JPH08109200A - 抗Ｃ５ａレセプター抗体、その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ヒトＣ５ａレセプターの免疫学的測定法におい
て有用な抗Ｃ５ａレセプターモノクローナル抗体を提供
する。 【構成】Ｃ５ａレセプターのリガンドとの結合を阻害す
るが、リガンド結合により生じる生物活性を中和しない
抗Ｃ５ａレセプターモノクローナル抗体、該抗体を産生
するハイブリドーマ、該抗体を免疫学的に反応させるこ
とを特徴とするＣ５ａレセプターの測定法。 【効果】本発明抗体は、Ｃ５ａレセプターとリガンドと
の結合を阻害するが、リガンド結合により生じる生物活
性を中和しないことから、各種疾病におけるＣ５ａの働
き、あるいはＣ５ａレセプターの発現の推移を探るうえ
で、極めて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞上に発現されてい
るヒトＣ５ａレセプターの免疫学的測定法およびその測
定に用いるモノクローナル抗体、さらにはそのモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。

【０００２】

【従来の技術】生体には病原微生物その他の異物の侵入
を阻止する防御機能として、抗体や感作リンパ球の関与
する特異的防御機能と免疫の関与しない非特異的防御が
ある。非特異的防御機能として重要なものに補体があ
る。補体系は９つの蛋白質（詳しくは約２０種）から成
り、それぞれの成分は肝細胞やマクロファージによって
作られ、正常な状態では体液中に不活性状態で個別に存
在するが、抗原抗体複合体、細菌細胞壁その他により活
性化され、生体防御因子として機能する。補体系の活性
化が起こると、体液中の補体系タンパクが酵素分解さ
れ、種々の生物活性を有する断片が産生される。これら
の補体タンパク断片のうち、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、Ｃ５ａの
３つは、アナフィラトキシンと総称され、アナフィラキ
シーショックを含む色々な炎症反応を引き起こす化学媒
体である。またこれらは、免疫調節物質としての作用も
有していることが明らかにされている。これら３つのア
ナフィラトキシンのうち最も強い炎症作用を引き起こす
物質であるＣ５ａは、補体第５成分Ｃ５が、Ｃ５転換酵
素によって切断され産生される２断片のうち小さい方の
断片すなわち、Ｃ５α鎖のＮ末端７４個のアミノ酸残基
から構成される分子量11,000の糖タンパク質である。Ｃ
５ａは、白血球遊走作用、血管透過性こう進作用、平滑
筋収縮作用を持ち、単球に作用してサイトカインを産生
させることにより免疫反応を調節する作用も有する。こ
のため、敗血症、成人呼吸窮迫症候群、喘息、粥状動脈
硬化症、心筋梗塞、脳梗塞等の虚血性疾患、乾せん、腎
炎、さらには外傷や火傷など致死率の高い多くの疾患の
原因物質となっている。

【０００３】Ｃ５ａがこれらの生物活性を現すには、そ
の特異的レセプター、Ｃ５ａレセプター（Ｃ５ａＲ）に
結合して細胞内に情報刺激が伝達される必要がある。ミ
エロイド細胞株ＨＬ６０およびＵ９３７のｃＤＮＡから
遺伝子クローニングがなされた結果、Ｃ５ａＲは350個
のアミノ酸残基より構成される糖タンパク質で、7回膜
貫通型の構造を有しており、細胞内のＧタンパクと結合
してその細胞内情報伝達を行うロドプシンレセプターの
一員であることが明らかになっている（Gerard,N. P.
および Gerard, C., ネイチヤー（Nature）第349巻：61
4頁, (1991)；Boulay, F. ら バイオケミストリー（Bio
chemistry）第30巻：2993頁, 1991）。Ｃ５ａＲを特異
的に認識する抗体は、モノクローナル抗体（Oppermann,
M. ら, ジャーナル オブ イムノロジー（The Journa
l of Immunology）第151巻：3794頁，1993）およびポリ
クローナル抗体（Morgan, E. L. ら, 同誌 377頁）のい
ずれも１９９３年になって、はじめて作製された。Oppe
rmann らによって作製されたモノクローナル抗体Ｓ５／
１は、Ｃ５ａＲのＮ末端１番目から３１番目までのアミ
ノ酸配列を有するペプチドを牛アルブミンに結合させた
タンパク質を免疫原として作製された。この抗体は、Ｃ
５ａＲとリガンドＣ５ａとの結合を競合的に阻害しリガ
ンド結合によっておこる好中球の生物活性を中和するも
ので、レセプターのＮ末端より数えて１５番目から２１
番目のアミノ酸配列の部位を認識している。

