JPH0811073B2 - ヒルジンの遺伝子工学的製法 - Google Patents
ヒルジンの遺伝子工学的製法Info
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- JPH0811073B2 JPH0811073B2 JP60174404A JP17440485A JPH0811073B2 JP H0811073 B2 JPH0811073 B2 JP H0811073B2 JP 60174404 A JP60174404 A JP 60174404A JP 17440485 A JP17440485 A JP 17440485A JP H0811073 B2 JPH0811073 B2 JP H0811073B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ヒルジンは薬用ヒル（Hirudo medicinalis）から得ら
れるポリペプチドであつて、このものは特異的なアンチ
トロンビン活性を示しそして抗凝血物質として用いられ
る。
れるポリペプチドであつて、このものは特異的なアンチ
トロンビン活性を示しそして抗凝血物質として用いられ
る。
今、一般式Ｉ （式中 ｍ＝０、１または３であり、 ＸはMet、Arg、Ser-Arg-MetまたはSer-Arg-Argを表わ
し、 ＡはIleまたは直接結合であり、 ＢはThrまたは直接結合であり、 ＣはThrであり、 ＤはThrまたは直接結合であり、 ＥはThrまたはIleであり、 ＦはGlyであり、 ＧはGluまたは直接結合であり、 ＨはGluまたはProであり、そして 式中場合により６個のCys残基のうちのそれぞれ２個が
ジスルフイツド橋により結合しているものとする）を有
するポリペプチドが、式Ｉのポリペプチドまたはその部
分配列をコードする遺伝子を発現プラスミド中に挿入す
るならば遺伝子工学的にも製造しうることが見出され
た。このものは以下に「ヒルジン」としても表示され
る。
し、 ＡはIleまたは直接結合であり、 ＢはThrまたは直接結合であり、 ＣはThrであり、 ＤはThrまたは直接結合であり、 ＥはThrまたはIleであり、 ＦはGlyであり、 ＧはGluまたは直接結合であり、 ＨはGluまたはProであり、そして 式中場合により６個のCys残基のうちのそれぞれ２個が
ジスルフイツド橋により結合しているものとする）を有
するポリペプチドが、式Ｉのポリペプチドまたはその部
分配列をコードする遺伝子を発現プラスミド中に挿入す
るならば遺伝子工学的にも製造しうることが見出され
た。このものは以下に「ヒルジン」としても表示され
る。
必要な遺伝子は知られた方法により化学的に合成し、
そこからゲノムを単離しそしてプロセシングするかまた
は誘導された細胞から知られた方法によりmRNAを単離し
そしてそこからcDNAを取得しうる。
そこからゲノムを単離しそしてプロセシングするかまた
は誘導された細胞から知られた方法によりmRNAを単離し
そしてそこからcDNAを取得しうる。
cDNAを介する経路およびなかんずく特にホスハイト法
による化学的合成が好ましい。さらに、式Ｉ（式中ｍは
１であり、ＸはMetまたはArgであり、ＢはThrまたは直
接結合であり、ＣはThrでありそしてＧはGluを表わす）
を有するポリペプチドをコードする遺伝子の合成が好ま
しい。本発明のもう一つの好ましい実施形態はＤおよび
ＥがThrであり、ＦがGlyでありそしてＧおよびＨがGlu
である場合はH-（Ｘ）m-A-B-C-はH-Val-Val-を表わさな
い式Ｉのポリペプチドに関する。
による化学的合成が好ましい。さらに、式Ｉ（式中ｍは
１であり、ＸはMetまたはArgであり、ＢはThrまたは直
接結合であり、ＣはThrでありそしてＧはGluを表わす）
を有するポリペプチドをコードする遺伝子の合成が好ま
しい。本発明のもう一つの好ましい実施形態はＤおよび
ＥがThrであり、ＦがGlyでありそしてＧおよびＨがGlu
である場合はH-（Ｘ）m-A-B-C-はH-Val-Val-を表わさな
い式Ｉのポリペプチドに関する。
特に好ましいのはｍが１であり、ＸがMetまたはArgで
あり、ＡおよびＢが直接結合であり、Ｃ、ＤおよびＥが
Thrであり、ＦがGlyであり、ＧおよびＨがGluである式
Ｉのポリペプチドの合成である。これに好ましいDNA配
列Ｉは最初に示されておりそして以下に本発明を説明す
るのに使用される。
あり、ＡおよびＢが直接結合であり、Ｃ、ＤおよびＥが
Thrであり、ＦがGlyであり、ＧおよびＨがGluである式
Ｉのポリペプチドの合成である。これに好ましいDNA配
列Ｉは最初に示されておりそして以下に本発明を説明す
るのに使用される。
遺伝コードは知られているようにデイジエネレイト
（degenerate）している、すなわち２種のアミノ酸に対
してのみそれぞれ１種のヌクレオチド配列がコードさ
れ、一方残る18種の遺伝的にコードされうるアミノ酸に
は２〜６種のヌクレオチドトリプレツトが割当てられ
る。しかしながらこれにより生ずる変異可能性を異なる
種の宿主細胞が常に同じに利用するわけではない。従つ
て遺伝子の合成には莫大な多様なコドンの組み合せによ
る多様性が存在する。
（degenerate）している、すなわち２種のアミノ酸に対
してのみそれぞれ１種のヌクレオチド配列がコードさ
れ、一方残る18種の遺伝的にコードされうるアミノ酸に
は２〜６種のヌクレオチドトリプレツトが割当てられ
る。しかしながらこれにより生ずる変異可能性を異なる
種の宿主細胞が常に同じに利用するわけではない。従つ
て遺伝子の合成には莫大な多様なコドンの組み合せによ
る多様性が存在する。
今、全アミノ酸配列をコードするDNA配列Ｉ、ならび
に配列Ｉの合成に利用されるDNA部分配列IIAおよびIIB
がヒルジンの特に好ましい形態の遺伝子工学的合成にと
つて特別に好都合であることが見出された。DNA配列Ｉ
のコードする鎖の５′−末端には制限エンドヌクレアー
ゼXbaIに対応する「張り出した」DNA配列が存在し、こ
れに対しコードする鎖の３′−末端には制限酵素SalIに
対応する一本鎖の張り出した配列が存在する。これらの
２種類の異なる認識配列により所望の方向におけるDNA
のプラスミド中への挿入が保証される（同じ認識配列を
選択しそして適当な制限分析またはDNA配列分析または
発現によりプラスミドDNAを特性化したのち適当な選択
をとり行なうことも可能である）。
に配列Ｉの合成に利用されるDNA部分配列IIAおよびIIB
がヒルジンの特に好ましい形態の遺伝子工学的合成にと
つて特別に好都合であることが見出された。DNA配列Ｉ
のコードする鎖の５′−末端には制限エンドヌクレアー
ゼXbaIに対応する「張り出した」DNA配列が存在し、こ
