JPH08109197A

JPH08109197A - 白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド

Info

Publication number: JPH08109197A
Application number: JP6270496A
Authority: JP
Inventors: Eiichi Nakayama; 睿一中山; Akiko Uenaka; 明子上中
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1994-10-07
Publication date: 1996-04-30

Abstract

(57)【要約】【目的】白血病腫瘍拒絶抗原ペプチドを提供するこ
と。【構成】ＡＫＴ遺伝子によりコードされるアミノ酸配
列または該ＡＫＴ遺伝子の変異によってその非翻訳領域
によりコードされるアミノ酸配列の中に部分的配列とし
て含まれるアミノ酸配列から構成されるペプチドであっ
て、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合
するモチーフを含むことを特徴とする白血病腫瘍拒絶抗
原ペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、白血病腫瘍拒絶抗原ペ
プチドに関し、さらに詳しくは、癌等の腫瘍の拒絶を誘
導する白血病腫瘍拒絶抗原ペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫系は、生物が生存するために必須な
生体防御機構である。免疫応答の初反応は、侵入してき
た異物を非自己抗原として認識することである。これ
は、遺伝子の再構成により多様性を獲得したＴ細胞レセ
プターが、細胞表面に提示された非自己に由来する抗原
ペプチドと、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）とを同時に
認識することによって、非自己抗原を厳格に識別するシ
ステムにより行われている（Ｃｅｌｌ６２：２０３，
１９９０）。

【０００３】抗原提示機構には、種々の経路が報告され
ているが、主としてクラスＩ（内因性）−クラスＩＩ
（外因性）抗原提示ルールと呼ばれる二経路に大別さ
れ、前者は、細胞性免疫、そして、後者は、体液性免疫
を獲得するための非自己抗原の処理機構である。バクテ
リアなどの外因性抗原は、種々の抗原提示細胞に取り込
まれた後、エンドソーム内でリソゾーム酵素により分解
され、生じた抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と
共にＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に提示される。

【０００４】ヘルパーＴ細胞は、遺伝子の再構成により
獲得した多様性に富むＴ細胞レセプターを発現してお
り、非自己抗原に由来するペプチドとＭＨＣクラスＩＩ
分子の両者を同時に認識して、活性化され、増殖する。
活性化されたヘルパーＴ細胞は、種々のサイトカインを
分泌して、Ｂ細胞の増殖と分化（即ち、非自己抗原に反
応する抗体の産生）を誘導する。分泌された特異抗体
は、細胞外の非自己抗原を捕捉し、補体系との協同作用
でこれを破壊する。

【０００５】一方、ウィルス、寄生虫、癌抗原などの内
因性抗原は、ほとんど全ての細胞に発現しているＭＨＣ
クラスＩ分子と共にＣＤ８＋キラー細胞（細胞傷害性Ｔ
細胞：ＣＴＬ）に提示され、上記と同様に多様性を獲得
したＴ細胞レセプターを介して、キラーＴ細胞が活性化
される。活性化されたキラーＴ細胞は、バーフォリン、
リンホトキシン、腫瘍壊死因子、細胞死因子Ｆａｓリガ
ンドなどの細胞傷害性因子を分泌し、内因性抗原を発現
する標的細胞を直接攻撃し、非自己抗原を細胞もろとも
破壊する。このように、クラスＩ（内因性）−クラスＩ
Ｉ（外因性）抗原提示ルールが、主要な非自己抗原の処
理機構であるとされている。

【０００６】この数年間における免疫監視システムの研
究分野の急速な発展は、蛋白質一次構造を決定するマイ
クロシークエンス法が進歩し、細胞表面に提示されてい
るＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子内に結合した抗原
ペプチドの構造が、次々に解析され始めたことに起因し
ている。その結果、クラスＩ分子には８〜１１のアミノ
酸残基、そしてクラスＩＩ分子には１３〜２０のアミノ
酸残基からなる抗原ペプチド群が結合していることが証
明され、これらのペプチド群とＭＨＣ分子との複合体の
Ｔ細胞に対する反応性が、自己免疫疾患、腫瘍免疫、移
植の際の拒絶等に関連する最も重要な研究課題となって
いる（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７０
７，１９９１）。

【０００７】ところで、腫瘍抗原は、癌化に伴って細胞
内に出現する蛋白分子であり、これも細胞質内でプロセ
ッシングを受けて、ＭＨＣ分子上に提示されるものと考
えられている。腫瘍拒絶抗原の存在が明らかにされたの
は、今から約半世紀前にさかのぼる。メチルコラントレ
ンのような化学物質で誘発した腫瘍を、同系マウスに移
植すると、腫瘍は増殖し続け、マウスは腫瘍死する。し
かし、腫瘤形成後に、これを外科的に切除し、回復後に
同じ腫瘍を移植しても、腫瘍の増殖はみられない。つま
り、切除により、宿主マウスは、その腫瘍に対する抵抗
性を獲得する。この抵抗性は、Ｔ細胞によって担われて
いることが養子移入の実験から明らかになった。このよ
うな腫瘍に対する移植抵抗性は、数多くの腫瘍で確認さ
れ、それぞれの腫瘍に特異的な拒絶抗原の存在が明らか
になった。

【０００８】このように、化学誘発癌には、各腫瘍に固
有の拒絶抗原が存在する。この抗原の特徴は、著しい多
様性である。多様性が分子レベルでどのような機構によ
って生みだされるのかについては、腫瘍免疫学者の最大
の関心事の一つであるが、未だにわかっていない。そこ
で、拒絶抗原を化学的に抽出して、その分子を解析する
試みがなされてきた（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５
４：１７７−１８０，１９９３）。

【０００９】例えば、腫瘍拒絶反応においては、それぞ
れの腫瘍、言い換えるとそれぞれの腫瘍抗原に応じて、
ＣＤ８あるいはＣＤ４陽性Ｔ細胞が種々の程度に関与し
ていることが知られている。そこで、ｉｎｖｉｔｒｏ
で、強い活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）クロ
ーンを樹立し、これを長期にわたり培養で維持しなが
ら、抗原特異性の解析を行うことが可能である。ブーン
（ＴｈｉｅｒｒｙＢｏｏｎ）らはこのようなＣＴＬ
を用い、遺伝子導入法によって、いくつかの拒絶抗原遺
伝子の解析をヒトメラノーマについても行い、自家癌患
者由来のＣＴＬが認識するメラノーマ抗原ＭＺ２−Ｅの
発現を支配するＭＡＧＥ−１遺伝子を得た（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２５４：１６４３，１９９１）。ＭＡＧＥ−１遺
伝子の第３エクソン由来の９個のペプチドがＣＴＬの標
的になっており、このペプチドを患者と同じＡ１陽性細
胞にパルスすると、ＣＴＬによりこの細胞は破壊され
る。Ａｌ陽性の頻度は、全メラノーマ患者の１０％に相
当する。ＭＡＧＥ−１は、肺癌と乳癌の一部にも発現さ
れているが、正常細胞には精巣を除いて発現はみられな
い。