【０００４】これらの抗体は、リガンドの結合を阻害
し、またレセプターの細胞表面での発現を蛍光抗体をも
ちいてＦＡＣＳ解析をすることを可能にした。その結
果、好中球、好酸球、単球上にＣ５ａＲが発現している
ことが明らかになった。しかしリガンドと競合阻害する
故にいくつかの不利な点があった。すなわち血小板上に
Ｃ５ａＲが存在するのかどうかは、モルモットの場合に
は、発現が証明されているもののヒトでは、議論の分か
れるところである。中和抗体Ｓ５／１は、リガンドの結
合部位と同じ部位に結合するため、少しの刺激で簡単に
活性化されてしまう血小板を扱う実験には、使用できな
い。そのためヒト血小板上のＣ５ａＲ発現については、
いまだに結論が得られていない。さらに、細胞上のＣ５
ａＲ発現量は、疾病などにより変化があるものと予想さ
れる。現存する中和抗体では、高感度なＣ５ａＲの定量
化には、誰も成功していないのが現状である。さらにＣ
５ａＲとリガンドとの結合には、１カ所だけではなくい
くつかの部位の相互作用が関与しているといわれてい
る。最近では、Ｎ末端以外にも細胞膜貫通部分によって
取り囲まれた、芯（core）とよばれる部分も結合に関与
しているという事実が示された（Siciliano, S.J.ら,
プロシーディングス オブ ナショナル アカデミーオブ
サイエンス（ＰＮＡＳ）第９１巻：１２１４頁，１９９
４年。Ｎ末端１５から２１番の配列をもつペプチドを認
識するモノクロナール抗体が、Ｃ５ａＲとそのリガンド
Ｃ５ａとの結合を阻害し、リガンド結合によってもたら
される細胞の生物活性を阻止することが明らかにされて
いるが、これと異なるペプチドを免疫原としてモノクロ
ーナル抗体を得、これがＣ５ａとレセプターとの結合を
阻害するかどうか、またＣ５ａ結合によって惹起される
細胞の生物活性を阻止するかを調べることによって、リ
ガンド結合部位の詳細な構造を解析し、レセプターによ
るシグナル伝達方法を明らかにしていく必要がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】炎症が起こったとき好
中球などの多核白血球は細胞表面上のＣ５ａＲの発現を
増やし、炎症部位への遊走を速め、また血管外への透過
を亢進さらには、顆粒の放出等による生体防御をすると
想像が出来る。これらの多核白血球に加え血小板は、刺
激をうけて多くの生物活性を持つ分子を含む大量の顆粒
を放出し、刺激からの生体反応としては、もっとも迅速
な応答を行っている。そしてその結果血小板自身は、凝
集をおこし死に至る。しかしＣ５ａＲの定量化が、可能
にされていない現状では、Ｃ５ａの刺激を受けた細胞が
このような現象をおこしているということは、想像の域
を越えることは無い。Ｃ５ａＲが正確に定量出来るよう
になれば、疾患の経過を知り、病因および病態の解明の
ために非常に有用な情報を与えることはまちがいない。
一方、リガンド結合部位を認識する抗体は、多くの場合
レセプターに結合することによってリガンドと同じ効
果、すなわちレセプタ-を介したシグナルを与えてしま
う。この結果細胞が活性化され、細胞凝集、レセプター
の内在化ひいては、細胞死に至ることにもなる。従って
抗体の結合による細胞の活性化を引き起こさない抗体を
用いての、レセプターの定量が望まれる。また上述した
ように、Ｃ５ａＲ上のリガンド結合部位を特定し、複雑
なリガンド結合に続くレセプター構造変化、さらにはシ
グナル伝達法を明らかにしていくためにも現存する中和
抗体以外のモノクローナル抗体の使用が望まれる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
を鑑み研究した結果、Ｃ５ａＲのＮ末端１番より２０番
のアミノ酸よりなるポリペプチドをキャリヤー蛋白キー
ホール リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とコンジュ
ゲートしたＫＬＨ−Ｃ５ａＲ_1-20を免疫原としてモノク
ローナル抗体を作成し、これを用いて細胞上に発現され
ているＣ５ａＲを安定に定量することを可能にした。こ
の知見に基づき、さらに鋭意研究し、本発明を完成し
た。即ち本発明は、（１）Ｃ５ａレセプターのリガンド
との結合を阻害するが、リガンド結合により生じる生物
活性を中和しない抗Ｃ５ａレセプターモノクローナル抗
体、（２）認識部位がＣ５ａレセプターのＮ末端２０ア
ミノ酸残基からなる領域に存する上記（１）記載の抗
体、（３）モノクローナル抗体ＭＨ１／２０である上記
（１）記載の抗体、（４）Ｃ５ａレセプターのリガンド
との結合を阻害するが、リガンド結合により生じる生物
活性を中和しない抗Ｃ５ａレセプターモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ、（５）Ｃ５ａレセプター
のＮ末端２０アミノ酸残基からなるペプチド断片で免疫
感作されたマウス脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合
してなる上記（４）記載のハイブリドーマ、（６）上記
（４）記載のハイブリドーマを液体培地または動物腹腔
内で培養し、培養上清または腹水より抗体を採取するこ
とを特徴とする上記（１）記載の抗体の製造法、（７）
マウスハイブリドーマＭＨ１／２０である上記（４）記
載のハイブリドーマ、（８）Ｃ５ａレセプターに上記
（１）記載の抗体を免疫学的に反応させることを特徴と
するＣ５ａレセプターの測定法、（９）フローサイトメ
トリー法である上記（８）記載の測定法および（１０）
上記（１）記載の抗体を含有するＣ５ａレセプター測定
用試薬に関するものである。

