有する細胞から組換え型
ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質を単離する
には、例えば下記の方法により行なうことができる。組
換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質を培
養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、
公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩
衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結
融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠
心分離やろ過により組換え型ヒト・インターロイキン８
レセプター蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い
られる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたん
ぱく変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、
ＴＭと省略することがある。）などの界面活性剤が含ま
れていてもよい。得られた抽出液中に含まれる組換え型
ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質の精製は、
自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうこ
とができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩
析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、
限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用
する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の
差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー
などの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電
点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用
いられる。

【００１８】かくして得られる組換え型ヒト・インター
ロイキン８レセプター蛋白質が遊離体で得られた場合に
は、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって
塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自
体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体
または他の塩に変換することができる。なお、組換え体
が産生する組換え型ヒト・インターロイキン８レセプタ
ー蛋白質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素
を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリ
ペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵
素としては、トリプシン、キモトリプシン、アルギニル
エンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼなどが用いら
れる。以上のごとく、ヒト・インターロイキン８レセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡを保持する発現ベクター
を含有する細胞を、ヒト・インターロイキン８レセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡの発現が可能な条件下で培
養することにより製造される組換え型ヒト・インターロ
イキン８レセプター蛋白質は、天然型のヒト・インター
ロイキン８レセプター蛋白質と実質的に同質の活性を有
するものである。実質的に同質の活性としては、例えば
リガンド結合活性、シグナル情報伝達などが挙げられ
る。リガンド結合活性としては、インターロイキン８、
インターロイキン８レセプターアゴニストなどとの結合
活性が挙げられる。実質的に同質とは、リガンド結合活
性などが性質的に同質であることを示す。したがって、
リガンド結合活性の強さなどの強弱、レセプター蛋白質
の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。

【００１９】本発明の組換え型ヒト・インターロイキン
８レセプター蛋白質の具体例としては、例えば配列番
号：１で表わされる塩基配列を有するｃＤＮＡから製造
される配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する
ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質タイプＡ、
配列番号：３で表わされる塩基配列を有するｃＤＮＡか
ら製造される配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を
有するヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質タイ
プＢなどの他に、配列番号：２または配列番号：４で表
わされるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸
が欠失したもの、配列番号：２または配列番号：４で表
わされるアミノ酸配列に１または２個以上のアミノ酸が
付加したもの、配列番号：２または配列番号：４で表わ
されるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が
他のアミノ酸で置換されたものなどが挙げられる。さら
に、これら組換え型ヒト・インターロイキン８レセプタ
ー蛋白質は、Ｎ末端のシグナルペプチドが切断されてい
てもよいし、分子内のアミノ酸の側鎖が適当な保護基
（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_1-6アシル
基など）で保護されていてもよいし、あるいは糖鎖など
が結合していてもよい。本発明の組換え型ヒト・インタ
ーロイキン８レセプター蛋白質の塩としては、とりわけ
生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩
としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化
水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢
酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハ
ク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、
メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが
用いられる。

【００２０】本発明の組換え型ヒト・インターロイキン
８レセプター蛋白質の部分ペプチドとしては、例えば、
本発明の組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター
蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位など
が用いられる。具体的には、疎水性プロット解析におい
て細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると
分析された部分ペプチドである。また、疎水性（Hydtop
hobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いること
ができる。さらに、個々のドメインを個別に含むペプチ
ドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分ペプ
チドでもよい。本発明の組換え型ヒト・インターロイキ
ン８レセプター蛋白質の部分ペプチドの塩としては、と
りわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この
様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン
酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例え
ば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン
酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安
息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との
塩などが用いられる。

【００２１】本発明の組換え型ヒト・インターロイキン
８レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩は、自
体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の
組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質を
適当なペプチダーゼで切断することによって製造するこ
とができる。ペプチドの合成法としては、例えば固相合
成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、
本発明の蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミ
ノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する
場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製
造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離と
してはたとえば、以下の〜に記載された方法が挙げ
られる。 Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ および M.A. Ondetti、
ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscie
nce Publishers, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを
精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適用
な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。

【００２２】本発明の組換え型ヒト・インターロイキン
８レセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞またはその細
胞膜画分、あるいは単離した組換え型ヒト・インターロ
イキン８レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩は、ヒト・インターロイキン８レセプターアゴ
ニストまたはアンタゴニストのスクリーニングに有用で
ある。すなわち、本発明は、 （１）（ｉ）本発明の組換え型ヒト・インターロイキ
ン８レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれら
の塩およびインターロイキン８を接触させた場合と
（ii）本発明の組換え型ヒト・インターロイキン８レ
セプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、
インターロイキン８および試験化合物を接触させた
場合との比較を行なうことを特徴とするヒト・インター
ロイキン８レセプターアゴニストまたはアンタゴニスト
のスクリーニング方法、および （２）（ｉ）本発明の組換え型ヒト・インターロイキ
ン８レセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞またはその
細胞膜画分およびインターロイキン８を接触させた場
合と（ii）本発明の組換え型ヒト・インターロイキン
８レセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞またはその細
胞膜画分、インターロイキン８および試験化合物を
接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするヒト
・インターロイキン８レセプターアゴニストまたはアン
タゴニストのスクリーニング方法を提供する。具体的に
は、本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と
（ii）の場合における、例えば該組換え型ヒト・インタ
ーロイキン８レセプター蛋白質、その部分ペプチドまた
はそれらの塩に対するインターロイキン８の結合量、細
胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする
ものである。