れに対しコードする鎖の３′−末端には制限酵素SalIに
対応する一本鎖の張り出した配列が存在する。これらの
２種類の異なる認識配列により所望の方向におけるDNA
のプラスミド中への挿入が保証される（同じ認識配列を
選択しそして適当な制限分析またはDNA配列分析または
発現によりプラスミドDNAを特性化したのち適当な選択
をとり行なうことも可能である）。
これら認識配列とアミノ酸配列に対するコドンとの間
にはコードする鎖の５′−末端にアミノ酸メチオニンに
対するコドンが存在する（これはDNA配列Ｉにおいて数
字０で示される）。これは代りに細菌性のまたはそれ以
外の宿主固有の蛋白質のプレ配列（シグナル配列または
リーダー配列とも呼ばれる）で置きかえることができ
〔概説論文：パールマン（Perlman）およびハルボーソ
ン（Halvorson）氏の「ジャーナル・オブ・モレキユラ
ー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）」第167巻第391頁（1
983年）参照〕、このものは細胞質から所望のポリペプ
チドの分泌をもたらしそしてこの排出過程において宿主
細胞中に天然に存在するシグナルペプチダーゼにより分
解される。次にコードする鎖の末端にグルタミンをコー
ドする三塩基連鎖に続き１個の停止コドンまたは好まし
くは、DNA配列Ｉに示されるように、２個の停止三塩基
連鎖が来る。これら停止コドンと張り出したSalI末端と
の間には制限酵素SstIに相当するヌクレオチド配列がDN
A配列Ｉ中に付加的に挿入される。
にはコードする鎖の５′−末端にアミノ酸メチオニンに
対するコドンが存在する（これはDNA配列Ｉにおいて数
字０で示される）。これは代りに細菌性のまたはそれ以
外の宿主固有の蛋白質のプレ配列（シグナル配列または
リーダー配列とも呼ばれる）で置きかえることができ
〔概説論文：パールマン（Perlman）およびハルボーソ
ン（Halvorson）氏の「ジャーナル・オブ・モレキユラ
ー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）」第167巻第391頁（1
983年）参照〕、このものは細胞質から所望のポリペプ
チドの分泌をもたらしそしてこの排出過程において宿主
細胞中に天然に存在するシグナルペプチダーゼにより分
解される。次にコードする鎖の末端にグルタミンをコー
ドする三塩基連鎖に続き１個の停止コドンまたは好まし
くは、DNA配列Ｉに示されるように、２個の停止三塩基
連鎖が来る。これら停止コドンと張り出したSalI末端と
の間には制限酵素SstIに相当するヌクレオチド配列がDN
A配列Ｉ中に付加的に挿入される。
制限酵素BamHIに対する内部の独特の切断部位（コド
ン30/31）により、例えばpBR322、pUC8またはpUC12のよ
うな良く研究されたクローニングベクター中に挿入され
うる２種類の遺伝子断片HIR-IおよびHIR-II（DNA配列II
参照）のサブクローニングが可能である。これに加え一
方ではヒルジンの部分配列への接近を生じそして他方で
は修飾を許容する制限酵素に対する一連の他の独特の認
識配列が遺伝子内部に挿入された（第１表参照）。
ン30/31）により、例えばpBR322、pUC8またはpUC12のよ
うな良く研究されたクローニングベクター中に挿入され
うる２種類の遺伝子断片HIR-IおよびHIR-II（DNA配列II
参照）のサブクローニングが可能である。これに加え一
方ではヒルジンの部分配列への接近を生じそして他方で
は修飾を許容する制限酵素に対する一連の他の独特の認
識配列が遺伝子内部に挿入された（第１表参照）。
DNA配列Ｉは、25〜35個の長さのヌクレオチドを有す
る14個のオリゴヌクレオチドから（DNA配列II参照）、
これらをはじめに化学的に合成しそして次に４〜６個の
ヌクレオチドのステイツキーエンド（sticky end）を介
して酵素的に結合させることにより合成されうる。
る14個のオリゴヌクレオチドから（DNA配列II参照）、
これらをはじめに化学的に合成しそして次に４〜６個の
ヌクレオチドのステイツキーエンド（sticky end）を介
して酵素的に結合させることにより合成されうる。
DNA配列Ｉにおいては、数個のコドンが割当てられる
アミノ酸ではこれらコドンは等価でなくむしろ大腸菌の
ようなそれぞれの宿主において異なる優先性を示すこと
も顧慮された。さらにパリンドローム配列も最小限度に
減少された。
アミノ酸ではこれらコドンは等価でなくむしろ大腸菌の
ようなそれぞれの宿主において異なる優先性を示すこと
も顧慮された。さらにパリンドローム配列も最小限度に
減少された。
従つてDNA配列Ｉの遺伝子構造は比較的小さな構成単
位から容易に得ることができ、２種類の遺伝子断片の良
く知られたベクター中におけるサブクローニングが可能
となりそしてそれらを組み合せて総遺伝子ならびに場合
によりその修飾物となしうる。
位から容易に得ることができ、２種類の遺伝子断片の良
く知られたベクター中におけるサブクローニングが可能
となりそしてそれらを組み合せて総遺伝子ならびに場合
によりその修飾物となしうる。
クローニングベクター中への合成遺伝子の挿入のあと
に、ヒルジンのアミノ酸配列を有する所望のペプチドが
直接（DNA配列IC）またはβ−ガラクトシダーゼまたは
その部分配列のような細菌性蛋白質との融合蛋白質の形
態で発現される。
に、ヒルジンのアミノ酸配列を有する所望のペプチドが
直接（DNA配列IC）またはβ−ガラクトシダーゼまたは
その部分配列のような細菌性蛋白質との融合蛋白質の形
態で発現される。
次にかかる融合蛋白質は知られた方法で化学的にまた
は酵素的に分解される。例えば配列ＩのＯ−位にアミノ
酸メチオニンが存在する場合（DNA配列IA）は、ブロム
シアンを用いる分解を遂行でき、この位置にアミノ酸ア
ルギニンが存在する場合（DNA配列IB）は、トリプシン
を用いる酵素的分解が遂行されうる。
は酵素的に分解される。例えば配列ＩのＯ−位にアミノ
酸メチオニンが存在する場合（DNA配列IA）は、ブロム
シアンを用いる分解を遂行でき、この位置にアミノ酸ア
ルギニンが存在する場合（DNA配列IB）は、トリプシン
を用いる酵素的分解が遂行されうる。
アミノ酸配列の好ましい修飾物を第２表に示す。ここ
でｍおよびｎは０である。
でｍおよびｎは０である。
これら修飾はDNA平面上の合成遺伝子の組成に従い適
当な制限酵素切断部位を用い、適当な遺伝子断片をドウ
ノボ（de novo）合成されたDNA配列と交換することによ
り容易に実現されうる。
当な制限酵素切断部位を用い、適当な遺伝子断片をドウ
ノボ（de novo）合成されたDNA配列と交換することによ
り容易に実現されうる。
アミノ酸配列の修飾例としては、ｍが１であり、Ｘお