【０００７】本発明の抗Ｃ５ａＲモノクローナル抗体
（ｍＡｂ）は、公知の遺伝子工学的手法によっても作成
できるが、通常、ハイブリドーマ法によって作成され
る。該抗体産生ハイブリドーマの作製は常法に従って実
施される。すなわち、Ｃ５ａＲまたはその部分ポリペプ
チドキャリヤーコンジュゲートあるいは、Ｃ５ａＲ発現
細胞を動物に免疫し、抗体産生を確認する。ここで、免
疫原としては、Ｃ５ａＲ部分ポリペプチド、特にＮ末端
２０アミノ酸残基からなる部分ポリペプチドのキャリヤ
ーとのコンジュゲートを用いることが好ましいが、目的
の抗体が得られる限り、特にこれに限定されない。次に
免疫動物より採取した抗体産生細胞、例えば脾臓細胞や
リンパ節細胞などを骨髄種細胞（例、マウスの場合、Ｎ
Ｓー１、Ｐ３Ｕ１、Ｓｐ２／０）と融合し、得られたハ
イブリドーマの中からＣ５ａＲ部分配列ポリペプチドコ
ンジュゲートに特異的に結合し、Ｃ５ａＲ発現細胞に結
合可能な抗体を産生する細胞をスクリーニングする。本
発明において抗原として用いるＣ５ａレセプターフラグ
メントペプチドキャリヤー蛋白結合体は、通常の方法に
よって作成される。すなわち(１)キャリヤー蛋白溶液
（１mg／mlないし２０mg／mlの濃度に調製しｐＨ７ない
し８のもの）と(２)m−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシミドエステル（３mg／mlの濃度ジメチル
ホルマミド中に調製したもの）(３)抗原ペプチド溶液
（１mg／mlから１０mg／mlの濃度に調製したもの）を用
意し、蛋白溶液(１)に(２)をゆっくり加える。室温にて
３０分撹拌後、ゲルろ過カラムにて蛋白画分を集めこれ
を(３)のペプチド溶液に加え、室温でさらに３時間反応
させる。この方法以外にたとえばグルタルアルデヒドに
よる重合法でもペプチド蛋白結合体を作ることが出来
る。

【０００８】免疫動物としては、例えばウサギ、ラッ
ト、マウス、ハムスター、モルモット等が用いられる
が、マウスが特に好ましくもちいられる。接種方法とし
ては、通常実施される方法に従えばよく、例えばＣ５ａ
Ｒ部分配列ポリペプチドコンジュゲートの場合、マウス
に１回０．０５−３０μｇ、好ましくは０．１−５μ
ｇ、Ｃ５ａＲ発現細胞の場合、マウスに１回１０⁵−１
０⁷細胞数を、等容量の生理食塩水及びフロイントの完
全アジュバントで乳化して、背部、腹部の皮下あるいは
腹腔内に２−３週毎に３−６回接種する方法が採られ
る。これらの免疫動物、例えばマウスから抗体価の高い
個体を選択し、最終免疫３−５日後に脾臓及び／あるい
は、リンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞
を骨髄腫細胞と融合させる。融合操作は既知の方法に従
って実施できるが、融合促進剤としては、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げら
れ、好ましくはＰＥＧが繁用される。骨髄腫細胞として
は、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｓｐ２／０などが挙げられ、
特にＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。脾臓細胞と骨髄腫
細胞との好ましい比率は１：１−１０：１で、これに平
均分子量約１０００−８０００のＰＥＧが、１０−８０
％の濃度で添加され、２０−３７℃で３−１０分間反応
するのがよい。