【００２３】より具体的には、本発明は、 （１ａ）（ｉ）標識したインターロイキン８を、本発明
の組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に接触させた場
合と、（ii）標識したインターロイキン８および試験化
合物を、本発明の組換え型ヒト・インターロイキン８レ
セプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に
接触させた場合における、標識インターロイキン８の該
レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩
に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするヒ
ト・インターロイキン８レセプターアゴニストまたはア
ンタゴニストのスクリーニング方法 （２ａ）（ｉ）標識したインターロイキン８を、本発明
の組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質
を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に接触させ
た場合と、（ii）標識したインターロイキン８および試
験化合物を、本発明の組換え型ヒト・インターロイキン
８レセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞またはその細
胞膜画分に接触させた場合における、標識インターロイ
キン８の該ＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に対する結
合量を測定し、比較することを特徴とするヒト・インタ
ーロイキン８レセプターアゴニストまたはアンタゴニス
トのスクリーニング方法、および

【００２４】（２ｂ）（ｉ）インターロイキン８を、本
発明の組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋
白質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に接触
させた場合と、（ii）インターロイキン８および試験化
合物を、本発明の組換え型ヒト・インターロイキン８レ
セプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜
画分に接触させた場合における、ヒト・インターロイキ
ン８レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、アラキ
ドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、
細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトー
ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸
化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性
などを促進する活性または抑制する活性など）を測定
し、比較することを特徴とするヒト・インターロイキン
８レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリ
ーニング方法を提供する。上記の（１ａ）または（２
ａ）のスクリーニング方法において、組換え型ヒト・イ
ンターロイキン８レセプター蛋白質に結合して、インタ
ーロイキン８と組換え型ヒト・インターロイキン８レセ
プター蛋白質との結合を阻害する化合物がヒト・インタ
ーロイキン８レセプターアゴニストまたはアンタゴニス
トとして選択できる。さらに、上記（２ｂ）のスクリー
ニング方法において、ヒト・インターロイキン８レセプ
ターに結合し、該レセプターを介して細胞刺激活性（例
えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内
Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生
成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内
蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、
細胞の遊走活性などを促進する活性または抑制する活性
など）を有する化合物をヒト・インターロイキン８レセ
プターアゴニストとして選択することができ、一方、該
細胞刺激活性を有しない化合物をヒト・インターロイキ
ン８レセプターアンタゴニストとして選択することがで
きる。本発明の組換え型ヒト・インターロイキン８レセ
プター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞が得られる以前は、
ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質を高発現で
きる動物細胞がなかったため、ヒト・インターロイキン
８レセプターアゴニストまたはアンタゴニストを効率良
くスクリーニングすることができなかった。

【００２５】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。本発明のスクリーニング方法におい
て、ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質を含有
するＣＨＯ細胞を用いる場合、該ＣＨＯ細胞をグルタル
アルデヒド、ホルマリンなどで固定化することができ
る。固定化方法は、それ自体公知の方法に従って行うこ
とができる。リガンドとして使用するインターロイキン
８としては、市販のものなどを用いることができる。ま
た、インターロイキン８の代わりに、公知のインターロ
イキン８レセプターアゴニストなどを使用することもで
きる。例えば、インターロイキン８レセプター蛋白質タ
イプＢに結合することが知られているＭＧＳＡ（Melano
ma Growth-Stimulating Activity）やＭＩＰ−２（Macr
ophage InflammatoryProtein-2）などを用いることもで
きる。標識したインターロイキン８としては、例えば、
〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識し
たインターロイキン８などを用いることができ、さらに
は、〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標
識した公知のインターロイキン８アゴニスト（例えば、
前述のＭＧＳＡ、ＭＩＰ−２など）などを用いることも
できる。例えば、〔¹²⁵Ｉ〕で標識されたインターロイ
キン８（アマーシャムおよびデュポン）などが好適であ
る。試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク、
非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙
げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよい
し、公知の化合物であってもよい。

【００２６】具体的には、上記の（１ａ）または（２
ａ）のスクリーニング方法を実施するには、まず、本発
明の組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分、あるい
は組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質
またはその部分ペプチドを、スクリーニングに適したバ
ッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製す
る。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐ
Ｈ約６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッフ
ァーなどの、インターロイキン８とレセプターとの結合
を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。ま
た、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔ
ｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、
デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加え
ることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプタ
ーやリガンドの分解を抑える目的で、ＰＭＳＦ、ロイペ
プチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチン
などのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。一
方、ＣＨＯ細胞が固定化細胞の場合、培養器に固定化さ
せたまま、つまりＣＨＯ細胞を生育させた状態で、ある
いはグルタルアルデヒドやパラホルムアルデヒドで固定
した細胞を用いて、インターロイキン８とインターロイ
キン８レセプター蛋白質を結合させることができる。こ
の場合、該緩衝液は培地やハンクス液などが用いられ
る。そして、０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶
液に、一定量（約５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐ
ｍ）の標識したインターロイキン８を添加し、同時に１
０^-4Ｍ〜１０^-10 Ｍの試験化合物を共存させる。非特異
的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のイン
ターロイキン８を加えた反応チューブも用意する。反応
は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分
から２４時間、望ましくは３０分から３時間行なう。反
応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファー
で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液
体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで
計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ₀）か
ら非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀−
ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳ
Ｂ）が例えば５０％以下になる試験化合物をアゴニスト
またはアンタゴニスト候補化合物として選択することが
できる。

【００２７】また、上記（２ｂ）のスクリーニング方法
を実施するためには、ヒト・インターロイキン８レセプ
ター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン
酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞
内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリ
ン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、
ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性などを
促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法ま
たは市販の測定用キットを用いて測定することができ
る。具体的には、まず、組換え型ヒト・インターロイキ
ン８レセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞をマルチウ
ェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうに
あたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示
さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添
加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出ある
いは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法
に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例
えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分
解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する
阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃ
ＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリン
などで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対
する産生抑制作用として検出することができる。

