JPH0810507A

JPH0810507A - 物質の連続的分離及び精製

Info

Publication number: JPH0810507A
Application number: JP6014260A
Authority: JP
Inventors: Gordon W Niven; ゴードン・ダブリュー・ニーベン; Peter Scurlock; ピーター・スカーロック; Anthony T Andrews; アンソニー・ティー・アンドリューズ
Original assignee: Biotechnology and Biological Sciences Research Council
Current assignee: Biotechnology and Biological Sciences Research Council
Priority date: 1993-02-09
Filing date: 1994-02-08
Publication date: 1996-01-16
Also published as: GB2274843A; GB2274843B; GB9302547D0; EP0611066A1

Abstract

(57)【要約】【目的】求める物質に可逆的に結合するのに適合した
非粒状担体を提供する。【構成】求める物質に可逆的に結合するのに適合した
非粒状担体を用いて求める物質を分離精製する。該担体
により結合される求める物質は、求める最終生成物であ
ってもよいし、又は求める最終生成物質から除去される
不純物であってもよい。該担体は、精製すべき物質を含
みその中で求める物質が該担体に吸着される供給原料
液、洗浄液、その中に該物質が該担体により脱着される
脱着液、及びさらに別の洗浄液中を連続的に通過するよ
うに配置されている。該担体は好ましくは吸収体でない
天然又は合成のポリマーであり、エンドレスベルトの形
態を取ると都合が良い。求める物質に可逆的に結合する
であろう薬剤は、該担体に化学的に結合させてもよく、
該物質の担体又は結合剤への結合は生物特異的アフィニ
ティー、疎水性又はイオン性相互作用によってもよい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、物質の連続的分離及び
精製の方法及び装置に関する。それは特に、生体物質、
とりわけ蛋白類の分離及び精製に適しているが、それら
に限定されるものではない。

【０００２】

【従来の技術】分離は、それが生物触媒単離、供給原料
調製又は生成物精製の形態を取るかどうかにかかわら
ず、ほとんどのバイオテクノロジー処理の基本的必要操
作である。ダウンストリーム加工がバイオテクノロジー
製品の費用の大部分を占めることがある（ドゥワイヤー
(Dwyer) 、1984年）ために、有効な大規模分離法が、特
に低価格／大量の生成物の精製において、必要不可欠で
ある。

【０００３】工業用バイオ分離において最も普通に使わ
れる、沈殿、カラムクロマトグラフィー及びバッチ吸着
のような方法は、不連続処理である。例えば液体クロマ
トグラフィーでは、処理時間の多くはカラムの平衡化、
再生及び洗浄に費やされる。連続的分離処理は、必要と
する労働力がより少なく調節が容易であることから魅力
的である。さらに、バイオテクノロジー製品の製造に用
いる多くの生物反応体システムは連続モードで機能す
る。これらは、従って、処理の調整を容易にし効率をア
ップさせるであろう連続的ダウンストリーム工程の開発
により補足することができる。

【０００４】有機化学物質を分離する連続的クロマトグ
ラフィー処理を開発するために、多様な試みが成されて
きたが、これらは技術的に複雑になりがちであったし、
選択性が低い（サスマン(Sussman) 、1976年）。連続的
分離は、一連のクロマトグラフィー・カラムを同時に使
用して各カラムからの溶出が連続的に起こるようにする
ことによりシミュレート(simulate)することができる
（ニクード(Nicoud)、1992年）。フアングら(Huang et
al. 、1986年）は、蛋白のアフィニティー分離にこのシ
ミュレートした移動床法(simulated moving bed metho
d)を利用した。

【０００５】アフィニティー相互作用は、その特異性ゆ
えに、最も有効なバイオ分離手段の一つである。吸着剤
を吸着環境及び脱着環境間で物理的に循環させる連続的
アフィニティー分離方法が考案されている（ヒューズ及
びチャーム(Hughes and Charm)、1979年；バーンズ及び
グレイブス(Burns and Graves)、1985年；パンガーら(P
ungor et al.) 、1987年）。しかしながら、問題は通常
の粒状アフィニティーマトリックスをこの方法に用いる
こと、すなわち吸着体を一つの液体媒質から単離して他
の液体媒質へ移動する方法の開発にある。