よびＣがValを表わし、ＡおよびＢが直接結合を表わ
し、ＤおよびＥがThrであり、ＦがGlyであり、Ｇおよび
ＨがGluでありそしてｎが０である式Ｉの（知られた）
ポリペプチドがあげられよう。この修飾はDNA平面上制
限酵素AccIに対応する切断部位を介して実現されうる。
よびＣがValを表わし、ＡおよびＢが直接結合を表わ
し、ＤおよびＥがThrであり、ＦがGlyであり、Ｇおよび
ＨがGluでありそしてｎが０である式Ｉの（知られた）
ポリペプチドがあげられよう。この修飾はDNA平面上制
限酵素AccIに対応する切断部位を介して実現されうる。
合成遺伝子または遺伝子断片のクローニングベクター
例えば商業上入手しうるプラスミドpUC8、pUC12およびp
BR322またはptac11およびpKK177.3のような他の一般的
に入手しうるプラスミド中への挿入はそれ自体知られた
方法で遂行される。さらに、化学的に合成された遺伝子
は、その蛋白質の発現を可能にする適当な化学的に合成
された調節領域を予め備えることもできる。それにはマ
ニアテイス（Maniatis）氏の教本〔マニアテイス氏他の
「モレキユラー・クローニング（Molecular Clonin
g）」、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring
Harbor）、1982年〕が参照されうる。かくして得られ
たハイブリツドプラスミドの適当な宿主細菌好ましくは
大腸菌中への形質転換も同様にそれ自体知られておりそ
して前記した教本中に詳細に記載されている。発現され
た蛋白質の取得およびそれらの精製はそれ自体知られた
方法で遂行されうる。
例えば商業上入手しうるプラスミドpUC8、pUC12およびp
BR322またはptac11およびpKK177.3のような他の一般的
に入手しうるプラスミド中への挿入はそれ自体知られた
方法で遂行される。さらに、化学的に合成された遺伝子
は、その蛋白質の発現を可能にする適当な化学的に合成
された調節領域を予め備えることもできる。それにはマ
ニアテイス（Maniatis）氏の教本〔マニアテイス氏他の
「モレキユラー・クローニング（Molecular Clonin
g）」、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring
Harbor）、1982年〕が参照されうる。かくして得られ
たハイブリツドプラスミドの適当な宿主細菌好ましくは
大腸菌中への形質転換も同様にそれ自体知られておりそ
して前記した教本中に詳細に記載されている。発現され
た蛋白質の取得およびそれらの精製はそれ自体知られた
方法で遂行されうる。
本発明により得られた遺伝子断片HIR-IおよびHIR-I
I、それらを用いて得られたハイブリツドプラスミドお
よび形質転換された宿主細菌は新規でありそして本発明
はそれらに関するものである。同じことはDNA配列Ｉか
ら変化された新規なDNA配列にもあてはまる。本発明の
他の態様は特許請求の範囲に記載されている。
I、それらを用いて得られたハイブリツドプラスミドお
よび形質転換された宿主細菌は新規でありそして本発明
はそれらに関するものである。同じことはDNA配列Ｉか
ら変化された新規なDNA配列にもあてはまる。本発明の
他の態様は特許請求の範囲に記載されている。
本発明のいくつかの態様を以下の実施例において詳細
に説明する。これらから多数の可能な変形および組み合
せが当業者には明らかであろう。百分率の記載は別に断
わりなければ重量によるものとする。
に説明する。これらから多数の可能な変形および組み合
せが当業者には明らかであろう。百分率の記載は別に断
わりなければ重量によるものとする。
実施例 （１）１本鎖オリゴヌクレオチドの化学合成 コードする鎖のヌクレオチド１〜32を包含する遺伝子
構成単位Iaの例を用いて遺伝子構成単位の合成について
説明する。知られた方法〔エム・ジエー・ゲイト（M.J.
Gait）氏他の「ヌクレイツク・アシツズ・レス（Nuclei
c Acids Res.）」第８巻第1081〜1096頁（1980年）参
照〕により３′−末端に存在するヌクレオチド、すなわ
ちこの場合チミジン（ヌクレオチド番号32）をシリカゲ
ル〔フラクトシル（FRACTOSIL） 、メルク（Merck）社
製品〕に３′−ヒドロキシ官能基を介して共有結合させ
る。これにははじめにシリカゲルを３−（トリエトキシ
シリル）−プロピルアミンと反応させてエタノールを脱
離させるとSi-O-Si結合が生成する。チミジンは３′−
Ｏ−スクシノイル−５′−ジメトキシトリチルエーテル
としてパラニトロフエノールおよびN,N′−ジシクロヘ
キシルカルボジイミドの存在下に修飾された担体と反応
させると、スクシノイル基の遊離のカルボキシ基がプロ
ピルアミノ基のアミノ基をアシル化する。
構成単位Iaの例を用いて遺伝子構成単位の合成について
説明する。知られた方法〔エム・ジエー・ゲイト（M.J.
Gait）氏他の「ヌクレイツク・アシツズ・レス（Nuclei
c Acids Res.）」第８巻第1081〜1096頁（1980年）参
照〕により３′−末端に存在するヌクレオチド、すなわ
ちこの場合チミジン（ヌクレオチド番号32）をシリカゲ
ル〔フラクトシル（FRACTOSIL） 、メルク（Merck）社
製品〕に３′−ヒドロキシ官能基を介して共有結合させ
る。これにははじめにシリカゲルを３−（トリエトキシ
シリル）−プロピルアミンと反応させてエタノールを脱
離させるとSi-O-Si結合が生成する。チミジンは３′−
Ｏ−スクシノイル−５′−ジメトキシトリチルエーテル
としてパラニトロフエノールおよびN,N′−ジシクロヘ
キシルカルボジイミドの存在下に修飾された担体と反応
させると、スクシノイル基の遊離のカルボキシ基がプロ
ピルアミノ基のアミノ基をアシル化する。
以下の合成段階においては塩基成分は５′−Ｏ−ジメ
トキシトリチル−ヌクレオシド−３′−亜燐酸モノメチ
ルエステル−ジアルキルアミドまたは−クロリドとして
用いられ、その際アデニンはN6−ベンゾイル化合物とし
て、シトシンはN4−ベンゾイル化合物として、グアニン
はN2−イソブチリル化合物としてそして何らアミノ基を
含有しないチミンは保護基なしで存在する。
トキシトリチル−ヌクレオシド−３′−亜燐酸モノメチ
ルエステル−ジアルキルアミドまたは−クロリドとして
用いられ、その際アデニンはN6−ベンゾイル化合物とし
て、シトシンはN4−ベンゾイル化合物として、グアニン
はN2−イソブチリル化合物としてそして何らアミノ基を
含有しないチミンは保護基なしで存在する。
結合されたチミジン２μモルを含有する重合体状担体
50mgを下記の試薬で遂次的に処理する。
50mgを下記の試薬で遂次的に処理する。
ａ）ニトロメタン、 ｂ）水１％を含有するニトロメタン中の飽和臭化亜鉛溶