【００２８】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明の組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分、あるい
は本発明の組換え型ヒト・インターロイキン８レセプタ
ー蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩を含有するも
のである。本発明のスクリーニング用キットの例として
は、次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質
標品 組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質を
含有するＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個
／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂９５％ａｉｒで２日
間培養したもの。 標識インターロイキン８ 市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで
標識したインターロイキン８ 水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存
し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。 インターロイキン８標準液 インターロイキン８を０.１％ウシ血清アルブミン（シ
グマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、
−２０℃で保存する。

【００２９】〔測定法〕 １２穴組織培養用プレートにて培養した組換え型ヒト
・インターロイキン８レセプター蛋白質を含有するＣＨ
Ｏ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９
０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。 １０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識インターロイキン８を５μｌ加え、室温にて１
時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化
合物のかわりに１０^-3Ｍのインターロイキンを５μｌ加
えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識インターロイキン８を０.２Ｎ
ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチ
レーターＡ（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。

【数１】 ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ₀ ：最大結合量

【００３０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、インターロイキン８と本発明の組換え型ヒト・イン
ターロイキン８レセプター蛋白質との結合を阻害する化
合物であり、具体的には、ヒト・インターロイキン８レ
セプターを介して細胞刺激活性を有する化合物またはそ
の塩（いわゆる、ヒト・インターロイキン８レセプター
アゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物ま
たはその塩（いわゆる、ヒト・インターロイキン８レセ
プターアンタゴニスト）である。ヒト・インターロイキ
ン８レセプターアゴニストは、インターロイキン８が有
する生理活性と同様の作用を有しているので、該生理活
性に応じて安全で低毒性な医薬組成物として有用であ
る。例えば、好中球の活性化促進剤または好中球の遊走
促進剤などとして、さらには抗ガン剤、抗菌剤、抗かび
剤、抗ウイルス剤などとして有用である。一方、ヒト・
インターロイキン８レセプターアンタゴニストは、イン
ターロイキン８が有する生理活性を抑制することができ
るので、該生理活性を抑制する安全で低毒性な医薬組成
物として有用である。例えば、好中球の活性化抑制剤ま
たは好中球の遊走抑制剤などとして、さらには炎症、リ
ウマチ、痛風、好中球性皮膚炎、喘息、成人呼吸窮迫症
候群、敗血症、primary fibrosis、クローン病、腎盂腎
炎、心筋梗塞、多臓器障害、ベーチェット病、Vogt-小
柳病、肝炎などの好中球浸潤を伴う疾患の予防・治療剤
などとして有用である。

【００３１】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるアゴニストまたはア
ンタゴニストを上述の医薬組成物として使用する場合、
常套手段に従って実施することができる。例えば、必要
に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは
水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性
溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使
用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に
認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、
安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施
に要求される単位用量形態で混和することによって製造
することができる。これら製剤における有効成分量は指
示された範囲の適当な容量が得られるようにするもので
ある。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添
加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラ
ガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロー
スのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギ
ン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムの
ような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような
甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのよ
うな香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセル
である場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のよう
な液状担体を含有することができる。注射のための無菌
組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻
油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解また
は懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方す
ることができる。

【００３２】注射用の水性液としては生理食塩水、ブド
ウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソル
ビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）な
どがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール
（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプ
ロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イ
オン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（Ｔ
Ｍ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液と
してはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤とし
て安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用し
てもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢
酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザ
ルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、
ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、
保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールな
ど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整された注
射液は通常、適当なアンプルに充填される。このように
して得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温
血哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、
ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど）に対して投与する
ことができる。該化合物またはその塩の投与量は、症状
などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成
人（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１
〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好
ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与す
る場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症
状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤
の形では通常成人（６０ｋｇとして）においては、一日
につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１
〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程
度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動
物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与するこ
とができる。

【００３３】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸

【００３４】Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ＢＳＡ ：ウシ血清アルブミン 後述の実施例１で得られた形質転換体 エシェリヒア
コリ （Escherichiacoli）ＤＨ５／ｐＡＫＫＯ１．１
１／ｈＩＬ８ＲＡおよび形質転換体 エシェリヒア コ
リ （Escherichia coli）ＤＨ５／ｐＡＫＫＯ１．１
１／ｈＩＬ８ＲＢは、平成６年１０月５日から通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）にそ
れぞれ寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８２０および寄託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８２１として寄託されている。後
述の実施例２で得られた形質転換体 ＣＨＯ／Ａ２１−
８および形質転換体ＣＨＯ／Ｂ４−４は、平成６年１０
月５日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所（ＮＩＢＨ）にそれぞれ寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４
８２２および寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８２３として
寄託されている。

【００３５】

【実施例】以下に参考例および実施例を挙げて本発明を
さらに具体的に説明するが、本発明がそれに限定される
ものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法
は、モレキュラー・クローニング〔Molecular Clonin
g〕に記載されている方法に従った。

【００３５】

【参考例１】ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質タイプＡｃＤＮＡのクローニング 公知のヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質タイ
プＡｃＤＮＡ（サイエンス（Sciense）, 253, 1278-128
0 (1991)）の塩基配列に基づき、ＤＮＡオリゴマーお
よびを合成した。は５'−ＧＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡ
ＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＧＴＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＧ
ＡＴＣＣ−３'（配列番号：５）であり、−４〜＋２０
（翻訳開始部位を＋１とする）のセンス配列を含むオリ
ゴマーである。また、は５'−ＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴ
ＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣ−
３'（配列番号：６）であり、＋１０３６〜＋１０５９
のアンチセンス配列を含むオリゴマーである。ヒト・脾
臓のｍＲＮＡ（CLONTECH社）５μｇから逆転写酵素を用
いてｃＤＮＡ合成を行なった。ＲＮＡを分解後、引き続
いて上記ＤＮＡオリゴマーおよびとＴａｑポリメレ
ースを用いてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を
行なった。反応条件は、最初９４℃で５分間おいた後、
９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で３分を１サイク
ルとして３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１５分
間反応させた。反応後、特異的に増幅されたＤＮＡ断片
を切り出し、Ｔ４ポリメレースで平滑末端化し、ｐＵＣ
１１９ベクター（宝酒造）のＨｉｎｃII部位に挿入し
て、プラスミドｐＵＣ１１９／ｈＩＬ８ＲＡを得た。挿
入されたヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質タ
イプＡｃＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー
（Applied Biochemical社）を用いて確認したところ、
公知の塩基配列と完全に一致した〔図１〕。以上のよう
にヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質タイプＡ
ｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを得た。