【０００６】バーンズ及びグレイブス(Burns and Grave
s)は、磁気安定化流動床を使用して、その中でアフィニ
ティーリガンドを含む磁気感受性のある固体粒子を、分
離が求められる物質を含む混合物がその中を流動する、
第一の磁化カラムと、脱着媒質がその中を流動する、第
二の磁化カラムの間を連続的に移送させた。パンガーら
(Pungor et al.）は、精製する物質の入った濾過容器と
脱着媒質の間を連続的にポンプ輸送されるアフィニティ
ービーズを使用した。

【０００７】ヒューズ及びチャーム(Hughes and Charm)
は、連続ベルトに固定された多孔性ナイロンパウチ中に
入ったアフィニティービーズを使用した。このベルト
は、精製される物質、洗浄溶液及び脱着媒質の入った複
数のチャンバー中を通るように配置されていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記の方法は全て、ビ
ーズ状のクロマトグラフィーマトリックスを使用する。
本発明者らは驚くべきことに今回、物質に可逆的に結合
するのに適合した非粒状担体を使用することにより、は
るかに速い再利用速度が達成され、それにより有効性の
より高い連続的分離法が提供されることを見出した。

【０００９】通常の知識によれば、吸着分離法は高い結
合能力をもたらすために大きな表面積を必要とする。そ
の結果、多孔性ビーズがこの目的に使用されてきた。し
かしながら、溶質の多孔性構造中への移動は通常、相対
的に遅い拡散過程により起こり、そのために固体相と液
体相の長時間の接触が必要である。本発明は、反復的(r
epaid)吸着及び脱着の達成を可能にする非多孔性吸着体
表面を用いることにより、この問題を克服しようとする
ものである。この結果として結合表面積が低いことは、
連続的処理の中で、リガンドの迅速な再利用により埋め
合わせられる。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、求める物質(a
desired material)に可逆的に結合するのに適合した非
粒状担体及び該担体がその中を連続的に通過するように
配置されている複数の液体用容器を含む、物質の連続的
分離及び精製のための装置を提供する。

【００１１】他の一面では本発明は、求める物質に可逆
的に結合するのに適合した非粒状担体を提供し、該担体
を最低一種類の精製すべき物質を含む供給原料液中に連
続的に通過させることを含む、物質の連続的分離及び精
製の方法であって、該担体、洗浄液、その中に該物質が
該担体によって脱着される最低一種類の脱着液、及びさ
らに別の洗浄液に該物質が吸着される方法を提供する。

【００１２】該担体により結合される求める物質は、求
める最終生成物であってもよいし、又は不純物であって
もよい。このように本発明の方法及び装置は、求める最
終生成物質を、この物質を該担体に可逆的に結合させる
ことによって供給原料物質から除去するか、又は不純物
を該担体に可逆的に結合させることによって供給原料液
から除去して純粋な供給原料液を求める最終生成物質と
して残すかのいずれかによって、分離及び精製するのに
用いることができる。

【００１３】さらに別の一面として、本発明は上記の装
置及び方法に使用するための、物質の可逆的結合に適合
した非粒状担体を提供する。

【００１４】物質の連続的分離及び精製は、液体容器中
の液体の流動と組み合わされた、該担体の液体媒質中を
通過する移動により達成される。

【００１５】いかなるタイプの吸着及び脱着分離手法を
本発明の方法及び装置と共に使用してもよい。適当な手
法には、標的物質とアフィニティリガンド或いは特異的
抗体の間の相互作用、イオン交換処理、又は疎水性相互
作用が含まれる。

【００１６】該担体物質は好ましくは、求める物質に可
逆的に結合することができる物質、又は結合可能になる
ように容易に誘導することができる物質のいずれかであ
るべきである。或いは、該担体は誘導することができる
物質によってコーティングされていてもよい。好ましく
は該担体は、望ましくは吸収体でない天然又は合成のポ
リマーである。ナイロン又はセルロースが特に適してい
る。適当なコーティング物質には、ポリアクリルアミ
ド、アガロース、デキストラン及びゼラチンが含まれ
る。