【００１０】さらに、ブーンらは、同様にして、ＨＬＡ
−Ａ２に提示されるヒトメラノーマ抗原として、チロシ
ナーゼを見い出した（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：
４８９，１９９３）。チロシナーゼは、ＨＬＡ−Ａ２を
もつヒトの頻度が高いため、免疫療法のターゲットとし
て一層期待される。しかし、その遺伝子は、正常のメラ
ノサイトにも発現されており、交差反応の心配がある。
これら同定された遺伝子について、ＣＴＬによって認識
される合成ペプチドが明らかにされているが、これらの
ペプチドで、実際に、能動免疫が可能かどうかについて
は未だ報告がない。現在までに報告されている腫瘍拒絶
抗原は、免疫原性の強いメラノーマに関するものであ
り、白血病腫瘍拒絶抗原についての報告はない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、白血
病腫瘍拒絶抗原ペプチドを提供することにある。腫瘍拒
絶反応は、ＭＨＣ分子上の８ないし１１残基のペプチド
の局所的な相互作用により引き起こされている。しかし
ながら、これらのペプチドの多くは、生体中では極めて
微量であり、その有効な解析手法がないために、白血病
細胞における腫瘍免疫に関しては、ほとんどが未知であ
るのが現状であり、新しい白血病腫瘍拒絶抗原の開発が
望まれていた。本願発明者らは、このような状況を踏ま
え、白血病腫瘍拒絶抗原ペプチドを効率よく見つけるた
めに、マウス白血病細胞をモデルに用いて、腫瘍拒絶抗
原メカニズムを詳細に検討すると共に、白血病疾患をは
じめとする各種病態の治療及び診断法を確立することを
目標として、鋭意研究を重ねた結果、新規な白血病腫瘍
拒絶抗原に関与するペプチドを同定することに成功し
て、本発明を完成するに至った。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ＡＫＴ
遺伝子によりコードされるアミノ酸配列または該ＡＫＴ
遺伝子の変異によってその非翻訳領域によりコードされ
るアミノ酸配列の中に部分的配列として含まれるアミノ
酸配列から構成されるペプチドであって、主要組織適合
性抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合するモチーフを含
むことを特徴とする白血病腫瘍拒絶抗原ペプチドが提供
される。

【００１３】本発明の好ましい実施態様は、下記の通り
である。（１）前記ペプチドが、１５以下のアミノ酸残基で構成
されている前記の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド。（２）前記ペプチドが、８〜１１のアミノ酸残基で構成
されている前記の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド。（３）前記ＡＫＴ遺伝子が、マウスｖ−ＡＫＴ、マウス
ｃ−ＡＫＴ、ヒトｖ−ＡＫＴ、またはヒトｃ−ＡＫＴ遺
伝子である前記の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド。（４）マウスｖ−ＡＫＴ遺伝子によりコードされるアミ
ノ酸配列が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列
である前記の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド。（５）マウスｃ−ＡＫＴ遺伝子によりコードされるアミ
ノ酸配列が、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
である前記の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド。（６）ＡＫＴ遺伝子の変異によって非翻訳領域によりコ
ードされるアミノ酸配列が、ｃ−ＡＫＴ遺伝子の変異に
よって非翻訳領域がアミノ酸に翻訳された際に得られる
アミノ酸配列である前記の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチ
ド。（７）マウスｃ−ＡＫＴ遺伝子の非翻訳領域が変異して
アミノ酸に翻訳された際に得られるアミノ酸配列が、配
列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列である前記の白
血病腫瘍拒絶抗原ペプチド。（８）前記ペプチドが、ＩｌｅＰｒｏＧｌｙＬｅ
ｕＰｒｏＬｅｕＳｅｒＬｅｕ（ＩＰＧＬＰＬ
ＳＬ）である白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド。（９）ＩＰＧＬＰＬＳＬが、ＭＨＣクラスＩ分子として
マウスＨ−２Ｌｄをもつ白血病細胞において活性を示す
ものである前記の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド。（１０）前記ペプチドが、ＭｅｔＴｙｒＧｌｕＭ
ｅｔＭｅｔＣｙｓＧｌｙＡｒｇＬｅｕ（ＭＹ
ＥＭＭＣＧＲＬ）である前記の白血病腫瘍拒絶抗原ペプ
チド。（１１）ＭＹＥＭＭＣＧＲＬが、ＭＨＣクラスＩ分子と
してマウスＨ−２Ｋｄをもつ白血病細胞において活性を
示すものである前記の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド。

【００１４】以下、本発明について詳述する。本発明の
腫瘍拒絶抗原ペプチドは、前記ペプチドのアミノ酸配列
のＮ末端にメチオニンが結合していないポリペプチド、
及び上記アミノ酸配列のＮ末端にシグナルペプチドの部
分もしくは全部が結合または欠損した中間体も含包す
る。自然の変異により、あるいは人工の変異により、ポ
リペプチドの主たる活性に変化を与えることなく、ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡの構造の一部を変化させる
ことが可能である。本発明の腫瘍拒絶抗原ポリペプチド
は、前記アミノ酸配列を有する相同変異体に相当する構
造を有するポリペプチドも含包する。本発明の腫瘍拒絶
抗原ペプチドは、癌化に伴って細胞内に出現する蛋白分
子であり、細胞質内でプロセッシングを受けて、ＭＨＣ
分子上に提示されている。

【００１５】本発明の腫瘍拒絶抗原ペプチドは、非共有
結合によってＭＨＣクラスＩ分子に結合しているため、
酸処理によって、容易にＭＨＣ分子から離れてくる。こ
の分子量数千ダルトン以下の短いペプチドは、モルカッ
トで５ＫＤ以上の蛋白分子と分離することができる。ペ
プチドの含まれた抽出液を逆相カラムを用いて高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、アセトニトリ
ル勾配に伴う溶出パターンを調べることができる。これ
ら溶出ペプチドの各ピークを分取し、ＭＨＣの一致する
別の腫瘍にパルスして、これを標的細胞とし、⁵¹Ｃｒ遊
離法でキラーＴ細胞の感作活性を調べることができる。
活性が検出されたペプチドを、エドマン分解法、さらに
はタンデム質量分析器を用いて、アミノ酸配列の決定を
行うことができる。このようにして、Ｔ細胞が認識する
癌抗原ペプチドを同定することが可能である。