液、 ｃ）メタノール、 ｄ）テトラヒドロフラン、 ｅ）アセトニトリル、 ｆ）無水アセトニトリル0.5ml中の適当なヌクレオシド
亜燐酸エステル40μモルおよびテトラゾール200μモル
（５分間）、 ｇ）ルチジン40％およびジメチルアミノピリジン10％を
含有するテトラヒドロフラン中の20％無水酢酸（２分
間）、 ｈ）テトラヒドロフラン、 ｉ）水20％およびルチジン40％を含有するテトラヒドロ
フラン、 ｊ）コリジン／水／テトラヒドロフラン（容量比5:4:
1）混合物中の３％沃素、 ｋ）テトラヒドロフラン、および ｌ）メタノール。
液、 ｃ）メタノール、 ｄ）テトラヒドロフラン、 ｅ）アセトニトリル、 ｆ）無水アセトニトリル0.5ml中の適当なヌクレオシド
亜燐酸エステル40μモルおよびテトラゾール200μモル
（５分間）、 ｇ）ルチジン40％およびジメチルアミノピリジン10％を
含有するテトラヒドロフラン中の20％無水酢酸（２分
間）、 ｈ）テトラヒドロフラン、 ｉ）水20％およびルチジン40％を含有するテトラヒドロ
フラン、 ｊ）コリジン／水／テトラヒドロフラン（容量比5:4:
1）混合物中の３％沃素、 ｋ）テトラヒドロフラン、および ｌ）メタノール。
「亜燐酸エステル」なる用語はここではデオキシリボ
ース−３′−モノ亜燐酸−モノメチルエステルであるこ
とが理解されるべきで、その際第三番目の原子価は塩素
によりまたは三級アミノ基例えばモルホリノ基により飽
和されている。それぞれの合成段階の収率は脱トリチル
化反応ｂ）後にジメトキシトリチル陽イオンの吸収を波
長496nmで計測することにより分光測光的に測定されう
る。
ース−３′−モノ亜燐酸−モノメチルエステルであるこ
とが理解されるべきで、その際第三番目の原子価は塩素
によりまたは三級アミノ基例えばモルホリノ基により飽
和されている。それぞれの合成段階の収率は脱トリチル
化反応ｂ）後にジメトキシトリチル陽イオンの吸収を波
長496nmで計測することにより分光測光的に測定されう
る。
オリゴヌクレオチドの合成完了後オリゴマーのメチル
ホスヘート保護基をｐ−チオクレゾールおよびトリエチ
ルアミンを用いて除去する。
ホスヘート保護基をｐ−チオクレゾールおよびトリエチ
ルアミンを用いて除去する。
次にアンモニアで３時間処理することによりオリゴヌ
クレオチドを固相担体から分離する。このオリゴマーを
濃アンモニアで２〜３日間処理すると塩基のアミノ保護
基が定量的に除去される。かくして得られた粗生成物を
高圧液体クロマトグラフイー（以下HPLCと略記する）ま
たはポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する。
クレオチドを固相担体から分離する。このオリゴマーを
濃アンモニアで２〜３日間処理すると塩基のアミノ保護
基が定量的に除去される。かくして得られた粗生成物を
高圧液体クロマトグラフイー（以下HPLCと略記する）ま
たはポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する。
それらのヌクレオチド配列がDNA配列IIに由来する残
りの遺伝子構成単位Ib〜IIhも全く同様に合成される。
りの遺伝子構成単位Ib〜IIhも全く同様に合成される。
（２）１本鎖オリゴヌクレオチドの遺伝子断片HIR-Iお
よびHIR-IIへの酵素的連結 オリゴヌクレオチドを５′−末端でホスホリル化する
にはオリゴヌクレオチドIb〜Ieの1nモルずつを50ミリモ
ルトリス−HCl緩衝液（pH7.6）20μｌ、塩化マグネシウ
ム10mMおよびジチオトレイトール（以下DTTと略記す
る）10mM中で5nモルのアデノシン三燐酸（ATP）および
４単位のT4−ポリヌクレオチドキナーゼと37℃で30分間
処理した。この酵素を95℃に５分間加熱することにより
不活性化した。DNA配列IIAおよびIIBにおいて「張り出
した」配列を形成するオリゴヌクレオチドIa、If、IIa
およびIIhはホスホリル化されない。このことは後続す
る連結においてDNA配列IIAまたはIIBに相当するより大
きいサブ断片の形成を阻止する。
よびHIR-IIへの酵素的連結 オリゴヌクレオチドを５′−末端でホスホリル化する
にはオリゴヌクレオチドIb〜Ieの1nモルずつを50ミリモ
ルトリス−HCl緩衝液（pH7.6）20μｌ、塩化マグネシウ
ム10mMおよびジチオトレイトール（以下DTTと略記す
る）10mM中で5nモルのアデノシン三燐酸（ATP）および
４単位のT4−ポリヌクレオチドキナーゼと37℃で30分間
処理した。この酵素を95℃に５分間加熱することにより
不活性化した。DNA配列IIAおよびIIBにおいて「張り出
した」配列を形成するオリゴヌクレオチドIa、If、IIa
およびIIhはホスホリル化されない。このことは後続す
る連結においてDNA配列IIAまたはIIBに相当するより大
きいサブ断片の形成を阻止する。
オリゴヌクレオチドIa〜Ifを以下のようにして連結さ
せてサブ断片HIR-Iとなす。すなわちオリゴヌクレオチ
ドIaおよびIfならびにIb、Ic、IdおよびIeの５′−燐酸
エステル１ミリモルずつをトリス−HCl（pH7.6）50ミリ
モル、塩化マグネシウム20ミリモル、塩化カリウム25ミ
リモルおよびDTT10ミリモルを含有する緩衝液45μｌ中
に一緒に溶解させる。DNA配列IIA記載のオリゴヌクレオ
チドの「アニーリング」にはオリゴヌクレオチドの溶液
を95℃に２分間加熱しそして次にゆつくりと（２〜３時
間）20℃迄冷却する。次に酵素的に結合させるには0.1M
DTT2μｌ、2.5mMアデノシン三燐酸（pH7）８μｌなら
びにT4-DNA-リガーゼ５μｌ（2000単位）を加えそして2
2℃で16時間インキユベーシヨンする。
せてサブ断片HIR-Iとなす。すなわちオリゴヌクレオチ
ドIaおよびIfならびにIb、Ic、IdおよびIeの５′−燐酸
エステル１ミリモルずつをトリス−HCl（pH7.6）50ミリ
モル、塩化マグネシウム20ミリモル、塩化カリウム25ミ
リモルおよびDTT10ミリモルを含有する緩衝液45μｌ中
に一緒に溶解させる。DNA配列IIA記載のオリゴヌクレオ
チドの「アニーリング」にはオリゴヌクレオチドの溶液
を95℃に２分間加熱しそして次にゆつくりと（２〜３時
間）20℃迄冷却する。次に酵素的に結合させるには0.1M
DTT2μｌ、2.5mMアデノシン三燐酸（pH7）８μｌなら
びにT4-DNA-リガーゼ５μｌ（2000単位）を加えそして2
2℃で16時間インキユベーシヨンする。
同様にしてオリゴヌクレオチドIIb〜IIgをホスホリル
化しそして次にオリゴヌクレオチドIIaおよびIIhと連結
させてサブ断片HIR-IIとなす。
化しそして次にオリゴヌクレオチドIIaおよびIIhと連結