【００１７】物質に可逆的に結合することができる薬剤
を該担体、又は該コーティング物質に化学的に結合させ
ると都合がよい。該結合剤は、標的物質に向けられた抗
体、免疫グロブリン類を結合するプロテインＡ、酵素の
基質、共役因子及び可逆的阻害剤、並びに、例えばデヒ
ドロゲナーゼ酵素類に結合するチバクロン・ブルー等の
染色化合物のような、特異的アフィニティーリガンドで
もよい。(“チバクロン(Cibacron)" は登録商標であ
る。）イオン交換作用に基づく分離を行うには、該結合
剤は例えばジエチルアミノエチル-(DEAE-)基又はカルボ
キシメチル-(CM-)基等の帯電官能基である。疎水性相互
作用については、該結合剤は例えば直鎖脂肪族又はフェ
ニル基である。しかしながら、供給原料液から除去すべ
き求める物質に特異的に可逆的結合するものであればい
ずれの適当な結合剤を使用してもよい。

【００１８】該結合剤は供給原料液から不純物を除去す
るために使用することもでき、例えば、上水道からの毒
性農薬の除去又は重金属を除去するための排水処理に使
用してもよい。

【００１９】非粒状担体の使用により、物質の結合する
広い表面積は必ずしも提供されない。しかしながら、固
体相及び液体相の間の接触時間が粒子の混合又は担体マ
トリックス中への拡散に左右されないため、結合表面の
迅速な再利用が可能である。

【００２０】好ましくは該非粒状担体はエンドレスベル
トであり、該担体上に起こる液体の流動が物質の該担体
との急速な会合及び解離の達成に重要なことがある。

【００２１】該結合剤は、いずれの適当な方法によって
該担体に化学的に結合させてもよい。選ばれる個々の方
法は、使用される個々の担体物質及び結合剤により変化
するであろう。結合は、例えばグルタルアルデヒド、臭
化シアン、ビス−オキシラン類及びカルボジイミダゾー
ル等が媒介してもよい。

【００２２】該薬剤は化学的スペーサーによって担体に
結合していると有利であり、好ましいスペーサー類はポ
リエチレンイミン、ポリリジン、ポリグルタミン酸ヒド
ラジド及びポリアクリル酸ヒドラジド類である。

【００２３】二個以上の物質を、精製すべき全ての物質
類との可逆的結合に適合した担体を用いて、供給原料液
から分離してもよい。複数の脱着液が供給され、各脱着
液は担体が通過する際に該担体から物質類のうちの一つ
を選択的に脱着する。

【００２４】本発明の好ましい態様を、添付の図面を参
照しながら以下に説明する。

【００２５】図１は、本発明による好ましい装置の概略
図である。

【００２６】図２は、ウシ膵臓抽出物を用いた場合の、
連続操作中の吸着チャンバー内（○）及び脱着チャンバ
ー内（●）のトリプシン活性を示す。

【００２７】図１について述べると、本発明の装置は４
個の液体チャンバー２を含むタンク１を含む。各チャン
バー２の中には、チャンバー壁内のリベート(rebate)中
にはめ込まれたインサート３がある。チャンバー間の隔
壁に取り付けられた上部ローラー５及びインサート３の
底に取り付けられた下部ローラー６により、ナイロンベ
ルト４がチャンバー２のそれぞれを通過する。ローラー
５、６によりベルト４の滑らかな通過が確保される。ベ
ルト４は、電動ステッパーモーター(electricstepper m
otor)に取り付けられたドライブホイール７により運転
される。該ベルトの張力は伸長アーム及びローラー配置
８により維持される。流入口及び流出口９、10は各チャ
ンバー２の上端付近でインサート３の両面に向かい合っ
て位置しており、蠕動ポンプ(peristaltic pumps)を経
由して適当な液体のリザーバーに接続されている。

【００２８】ドライブホイール７の回転方向及びそれに
よるベルト４の移動方向は矢印Ｒにより示されている。
使用に際して、図１に示すようにベルト４は液体チャン
バー２を左から右へ連続的に通過する。一番左のチャン
バーは吸着チャンバーであり、精製すべき物質を含む供
給原料液が入っており、ベルト４はこのチャンバーを最
初に通過する。次のチャンバーには洗浄液が入ってお
り、その次のチャンバーは脱着チャンバーであり、担体
により結合された物質が担体からその中に放出される脱
着液が入っており、最後のチャンバーには別の洗浄液が
入っている。該ベルトはこれらのチャンバーを連続的に
通過する。

【００２９】該ベルトが吸着チャンバーを通過する間
に、供給原料液から除去されるべき物質が担体に結合す
る。該物質はこの後、該ベルトが次のチャンバーを通過
する間に洗浄される。脱着チャンバー内で、結合した物
質が脱着液中に放出される。該担体はその後洗浄され、
該ベルトが最後のチャンバーを通過する際に再び使用で
きるように再生される。このようにして、連続的精製方
法が、該方法の種々の段階を同時に通過する該ベルトの
種々の部分とともに提供される。