【００１６】しかしながら、実際には、エドマン分解法
あるいはタンデム質量分析器によるアミノ酸配列の決定
には、少なくとも数十ピコモルのペプチド量が必要であ
り、このためには、莫大な数の腫瘍細胞数が必要とな
る。もう一つの問題点は、ＨＰＬＣで溶出した各分画内
に含まれるペプチドは、少なくとも数種類であり、この
ため、エドマン分解法によって得られるシグナルも数種
類となり、アミノ酸配列を正確に決定するのは難しい。
このため、タンデム質量分析器を用いて、ペプチドの壊
れ方からアミノ酸配列を読み取る方法が注目されている
が、この方法も実際に得られるデータからアミノ酸配列
を正確に予測するのは簡単ではない。そこで、本発明者
等は、ＢＡＬＢ／ｃ放射線白血病ＲＬ♂１（以下、ＲＬ
１と略記）細胞に特異的なＣＴＬによって認識される固
有抗原が存在することをもとに（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３４８６，１９７
９）、腫瘍免疫に関する研究を鋭意重ねてきた結果、白
血病腫瘍拒絶抗原を得ることに成功した。

【００１７】以下、本発明者らが白血病腫瘍拒絶抗原を
見いだすに至った経緯を述べる。放射線誘発マウス白血
病ＲＬ１をＢＡＬＢ／ｃとＢ６マウスのＦ１に接種する
と、一旦腫瘍を形成した後に拒絶される。宿主マウスに
抗ＣＤ８抗体をインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）投与し、Ｃ
Ｄ８Ｔ細胞を除去すると、拒絶反応は阻止され、宿主マ
ウスはすべて腫瘍死する。一方、抗ＣＤ４抗体では、影
響を受けない。このことから、拒絶には、主としてＣＤ
８陽性Ｔ細胞が関与していることがわかる。腫瘍を拒絶
したマウス脾細胞を、インビトロでＲＬ１細胞で再刺激
すると、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が誘発
される（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｌ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ７６：３４８６−３４９０，１９７９）。誘導され
たＣＴＬをＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕマウスに移入した
後、これらのマウスにＲＬ１を接種すると、ＲＬ１細胞
の増殖が阻止される（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５６：１
４１−１５１，１９８５）。

【００１８】ＲＬ１細胞の拒絶を担っているこのような
ＣＴＬに認識される拒絶抗原ペプチドを明らかにするこ
とを目的に、本発明者らは、腫瘍拒絶マウスの脾細胞か
らＣＴＬの株化を試み、６種類のクローン化ＣＴＬ株を
樹立した。細胞傷害活性測定の結果、バルクＣＴＬ及び
６つのＣＴＬクローンのすべてが、ＲＬ１細胞を特異的
に傷害することがわかった（表１）。

【００１９】

【表１】（脚注）実施例１で得られたＲＬ１のＣＴＬ細胞の標的
細胞（ＲＬ１及びＰ８１５）に対する細胞傷害活性の特
異性を示す。ＣＴＬ細胞としては、ＲＬ１に対するバル
クＣＴＬとクローン化ＣＴＬ細胞６種類（ｃｌｏｎｅ
１２，１４，３１，３３，４４，１０３）を用いた。細
胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）：標的細胞の比＝９：１

【００２０】表１の結果から、ＲＬ１細胞には、これら
のＣＴＬが認識する特異的な抗原が存在していることが
わかる。また、表２にみられるように、抗Ｈ−２モノク
ローナル抗体による細胞傷害性抑制試験の結果、これら
のＣＴＬの細胞傷害性は、すべてＬｄ拘束性であること
がわかった。抗ＣＤ８抗体で細胞傷害活性の抑制が起こ
り、ＣＴＬは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞である。つまり、これ
らＣＴＬのＴ細胞レセプターは、Ｌｄ分子と結合したペ
プチドを認識していることがわかった。

【００２１】

【表２】（脚注）実施例１で得られたマウス主要組織適合抗原
（Ｈ−２）に対するモノクローナル抗体による細胞傷害
抑制試験である。マウス主要組織適合抗原として、クラ
スＩ分子としては、Ｋ、Ｄ、Ｌがあり、クラスＩＩ分子
としては、Ａ、Ｅがある。血清及びモノクローナル抗体
は、５０倍希釈で使用した。バルクとクローン化傷害性
Ｔ細胞（ＣＴＬ）：ＲＬ♂１標的細胞の比＝５：１。＊：正常マウス血清

【００２２】本発明者らは、図１に示すように、ＲＬ１
細胞を酸（トリフルオロ酢酸：ＴＦＡ）で処理してＭＨ
Ｃ結合ペプチドを抽出した。分子量５０００以下の画分
を、逆相ＨＰＬＣ（ＯＤＰカラム）により分画し、各フ
ラクションをＲＬ１と同じＨ−２分子（Ｈ−２ｄ）を発
現するＤＢＡ／２由来のマウスサイトーマｐ８１５細胞
に加え、感作活性を調べた。ｐ８１５細胞が、ＲＬ１特
異的ＣＴＬによって、ＲＬ１細胞と同様に細胞傷害を受
けるようになれば、感作に用いたそのフラクションに
は、標的抗原ペプチドが含まれていることになる。１２
匹の担癌マウスより得たＲＬ１腹水細胞の分子量５００
０以下のＴＦＡ抽出物を、ＴＦＡ存在下で２０〜６０％
アセトニトリルグラジエント溶出を行った。

【００２３】図１に見られるように、２３分（ピーク
ａ）と２６分（ピークｂ）のフラクションに強い感作活
性が認められ、その他のフラクションには認められなか
った。これらのフラクションの感作活性は、バルクＣＴ
Ｌ及び６つのＣＴＬクローンですべて同様に認められ
た。この結果から、抽出抗原は、主要なＣＴＬ認識抗原
であることがわかった。これらの活性フラクションで感
作したｐ８１５が、⁵¹Ｃｒで標識したＲＬ１に対する細
胞傷害活性を抑制するか否かを調べた結果、感作ｐ８１
５は、無標識ＲＬ１と同様に、細胞傷害活性を抑制し
た。