【００３６】

【参考例２】ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質タイプＢｃＤＮＡのクローニング 公知のヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質タイ
プＢｃＤＮＡ（サイエンス（Sciense）, 253, 1280-128
3 (1991)）の塩基配列に基づき、ＤＮＡオリゴマーお
よびを合成した。は５'−ＧＴＧＣＧＴＣＧＡＣＴ
ＧＣＡＧＴＴＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＡＧＣＴ
ＴＴＧ−３'（配列番号：７）であり、−５〜＋１９
（翻訳開始部位を＋１とする）のセンス配列を含むオリ
ゴマーである。また、は５'−ＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣ
ＡＡＧＣＴＴＧＧＴＣＴＴＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＧＧＡ
ＡＧＴＧＴＧ−３'（配列番号：８）であり、＋１０４
８〜＋１０７２のアンチセンス配列を含むオリゴマーで
ある。ヒト・脾臓のｃＤＮＡ（CLONTECH社）２ｎｇと上
記ＤＮＡオリゴマーおよびとＴａｑポリメレースを
用いてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行なっ
た。反応条件は、最初９４℃で５分間おいた後、９４℃
で１分、５５℃で２分、７２℃で３分を１サイクルとし
て３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１５分間反応
させた。反応後、特異的に増幅されたＤＮＡ断片を切り
出し、Ｔ４ポリメレースで平滑末端化し、ｐＵＣ１１９
ベクター（宝酒造）のＨｉｎｃII部位に挿入して、プラ
スミドｐＵＣ１１９／ｈＩＬ８ＲＢを得た。挿入された
ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質タイプＢｃ
ＤＮＡの塩基配列を、〔α-³²Ｐ〕ｄＣＴＰ（Amersham
社）を用いた通常の方法で確認したところ、公知の塩基
配列と完全に一致した〔図３〕。以上のようにヒト・イ
ンターロイキン８レセプター蛋白質タイプＢｃＤＮＡ断
片を含むプラスミドを得た。

【００３７】

【実施例１】ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質ｃＤＮＡ発現ベクターの構築 ＣＨＯ細胞での発現ベクターとしては、ｐＡＫＫＯ１．
１１を用いた。ｐＡＫＫＯ１．１１は次のようにして構
築した。特開平５−０７６３８５公報に記載のｐＴＢ１
４１７からＨｉｎｄIIIおよびＣｌａＩ処理によってＳ
ＲαプロモーターおよびｐｏｌｙＡ付加シグナルを含む
１．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。また、ｐＴＢ３４８
（Naruo, K. et al. バイオケミカル・アンド・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Bioche
m. Biophys. Res. Commun.）128, 256-264(1985)）から
ＣｌａＩおよびＳａｌＩ処理によりジヒドロ葉酸還元酵
素（ｄｈｆｒ）遺伝子を含む４．５ｋｂのＤＮＡ断片を
得た。これらのＤＮＡ断片をＴ４ポリメラーゼ処理によ
り末端を平滑末端にした後、Ｔ４ライゲースにより連結
し、ｐＡＫＫＯ１．１１プラスミドを構築した。次に、
参考例１および参考例２で得たｐＵＣ１１９／ｈＩＬ８
ＲＡおよびｐＵＣ１１９／ｈＩＬ８ＲＢからＳａｌＩで
ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質タイプＡｃ
ＤＮＡおよびヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質タイプＢｃＤＮＡ断片をそれぞれ切り出し、発現ベク
ターｐＡＫＫＯ１．１１の唯一のクローニング部位であ
るＳａｌＩ部位に挿入して、ヒト・インターロイキン８
レセプター蛋白質タイプＡｃＤＮＡの発現プラスミドｐ
ＡＫＫＯ１．１１／ｈＩＬ８ＲＡおよびヒト・インター
ロイキン８レセプター蛋白質タイプＢｃＤＮＡの発現プ
ラスミドｐＡＫＫＯ１．１１／ｈＩＬ８ＲＢを得た。ｐ
ＡＫＫＯ１．１１／ｈＩＬ８ＲＡおよびｐＡＫＫＯ１．
１１／ｈＩＬ８ＲＢを塩化カルシウム法にて大腸菌ＤＨ
５にそれぞれ導入し、ヒト・インターロイキン８レセプ
ター蛋白質タイプＡｃＤＮＡの発現プラスミドｐＡＫＫ
Ｏ１．１１／ｈＩＬ８ＲＡを保持する形質転換体 エシ
ェリヒア コリ（Escherichia coli）ＤＨ５／ｐＡＫＫ
Ｏ１．１１／ｈＩＬ８ＲＡおよびヒト・インターロイキ
ン８レセプター蛋白質タイプＢｃＤＮＡの発現プラスミ
ドｐＡＫＫＯ１．１１／ｈＩＬ８ＲＢを保持する形質転
換体 エシェリヒア コリ（Escherichia coli）ＤＨ５
／ｐＡＫＫＯ１．１１／ｈＩＬ８ＲＢを得た。