【００３０】該物質の吸着及び脱着は、各チャンバー内
を流動する液体媒質の組成によって調節される。吸着及
び洗浄チャンバー内では、液体組成は該物質の担体への
結合を促進させるようなものにする。脱着チャンバー内
の媒質の組成は、結合した物質が担体から脱着させるよ
うなものにする。

【００３１】供給原料液から二個以上の物質が除去され
ることが求められる別の態様においては、除去され担体
に結合される物質のそれぞれに対して脱着チャンバーが
提供される。該担体が複数の脱着チャンバーを通過する
に連れて、該担体からの結合した種々の物質それぞれの
段階的脱着が成される。このように、本方法及び装置
は、数個の求める生成物質を一つの供給原料液から同時
に分離するのに使用することができ、各生成物は異なる
脱着チャンバー中に脱着される。或いは、数個の異なる
不純物を、精製が求められる供給原料液から除去するこ
とができる。

【００３２】例えば、イオン交換処理において、0.2M塩
で溶出する最初の脱着で不純物を除去してもよく、それ
により0.4M塩でこれらの不純物なしに生成物を単離する
ことができる。その後、1M塩での最終脱着により残りの
不純物が再生段階の前に除去される。

【００３３】ベルトの速度及びチャンバーを通る液体流
量のような種々の操作パラメーターが該処理の効率に影
響することが見出されている。一つのチャンバーから次
のチャンバーへの液体の自動的移動（キャリーオーバ
ー：carryover）も処理効率に影響することが見られる
かもしれない。精製すべき特定の物質によるパラメータ
ーの最適の値、利用する操作手法、及び使用する装置の
規模を選択することは、当業者にとっては日常的な実験
上の問題に入る。

【００３４】吸着チャンバー中の目的化合物の濃度と脱
着チャンバーへの移動速度の間の関係が、以下の式：移動＝Ｍ×濃度／（Ｋ＋濃度）（式中、Ｍはベルトの結合能力を示し、Ｋは平衡定数を
示す）のようになることは実験的に証明されている。こ
れらの定数を用いることにより最も有利な供給原料濃度
及び流速の決定が可能である。

【００３５】供給原料濃度が該ベルトを飽和させること
ができると仮定すれば、ベルトの接触時間と液体媒質の
間の関係は時間定数によって決定されることになる。す
なわち、生成物の最大移動をもたらすベルト速度が存在
するであろう。この速度より速く稼働させると利点はな
にもなく、キャリーオーバーが増加することになり、他
方、これより遅く稼働させると生成物の移動速度が低下
するであろう。

【００３６】別の平衡定数は、担体に結合した生成物と
脱着チャンバー中の遊離溶液の濃度の間の関係を決定す
るであろう。脱着チャンバー中に生成物が大量に蓄積す
ると、脱着処理を行う能力を制限することになる。加え
て、生成物濃度が高いと再生チャンバー中へのキャリー
オーバーにより失われる物質の量が増加する。これらの
因子は、該装置を稼働させる最も効率の良い方法は可能
な限り脱着バッファーの流速を上げることであることを
意味している。しかしながらこれは、アッセイ及びその
後の使用に向けて生成物を濃縮する必要性に対して考量
しなければならない。大量の希釈された生成物は扱いが
困難であり費用が掛かることがある。

【００３７】洗浄媒質の流速を上げても、最も有効な稼
働が得られる。一定量の洗浄媒質はキャリーオーバーに
より脱着チャンバー中に移送される。該洗浄媒質中の求
められていない物質の濃度が高まるに任せておくと、生
成物に混入する量が増加する。この作用は、ベルト速度
が上がりキャリーオーバー率が上がると、より大きくな
る。

【００３８】キャリーオーバーを制限することは、該装
置の稼働効率を上げるために重要である。単位表面積当
たりの高い結合能力も、効率の良い稼働をもたらす。

【００３９】次に、本発明の方法及び装置を以下の実施
例に基づいてさらに詳しく述べることにする。

【００４０】

【実施例】実施例１本発明の方法及び装置を、トリプシンを特異的に吸着さ
せるためのアフィニティーリガンドとして大豆トリプシ
ン阻害剤を用い、さらに吸着及び脱着処理を調節するた
めに液体媒質のpHを変化させて、試験した。