【００２４】これらの結果より、ＲＬ１ＣＴＬの認識抗
原は、比較的単一であり、酸により効率よく抽出される
ことがわかる。フラクションの感作活性は、ＲＬ１への
細胞傷害活性と同様に、抗Ｌｄ抗体によって阻害され、
また、既知のＬｄ結合ペプチドで阻害される（表２）。
これらのことは、フラクションの活性がＬｄ分子に結合
するペプチドによるものであることを示している。ＲＬ
１細胞を可溶化し、アフィニティーカラムでＬｄ分子を
ＴＦＡ処理して、遊離する分子量５０００以下の物質を
前述のＯＤＰカラムによる逆相ＨＰＬＣで分画すると、
ＲＬ１細胞より直接酸抽出した場合と同じ２３分に活性
フラクションを得た。この場合、２６分のフラクション
には、感作活性はほとんどみられなかった。

【００２５】そこで、活性ペプチドを精製同定するため
に、２５０匹のＲＬ１担癌マウスより、２．５ｘ１０¹¹
個の腹水細胞を集め、ＴＦＡにより酸抽出し、前述のＯ
ＤＰカラムによる逆相ＨＰＬＣを繰り返し行い、感作活
性のある２３分と２６分のフラクションを各々プールし
た。プールした各活性フラクションについて、Ｃ２／Ｃ
１８カラムで、中性及び酸性の条件下で、リクロマトク
ロマトグラフィーを行い、単峰性のピークを得た。エド
マン分解法による一次構造の解析を行い、ＯＤＰで２３
分由来の活性ピークからは、オクタマーのｐＲＬｌａ
（アミノ酸配列；ＩｌｅＰｒｏＧｌｙＬｅｕＰ
ｒｏＬｅｕＳｅｒＬｅｕ、即ち、ＩＰＧＬＰＬＳ
Ｌ）が、２６分由来の活性ピークからは、デカマーのｐ
ＲＬ１ｂ（アミノ酸配列；ＳｅｒＩｌｅＩｌｅＰ
ｒｏＧｌｙＬｅｕＰｒｏＬｅｕＳｅｒＬｅ
ｕ、即ち、ＳＩＩＰＧＬＰＬＳＬ）ペプチドの配列が得
られた。

【００２６】これらの配列をもとにした合成ペプチド
は、ＯＤＰ逆相ＨＰＬＣで、細胞内でプロセスされたペ
プチドと同じ２３分と２６分に溶出され、１〜１００ｎ
Ｍの濃度で感作活性を示すことが確認された。ホモロジ
ー検索の配列情報より、これら２種類のペプチドは、オ
ンコジーンＡＫＴ−１遺伝子のコードする蛋白の一部分
であることが明らかになった。このことより、ｐＲＬ１
ａは、ｐＲＬ１ｂの２個のアミノ酸が切られて、一個の
白血病腫瘍拒絶抗原エピトープを形成しているものと考
えられる。

【００２７】本発明で得られた白血病腫瘍拒絶抗原のペ
プチドと相同性がある癌遺伝子ＡＫＴの由来に関して
は、以下の通りである。ＡＫＴ８ウィルスは、Ｔ細胞リ
ンパ腫瘍からとられたレトロウィルスであり（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４，
３０６５，１９７７）、培養ミンク肺細胞をトランスフ
ォームする活性がある。ｖ−ＡＫＴ遺伝子は、ＡＫＴ８
ウィルスの感染したミンク肺細胞からクローニングされ
た遺伝子であり、これは、レトロウィルス由来のＧａｇ
蛋白と、細胞由来のｃ−ＡＫＴの非翻訳領域（ｃ−ＡＫ
ＴのＡＴＧコドン上流６０残基）が翻訳された蛋白とｃ
−ＡＫＴ蛋白が融合した蛋白であることが報告されてい
る（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，２７４−２７７）。

【００２８】ｃ−ＡＫＴに関しては、マウス及びヒトで
クローニングされており、ヒトとマウスでは、９０％の
核酸レベルでのホモロジーがあり、アミノ酸レベルでは
９８％のホモロジーがある（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９，９２６７−９２７１，１
９９２）。ｃ−ＡＫＴ遺伝子に関しては、Ｎ末端側にｓ
ｒｃホモロジー２様ドメインがあり、Ｃ末端側にはプロ
テインカイネース様ドメインがある。

【００２９】本発明により、同定されたペプチドは、ｃ
−ＡＫＴ遺伝子のＡＴＧコドン上流の非翻訳領域部分に
相当するものであり、ｖ−ＡＫＴ由来か、ｃ−ＡＫＴ遺
伝子が自然の変異または癌化などに起因する変異（点突
然変異、欠失、挿入、フレームシフトなど）により翻訳
されたものと考えられる。表３に、白血病腫瘍拒絶抗原
ペプチドとＡＫＴ遺伝子とのペプチドのアミノ酸配列の
比較結果を示す。

【００３０】

【表３】

【００３１】本発明の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチドは、
主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子のマウスアロ
タイプＨ−２Ｌｄにおいては、表３に示すようにＩＰＧ
ＬＰＬＳＬである。しかしながら、他の主要組織適合抗
原においては、このアミノ酸配列に限定されるものでは
ない。ＭＨＣクラスＩ分子は、マウスでは、第１７染色
体上のＨ−２Ｋ、Ｄ、Ｌ上に存在し、マウスの種類によ
って、ｂ、ｄ、ｆ、ｊ、ｋ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｕ、ｖ、
ｚ等のハロタイプが知られている。一方、ヒトでは、Ｍ
ＨＣクラスＩ分子は、第６染色体上のＨＬＡ−Ａ、Ｂ、
Ｃ上に存在し、ヒトの個体差により、ＨＬＡ−Ａでは、
２５種類以上、ＨＬＡ−Ｂでは、３２種類以上、ＨＬＡ
−Ｃでは、１１種類以上が報告されている。

【００３２】これらＭＨＣクラスＩ分子上に結合するペ
プチドの解析について、最近になっていくつか報告され
ている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１
８１−２０７，１９９４）。これは、可溶化した細胞膜
から、マウス及びヒトのクラスＩ分子を免疫沈降させ、
これらのクラスＩ分子に自己結合している自己ペプチド
を精製して、アミノ酸分析を行い、その一次構造を解析
することによって行われた。その結果、各クラスＩ分子
に結合するペプチドのモチーフは、異なる遺伝子座にコ
ードされるクラスＩ分子ごとに、即ち、ハロタイプごと
に異なることが明らかとなっている。