【００３８】

【実施例２】ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質ｃＤＮＡのＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞での発現 ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞１×１０⁶細胞を、直径１０cm
のシャーレを用いて、ウシ胎児血清を含むα-ＭＥＭ培
地で２４時間培養し、この細胞に実施例１で得たヒト・
インターロイキン８レセプター蛋白質タイプＡｃＤＮＡ
の発現プラスミドｐＡＫＫＯ１．１１／ｈＩＬ８ＲＡお
よびヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質タイプ
ＢｃＤＮＡの発現プラスミドｐＡＫＫＯ１．１１／ｈＩ
Ｌ８ＲＢ１μｇをそれぞれリン酸カルシウム法で導入し
た。導入４８時間後、培地を１０％ウシ胎児血清を含む
α-ＭＥＭ培地に換えて、プラスミドを染色体に組み込
んだ細胞を選択した。さらに選択された細胞を、限界希
釈法によって単一細胞からクローニングし、ヒト・イン
ターロイキン８レセプター蛋白質タイプＡ安定に高発現
する細胞株ＣＨＯ／Ａ２１-８およびヒト・インターロ
イキン８レセプター蛋白質タイプＢを安定に高発現する
細胞株ＣＨＯ／Ｂ４−４を得た。

【００３９】

【実施例３】ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質を発現する固定化細胞の調製 実施例２で得たヒト・インターロイキン８レセプター蛋
白質を発現しているＣＨＯ細胞を２４穴あるいは９６穴
プレートに培養した後、培地を除去し、０.０１％グル
タルアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水を加え、３
０分静置した。２回洗浄後、２％ＢＳＡ、０.２％Ｎａ
Ｎ₃を含むリン酸緩衝液を加え、−４℃で保存した。

【００４０】

【実施例４】ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質を含有するＣＨＯ細胞膜画分の調製 実施例２で得たヒト・インターロイキン８レセプター蛋
白質タイプＡおよびタイプＢをそれぞれ発現しているＣ
ＨＯ細胞（１０⁹個）を０.５３ｍＭ ＥＤＴＡを添加し
たリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ-ＥＤＴＡ）に浮遊さ
せ、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞のペレット
に細胞用ホモジネートバッファー（５０ｍＭ トリス-塩
酸緩衝液、０.１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２
０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、４μｇ／ｍｌ Ｅ-６４、
１μｇ／ｍｌ ペプスタチンＡ）を２０ｍｌ加え、ポリ
トロンホモジナイザーを用いてホモジネートした。１０
００ｒｐｍで５分遠心し、上清を３８,０００×ｇ、２
０分間遠心し、膜画分の沈殿物を得た。この沈殿物を２
ｍlの０.２％ ＢＳＡを含むホモジネートバッファーに
懸濁し、分注して、−８０℃で保存し、使用の都度、解
凍して用いた。

【００４１】

【実施例５】ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質活性の測定 ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質タイプＡお
よびタイプＢをそれぞれ発現しているＣＨＯ細胞を２４
穴プレートに培養した。結合反応はリガンドとして２５
ｐＭの〔¹²⁵Ｉ〕インターロイキン８（２０００Ｃｉ／
ｍｍｏｌ；ＮＥＭ、NEX277）または〔¹²⁵Ｉ〕ＧＲＯ／
ＭＧＳＡ（２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＮＥＭ、NEX321）
を含む１ｍｌの測定用緩衝液（１０％ウシ胎児血清、
０.２％ＮａＮ₃を含むα-ＭＥＭ培地）中で３７℃、１
時間行った。反応終了後、上清を除き、２ｍｌのリン酸
緩衝生理食塩水で３回洗浄した。残った〔¹²⁵Ｉ〕の量
は１％ＳＤＳ-０.２Ｎ ＮａＯＨ溶液で細胞を剥がした
後、ガンマカウンターで測定し、これを総結合量とし
た。また、結合反応に２５０ｐＭの非標識インターロイ
キン８を加えて同様の操作を行ない、得られた
〔¹²⁵Ｉ〕の量を非特異的結合量とした。総結合量から
非特異的結合量を差し引いたものを特異的結合量とし
た。その結果を〔表１〕に示す。

【００４２】

【表１】 Leeら（Lee, J. et al. ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）267, 16283-162
87(1992)）によって、インターロイキン８レセプター蛋
白質タイプＡはインターロイキン８と結合するがＧＲＯ
／ＭＧＳＡとは結合せず、インターロイキン８レセプタ
ー蛋白質タイプＢはインターロイキン８およびＧＲＯ／
ＭＧＳＡと結合することが報告されている。〔表１〕の
結合特異性の結果は、Leeらの報告と一致しており、Ｃ
ＨＯ／Ａ２１−８はヒト・インターロイキン８レセプタ
ータイプＡを、ＣＨＯ／Ｂ４−４はヒト・インターロイ
キン８レセプタータイプＢを発現していることが確認さ
れた。

【００４３】

【実施例６】ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
質の発現量および解離定数の測定 ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質タイプＡお
よびタイプＢをそれぞれ発現している細胞を９６穴プレ
ートにコンフルエンシーに達するまで培養した。細胞あ
たりのインターロイキン８の最大結合量および解離定数
（Ｋｄ）は以下の方法で測定した。〔¹²⁵Ｉ〕インター
ロイキンの終濃度が０.４〜２５ｎＭまでの数段階に調
製した測定用緩衝液５０μｌを各ウェルに加え、３７
℃、１時間インキュベートした。インキュベーション
後、実施例５に記載の方法で細胞に結合した〔¹²⁵Ｉ〕
活性を測定した。細胞数はウェル中の細胞をトリプシン
-ＥＤＴＡ液で剥がした後、血球計算盤で測定した。こ
の測定結果に基づきスキャッチャード解析を行った結
果、〔¹²⁵Ｉ〕インターロイキン８の最大結合量はイン
ターロイキン８レセプター蛋白質タイプＡでは１細胞あ
たり３８４,０００およびその解離定数は２.９ｎＭであ
り、インターロイキン８レセプター蛋白質タイプＢでは
１細胞あたり６６０，０００およびその解離定数は４．
７ｎＭであった。結果を〔図７〕および〔図８〕に示
す。この結果から、本発明のヒト・インターロイキン８
レセプター蛋白質タイプＡおよびタイプＢをそれぞれ発
現している細胞は、ヒト好中球に比べ約２０倍のリガン
ド結合活性（比活性）をもった細胞であることが判明し
た。さらに、インターロイキン８の解離定数も天然型の
ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質のものと同
等であることが判明した（Samanta,A. K. et al. ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン(J. Ex
p. Med.) 169, 1185-1189(1989)）。