【００４１】連続的操作下のトリプシンの特異的アフィ
ニティーによる移動を、供給原料としてウシ膵臓アセト
ン粉末製剤を用いて調べた。

【００４２】ウシ膵臓アセトン粉末（シグマ社、製品番
号 P3006）を 20 mM CaCl₂及び 100mM NaClを含む 50 m
Mトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン(Tris)/HC
l、pH8 中に 100 mg ml^-1になるように懸濁した。これ
を５℃で30分間攪拌した。かなりの量の不溶性物質を 3
000 x g 、30分、５℃で遠心分離して除去した。

【００４３】最初の洗浄媒質はバッファーを加えていな
い蒸留水を用い、脱着媒質として 100 mM グリシン/HC
l、pH 2.3、を用い、第二洗浄媒質として 50 mM Tris/H
Cl 、pH 8、を用いた。さらに、全溶液は 20 mM CaCl₂
及び 100 mM NaClを含有した。

【００４４】各運転の開始前に、吸着チャンバーを 300
mU ml^-1トリプシンを含む希釈した粗物質で満たした。
その後、1160 mU ml^-1トリプシンを含む供給原料を 0.2
5 mlmin^-1の流速で加えた。0.5 ml min ^-1 の脱着媒質
の流速は運転開始の30分後に始められた。ベルト速度は
1 m min ^-1 、洗浄媒質の流速は 10 ml min ^-1 であっ
た。吸着及び脱着チャンバー中のpHを随時手動で調整す
ることが必要であった。全時点で、吸着チャンバー内の
pHは7.5-8.0 に維持され、脱着チャンバー内のpHは2.3-
2.8 に維持された。

【００４５】大豆トリプシン阻害剤(SBTI)のナイロンベ
ルトへの結合 SBTIを、アンドリュース及びムバフォー(Andrews and M
bafor 、1991年）の方法を改良したものによってナイロ
ン66ベルトに共有結合させた。ナイロンテープ（幅 4 c
m)はロンドンの A.R. ホーウェル社から入手した。190
cm長のエンドレスベルトが切断末端のヒートシールによ
り形成された。2.5 M HCl 中 16 時間の部分的加水分解
によりナイロンを活性化させた。SBTIを、グルタルアル
デヒド媒介結合を用いてポリエチレンイミンスペーサー
により活性化ナイロンに結合させた。該ベルトを20℃の
以下の溶液中でインキュベートした：5% (v/v)グルタル
アルデヒド，5 時間；5% (v/v)ポリエチレンイミン，16
時間；5% (v/v)グルタルアルデヒド，5 時間； 1 mg ml
^-1 SBTI ，16時間；2% (v/v)エタノールアミン，5時
間。各試薬は 0.1 M リン酸カリウムバッファー、pH 8
中に調製され、該ベルトは各段階の間に蒸留水で徹底的
に洗浄した。

【００４６】トリプシン測定トリプシンは、 Nα- ベンゾイル-DL-アルギニン p- ニ
トロアニリド(BAPNA)（ハーバーバックら(Haverback et
al.)、1960年）の加水分解を測定することによりアッ
セイした。0.8 ml中に50 mM Tris/HCl、pH 8、20 mM Ca
Cl₂ 、0.1 mM BAPNA及び 0.1 ml トリプシン溶液を含む
一対の反応混合液を 37 ℃、20分間インキュベートし
た。この時間中、反応速度は線形であった。0.8 mlの 3
0% (v/v)酢酸を加えて反応を停止した。各サンプルを 1
0000 x gで10分間遠心分離した。410 nmの吸光度をその
後測定し、p-ニトロアニリド濃度を8800 M^-1cm^-1の分子
吸光係数を用いて算出した。１単位のトリプシン活性
は、上記の条件下で１分間に１μmol のp-ニトロアニリ
ドを生成するのに必要な酵素量と定義した。

【００４７】この実験の経過中の、吸着及び脱着チャン
バー内のトリプシン濃度を図２に示す。各チャンバー内
のトリプシン濃度はおよそ 1.5 h後に定常状態に達し、
これがさらに 6.5 hの間ベルトの移送能力の悪化が見ら
れることなく維持された。定常状態における吸着及び脱
着チャンバー内の平均トリプシン濃度はそれぞれ、213m
U ml^-1及び97 mU ml^-1であった。この実験で用いたベル
トの移送能力の値は1150mU m^-2であった。