【０００９】抗Ｃ５ａＲｍＡｂ産生ハイブリドーマのス
クリーニングには種々の方法が使用できる。例えば、マ
イクロプレート上にＣ５ａＲまたは免疫を用いたＣ５ａ
Ｒ部分ポリペプチドとＢＳＡ（牛血清アルブミン）のコ
ンジュゲート（例えば、ＢＳＡ−Ｃ５ａＲ_1-20）を常法
に従って固定化し、抗原感作プレートを作成する。次い
でハイブリドーマ培養上清をこの抗原感作プレートに添
加し、プレート上に結合した抗Ｃ５ａＲ抗体を検出す
る、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により培養上清中の
抗体価を測定する。ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミジン）添加培地で選別、育種された抗体活
性陽性のハイブリドーマは直ちにクローニングに供され
るが、通常このクローニング操作は限界希釈法などで容
易に実施される。クローン化されたハイブリドーマの培
養上清を上記のＥＬＩＳＡに供し、抗体活性陽性示すも
ののうち、Ｃ５ａＲ発現細胞（例えば好中球など）に結
合し蛍光標識二次抗体を用いて検出される抗体産生ハイ
ブリドーマを選別し、目的とする抗Ｃ５ａモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマを取得する事が出来る。以上
のような製造法に従って作成した抗Ｃ５ａＲｍＡｂ産生
ハイブリドーマの例として、後述の実施例１−（３）に
示すハイブリドーマＭＨ１／２０が挙げられる。上記し
た本発明のハイブリドーマの培養は通常、液体培地中ま
たは動物腹腔内（例えば、マウスなど哺乳類を使用）で
公知の方法により実施出来る。培養液および腹水液中の
抗体の精製についても公知の生化学的手法を組み合わせ
て実施出来る。例えば、細胞培養液あるいは腹水液を遠
心分離後、塩析（通常硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナ
トリウムを使用）し、得られた蛋白沈澱物を適当な溶液
に溶解し透析する。次いでカラムクロマトグラフィー
（イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、プロテインＡカ
ラム、プロテインＧカラム、ヒドロキシアパタイトカラ
ムなど）に供し、目的とする抗体を分離精製出来る。以
上のような分離精製操作により、例えば蛋白質として９
０％以上の純度のｍＡｂを、１Ｌの細胞培養上清から約
５−２０mg、２０mlの腹水液からは約２０−１００mg得
られる。

【００１０】以上のようにして得られたｍＡｂはタンパ
ク質として均一であり、蛋白分解酵素処理などにより、
Ｃ５ａＲに対する結合能を保持したままＦ（ａｂ'）₂や
Ｆａｂ断片などを調製でき、これらは本発明のｍＡｂ全
ＩｇＧ分子と同様の目的に用いられるものであり、本発
明でいう「抗ヒトＣ５ａＲモノクローナル抗体」に含ま
れる。またこれらのハイブリドーマがマウスＩｇＧｍＡ
ｂを産生する場合には、該抗Ｃ５ａＲｍＡｂの抗原認識
部位をふくむ可変領域あるいは超可変領域をコードする
ＤＮＡを取得し、これに遺伝子操作技術（Z. Steplewsk
i ら.、プロシーディングス オブ ナショナル アカ
デミー オブ サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sc
i.），第８５巻：４８５２頁、１９８８；L .Reichmann
ら.、ネイチヤー（Nature），第332巻：323頁、１９８
８）を用いてヒトＩｇＧの定常領域あるいは／および可
変領域フレームワークをコードする遺伝子を結合させ、
マウスーヒト・キメラ抗体あるいはヒト型化抗体を作成
する事もできる。

【００１１】上記により得られた本発明精製抗体は、放
射性同位元素、酵素、発光物質、蛍光色素等で常法に従
って標識化されて各種の免疫測定法に試薬として用いら
れる。放射性同位元素としては、たとえば¹²⁵Ｉ、
¹³¹Ｉ、³Ｈ、¹⁴Ｃなどが、酵素としては、安定で比活性
が大きなものが好ましく、例えば、(１)カルボヒドラー
ゼ〔例、グリコシダーゼ（例、β−ガラクトシダーゼ、
β−グリコシダーゼ、β−グルクロシダーゼ、β−フル
クトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダ
ーゼ、α−マンノシダーゼ、アミラーゼ（例、α−アミ
ラーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミ
ラーゼ、タカアミラーゼＡ）、セルラーゼ、リゾチー
ム）〕、(２)アミラーゼ（例、ウレアーゼ、アスパラギ
ナーゼ）、(３)エステラーゼ〔例、コリンエステラーゼ
（例、アセチルコリンエステラーゼ）、ホスファターゼ
（例、アルカリホスファターゼ）、スルファターゼ、リ
パーゼ〕、(４)ヌクレアーゼ（例、デオキシリボヌクレ
アーゼ、リボヌクレアーゼ）、(５)鉄・ポルフィリン酵
素（例、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、チトクローム
オキシターゼ）、(６)銅酵素（例、チロシナーゼ、アス
コルビン酸オキシターゼ）、(７)脱水素酵素（例、アル
コール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵
素、イソクエン酸脱水素酵素）などが、発光物質として
はルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシ
ゲニンなどがそれぞれ挙げられる。蛍光色素としては、
フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、フル
オレスカミン、フルオレッセンスイソチオシアネートな
どが挙げられる。上記の標識試薬のなかでも、蛍光試薬
がより好ましく用いられる。以下に細胞上に発現されて
いるヒトＣ５ａＲの本発明抗体を用いた免疫学的測定法
の操作について具体的に説明するが、これに限定される
ものでないことは言うまでもない。