【００４４】

【発明の効果】本発明のヒト・インターロイキン８レセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡを保持する発現ベクタ
ーを保持するＣＨＯ細胞は、ヒト・インターロイキン８
レセプター蛋白質を高発現することができる。また、本
発明の組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋
白質を含有するＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜分画また
は組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質
もしくはその部分ペプチドを用いて、ヒト・インターロ
イキン８レセプターアゴニストまたはアンタゴニストを
効率良くスクリーニングすることができる。本発明のス
クリーニング方法によれば、アゴニストまたはアンタゴ
ニストを有利に選択することができるので、例えば、好
中球の浸潤を伴うような炎症性疾患の予防・治療剤、あ
るいは抗腫瘍剤などの医薬品を早期に開発することがで
きる。

【００４５】

【配列表】

【配列番号：１】配列の長さ：１０５３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGTCAAATA TTACAGATCC ACAGATGTGG GATTTTGATG ATCTAAATTT 50 CACTGGCATG CCACCTGCAG ATGAAGATTA CAGCCCCTGT ATGCTAGAAA 100 CTGAGACACT CAACAAGTAT GTTGTGATCA TCGCCTATGC CCTAGTGTTC 150 CTGCTGAGCC TGCTGGGAAA CTCCCTGGTG ATGCTGGTCA TCTTATACAG 200 CAGGGTCGGC CGCTCCGTCA CTGATGTCTA CCTGCTGAAC CTGGCCTTGG 250 CCGACCTACT CTTTGCCCTG ACCTTGCCCA TCTGGGCCGC CTCCAAGGTG 300 AATGGCTGGA TTTTTGGCAC ATTCCTGTGC AAGGTGGTCT CACTCCTGAA 350 GGAAGTCAAC TTCTACAGTG GCATCCTGCT GTTGGCCTGC ATCAGTGTGG 400 ACCGTTACCT GGCCATTGTC CATGCCACAC GCACACTGAC CCAGAAGCGT 450 CACTTGGTCA AGTTTGTTTG TCTTGGCTGC TGGGGACTGT CTATGAATCT 500 GTCCCTGCCC TTCTTCCTTT TCCGCCAGGC TTACCATCCA AACAATTCCA 550 GTCCAGTTTG CTATGAGGTC CTGGGAAATG ACACAGCAAA ATGGCGGATG 600 GTGTTGCGGA TCCTGCCTCA CACCTTTGGC TTCATCGTGC CGCTGTTTGT 650 CATGCTGTTC TGCTATGGAT TCACCCTGCG TACACTGTTT AAGGCCCACA 700 TGGGGCAGAA GCACCGAGCC ATGAGGGTCA TCTTTGCTGT CGTCCTCATC 750 TTCCTGCTTT GCTGGCTGCC CTACAACCTG GTCCTGCTGG CAGACACCCT 800 CATGAGGACC CAGGTGATCC AGGAGACCTG TGAGCGCCGC AACAACATCG 850 GCCGGGCCCT GGATGCCACT GAGATTCTGG GATTTCTCCA TAGCTGCCTC 900 AACCCCATCA TCTACGCCTT CATCGGCCAA AATTTTCGCC ATGGATTCCT 950 CAAGATCCTG GCTATGCATG GCCTGGTCAG CAAGGAGTTC TTGGCACGTC 1000 ATCGTGTTAC CTCCTACACT TCTTCGTCTG TCAATGTCTC TTCCAACCTC 1050 TGA 1053

【００４６】

【配列番号：２】配列の長さ：３５０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク 配列 Met Ser Asn Ile Thr Asp Pro Gln Met Trp Asp Phe Asp Asp Leu Asn 1 5 10 15 Phe Thr Gly Met Pro Pro Ala Asp Glu Asp Tyr Ser Pro Cys Met Leu 20 25 30 Glu Thr Glu Thr Leu Asn Lys Tyr Val Val Ile Ile Ala Tyr Ala Leu 35 40 45 Val Phe Leu Leu Ser Leu Leu Gly Asn Ser Leu Val Met Leu Val Ile 50 55 60 Leu Tyr Ser Arg Val Gly Arg Ser Val Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn 65 70 75 80 Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu Pro Ile Trp Ala 85 90 95 Ala Ser Lys Val Asn Gly Trp Ile Phe Gly Thr Phe Leu Cys Lys Val 100 105 110 Val Ser Leu Leu Lys Glu Val Asn Phe Tyr Ser Gly Ile Leu Leu Leu 115 120 125 Ala Cys Ile Ser Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Arg 130 135 140 Thr Leu Thr Gln Lys Arg His Leu Val Lys Phe Val Cys Leu Gly Cys 145 150 155 160 Trp Gly Leu Ser Met Asn Leu Ser Leu Pro Phe Phe Leu Phe Arg Gln 165 170 175 Ala Tyr His Pro Asn Asn Ser Ser Pro Val Cys Tyr Glu Val Leu Gly 180 185 190 Asn Asp Thr Ala Lys Trp Arg Met Val Leu Arg Ile Leu Pro His Thr 195 200 205 Phe Gly Phe Ile Val Pro Leu Phe Val Met Leu Phe Cys Tyr Gly Phe 210 215 220 Thr Leu Arg Thr Leu Phe Lys Ala His Met Gly Gln Lys His Arg Ala 225 230 235 240 Met Arg Val Ile Phe Ala Val Val Leu Ile Phe Leu Leu Cys Trp Leu 245 250 255 Pro Tyr Asn Leu Val Leu Leu Ala Asp Thr Leu Met Arg Thr Gln Val 260 265 270 Ile Gln Glu Thr Cys Glu Arg Arg Asn Asn Ile Gly Arg Ala Leu Asp 275 280 285 Ala Thr Glu Ile Leu Gly Phe Leu His Ser Cys Leu Asn Pro Ile Ile 290 295 300 Tyr Ala Phe Ile Gly Gln Asn Phe Arg His Gly Phe Leu Lys Ile Leu 305 310 315 320 Ala Met His Gly Leu Val Ser Lys Glu Phe Leu Ala Arg His Arg Val 325 330 335 Thr Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Val Asn Val Ser Ser Asn Leu 340 345 350