させてサブ断片HIR-IIとなす。
遺伝子断片HIR-IおよびHIR-IIは10％ポリアクリルア
ミドゲル（尿素添加せず、20×40cm、厚さ1mm）上のゲ
ル電気泳動により精製され、その際マーカー物質として
はHinfIで切断されたφX174DNA（BRL社製品）またはHae
IIIで切断されたpBR322が用いられる。
ミドゲル（尿素添加せず、20×40cm、厚さ1mm）上のゲ
ル電気泳動により精製され、その際マーカー物質として
はHinfIで切断されたφX174DNA（BRL社製品）またはHae
IIIで切断されたpBR322が用いられる。
（３）遺伝子断片HIR-IおよびHIR-IIを含有するハイブ
リツドプラスミドの調製 ａ）遺伝子断片HIR-IのpUC12中への挿入 商業上入手しうるプラスミドpUC12を知られた方法で
制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびBamHIを用い製造者
の指示に従い開環させる。消化混合物を５％ポリアクリ
ルアミドゲル上知られた方法で電気泳動することにより
分離しそして断片をエチジウムブロマイドで染色するか
または放射性標識づけ（「マニアテイス氏による「ニツ
クトランスレーシヨン」前出引用文献参照）により視認
可能となす。続いてプラスミドバンドをアクリルアミド
ゲルから切断しそして電気泳動によりポリアクリルアミ
ドから分離する。消化混合物の分離は２％低融点アガロ
ースゲル上にても（実施例5a記載のように）行われう
る。
リツドプラスミドの調製 ａ）遺伝子断片HIR-IのpUC12中への挿入 商業上入手しうるプラスミドpUC12を知られた方法で
制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびBamHIを用い製造者
の指示に従い開環させる。消化混合物を５％ポリアクリ
ルアミドゲル上知られた方法で電気泳動することにより
分離しそして断片をエチジウムブロマイドで染色するか
または放射性標識づけ（「マニアテイス氏による「ニツ
クトランスレーシヨン」前出引用文献参照）により視認
可能となす。続いてプラスミドバンドをアクリルアミド
ゲルから切断しそして電気泳動によりポリアクリルアミ
ドから分離する。消化混合物の分離は２％低融点アガロ
ースゲル上にても（実施例5a記載のように）行われう
る。
次にプラスミド１μｇを、実施例２に記載されたよう
にして予めホスホリル化された遺伝子断片HIR-I10ngと1
6℃で一夜連結させる。第１図に示されるハイブリツド
プラスミドが得られる。
にして予めホスホリル化された遺伝子断片HIR-I10ngと1
6℃で一夜連結させる。第１図に示されるハイブリツド
プラスミドが得られる。
ｂ）遺伝子断片HIR-IIのpUC8中への挿入 ａ）項と同様にして商業上入手しうるプラスミドpUC8
をBamHIおよびSalIで切断しそして予め実施例２に記載
されたようにしてホスホリル化された遺伝子断片HIR-II
と連結させる。第２図に示されるハイブリツドプラスミ
ドが得られる。
をBamHIおよびSalIで切断しそして予め実施例２に記載
されたようにしてホスホリル化された遺伝子断片HIR-II
と連結させる。第２図に示されるハイブリツドプラスミ
ドが得られる。
（４）完全なる遺伝子の合成およびプラスミド中への挿
入 ａ）形質転換および増殖 かくして得られたハイブリツドプラスミドを大腸菌中
に形質転換させる。これには大腸菌K12菌株を70mM塩化
カルシウム溶液で処理することによりコンピテントとな
しそして塩化カルシウムが70mMである10mMのトリス−HC
l緩衝液（pH7.5）中のハイブリツドプラスミドの懸濁液
を加えた。形質転換された菌株を常法によりそのプラス
ミドによりもたらされる抗生物質抵抗性または感受性を
利用して選択しそしてハイブリツドベクターを増殖させ
る。細胞を殺したのちハイブリツドプラスミドを単離
し、初めに用いられた制限酵素を用いて開環させそして
遺伝子断片HIR-IおよびHIR-IIを電気泳動により単離す
る。
入 ａ）形質転換および増殖 かくして得られたハイブリツドプラスミドを大腸菌中
に形質転換させる。これには大腸菌K12菌株を70mM塩化
カルシウム溶液で処理することによりコンピテントとな
しそして塩化カルシウムが70mMである10mMのトリス−HC
l緩衝液（pH7.5）中のハイブリツドプラスミドの懸濁液
を加えた。形質転換された菌株を常法によりそのプラス
ミドによりもたらされる抗生物質抵抗性または感受性を
利用して選択しそしてハイブリツドベクターを増殖させ
る。細胞を殺したのちハイブリツドプラスミドを単離
し、初めに用いられた制限酵素を用いて開環させそして
遺伝子断片HIR-IおよびHIR-IIを電気泳動により単離す
る。
ｂ）遺伝子断片の連結 増殖により得られるサブ断片HIR-IおよびHIR-IIを実
施例２に記載されるようにして酵素的に連結し（60℃で
のアニーリング）そしてかくして得られたDNA配列Ｉを
有する合成遺伝子をクローニングベクターpUC12中に挿
入する。第３図に示されるハイブリツドプラスミドが得
られる。
施例２に記載されるようにして酵素的に連結し（60℃で
のアニーリング）そしてかくして得られたDNA配列Ｉを
有する合成遺伝子をクローニングベクターpUC12中に挿
入する。第３図に示されるハイブリツドプラスミドが得
られる。
ｃ）〔Val1,Val2〕−ヒルジンに対する遺伝子の調製 第３図に示されるプラスミドから実施例5aに記載され
るようにしてAccI-SalI−断片（ヌクレオチド13-212）
が得られ、次にこれを予めXbaIおよびSalIで開環させた
プラスミドpUC12中に下記アダプター を用いて連結させうる。
るようにしてAccI-SalI−断片（ヌクレオチド13-212）
が得られ、次にこれを予めXbaIおよびSalIで開環させた
プラスミドpUC12中に下記アダプター を用いて連結させうる。
ｄ）第２表の修飾物ａ）に対する遺伝子の調製 この目的には下記DNA配列が合成される。
この配列は第３図記載のプラスミドから制限酵素SmaI
およびAccIで開環されたDNA中にSmaI-AccI−アダプター
として挿入されうる。
およびAccIで開環されたDNA中にSmaI-AccI−アダプター
として挿入されうる。
ｅ）第２表の修飾物ｂ）に対する遺伝子の調製 はじめに下記DNA配列を合成する。
このACA−トリプレツトのところで短縮されたDNA配列
をｄ）項記載のようにして挿入する。
をｄ）項記載のようにして挿入する。
ｆ）第２表の修飾物ｃ）に対する遺伝子の調製 第２表の前記ｅ）項に記載されているような（修飾物
ｂ）DNA配列から出発する。AccIおよびSalIで分解後２
種類の断片を得、これを単離する。AccI-SalI（ヒルジ