【００１２】１）間接染色法 １０⁵−１０⁶個の細胞を遠心分離によって細胞ペレット
とし、これに０．０１％アジ化ナトリウムと１％ＢＳＡ
あるいは、１％ＦＣＳを含む適当な緩衝液で希釈したｍ
Ａｂを２０μｌ添加する。該抗体の濃度は１−１００μ
ｇ／ml、好ましくは、５−５０μｇ／mlである。緩衝液
はハンクスバランスドソルトソルーション（ＨＢＳＳ）
あるいは、ＲＰＭＩ １６４０などの培地等が用いられ
る。細胞のかわりに血小板を用いるときは、これらの緩
衝液に１０％の容量の日局クエン酸ナトリウムの３．８
％水溶液を加える。細胞と抗体との反応は、約０℃−３
０℃にて２０分〜１時間行う。反応終了後、反応液に抗
体希釈に用いた緩衝液を１ml加え遠心分離する。遠心上
清を取り除き、細胞ペレットに標識したＦ（ａｂ'）₂抗
マウスＩｇＧ抗体を適当に希釈して２０μｌ加える。該
標識抗体の濃度は、標識の強さあるいは、抗体価によっ
てことなるが、通常０．１−５０uｇ／mlで用いられ
る。同様の反応条件で２０分から１時間反応させた後緩
衝液を加えて洗浄する。標識抗体により標識された細胞
などは適当な解析装置を用いて測定すればよい。例え
ば、蛍光染色された細胞あるいは、血小板などはＦＡＣ
Ｓｔａｒなどの解析装置にて解析する。 ２）直接染色法 １）の方法の第１段階に反応させる抗Ｃ５ａＲ抗体を蛍
光色素などの標識剤で標識しておく方法であり、反応は
１段階のみである。希釈液、反応時間、などの条件は、
１）の方法と同じである。

【００１３】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するもの
でないことは言うまでもない。なお、実施例で得られた
ハイブリドーマＭＨ１／２０は、平成６年８月５日より
財団法人発酵生物研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ
５０４４３として、また、平成６年８月２３日より通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）
に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７８４として寄託され
ている。 実施例１ マウス抗Ｃ５ａＲｍＡｂ産生ハイブリドー
マの作製 (１)免疫 Ｃ５ａＲＮ末端１−２０番目の配列（ＮＨ₂−ＭＮＳＦ
ＮＹＴＴＰＤＹＧＨＹＤＤＫＤＴＬ−ＣＯＯＨ）〔配列
番号１〕をもつポリペプチドをキャリヤー蛋白ＫＬＨに
コンジュゲートしたＫＬＨ−Ｃ５ａＲ_1-20をフロイント
完全アジュバントと等量混ぜ合わせて乳化しＢＡＬＢ／
ｃマウスの腹腔内に１回５μｇ、３週間の間隔をおいて
５回免疫した。なお初回以外は、フロイントの不完全ア
ジュバントを用いた。各免疫後２週間目に採血し血中の
抗体価を、ＢＳＡ−Ｃ５ａＲ_1-20（Ｃ５ａＲＮ末端１−
２０番目のポリペプチドをキャリヤー蛋白ＢＳＡにコン
ジュゲートしたもの）を抗原としたＥＬＩＳＡで測定し
た。すなわちＢＳＡ−Ｃ５ａＲ_1-20を２０μｇ／ml、各
ウエル５０μｌずつコートし、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ
でブロックした。そこへ、希釈した免疫マウス血清を５
０μｌずつ加え、３７℃で１時間反応させた。ウエルを
０．０１％ Tween ２０を含むＰＢＳでよく洗った後、
西洋ワサビパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗
体を添加し１時間反応させた。洗浄後、酵素基質として
ｏ−フェニレンジアミンおよびＨ₂Ｏ₂を含む０．１Ｍク
エン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を加えて室温で酵素反応を
実施した。１Ｎ硫酸で反応を停止後、４９０nmの吸光度
を測定した。５回目の免疫で抗体価が最高値を示した個
体について、さらにＫＬＨ−Ｃ５ａＲ_1-20溶液を静脈内
投与した。

【００１４】(２)細胞融合 最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０⁸個）。次いでマウス骨髄腫細
胞Ｐ３Ｕ１（２×１０⁷個）を添加し、ポリエチレング
リコールＰＥＧ６０００をもちいて融合した（ケーラー
とミルスタインネイチヤー（Nature）第256巻：495頁,
1975年)。融合終了後、細胞混液をヒポキサンチン、ア
ミノプテリン及びチミヂンを含む、いわゆるＨＡＴ培地
中に懸濁し１０日間培養した。以後は親細胞株の選択除
去が終了次第ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨ
Ｔ培地に変え培養を続けた。 (３)ハイブリドーマの選択およびクローニング 融合１０−２０日後にハイブリドーマの出現を認めたの
で、（１）で記述したＢＳＡ−Ｃ５ａＲ_1-20を抗原とす
るＥＬＩＳＡにより、ハイブリドーマ培養上清中の抗体
価を測定した。強い抗体活性を示したハイブリドーマに
ついては、限界希釈法によるクローニングを行った。こ
れらのハイブリドーマにつき末梢血から分離した好中球
への抗体結合をフローサイトメトリー解析で検定を行っ
た。すなわち好中球にハイブリドーマ培養上清を加え、
０℃３０分間反応させた。次いで、１回洗浄後、２次抗
体としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と反応さ
せた。３０分反応後ＦＡＣＳｔａｒ（ベクトンディキン
ソン社）に供した。ＭＨ１／２０抗体のみが好中球に結
合した。ＭＨ１／２０抗体は、ＩｇＧ１，κサブクラス
であることをサブクラス確認キットで決定した。 （４）ＭＨ１／２０抗体の精製 予め０．５ml鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウス
に、ハイブリドーマ細胞ＭＨ１／２０ ２×１０⁶個を
腹腔内投与した。約１０−１５日後に腹水を採取しプロ
テインＧを用いるアフィニティクロマトグラフィーによ
り常法通りＭＨ１／２０抗体を精製した。