【００４７】

【配列番号：３】配列の長さ：１０６８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGGAGAGTG ACAGCTTTGA AGATTTCTGG AAAGGTGAAG ATCTTAGTAA 50 TTACAGTTAC AGCTCTACCC TGCCCCCTTT TCTACTAGAT GCCGCCCCAT 100 GTGAACCAGA ATCCCTGGAA ATCAACAAGT ATTTTGTGGT CATTATCTAT 150 GCCCTGGTAT TCCTGCTGAG CCTGCTGGGA AACTCCCTCG TGATGCTGGT 200 CATCTTATAC AGCAGGGTCG GCCGCTCCGT CACTGATGTC TACCTGCTGA 250 ACCTAGCCTT GGCCGACCTA CTCTTTGCCC TGACCTTGCC CATCTGGGCC 300 GCCTCCAAGG TGAATGGCTG GATTTTTGGC ACATTCCTGT GCAAGGTGGT 350 CTCACTCCTG AAGGAAGTCA ACTTCTATAG TGGCATCCTG CTACTGGCCT 400 GCATCAGTGT GGACCGTTAC CTGGCCATTG TCCATGCCAC ACGCACACTG 450 ACCCAGAAGC GCTACTTGGT CAAATTCATA TGTCTCAGCA TCTGGGGTCT 500 GTCCTTGCTC CTGGCCCTGC CTGTCTTACT TTTCCGAAGG ACCGTCTACT 550 CATCCAATGT TAGCCCAGCC TGCTATGAGG ACATGGGCAA CAATACAGCA 600 AACTGGCGGA TGCTGTTACG GATCCTGCCC CAGTCCTTTG GCTTCATCGT 650 GCCACTGCTG ATCATGCTGT TCTGCTACGG ATTCACCCTG CGTACGCTGT 700 TTAAGGCCCA CATGGGGCAG AAGCACCGGG CCATGCGGGT CATCTTTGCT 750 GTCGTCCTCA TCTTCCTGCT TTGCTGGCTG CCCTACAACC TGGTCCTGCT 800 GGCAGACACC CTCATGAGGA CCCAGGTGAT CCAGGAGACC TGTGAGCGCC 850 GCAATCACAT CGACCGGGCT CTGGATGCCA CCGAGATTCT GGGCATCCTT 900 CACAGCTGCC TCAACCCCCT CATCTACGCC TTCATTGGCC AGAAGTTTCG 950 CCATGGACTC CTCAAGATTC TAGCTATACA TGGCTTGATC AGCAAGGACT 1000 CCCTGCCCAA AGACAGCAGG CCTTCCTTTG TTGGCTCTTC TTCAGGGCAC 1050 ACTTCCACTA CTCTCTAA 1068

【００４８】

【配列番号：４】配列の長さ：３５５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク 配列 Met Glu Ser Asp Ser Phe Glu Asp Phe Trp Lys Gly Glu Asp Leu Ser 1 5 10 15 Asn Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu Pro Pro Phe Leu Leu Asp Ala Ala 20 25 30 Pro Cys Glu Pro Glu Ser Leu Glu Ile Asn Lys Tyr Phe Val Val Ile 35 40 45 Ile Tyr Ala Leu Val Phe Leu Leu Ser Leu Leu Gly Asn Ser Leu Val 50 55 60 Met Leu Val Ile Leu Tyr Ser Arg Val Gly Arg Ser Val Thr Asp Val 65 70 75 80 Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu 85 90 95 Pro Ile Trp Ala Ala Ser Lys Val Asn Gly Trp Ile Phe Gly Thr Phe 100 105 110 Leu Cys Lys Val Val Ser Leu Leu Lys Glu Val Asn Phe Tyr Ser Gly 115 120 125 Ile Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ser Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val 130 135 140 His Ala Thr Arg Thr Leu Thr Gln Lys Arg Tyr Leu Val Lys Phe Ile 145 150 155 160 Cys Leu Ser Ile Trp Gly Leu Ser Leu Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu 165 170 175 Leu Phe Arg Arg Thr Val Tyr Ser Ser Asn Val Ser Pro Ala Cys Tyr 180 185 190 Glu Asp Met Gly Asn Asn Thr Ala Asn Trp Arg Met Leu Leu Arg Ile 195 200 205 Leu Pro Gln Ser Phe Gly Phe Ile Val Pro Leu Leu Ile Met Leu Phe 210 215 220 Cys Tyr Gly Phe Thr Leu Arg Thr Leu Phe Lys Ala His Met Gly Gln 225 230 235 240 Lys His Arg Ala Met Arg Val Ile Phe Ala Val Val Leu Ile Phe Leu 245 250 255 Leu Cys Trp Leu Pro Tyr Asn Leu Val Leu Leu Ala Asp Thr Leu Met 260 265 270 Arg Thr Gln Val Ile Gln Glu Thr Cys Glu Arg Arg Asn His Ile Asp 275 280 285 Arg Ala Leu Asp Ala Thr Glu Ile Leu Gly Ile Leu His Ser Cys Leu 290 295 300 Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Phe Ile Gly Gln Lys Phe Arg His Gly Leu 305 310 315 320 Leu Lys Ile Leu Ala Ile His Gly Leu Ile Ser Lys Asp Ser Leu Pro 325 330 335 Lys Asp Ser Arg Pro Ser Phe Val Gly Ser Ser Ser Gly His Thr Ser 340 345 350 Thr Thr Leu 355