【００４８】トリプシンの比活性(specific activitie
s)は、トリプシン活性 ( mU ml^-1)を 1cmセルを用いた
280 nm の吸光度で割って算出することにより評価し
た。定常状態の間の溶出流中のトリプシンの平均比活性
は 214 mU (A₂₈₀)^-1であり、この値は定常状態の期間を
通じて維持された。供給原料中のトリプシンの比活性は
67 mU (A₂₈₀)^-1であったので、この装置を用いて連続的
にトリプシンの濃縮が達成されたことが明らかである。

【００４９】ナイロンは、チャンバー間の液体の自動的
移動を減らす助けとなる非吸収体であり、さらに部分的
加水分解の後に容易に誘導可能であるために、リガンド
担体ベルトに適当な物質として選択された。上記の誘導
処置により、およそ1000-2000 mU m^-2の見かけのトリプ
シン移送能力を持つベルトが得られた。

【００５０】アフィニティー分離の全ての段階がベルト
の種々の部分で同時に起こるので、該分離処理は吸着担
体の再生又は洗浄のために停止する必要がない。操作の
途中で分離処理を中断することなくベルトを取り替える
ことさえ可能であろう。バッチ式分離とは異なり、該連
続的分離処理は実時間のモニター及び調節が可能であ
る。これは、予測及び調節可能な品質の生成物の一定の
流動を作らせる自動処理化及びコンピューター管理の可
能性を導く。このことは、処理確認及び品質保証におい
てかなりの利益をもたらすであろう。

【００５１】この技法では、供給原料が多孔性アフィニ
ティーマトリックスを通過しないために、粒状物質によ
る汚れが重要な問題になることはない。従ってこの方法
は予備処理をほとんどしていない粗物質に利用すること
ができる。

【００５２】従来技術の吸着分離方法では、効率は蛋白
が結合する広い表面積が得られるかどうかに左右され
る。非多孔性物質を担体に用いた場合、通常のクロマト
グラフィー吸着体に比較するとはるかに少ない結合面積
しか提供されない。しかしながら本発明者らは、ベルト
と吸着及び脱着媒質の間の接触時間が短いことがアフィ
ニティーリガンドの迅速な再利用を可能にさせ、これは
見かけ上の結合面積の低さを補って余りあることを見出
している。確かに、以前に検討されたヒューズ及びチャ
ームの方法では、およそ１μmol のアフィニティーリガ
ンドを含む１ベルトサイクルは１サイクルに37時間を要
し、リガンド再利用速度は 0.027μmol/hであった。し
かしながら、はるかに低い表面積を有する本発明の非粒
子状担体はわずか 0.0075 μmol のリガンドしか持たな
いが、ベルトサイクル時間はわずかに 114秒であり、リ
ガンド再利用速度は 0.24 μmol/h であった。これは、
従来技術であるヒューズ及びチャームの方法により達成
された速度のほぼ10倍の速さである。この特徴が、使用
したリガンドの量に比べて大量の標的蛋白の分離を可能
にしている。リガンドの費用がアフィニティークロマト
グラフィーの利用に際して、特に低価格／大量の生成物
を精製する場合に、しばしば制約となっている。迅速な
リガンドの再利用はより大規模なアフィニティー分離を
可能にするであろう。

【００５３】引用文献アンドリュース,A.T. 及びムバフォー,W.(Andrews and
Mbafor):ナイロンフィルムへの酵素の固定；バイオケミ
カル・ソサイエティ・トランサクション(Biochem. Soc.
Trans.)、19巻、271S、1991年。

【００５４】バーンズ,M.A. 及びグレイブス,D.J.(Burn
s,M.A. and Graves,D.J.):磁気安定化流動化ベッドを使
用した連続的アフィニティークロマトグラフィー；バイ
オテクノロジカル・プログレス(Biotechnol. Progres
s)、１巻、95-103頁、1985年。

【００５５】ドゥワイヤー, J.L. (Dwyer, J.L.): 高速
液体クロマトグラフィーによるバイオ生成物分離の大規
模化；バイオ／テクノロジィー(Bio/technology)、２
巻、957-964 頁、1984年。