【００１５】実施例２ Ｃ５ａ惹起好中球活性化阻止
試験 （１）Ｐ３９（＋）細胞の分化 Ｐ３９（＋）細胞は、骨髄腫患者の細胞より樹立された
ミエロイド細胞株Ｐ３９細胞から補体第３成分（Ｃ３）
を結合し凝集能をもつサブラインとして樹立された細胞
株である（Matsumoto, M. ら, ヨーロピアン ジャーナ
ル オブ イムノロジー（Eur. J. Immunol.）第21巻：
1787頁, 1991年）。この細胞は、ジブチリル cAMP)を添
加して培養すると細胞質内に顆粒をもち多型核化して好
中球様の細胞に分化する。分化の指標の１つとしてＣ５
ａＲの発現があり、分化した細胞にＣ５ａを添加すると
反応液中に顆粒を放出する。従って顆粒中の酵素の１つ
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼを定量する事に
よって分化の度合いを調べることができる。この原理を
用いＰ３９（＋）細胞の分化を観察した。その方法は次
のとおりである。分化した細胞を２回洗浄した後１０⁷
／ml ＨＢＳＳに調製し終濃度５μｇ／mlの Cytochalas
in Ｂで１５分間反応させた。この細胞懸濁液１００μ
ｌに希釈したＣ５ａ１００μｌを加え３７℃で１時間反
応させた。反応混液を１５００回転にて１０分間遠心し
上清１００μｌを９６穴プレートに移し、これに基質ｐ
−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ドを５０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中で１時
間反応し０．４Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０．５）を添
加して反応を停止、４０５nmで吸光度を測定した。この
結果は〔図１〕に示すとおりＰ３９（＋）細胞（●）
は、２日間で分化しその後は、急速に細胞死に到った。
なお、対照としてジブチルｃＡＭＰ非測定（□）および
Ｃ５ａ非添加（○）Ｐ３９（＋）細胞の酵素活性を同様
の方法で測定した。 （２） 抗体によるＣ５ａＲの機能阻害試験 上記実施例１−（１）で示したＰ３９（＋）細胞分化の
条件すなわち０．５ｍＭ ジブチリル−cAMP 中で２日
間分化させた細胞をもちいて０.１，０.３，１および３
ｎＭのＣ５ａ刺激による酵素の放出を同様の方法で測定
した。このときＭＨ１／２０抗体（２０μｇ／ml）が存
在しても放出される酵素の量には殆ど差は見られなかっ
た〔図２〕。なお、図中、□は抗体共存下の酵素量を○
は抗体非存在下（対照）の酵素量を示す。

【００１６】実施例３ Ｃ５ａ結合阻害活性試験 Ｃ５ａのＣ５ａＲへの結合は、¹²⁵Ｉ−Ｃ５ａを用い、
好中球、単球、あるいは、株化した細胞などへの結合を
３０分から１時間反応させ、未結合分を遠心分離で除い
た後、放射活性を測定することによって定量できる。こ
の結合を阻害する物質を探索する場合などは、多くのサ
ンプルを同時に定量する必要があるが、こういう場合に
は、細胞膜を調製し、¹²⁵Ｉ−Ｃ５ａの膜への結合を調
べる方法を用いることができる。 （１）膜画分の調製 分化Ｐ３９（＋）細胞をＨＢＳＳで洗浄し、０.２５Ｍ
ショ糖，０.０４Ｍ ＮaＣl，０.１Ｍ ＫＣl，０.００
５Ｍ ＭgＣl₂，０.０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６）にインヒビターカクテル｛１０μＭ ロイペプチ
ン, １０μＭ ペプスタチン，５０μＭ ０−フエナン
スロリン，１００ＫＩＵ アプロチニン，１００μＭ
p−アミジノフェニル−メタンスルホニル フルオリド
塩酸（p−ＡＰＭＳＦ）｝を加えたものに懸濁した。
テフロンホモゲナイザーに細胞懸濁液をいれて、氷上１
０−４０ストローク破砕を行う。顕微鏡で細胞膜が破砕
され、核膜は保持されているのを確認した。３０００回
転１０分間遠心し、核及び破砕されなかった細胞を除
き、上清に５mＭ ＥＤＴＡを加えて、１００,０００回
転２０分間遠心して得られた沈澱をＰＢＳに上記のイン
ヒビターカクテルと５mＭＥＤＴＡを加えた溶液に懸濁
し、これを膜画分として用いた。 （２）Ｃ５ａ結合試験 上記（１）で調製した膜画分１０⁶個細胞相当に¹²⁵Ｉ−
Ｃ５ａ（１０,０００cpm）を加え、氷上６０分間反応
後、グラスフィルター（Whatmann ＧＦ／Ｂ）上で吸引
濾過し３回洗浄した。フィルターにトラップされた放射
活性を測定した。この結合反応の特異性を示すため、放
射ラベルしていないコールドＣ５ａを量を変化させて反
応系に加えたところコールドＣ５ａの濃度依存性の結合
阻害がみられ、結合がレセプター／リガンド特異的に起
こっていることが示された〔図３〕。この反応系にモノ
クローナル抗体ＭＨ１／２０を加えた時、抗体濃度依存
的に¹²⁵Ｉ−Ｃ５ａ結合阻害がみられた〔図４〕。上記
実施例（２）において、ＭＨ１／２０がＣ５ａ惹起Ｐ３
９（＋）細胞の機能阻害はしないことと合わせ、Ｃ５ａ
ＲとＣ５ａの結合様式が２箇所以上であることを示して
いる。