ン）−断片を酵素HinfIを用いて切断しそして得られる
断片のより大きい方を単離する。この断片、AccI-SalI
で開環された残余プラスミド−DNAおよび合成DNA配列 を同じ容器中で連結させる。得られるハイブリツドプラ
スミドは第２表の修飾物ｃ）をコードする。
ｂ）DNA配列から出発する。AccIおよびSalIで分解後２
種類の断片を得、これを単離する。AccI-SalI（ヒルジ
ン）−断片を酵素HinfIを用いて切断しそして得られる
断片のより大きい方を単離する。この断片、AccI-SalI
で開環された残余プラスミド−DNAおよび合成DNA配列 を同じ容器中で連結させる。得られるハイブリツドプラ
スミドは第２表の修飾物ｃ）をコードする。
ｇ）第２表の修飾物ｄ）に対する遺伝子の調製 同様にAccIおよびSalIで切断された前記ｅ）項に記載
されるような（すなわち第２表の修飾物ｂ）をコードす
るDNA配列から出発する。しかしこのAccI-SalI−（ヒル
ジン）断片はTaqIおよびDdeIと反応させそして切り出さ
れた断片を合成DNA配列 と置換する。かかる修飾されたAccI-SalI−（ヒルジ
ン）−断片をここで残余プラスミド−DNAと連結させ
る。得られるプラスミドは第２表の修飾物ｄ）をコード
する。
されるような（すなわち第２表の修飾物ｂ）をコードす
るDNA配列から出発する。しかしこのAccI-SalI−（ヒル
ジン）断片はTaqIおよびDdeIと反応させそして切り出さ
れた断片を合成DNA配列 と置換する。かかる修飾されたAccI-SalI−（ヒルジ
ン）−断片をここで残余プラスミド−DNAと連結させ
る。得られるプラスミドは第２表の修飾物ｄ）をコード
する。
ｈ）第２表の修飾物ｇ）に対する遺伝子の調製 第２図に示されるハイブリツドプラスミドからBam HI
-SalI−（ヒルジン）−断片を単離しそしてKpnIを用い
て切断する。生成した２種類の断片のうち大きい方を単
離しそして合成DNA配列 と連結させる。この連結生成物をここで第１図記載のプ
ラスミド−DNAから単離されたXbaI-Bam HI−（ヒルジ
ン）−断片と連結させそして4b）項記載のようにしてpU
C12中に挿入する。第２表の修飾物ｇ）をコードするハ
イブリツドプラスミドが得られる。
-SalI−（ヒルジン）−断片を単離しそしてKpnIを用い
て切断する。生成した２種類の断片のうち大きい方を単
離しそして合成DNA配列 と連結させる。この連結生成物をここで第１図記載のプ
ラスミド−DNAから単離されたXbaI-Bam HI−（ヒルジ
ン）−断片と連結させそして4b）項記載のようにしてpU
C12中に挿入する。第２表の修飾物ｇ）をコードするハ
イブリツドプラスミドが得られる。
ｉ）第２表の修飾物ｆ）に対する遺伝子の調製 第２表の修飾物ｇ）をコードするDNAから、XbaI-SalI
−（ヒルジン）−断片を単離しそしてHinfIと反応させ
る。生成した２種類の断片のうちの大きい方を合成DNA
配列 と連結させそして連結生成物をXbaIおよびSalIで開環さ
れたプラスミドpUC12中に挿入する。このハイブリツド
プラスミドは第２表の修飾物ｆ）をコードする。
−（ヒルジン）−断片を単離しそしてHinfIと反応させ
る。生成した２種類の断片のうちの大きい方を合成DNA
配列 と連結させそして連結生成物をXbaIおよびSalIで開環さ
れたプラスミドpUC12中に挿入する。このハイブリツド
プラスミドは第２表の修飾物ｆ）をコードする。
ｊ）他の修飾物の調製 他のありうる修飾物の例として以下に記載する。
第２表の修飾物ｃ）およびｄ）をコードするDNA配列
はDNA配列ＩのBamHI認識部位に相当する97bp位置を含有
する。この切断点を利用して２種類の修飾物の前記した
AccI-BamHI部分配列およびBamHI-SalI部分配列が相互に
連結されうる。
はDNA配列ＩのBamHI認識部位に相当する97bp位置を含有
する。この切断点を利用して２種類の修飾物の前記した
AccI-BamHI部分配列およびBamHI-SalI部分配列が相互に
連結されうる。
これらの修飾物すべてはDNA配列Ｉについて記載され
ているのと同様に、大腸菌中に形質転換されそして発現
されうる。
ているのと同様に、大腸菌中に形質転換されそして発現
されうる。
（５）DNA配列IA、IBおよびIC発現のためのハイブリツ
ドプラスミドの構成 ａ）pKK177.3中へのDNA配列ICの挿入（直接発現） 発現プラスミドpKK177.3〔EcoRI認識部位中にSalI切
断部位を含有する配列が合成的に挿入されたプラスミド
ptac11（アンマン（Amman）氏他、「ジーン（Gene）」
第25巻第167頁（1983年）参照）〕を制限酵素EcoRIおよ
びSalIを用いて開環させる。第３図記載のプラスミドか
らDNA配列ICを次のようにして取得する。すなわちこの
プラスミドを初めに制限酵素SalIそして次に酵素AccIを
用いて切断しそして次に２％低融点アガロースゲル上の
ゲル電気泳動し、プラスミドバンドから（製造者の尺度
記載に従い）、高められた温度でゲルを溶解させてDNA
を取得することにより小さなAccI-SalI−断片を分離す
る。このDNA断片を下記アダプター を用いて反応させてDNA配列ICとなしうる。
ドプラスミドの構成 ａ）pKK177.3中へのDNA配列ICの挿入（直接発現） 発現プラスミドpKK177.3〔EcoRI認識部位中にSalI切
断部位を含有する配列が合成的に挿入されたプラスミド
ptac11（アンマン（Amman）氏他、「ジーン（Gene）」
第25巻第167頁（1983年）参照）〕を制限酵素EcoRIおよ
びSalIを用いて開環させる。第３図記載のプラスミドか
らDNA配列ICを次のようにして取得する。すなわちこの
プラスミドを初めに制限酵素SalIそして次に酵素AccIを
用いて切断しそして次に２％低融点アガロースゲル上の
ゲル電気泳動し、プラスミドバンドから（製造者の尺度
記載に従い）、高められた温度でゲルを溶解させてDNA
を取得することにより小さなAccI-SalI−断片を分離す
る。このDNA断片を下記アダプター を用いて反応させてDNA配列ICとなしうる。
開環されたプラスミドpKK177.3を遺伝子ICと連結させ
ることにより、発現領域または調節領域が挿入の上流に
位置するハイブリツドプラスミドが生成される。イソプ
ロピル−β−チオガラクトピラノシド（IPTG）のような
適当な誘導物質を添加した後にmRNAが形成されそしてこ
れがDNA配列ICに対応するメチオニルポリペプチドの発
現を生ずる。
ることにより、発現領域または調節領域が挿入の上流に
位置するハイブリツドプラスミドが生成される。イソプ
ロピル−β−チオガラクトピラノシド（IPTG）のような