【００５６】ハーバーバック, B.J., ダイス, B., バン
ディ, H.及びエドモンドソン, H.A.(Haverback, B.J.,
Dyce, B., Bundy, H. and Edmondson, H.A.): ヒト膵液
中のトリプシン、トリプシノーゲン及びトリプシン阻害
剤；アメリカン・ジャーナル・オブ・メディスン(Am.
J. Med.) 、29巻、424-433 頁、1960年。

【００５７】フアング, S.Y., リン, C.K., チャン, W.
H.及びリー, W.S.(Huang, S.Y., Lin,C.K., Chang, W.
H. and Lee, W.S.):シミュレートした移動床クロマトグ
ラフィーによる酵素精製及び濃縮：実験的検討；ケミカ
ル・エンジニアリング・コミュニケイションズ(Chem. E
ng. Commun.)、45巻、291-309 頁、1986年。

【００５８】ヒューズ, J.J.及びチャーム, S.E.(Hughe
s, J.J. and Charm, S.E.)：免疫吸着剤を用いた生物物
質の連続的精製方法；バイオテクノロジィ・アンド・バ
イオエンジニアリング(Biotec. Bioeng.) 、21巻、1439
-1455 頁、1979年。

【００５９】ニクード, R.M.(Nicoud, R.M.)：シミュレ
ートした移動床：強力なクロマトグラフィー処理；LC.G
C インターナショナル(LC.GC International) 、５巻、
５号、43-47 頁、1992年。

【００６０】パンガー, E., アフェヤン, N.B., ゴード
ン, N.F.及びクーネイ, C.L.(Pungor,E., Afeyan, N.
B., Gordon, N.F. and Cooney, C.L.):連続的アフィニ
ティーリサイクル抽出：新規の蛋白分離法；バイオテク
ノロジィ(Bio-technology)、５巻、604-608 頁、1987
年。

【００６１】サスマン, M.V.(Sussman, M.V.):連続的ク
ロマトグラフィー；ケムテック(Chemtech.) 、４月号、
260-264 頁、1976年。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による好ましい装置の概略図である。

【図２】ウシ膵臓抽出物を用いた場合の、連続操作中の
吸着チャンバー内（○）及び脱着チャンバー内（●）の
トリプシン活性を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ゴードン・ダブリュー・ニーベンイギリス国アールジー１・５キューエフ, レディング，フォックスヒル・ロード 59 (72)発明者ピーター・スカーロックイギリス国アールジー７・１ディーアール，レディング，スペンサーズ・ウッド, クロフト・ロード（番地なし），リトル・オーチャード (72)発明者アンソニー・ティー・アンドリューズイギリス国アールジー26・５エイイー，ブラムレー・ニヤー・バシングストーク，ブラムレー・レーン（番地なし），チューダー・コテージ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】求める物質に可逆的に結合するのに適合
した非粒状担体及び該担体がその中を連続的に通過する
ように配置されている複数の液体用容器を含む、物質の
連続的分離及び精製のための装置。
【請求項２】該担体がエンドレスベルトである、請求
項１記載の装置。
【請求項３】求める物質に可逆的に結合することがで
きる薬剤が該担体に化学的に結合している、請求項１又
は２に記載の装置。
【請求項４】求める物質に可逆的に結合することがで
きる薬剤が化学的に結合している物質により、該担体が
コーティングされている、請求項１又は２に記載の装
置。
【請求項５】該薬剤が化学的スペーサーによって該担
体又は該コーティング物質に結合している、請求項３又
は４に記載の装置。
【請求項６】該担体が天然又は合成ポリマーである、
上記の請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項７】該担体がナイロンである、請求項６記載
の装置。
【請求項８】精製すべき求める物質に可逆的に結合す
るのに適合した非粒状担体を供給し、最低一種類の精製
すべき物質を含みその中で求める該物質が担体に吸着さ
れる供給原料液、洗浄液、その中に該物質が該担体によ
り脱着される最低一種類の脱着液、及びさらに別の洗浄
液中に該担体を連続的に通過させることを含む、物質の
連続的分離及び精製の方法。
【請求項９】複数の求める物質が供給原料液から該担
体に吸着され、且つ複数の脱着液が吸着された各物質の
特異的脱着のために供給される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】請求項１記載の装置に使用するため
の、物質に可逆的に結合するのに適合した非粒状担体。
【請求項１１】請求項７記載の方法に使用するため
の、物質に可逆的に結合するのに適合した非粒状担体。