【００１７】実施例４ フローサイトメトリー （１）多核白血球細胞 末梢血から分離した好中球、および分化Ｐ３９（＋）細
胞についてＭＨ１／２０抗体の結合をフローサイトメト
リー解析によって定量した。１０⁶個の細胞をＦＩＴＣ
標識したＭＨ１／２０抗体（２０μｇ／ml）と０．０１
％アジ化ナトリウム、１％ＦＣＳの存在下氷上で３０分
間反応させた。同緩衝液で１回洗浄しＦＡＣＳｔａｒに
供した。結果は、〔図５〕〜〔図７〕に示すとおり、好
中球〔図５〕Ｐ３９（＋）〔図６〕ともにほとんどすべ
ての細胞が強く染色されておりＣ５ａＲを大量に発現し
ていることが分かる。一方、未分化のＰ３９（＋）は、
全くＭＨ１／２０抗体を結合していなかった〔図７〕。
なお、図中点線は、ＭＨ１／２０抗体、直線は対照であ
るＯＫＴ３抗体との反応を示す。 （２）血小板および巨核芽球細胞ＭＥＧ０１ １．血小板の分離 血小板は、わずかな刺激で簡単に活性化され凝集してし
まうため、次のような方法で分離しできるだけ活性化を
抑えた。すなわち１０％容量のチトラール（日本薬局方
クエンサンナトリウムの３．８％水溶液）中へ静かに採
血し、ただちに３０００回転で遠心した。３０００回転
到達後５秒間で遠心を止め、上清を血小板濃縮血漿（Ｐ
ＲＰ）として用いた。ここで血小板を洗浄する必要のあ
るときは、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む Tyrode 緩衝液を用
い、９０００回転２秒間の遠心を行った。 ２．血小板へのＭＨ１／２０抗体の結合 血小板上には、Ｃ５ａＲが発現していても少数であると
予想できるので、（１）でもちいた直接染色法ではなく
間接染色法を用いて、コントロール抗体によるバックグ
ラウンドをより正確に比較した。すなわちＰＲＰ１００
μｌにＭＨ１／２０抗体あるいはコントロール抗体とし
てＴ細胞とのみ反応するＯＫＴ３抗体（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ８００１細胞培養上清より取得）を１０μｌ加え、氷
上３０分間反応させた。５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴｙｒ
ｏｄｅ緩衝液１mlを加えて、９０００回転到達後２秒間
遠心した。上清を除きペレットに２次抗体ＦＩＴＣ標識
ヤギ抗マウスＩｇＧを加えて、氷上３０分間反応させ
た。この反応混液に１％ＢＳＡと５ｍＭ ＥＤＴＡを含
むＰＢＳを１ml加えてＦＡＣＳｔａｒに供した。正常人
６名の血小板について調べた結果いずれも有意な抗体結
合は見られなかった。コントロールとして、血小板の表
面抗原マーカーであるＧIIｂ／IIIａに対する抗体（ニ
チレイ）を用いると強い結合がみられた〔図８〕。な
お、図中、破線は、ＧＰIIｂ／IIIａ、直線はＣ５のレ
セプター点線はＯＫＴ３抗原の発現を示す。 ３．巨核芽球細胞ＭＥＧ０１の分化とＭＨ１／２０抗体
の結合性 血小板の前駆細胞とされている巨核芽球細胞株ＭＥＧ０
１（ＩＦＯ ５０１５１）は、適当な刺激を与えると分
化して血小板様の粒子を放出するようになる。そこで、
ＭＥＧ０１に０．５ｍＭジブチリル ｃＡＭＰを添加し
て、経時的にＭＨ１／２０抗体の結合性を実施例４−
（１）と同じ方法で調べたところ、５日目をピークに抗
体結合が見られた。未分化のＭＥＧ０１にも抗体が結合
している細胞が見られた〔図９〕〜〔図１５〕。図中、
直線はＭＨ１／２０抗体、点線は対照であるＯＫＴ３抗
体による染色を示す。