適当な誘導物質を添加した後にmRNAが形成されそしてこ
れがDNA配列ICに対応するメチオニルポリペプチドの発
現を生ずる。
ｂ）発現プラスミドpCK-5196中へのヒルジン遺伝子IAお
よびIBの挿入（融合構成） 発現プラスミドpCK-5196（第４図参照）はそれ自体知
られたプラスミドpBR322の「高コピー数」誘導体である
プラスミドpAT153の誘導体〔トウイツグ（Twigg）およ
びシエラト（Sherrat）〕である。このものはtetR−遺
伝子（pBR322のHindIII）およびampR−遺伝子（pBR322
中の3231−位にあるAhaIII）のターミネーターの間に挿
入された、ヌクレオシド番号1554（アミノ酸番号518:Tr
pに相当）までの知られたβ−ガラクトシダーゼの配列
を有する知られたLac UV5−プロモーターを含有してい
る。このベクターのもう一つの特徴は、β−ガラクトシ
ダーゼ配列とターミネーター配列の間に挿入された、知
られたプラスミドpUC13に由来するポリリンカー配列で
ある。lac UV5−プロモーターの転写はtetR−遺伝子に
逆らつて進行する。
よびIBの挿入（融合構成） 発現プラスミドpCK-5196（第４図参照）はそれ自体知
られたプラスミドpBR322の「高コピー数」誘導体である
プラスミドpAT153の誘導体〔トウイツグ（Twigg）およ
びシエラト（Sherrat）〕である。このものはtetR−遺
伝子（pBR322のHindIII）およびampR−遺伝子（pBR322
中の3231−位にあるAhaIII）のターミネーターの間に挿
入された、ヌクレオシド番号1554（アミノ酸番号518:Tr
pに相当）までの知られたβ−ガラクトシダーゼの配列
を有する知られたLac UV5−プロモーターを含有してい
る。このベクターのもう一つの特徴は、β−ガラクトシ
ダーゼ配列とターミネーター配列の間に挿入された、知
られたプラスミドpUC13に由来するポリリンカー配列で
ある。lac UV5−プロモーターの転写はtetR−遺伝子に
逆らつて進行する。
このプラスミドはβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸番
号518に真核性遺伝子に対するクローニング位置として
役立つプラスミドpUC13からのポリリンカー部分XbaI-Ba
m HI-SmaI-SatIを含有する。このプラスミドpCK-5196を
制限酵素XbaIおよびSstIで開環させそして第３図に示さ
れるプラスミドからXbaI-SstI消化により単離されうるD
NA配列IAと連結させる。UV5−調節領域のうしろにβ−
ガラクトシダーゼの最初の518個のアミノ酸に対するコ
ドンをそしてそれに続いてSer-Arg-Met−（ヒルジン１
〜64）に対するコドンを含有する第５図に示されるハイ
ブリツドプラスミドが得られる。
号518に真核性遺伝子に対するクローニング位置として
役立つプラスミドpUC13からのポリリンカー部分XbaI-Ba
m HI-SmaI-SatIを含有する。このプラスミドpCK-5196を
制限酵素XbaIおよびSstIで開環させそして第３図に示さ
れるプラスミドからXbaI-SstI消化により単離されうるD
NA配列IAと連結させる。UV5−調節領域のうしろにβ−
ガラクトシダーゼの最初の518個のアミノ酸に対するコ
ドンをそしてそれに続いてSer-Arg-Met−（ヒルジン１
〜64）に対するコドンを含有する第５図に示されるハイ
ブリツドプラスミドが得られる。
同様の方法でアミノ酸番号１（スレオニン）に対する
コドンの前にアミノ酸アルギニンに対するコドンが存在
する、プラスミドpCK-5196中にDNA配列IBが挿入された
第６図に示されるハイブリツドプラスミドが得られう
る。DNA配列IBは第３図に示されるプラスミドから、こ
れを制限酵素SstIおよびAccIで切断しそして下記アダプ
ター と連結させることにより得られる。
コドンの前にアミノ酸アルギニンに対するコドンが存在
する、プラスミドpCK-5196中にDNA配列IBが挿入された
第６図に示されるハイブリツドプラスミドが得られう
る。DNA配列IBは第３図に示されるプラスミドから、こ
れを制限酵素SstIおよびAccIで切断しそして下記アダプ
ター と連結させることにより得られる。
（ｂ）ハイブリツドプラスミドの形質転換 コンピテントな大腸菌細胞を配列ＩまたはIA、IBまた
はICを含有するハイブリツドプラスミド0.1〜１μｇを
用いて形質転換しそしてtac−プラスミドの場合はアン
ピシリン含有寒天プレート上に、そしてpCK-5196ハイブ
リツドプラスミドの場合はテトラサイクリンを含有する
寒天プレート上に塗布する。続いて正しく組み込まれた
ヒルジン配列を相当するプラスミド中に含有するクロー
ンをDNA迅速処理により同定する（マニアテイス氏の方
法、前記参照）。
はICを含有するハイブリツドプラスミド0.1〜１μｇを
用いて形質転換しそしてtac−プラスミドの場合はアン
ピシリン含有寒天プレート上に、そしてpCK-5196ハイブ
リツドプラスミドの場合はテトラサイクリンを含有する
寒天プレート上に塗布する。続いて正しく組み込まれた
ヒルジン配列を相当するプラスミド中に含有するクロー
ンをDNA迅速処理により同定する（マニアテイス氏の方
法、前記参照）。
（７）ヒルジン活性を有するポリペプチドの発現 大腸菌中への前記tac−ハイブリツドプラスミドの形
質転換後に、ヒルジン−アミノ酸配列の他にアミノ末端
にさらに付加的にプロムシアン分解により除去されうる
メチオニル基を担持するポリペプチドが発現される。こ
れに対し大腸菌を第５図または第６図記載のハイブリツ
ドプラスミドで形質転換すると配列Ser-Arg-MetまたはS
er-Arg-Argを介して相互に架橋されたβ−ガラクトシダ
ーゼの518個のアミノ酸とヒルジンとからなる融合蛋白
質が得られる。これら融合蛋白質はブロムシアンまたは
トリプシンで分解されてヒルジンおよびβ−ガラクトシ
ダーゼ断片を生成しうる。
質転換後に、ヒルジン−アミノ酸配列の他にアミノ末端
にさらに付加的にプロムシアン分解により除去されうる
メチオニル基を担持するポリペプチドが発現される。こ
れに対し大腸菌を第５図または第６図記載のハイブリツ
ドプラスミドで形質転換すると配列Ser-Arg-MetまたはS
er-Arg-Argを介して相互に架橋されたβ−ガラクトシダ
ーゼの518個のアミノ酸とヒルジンとからなる融合蛋白
質が得られる。これら融合蛋白質はブロムシアンまたは
トリプシンで分解されてヒルジンおよびβ−ガラクトシ
ダーゼ断片を生成しうる。
（９）後処理および精製 所望の光学濃度となるまで培養した細菌菌株を適当な
誘導物質、例えば、IPTGと充分な時間例えば２時間培養