【００３３】例えば、マウス、Ｈ−２Ｌｄでは、Ｎ末端
から２番目のアミノ酸の位置にＰが、Ｃ末端側（８−１
１番目）にＦやＬをもつペプチドが結合する。本発明の
Ｈ−２Ｌｄ結合性の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチドである
ＩＰＧＬＰＬＳＬも、このモチーフに合致する。この他
にもマウス、Ｈ−２Ｋｄ（２番目；Ｙ、Ｃ末端；Ｉ、
Ｌ、Ｖ）、Ｈ−２Ｋｋ（２番目；Ｅ、Ｃ末端；Ｉ），Ｈ
−２Ｄｄ（２番目；Ｇ、３番目；Ｐ、Ｃ末端：Ｌ、Ｉ、
Ｆ）、Ｈ−２Ｄｂ（５番目；Ｎ、Ｃ末端；Ｍ、Ｉ）等に
ついて、また、ヒトに関してもＨＬＡ−Ａ２．ｌ（２番
目；Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｃ末端；Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ）、ＨＬＡ−
Ａ３．１（２番目：Ｌ、Ｃ末端；Ｙ、Ｋ）、ＨＬＡ−Ｂ
７（２番目；Ｐ、Ｃ末端；Ｌ、Ｉ）等が報告されている
（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２；１８１−
２０７，１９９４）。

【００３４】したがって、本発明の白血病腫瘍拒絶抗原
ペプチドは、癌遺伝子ＡＫＴのコードする蛋白のアミノ
酸配列のうちで、上記マウス及びヒトのＭＨＣクラスＩ
分子に結合するモチーフであれば、特にその配列は限定
されることなく、腫瘍拒絶抗原ペプチドとして用いるこ
とができる。本発明者等は、実際に、マウスＨ−２Ｋｄ
のモチーフである２番目のＹ、Ｃ末端のＩ、Ｌ、Ｖの配
列をｖ−ＡＫＴ（配列番号１）で検索したところ、ＧＹ
ＫＥＲＰＱＤＶ（５８−６６番目）、ＤＹＬＨＳＥＫＮ
Ｖ（２８３−２９１番目）、ＭＹＥＭＭＣＧＲＬ（３６
０−３６８番目）、ＦＹＮＱＤＨＥＫＬ（３７０−３７
８番目）のペプチドが、このモチーフに一致することが
わかった。

【００３５】そこで、これらペプチドで感作したバルク
のＣＴＬを用いて、Ｈ−２Ｋｄをもつｐ８１５細胞に対
する細胞傷害活性を調べたところ、ＭＹＥＭＭＣＧＲＬ
（３６０−３６８番目）が活性のあるペプチドであるこ
とが判明した。このペプチドは、マウスｃ−ＡＫＴ（配
列番号２）の３３９−３４７番目のペプチドにも相当す
る。したがって、他のマウスのＭＨＣクラスＩ分子や、
ヒトＭＨＣクラスＩ分子についても、同様にして白血病
腫瘍拒絶抗原ペプチドを効率よく同定することが可能で
ある。

【００３６】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００３７】［実施例１］（１）細胞傷害活性測定本発明における細胞傷害活性の測定は、以下のようにし
て行った。腫瘍細胞（標的細胞）２×１０⁶個を、２Ｍ
Ｂ_qＮａ ₂ ⁵¹ＣｒＯ₄と０．３ｍｌの培養液中で１時間
培養し、標識した。これらの細胞を洗浄し、標的細胞と
して用いた。標識化された１×１０⁴個の細胞（１００
μｌ）を標的細胞として用い、ＣＴＬ細胞（１００μ
ｌ）をエフェクター細胞として添加し、９６穴培養プレ
ートで培養した。抗体を用いたブロッキングアッセイ
は、希釈したモノクローナル抗体１００μｌをエフェク
ター細胞５０μｌとラベル化した標的細胞５０μｌに添
加し、行った。

【００３８】ＨＰＬＣフラクションを用いた刺激試験
は、５〜１０μｌのＨＰＬＣ画分を１００μｌの培養液
に希釈して、１×１０⁴個の標識化された標的細胞（５
０μｌ）と１時間室温でインキュベートし、エフェクタ
ー細胞５０μｌを添加した。４時間のインキュベーショ
ン後、培養上清（１００μｌ）をとり、ガンマーカウン
ターで放射線活性を測定した。特異的傷害活性は、以下
のように算出した。ＣＴＬ活性＝〔（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）〕×１００ａ：ターゲット細胞をエフェクター細胞とインキュベー
トした際に遊離する放射線活性ｂ：エフェクター細胞のみでインキュベートした際に遊
離する自然遊離放射線活性ｃ：ターゲット細胞を界面活性剤等で処理した際に生じ
る最大遊離放射線活性

【００３９】（２）ＲＬ１細胞特異的細胞傷害性Ｔ細胞
の樹立と維持ＣＢ６Ｆ１マウスの脾細胞５×１０⁷個と放射線照射
（１００Ｇｙ）したＲＬ１細胞１×１０⁶個を細胞培養
用フラスコで５日間培養した。培養液は、ＲＰＭＩ１
６４０、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミ
ン酸、１００ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌス
トレプトマイシン、５０ｍＭ２−メルカプトエタノール
を用いた。培養フラスコから剥離した細胞（５×１０⁴
個）は、バルクのＣＴＬ細胞として、１週間毎に１×１
０⁵個の放射線照射（１００Ｇｙ）したＲＬ１細胞を刺
激細胞とし、５×１０⁵個の放射線照射（２０Ｇｙ）し
たＣＢ６Ｆ１の脾臓細胞をフィーダー細胞として、５ｎ
ｇ／ｍｌヒトリコンビナントＩＩ−２を添加した培養液
中で維持した。ＣＴＬ細胞のクローン化は、９６穴プレ
ートにＣＴＬ細胞を３から０．３個の割合でまき、１×
１０⁴個の放射線照射したＲＬ１細胞と１×１０⁶個の放
射線照射したＣＢ６Ｆ１脾細胞とＩＬ−２存在下で培養
した。１０〜１４日後に増殖してきた細胞の細胞傷害活
性を調べることにより、クローン化し、６種類のクロー
ン化したＣＴＬ細胞を得ることができた。