【００４９】

【配列番号：５】配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGCGTCGAC AGATCTGGAC ATGTCAAATA TTACAGATCC 40

【００５０】

【配列番号：６】配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGCAAGCTT TGGTTTTCAG AGGTTGGAAG AGAC 34

【００５１】

【配列番号：７】配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGCGTCGAC TGCAGTTAAC ATGGAGAGTG ACAGCTTTG 39

【００５２】

【配列番号：８】配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGCGTCGAC AAGCTTGGTC TTAGAGAGTA GTGGAAGTGT G 41

【００５３】

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例１で得られたヒト・インターロイキン８
レセプター蛋白質タイプＡｃＤＮＡの全塩基配列を示
す。

【００５４】

【図２】参考例１で得られたヒト・インターロイキン８
レセプター蛋白質タイプＡｃＤＮＡにコードされるアミ
ノ酸配列を示す。

【００５５】

【図３】参考例２で得られたヒト・インターロイキン８
レセプター蛋白質タイプＢｃＤＮＡの全塩基配列を示
す。

【００５６】

【図４】参考例２で得られたヒト・インターロイキン８
レセプター蛋白質タイプＢｃＤＮＡにコードされるアミ
ノ酸配列を示す。

【００５７】

【図５】ｐＡＫＫＯ１．１１／ｈＩＬ８ＲＡで標示され
る発現ベクターの構成図を示す。

【００５８】

【図６】ｐＡＫＫＯ１．１１／ｈＩＬ８ＲＢで標示され
る発現ベクターの構成図を示す。

【００５９】

【図７】実施例６で得られたヒト・インターロイキン８
レセプター蛋白質タイプＡのスキャッチャード・プロッ
ト（解離定数曲線）を示す。

【００６０】

【図８】実施例６で得られたヒト・インターロイキン８
レセプター蛋白質タイプＢのスキャッチャード・プロッ
ト（解離定数曲線）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/02 6807−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 7729−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白
   質をコードするＤＮＡを保持することを特徴とするｐＡ
   ＫＫＯ１．１１／ｈＩＬ８ＲＡまたはｐＡＫＫＯ１．１
   １／ｈＩＬ８ＲＢで標示される発現ベクター。
2. 【請求項２】請求項１記載の発現ベクターを含有するこ
   とを特徴とするＣＨＯ細胞。
3. 【請求項３】ＣＨＯ細胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子
   を欠損しているＣＨＯ細胞である請求項２記載のＣＨＯ
   細胞。
4. 【請求項４】請求項２記載のＣＨＯ細胞を、ヒト・イン
   ターロイキン８レセプター蛋白質をコードするＤＮＡの
   発現が可能な条件下で培養することを特徴とする組換え
   型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質の製造
   法。
5. 【請求項５】請求項２記載のＣＨＯ細胞を、ヒト・イン
   ターロイキン８レセプター蛋白質をコードするＤＮＡの
   発現が可能な条件下で培養することにより製造され得る
   組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター蛋白質を
   含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分。
6. 【請求項６】請求項５記載の組換え型ヒト・インターロ
   イキン８レセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞から単
   離される組換え型ヒト・インターロイキン８レセプター
   蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩。
7. 【請求項７】請求項５記載のＣＨＯ細胞またはその細胞
   膜画分を用いることを特徴とするヒト・インターロイキ
   ン８レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスク
   リーニング方法。
8. 【請求項８】請求項６記載の組換え型ヒト・インターロ
   イキン８レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそ
   れらの塩を用いることを特徴とするヒト・インターロイ
   キン８レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのス
   クリーニング方法。
9. 【請求項９】請求項５記載のＣＨＯ細胞もしくはその細
   胞膜画分、または請求項６記載の組換え型ヒト・インタ
   ーロイキン８レセプター蛋白質、その部分ペプチドもし
   くはそれらの塩を含有することを特徴とするヒト・イン
   ターロイキン８レセプターアゴニストまたはアンタゴニ
   ストのスクリーニング用キット。
10. 【請求項１０】請求項７もしくは請求項８記載のスクリ
    ーニング方法または請求項９記載のスクリーニング用キ
    ットを用いて得られるヒト・インターロイキン８レセプ
    ターアゴニストまたはその塩。
11. 【請求項１１】請求項７もしくは請求項８記載のスクリ
    ーニング方法または請求項９記載のスクリーニング用キ
    ットを用いて得られるヒト・インターロイキン８レセプ
    ターアンタゴニストまたはその塩。
12. 【請求項１２】請求項１０記載のアゴニストまたはその
    塩を含有することを特徴とする好中球の活性化促進剤ま
    たは好中球の遊走促進剤。
13. 【請求項１３】請求項１１記載のアンタゴニストまたは
    その塩を含有することを特徴とする好中球の活性化抑制
    剤または好中球の遊走抑制剤。