する。続いて細胞を0.1％クレゾールおよび0.1ミリモル
のベンジルスルホニルフルオライドを用いて殺す。
誘導物質、例えば、IPTGと充分な時間例えば２時間培養
する。続いて細胞を0.1％クレゾールおよび0.1ミリモル
のベンジルスルホニルフルオライドを用いて殺す。
遠心分離または過したのち細胞塊を緩衝溶液（50mM
トリスおよび50mM EDTA、pH7.5）中にとりそして例えば
フレンチプレス（French-Press）またはダイノ（DYNO）
ミル（ウイリー・バホーフアー（Willy Bachofer）社
製品、バーゼル）を用いて機械的に粉砕し、次に不溶の
成分を遠心分離除去する。上澄み液からヒルジンを含有
する蛋白質を慣用の方法により精製する。イオン交換カ
ラム、吸着カラムまたはゲル過カラムでのクロマトグ
ラフイー、またはトロンビンカラムまたは抗体カラムで
のアフイニテイクロマトグラフイーが適当である。ドデ
シル硫酸ナトリウム−アクリルアミドゲルによる分析ま
たはHPLC分析により生成物の濃度および純度が検査され
る。β−ガラクトシダーゼ部分を有する融合蛋白質は溶
解された細菌の粗抽出物中においてすでにβ−ガラクト
シダーゼ（１〜518）とは異なるそれらの展開挙動に基
づき検出されうる。遺伝子工学的に産生されたヒルジン
の特性化は水蛭から単離された真正物質との比較による
かまたはヒルジンの血液凝固阻止性質に基づく試験によ
り遂行される。
トリスおよび50mM EDTA、pH7.5）中にとりそして例えば
フレンチプレス（French-Press）またはダイノ（DYNO）
ミル（ウイリー・バホーフアー（Willy Bachofer）社
製品、バーゼル）を用いて機械的に粉砕し、次に不溶の
成分を遠心分離除去する。上澄み液からヒルジンを含有
する蛋白質を慣用の方法により精製する。イオン交換カ
ラム、吸着カラムまたはゲル過カラムでのクロマトグ
ラフイー、またはトロンビンカラムまたは抗体カラムで
のアフイニテイクロマトグラフイーが適当である。ドデ
シル硫酸ナトリウム−アクリルアミドゲルによる分析ま
たはHPLC分析により生成物の濃度および純度が検査され
る。β−ガラクトシダーゼ部分を有する融合蛋白質は溶
解された細菌の粗抽出物中においてすでにβ−ガラクト
シダーゼ（１〜518）とは異なるそれらの展開挙動に基
づき検出されうる。遺伝子工学的に産生されたヒルジン
の特性化は水蛭から単離された真正物質との比較による
かまたはヒルジンの血液凝固阻止性質に基づく試験によ
り遂行される。
第１図はpUC12中への遺伝子断片HIR-Iの挿入を示す。 第２図はpUC8中への遺伝子断片HIR-IIの挿入を示す。 第３図はpUC12中へのDNA配列Ｉの挿入を示す。 第４図はプラスミドpCK5196の構造を示す図である。 第５図は第３図に示されるプラスミドから切り出された
DNA配列IA（XbaI-SstI断片）のプラスミドpCK-5196中へ
の挿入により得られるハイブリツドプラスミドの構造を
示す図である。 第６図はプラスミドpCK5196中にDNA配列IBが挿入された
ハイブリツドプラスミドの構造を示す図である。
DNA配列IA（XbaI-SstI断片）のプラスミドpCK-5196中へ
の挿入により得られるハイブリツドプラスミドの構造を
示す図である。 第６図はプラスミドpCK5196中にDNA配列IBが挿入された
ハイブリツドプラスミドの構造を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 パウル・ハーベルマン ドイツ連邦共和国デー‐6230フランクフル ト・アム・マイン80．ハイムヘンヴエーク 80 (72)発明者 オイゲーン・ウールマン アメリカ合衆国マサチユーセツツ州 （02178）ベルモント．ワシントンストリ ート287 (72)発明者 フリードリヒ・ヴエンゲンマイアー ドイツ連邦共和国デー‐6238ホフハイム・ アム・タウヌス．アム・ザイエンバツハ38 (56)参考文献 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ 165〔1984. ４〕ｐ．180−183 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ 164〔1983〕 ｐ．307−313
Claims (8)
- 【請求項１】一般式Ｉ （式中 ｍ＝０、１または３であり、 ＸはMet、Arg、Ser-Arg-MetまたはSer-Arg-Argを表わ
し、 ＡはIleまたは直接結合であり、 ＢはThrまたは直接結合であり、 ＣはThrであり、 ＤはThrまたは直接結合であり、 ＥはThrまたはIleであり、 ＦはGlyであり、 ＧはGluまたは直接結合であり、そして ＨはGluまたはProである） を有するヒルジン活性を有するポリペプチドを製造する
に当り、式Ｉを有するポリペプチドをコードする遺伝子
を発現プラスミド中に挿入し、該プラスミドを宿主細菌
に形質転換し、該細菌を培養し、生成した所望のポリペ
プチドを培養物中から採取することからなる方法。 - 【請求項２】挿入された遺伝子のコードしない鎖が式Ｉ
のポリペプチドをコードする遺伝子のコードする鎖とハ
イブリダイズしていることからなる前記特許請求の範囲
第１項記載の方法。 - 【請求項３】その遺伝子が化学的に、またはmRNAを介し
て酵素的に合成されることからなる前記特許請求の範囲
第１または２項記載の方法。 - 【請求項４】化学的合成がホスハイト法であることから
なる前記特許請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項５】その遺伝子がカルボキシ末端アミノ酸につ
いてのコドンの下流に２個の停止コドンを含有すること
からなる前記特許請求の範囲第１項ないし第４項のいず
れかの項に記載された方法。 - 【請求項６】その遺伝子が下記のDNA配列Ｉに相当する
ことからなる前記特許請求の範囲第１項ないし第６項の
いずれかの項に記載の方法。 - 【請求項７】一般式Ｉ （式中 ｍ＝０、１または３であり、 ＸはMet、Arg、Ser-Arg-MetまたはSer-Arg-Argを表わ
し、 ＡはIleまたは直接結合であり、 ＢはThrまたは直接結合であり、 ＣはThrであり、 ＤはThrまたは直接結合であり、 ＥはThrまたはIleであり、 ＦはGlyであり、 ＧはGluまたは直接結合であり、そして ＨはGluまたはProである） を有するヒルジン活性を有するポリペプチドを含有する
融合ペプチド。 - 【請求項８】細菌性部分がβ−ガラクトシダーゼのアミ
ノ酸配列を含有することからなる前記特許請求の範囲第
７項記載の融合ペプチド。
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