【００４０】得られたバルクＣＴＬ細胞と、クローン化
ＣＴＬ細胞のＲＬ１細胞と、ｐ８１５細胞に対する細胞
傷害活性を表１に示す。マウス主要組織適合抗原（Ｈ−
２）に対する各種モノクローナル抗体による細胞傷害抑
制試験の結果を表２に示す。マウス主要組織抗原とし
て、クラスＩ分子としては、Ｋ、Ｄ、Ｌがあり、クラス
ＩＩ分子としては、Ａ、Ｅがあるが、これらのモノクロ
ーナル抗体のうち、抗Ｌｄ分子のモノクローナル抗体の
みが、細胞傷害活性を抑制していることから、本白血病
腫瘍拒絶抗原は、Ｌｄ分子に結合していることがわか
る。

【００４１】［実施例２］白血病腫瘍拒絶抗原ペプチドの精製は、以下の方法で行
った。（１）高速液体クロマトグラフィーによる精製ＲＬ１細胞２．５×１０¹¹個をＢａｌｂ／ｃマウス２５
０匹の腹水から調製した。得られた細胞は、０．１％Ｔ
ＦＡ（トリフルオロ酢酸）中、ダンスホモジナイザーで
１０ストロークホモジナイズし、ソニケーターで３分間
処理した。ホモジネートは、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．
０）で３０分間撹拌した。１０，０００Ｇで３０分間遠
心して、上澄みをモレキュラーカットメンブラン（分子
量５０００、ミリボア社）で濾過した。マウス１０匹分
より得た濾液を０．１％ＴＦＡに溶かし、逆相高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（ＯＤＰ；１０×２５
０ｍｍ、１０μｍ、ＡＳＡＨＩＰＡＫ，ＫＡＷＡＳＡＫ
Ｉ）で分離した。カラム溶出溶媒は、０．１％ＴＦＡ中
２０％から６０％のアセトニトリル濃度勾配で用いた。
フラクションは、２ｍｌづつ分画した。各フラクション
の活性は、ＲＬ１細胞に対するキラーＴ細胞を用いて、
ターゲット細胞として、Ｈ−２Ｌｄを持つｐ８１５細胞
を用いた。図１に、１回目のＣ１８カラムの結果を示
す。ピークａとピークｂの画分にｐ８１５細胞に対する
細胞傷害活性があった。

【００４２】さらに、精製するために、逆相ＨＰＬＣ
Ｃ２／Ｃ１８カラム（ＳｕｐｅｒＰａｃ^TM Ｐｅｐ−
Ｓ；４×２５０ｍｍ、５μｍｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａＬＫＢ，Ｓｗｅｒｄｅｎ）にピーク
ａとピークｂの画分をアプライして、中性条件下で、ア
セトニトリル濃度勾配により１ｍｌ／ｍｉｎの速度で溶
出した。逆相ＨＰＬＣで分画したプロフィール、及び各
フラクションの一部をとり、ｐ８１５細胞に加え、ＲＬ
１特異的ＣＴＬによる傷害活性を調べた結果を図２に示
す。図２Ａは、ピークａ由来の画分をアプライした際の
プロフィールであり、１２分（ピークａ′）に強い細胞
傷害活性が見られ、図２Ｂは、ピークｂ由来の画分をア
プライした際のプロフィールで、２９分（ピークｂ′）
のフラクションに強い細胞傷害活性が見られた。

【００４３】図２ピークａ′とピークｂ′の画分を３回
目の逆相ＨＰＬＣ（Ｃ２／Ｃ１８カラム、酸性条件下
０．１％ＴＦＡ、アセトニトリル濃度勾配；０．５％
（Ａ）あるいは１．６６％（Ｂ）／分、２ｍｌ／ｍｉ
ｍ）で分画したプロフィールを図３に示す。各フラクシ
ョンの一部をとり、ｐ８１５細胞に加え、ＲＬ１特異的
ＣＴＬによる傷害活性を調べた。図３Ａは、ピークａ′
由来の画分をアプライした際のプロフィールで、２４．
５分（ピークａ″）に強い細胞傷害活性が見られ、図３
Ｂはピークｂ′由来の画分をアプライした際のプロフィ
ールで、２３分（ピークｂ″）のフラクションに強い細
胞傷害活性が見られた。

【００４４】（２）ペプチドシークエンスペプチドシークエンスは、ペプチドシークエンサー（モ
デル４７７Ａ；アプライドバイオシステムズ社）を用い
て、エドマン分解法によって決定した。ピークａ″画分
は、ＩＰＧＬＰＬＳＬ、ピークｂ″画分は、ＳＩＩＰＧ
ＬＰＬＳＬと決定された。

【００４５】［実施例３］結合ペプチドのキャラクタライゼイション（１）ペプチド合成ＩＰＧＬＰＬＳＬとＳＩＩＰＧＬＰＬＳＬのペプチド
を、Ｆ−ｍｏｃ法を用いた固相合成法で、ペプチド合成
装置（モデル４３０Ａ、アプライドバイオシステムズ
社）を用いて化学合成した。合成したペプチドは、逆相
ＨＰＬＣカラム（Ｃ８カラム、１０×１００ｍｍ、２０
μｍＰａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅ、アプライズドバイ
オシステムズ社）により、０．１％ＴＦＡアセトニトリ
ル存在下、アセトニトリル濃度勾配により、９８％以上
に精製した。これらのペプチドを用いて、ＣＴＬ刺激活
性を調べた結果を図４に示す。

【００４６】ＲＬ１のＣＴＬ細胞の細胞傷害活性を標的
細胞として、Ｔ１．１．１（Ｌｄトランスフェクトした
Ｌ細胞）；Ｔ４．８．３（Ｄｂをトランスフェクトした
Ｌ細胞）；ｐ８１５（Ｌｄ−発現細胞）とした場合につ
いて、ペプチド添加効果を調べた。ペプチドとしては、
ｐＲＬＩａ（ＩＰＧＬＰＬＳＬ）とｐＲＬ１ｂ（ＳＩＩ
ＰＧＬＰＬＳＬ）添加による⁵¹Ｃｒ遊離能によって調べ
たが、ｐＲＬ１ａ（ＩＰＧＬＰＬＳＬ）とｐＲＬ１ｂ
（ＳＩＩＰＧＬＰＬＳＬ）ともにＨ−２Ｌｄを発現して
いる細胞であるＴ１．１．１、ｐ８１５細胞では、細胞
傷害活性は認められたが、Ｈ−２Ｄｂを発現しているＴ
４．８．３細胞では、この活性は認められなかった。し
たがって、本ペプチドは、特異的にＨ−２Ｌｄ分子に結
合している腫瘍拒絶抗原である。ｐＲＬ１ｂにもｐＲＬ
１ａと同様に活性があったのは、ｐＲＬ１ｂが培養液中
の血清等で分解されて、ｐＲＬ１ａに変わるためであ
る。