【００１８】

【発明の効果】本発明抗体は、Ｃ５ａレセプターのリガ
ンドとの結合を阻害するが、リガンド結合により生じる
生物活性を中和しないことから、各種疾病における、Ｃ
５ａの働き、あるいはＣ５ａレセプターの発現の推移を
探るうえで、極めて有用であり、このことは現存の抗Ｃ
５ａ抗体を用いた系では結論が得られていなかった血小
板上のＣ５ａの存在の有無を本実施例において明瞭に確
認していることからも明らかである。

【００１９】

【配列表】配列番号(SEQ ID NO)：１ 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：２０ 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸 配列の種類（MOLECULE TYPE)：ペプチド 配列: Met Asn Ser Phe Asn Tyr Thr Thr Pro Asp Tyr Gly His Tyr Asp Asp 1 5 10 15 Lys Asp Tyr Leu 20

【図面の簡単な説明】

【図１】は、ミエロイド細胞Ｐ３９（＋）の分化を示
す。

【図２】は、抗体共存時の分化Ｐ３９（＋）細胞のＣ５
ａ刺激によるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダー
ゼ放出反応を示す。

【図３】コールドＣ５ａ添加による分化Ｐ３９（＋）細
胞膜画分に対する標識Ｃ５ａの結合阻害を示す。

【図４】ＭＨ１／２０抗体添加による分化Ｐ３９（＋）
細胞膜画分に対するＣ５ａの結合阻害を示す。

【図５】末梢血中より分離した多核白血球表面でのＣ５
ａＲの発現の解析。

【図６】分化Ｐ３９（＋）Ｄ細胞でのＣ５ａＲの発現の
解析。

【図７】未分化Ｐ３９（＋）細胞でのＣ５ａＲの発現の
解析。

【図８】ヒト正常血小板上でのＣ５ａＲの発現の解析。

【図９】巨核芽球細胞の分化に併うＣ５ａＲの発現の推
移。ジブチルｃＡＭＰ添加後（０日）

【図１０】巨核芽球細胞の分化に併うＣ５ａＲの発現の
推移。ジブチルｃＡＭＰ添加後（２日）

【図１１】巨核芽球細胞の分化に併うＣ５ａＲの発現の
推移。ジブチルｃＡＭＰ添加後（３日）

【図１２】巨核芽球細胞の分化に併うＣ５ａＲの発現の
推移。ジブチルｃＡＭＰ添加後（４日）

【図１３】巨核芽球細胞の分化に併うＣ５ａＲの発現の
推移。ジブチルｃＡＭＰ添加後（５日）

【図１４】巨核芽球細胞の分化に併うＣ５ａＲの発現の
推移。ジブチルｃＡＭＰ添加後（７日）

【図１５】巨核芽球細胞の分化に併うＣ５ａＲの発現の
推移。ジブチルｃＡＭＰ添加後（９日）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/577 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｃ５ａレセプターのリガンドとの結合を阻
   害するが、リガンド結合により生じる生物活性を中和し
   ない抗Ｃ５ａレセプターモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】認識部位がＣ５ａレセプターのＮ末端２０
   アミノ酸残基からなる領域に存する請求項１記載の抗
   体。
3. 【請求項３】モノクローナル抗体ＭＨ１／２０である請
   求項１記載の抗体。
4. 【請求項４】Ｃ５ａレセプターのリガンドとの結合を阻
   害するが、リガンド結合により生じる生物活性を中和し
   ない抗Ｃ５ａレセプターモノクローナル抗体を産生する
   ハイブリドーマ。
5. 【請求項５】Ｃ５ａレセプターのＮ末端２０アミノ酸残
   基からなるペプチド断片で免疫感作されたマウス脾臓細
   胞とマウス骨髄腫細胞とを融合してなる請求項４記載の
   ハイブリドーマ。
6. 【請求項６】請求項４記載のハイブリドーマを液体培地
   または動物腹腔内で培養し、培養上清または腹水より抗
   体を採取することを特徴とする請求項１記載の抗体の製
   造法。
7. 【請求項７】マウスハイブリドーマＭＨ１／２０である
   請求項４記載のハイブリドーマ。
8. 【請求項８】Ｃ５ａレセプターに請求項１記載の抗体を
   免疫学的に反応させることを特徴とするＣ５ａレセプタ
   ーの測定法。
9. 【請求項９】フローサイトメトリー法である請求項８記
   載の測定法。
10. 【請求項１０】請求項１記載の抗体を含有するＣ５ａレ
    セプター測定用試薬。