【００４７】［実施例４］（１）マウス、Ｈ−２Ｋｄのモチーフである２番目の
Ｙ、Ｃ末端のＬ、Ｌ、Ｖの配列をｖ−ＡＫＴで検索した
ところ、ＧＹＫＥＲＰＱＤＶ（５８−６６番目）、ＤＹ
ＬＨＳＥＫＮＶ（２８３−２９１番目）、ＭＹＥＭＭＣ
ＧＲＬ（３６０−３６８番目）、ＦＹＮＱＤＨＥＫＬ
（３７０−３７８番目）のペプチドであることがわかっ
た。このペプチドをＦ−ｍｏｃ法を用いた固相合成法
で、ペプチド合成装置（モデル４３０Ａ、アプライドバ
イオシステムズ社）を用いて化学合成した。合成したペ
プチドは、逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ８カラム、１０×１
００ｍｍ、２０μｍＰａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅ、アプ
ライズドバイオシステムズ社）により、０．１％ＴＦＡ
アセトニトリル存在下、アセトニトリル濃度勾配によ
り、９８％以上に精製した。

【００４８】（２）ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞３×１
０⁶個と、合成したペプチドを各々１×１０^-4Ｍになる
ようにして、細胞培養用プレートで５日間培養した。培
養液は、ＲＰＭＩ１６４０，１０％牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）、２ｍＭグルタミン酸、１００μ／ｍｌペニシリ
ン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍＭ２
−メルカプトエタノールを用いた。培養プレートから細
胞（５×１０⁵個）を回収し、バルクのＣＴＬ細胞とし
て、細胞傷害活性試験に用いた。これらのペプチドを感
作したＨ−２Ｋｄをもつｐ８１５細胞（標的細胞）に対
する細胞傷害活性を調べたところ（図５）、ＭＹＥＭＭ
ＣＧＲＬ（３６０−３６８番目）が１×１０^-4Ｍ添加し
た際に活性のあるペプチドであることが判明した。

【００４９】

【発明の効果】本発明の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド
は、これを用いることにより、各種病態の診断及び治療
法を解明する技術が提供される。特に、白血病の腫瘍免
疫治療に有効である。本発明の腫瘍拒絶抗原ペプチド
は、免疫系の腫瘍拒絶のメカニズムの解明、腫瘍免疫疾
患などの診断及び治療、免疫活性化剤の開発に有効であ
る。これ以外にも、癌遺伝子ＡＫＴは、胃癌細胞（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．
８４，５０３４−５０３７，１９８７）や卵巣癌（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．
８９，１９９２）においても、発現が増大していること
が報告されているので、癌化のメカニズムの解明や癌の
診断及び治療に有用である。

【００５０】本発明の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチドのヒ
トでの治療について、例を挙げて述べれば、以下のよう
になる。まず、各々の患者のＭＨＣクラスＩ分子に結合
するＡＫＴ遺伝子のコードする白血病腫瘍拒絶抗原ペプ
チドを選別する。次に、患者の腫瘍細胞、あるいはそれ
と同じＭＨＣクラスＩ分子をもつ細胞に、この白血病腫
瘍拒絶抗原ペプチドを添加する。次いで、患者のＴ細胞
を添加し、生体外で培養して、白血病腫瘍拒絶抗原ペプ
チドを認識する細胞傷害性Ｔ細胞を特異的に誘導し、患
者に戻して、治療する。この他にも、白血病腫瘍拒絶抗
原ペプチドを単独で、あるいは安定性を増大させる各種
薬剤等、例えば、リポソーム等と結合させて、投与する
ことも可能である。（なお、本明細書において、アミノ
酸などを略号で示す場合は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによる
略号あるいは当該分野における慣用の略号を使用し
た。）

【００５１】

【配列表】

【００５２】配列番号：１配列の長さ：５０１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Arg Glu Glu Thr Leu Ile Ile Ile Pro Gly Leu Pro Leu Ser Leu 1 5 10 15 Gly Ala Thr Asp Thr Met Asn Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp 20 25 30 Leu His Lys Arg Gly Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe 35 40 45 Leu Leu Lys Asn Asp Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln 50 55 60 Asp Val Asp Gln Arg Glu Ser Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln 65 70 75 80 Cys Gln Leu Met Lys Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Ile Ile 85 90 95 Arg Cys Leu Gln Trp Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Glu 100 105 110 Thr Pro Glu Glu Arg Glu Glu Trp Ala Thr Ala Ile Gln Thr Val Ala 115 120 125 Asp Gly Leu Lys Arg Gln Glu Glu Glu Thr Met Asp Phe Arg Ser Gly 130 135 140 Ser Pro Ser Asp Asn Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala 145 150 155 160 Lys Pro Lys His Arg Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu 165 170 175 Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala 180 185 190 Thr Gly Arg Tyr Tyr Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val 195 200 205 Ala Lys Asp Glu Val Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln 210 215 220 Asn Ser Arg His Pro Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr 225 230 235 240 His Asp Arg Leu Cys Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu 245 250 255 Phe Phe His Leu Ser Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg 260 265 270 Phe Tyr Gly Ala Glu Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu 275 280 285 Lys Asn Val Val Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp 290 295 300 Lys Asp Gly His Ile Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly 305 310 315 320 Ile Lys Asp Gly Ala Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr 325 330 335 Leu Ala Pro Glu Val Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp 340 345 350 Trp Trp Gly Leu Gly Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu 355 360 365 Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met 370 375 380 Glu Glu Ile Arg Phe Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu 385 390 395 400 Leu Ser Gly Leu Leu Lys Lys Asp Pro Thr Gln Arg Leu Gly Gly Gly 395 410 415 Ser Glu Asp Ala Lys Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Asn Ile 420 425 430 Val Trp Gln Asp Val Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro 435 440 445 Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr 450 455 460 Ala Gln Met Ile Thr Ile Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu 465 470 475 480 Cys Val Asp Ser Glu Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser 485 490 495 Ala Ser Gly Thr Ala 500

【００５３】配列番号：２配列の長さ：４７９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Asn Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp 20 25 30 Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln Asp Val Asp Gln Arg 35 40 45 Glu Ser Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln Cys Gln Leu Met Lys 50 55 60 Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp 65 70 75 80 Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg 85 90 95 Glu Glu Trp Ala Thr Ala Ile Gln Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Arg 100 105 110 Gln Glu Glu Glu Thr Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asn 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg 130 135 140 Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr 145 150 155 160 Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr 165 170 175 Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val 180 185 190 Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro 195 200 205 Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys 210 215 220 Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser 225 230 235 240 Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu 245 250 255 Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr 260 265 270 Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile 275 280 285 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala 290 295 300 Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val 305 310 315 320 Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly 325 330 335 Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln 340 345 350 Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe 355 360 365 Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 370 375 380 Lys Lys Asp Pro Thr Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys 385 390 395 400 Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Asn Ile Val Trp Gln Asp Val 395 410 415 Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu 420 425 430 Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met Ile Thr 435 440 445 Ile Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu Arg 450 455 460 Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala 465 470 475

【００５４】配列番号：３配列の長さ：９４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Asp Gln Arg Thr Asp Arg Ala Ala Ser Cys Gly Arg His Arg Gly 1 5 10 15 Gly Pro Asp Pro Ala Ser Ser Ala Arg Pro Asp Ala Ala Ala Phe Ser 20 25 30 Arg Pro Arg Pro Ala Pro Ala Arg Gly Met Arg Ser Gly Gly Arg Pro 35 40 45 Arg Pro Arg Pro Gly Xaa Ala Gln Ser Pro Ala Arg Gly Gly Pro Thr 50 55 60 Leu Arg Pro Gly Arg Leu Gly Ser Ala Tyr Arg Glu Glu Thr Leu Ile 65 70 75 80 Ile Ile Pro Gly Leu Pro Leu Ser Leu Gly Ala Thr Asp Thr 85 90

【図面の簡単な説明】

【図１】１回目のＲＬ１抗原ペプチドの逆相ＨＰＬＣ分
離パターンと細胞傷害活性試験の結果を示す図である。
２３分（ピークａ）と２６分（ピークｂ）のフラクショ
ンに強い細胞傷害活性が見られた。

【図２】２回目のＲＬ１抗原ペプチドの逆相ＨＰＬＣ分
離パターンと細胞傷害活性試験の結果を示す図である。
図２Ａは、ピークａ由来の画分をアプライした際のプロ
フィールで、１２分（ピークａ″）のフラクションに強
い細胞傷害活性が見られた。図２Ｂは、ピークｂ由来の
画分をアプライした際のプロフィールで、２９分（ピー
クｂ″）のフラクションに強い細胞傷害活性が見られ
た。

【図３】３回目のＲＬ１抗原ペプチドの逆相ＨＰＬＣ分
離パターンと細胞傷害活性試験の結果を示す図である。
図３Ａは、ピークａ′由来の画分をアプライした際のプ
ロフィールで、２４．５分（ピークａ″）のフラクショ
ンに強い細胞傷害活性が見られた。図３Ｂは、ピーク
ｂ′由来の画分をアプライした際のプロフィールで、２
３分（ピークｂ″）のフラクションに強い細胞傷害活性
が見られた。

【図４】実施例３で得られたペプチドフラグメントｐＲ
Ｌ１ａ（ＩＰＧＬＰＬＳＬ）とｐＲＬ１ｂ（ＳＩＩＰＧ
ＬＰＬＳＬ）のＣＴＬ刺激活性を示す図である。

【図５】Ｋｄに対する抗原ペプチドの細胞傷害活性試験
の結果を示す図である。縦軸は細胞傷害活性（％）を、
横軸はＥ／Ｔ比でエフェクター細胞と標的細胞の割合を
示す。ｐ８１５細胞にＫＤ３（ＭＹＥＭＭＣＧＲＬ）を
添加した際に細胞傷害活性を増大させることがわかる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＡＫＴ遺伝子によりコードされるアミノ
酸配列または該ＡＫＴ遺伝子の変異によってその非翻訳
領域によりコードされるアミノ酸配列の中に部分的配列
として含まれるアミノ酸配列から構成されるペプチドで
あって、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子に
結合するモチーフを含むことを特徴とする白血病腫瘍拒
絶抗原ペプチド。
【請求項２】前記ペプチドが、１５以下のアミノ酸残
基で構成されている請求項１記載の白血病腫瘍拒絶抗原
ペプチド。
【請求項３】前記ペプチドが、８〜１１のアミノ酸残
基で構成されている請求項１記載の白血病腫瘍拒絶抗原
ペプチド。
【請求項４】ＡＫＴ遺伝子が、マウスｖ−ＡＫＴ、マ
ウスｃ−ＡＫＴ、ヒトｖ−ＡＫＴ、またはヒトｃ−ＡＫ
Ｔ遺伝子である請求項１ないし３のいずれか１項記載の
白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド。
【請求項５】マウスｖ−ＡＫＴ遺伝子によりコードさ
れるアミノ酸配列が、配列表の配列番号１に記載のアミ
ノ酸配列である請求項４記載の白血病腫瘍拒絶抗原ペプ
チド。
【請求項６】マウスｃ−ＡＫＴ遺伝子によりコードさ
れるアミノ酸配列が、配列表の配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列である請求項４記載の白血病腫瘍拒絶抗原ペプ
チド。
【請求項７】ＡＫＴ遺伝子の変異によって非翻訳領域
によりコードされるアミノ酸配列が、ｃ−ＡＫＴ遺伝子
の変異によって非翻訳領域がアミノ酸に翻訳された際に
得られるアミノ酸配列である請求項４記載の白血病腫瘍
拒絶抗原ペプチド。
【請求項８】マウスｃ−ＡＫＴ遺伝子の非翻訳領域が
変異してアミノ酸に翻訳された際に得られるアミノ酸配
列が、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列である
請求項７記載の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド。
【請求項９】前記ペプチドが、ＩｌｅＰｒｏＧｌ
ｙＬｅｕＰｒｏＬｅｕＳｅｒＬｅｕ（ＩＰＧ
ＬＰＬＳＬ）である請求項１ないし８のいずれか１項に
記載の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド。
【請求項１０】ＩＰＧＬＰＬＳＬが、ＭＨＣクラスＩ
分子としてマウスＨ−２Ｌｄをもつ白血病細胞において
活性を示す請求項９記載の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチ
ド。
【請求項１１】前記ペプチドが、ＭｅｔＴｙｒＧ
ｌｕＭｅｔＭｅｔＣｙｓＧｌｙＡｒｇＬｅ
ｕ（ＭＹＥＭＭＣＧＲＬ）である請求項１ないし８の
いずれか１項に記載の白血病腫瘍拒絶抗原ペプチド。
【請求項１２】ＭＹＥＭＭＣＧＲＬが、ＭＨＣクラス
Ｉ分子としてマウスＨ−２Ｋｄをもつ白血病細胞におい
て活性を示す請求項１１記載の白血病腫瘍拒絶抗原ペプ
チド。