JPH08112100A - 染色体診断方法 - Google Patents
染色体診断方法Info
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- JPH08112100A JPH08112100A JP25091694A JP25091694A JPH08112100A JP H08112100 A JPH08112100 A JP H08112100A JP 25091694 A JP25091694 A JP 25091694A JP 25091694 A JP25091694 A JP 25091694A JP H08112100 A JPH08112100 A JP H08112100A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒト細胞から単離した微小染色体対をレーザ
ー染色体切断法により微細断片化し、これらの断片化し
たＤＮＡを配列番号１記載のオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとするポリメラーゼ連鎖反応法ＳＵＰ−ＰＣＲに
よって増幅し、この増幅されたＤＮＡ断片の集合をプロ
ーブとして上記ヒト細胞の染色体および／または遺伝的
に正常なヒト細胞染色体を蛍光 in situハイブリダイゼ
イションすることにより、上記の微小染色体対が由来す
る染色体位置を同定する。 【効果】 染色体異常の一つである微小染色体対が、染
色体のどの部位に由来するものであるかを簡単かつ高精
度に知ることができる。これによって、微小染色体の存
在がどのような遺伝性疾患をもたらす危険性があるかを
出生以前に診断することが可能となり、出生の前後にお
ける対策および治療手段を選択する際の重要な情報が提
供される。
ー染色体切断法により微細断片化し、これらの断片化し
たＤＮＡを配列番号１記載のオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとするポリメラーゼ連鎖反応法ＳＵＰ−ＰＣＲに
よって増幅し、この増幅されたＤＮＡ断片の集合をプロ
ーブとして上記ヒト細胞の染色体および／または遺伝的
に正常なヒト細胞染色体を蛍光 in situハイブリダイゼ
イションすることにより、上記の微小染色体対が由来す
る染色体位置を同定する。 【効果】 染色体異常の一つである微小染色体対が、染
色体のどの部位に由来するものであるかを簡単かつ高精
度に知ることができる。これによって、微小染色体の存
在がどのような遺伝性疾患をもたらす危険性があるかを
出生以前に診断することが可能となり、出生の前後にお
ける対策および治療手段を選択する際の重要な情報が提
供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、染色体診断方法に関
するものである。さらに詳しくは、この発明は、遺伝性
疾患に対してハイリスクなヒト細胞に存在する余分な微
小染色体対が細胞染色体のどの位置に由来するものであ
るかを同定することによって、種々の遺伝性疾患の原因
となる染色体異常を診断する新しい方法に関するもので
ある。
するものである。さらに詳しくは、この発明は、遺伝性
疾患に対してハイリスクなヒト細胞に存在する余分な微
小染色体対が細胞染色体のどの位置に由来するものであ
るかを同定することによって、種々の遺伝性疾患の原因
となる染色体異常を診断する新しい方法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術とその課題】近年の医学・分子生物学の進
歩に伴い、ほとんど全ての疾患に遺伝的要因が関与する
ことが示唆されている。そのため、遺伝子または染色体
のレベルで疾患を理解することの重要性が高まってお
り、その診断においても遺伝子および染色体を直接対象
とする必要性が強く指摘されている。
歩に伴い、ほとんど全ての疾患に遺伝的要因が関与する
ことが示唆されている。そのため、遺伝子または染色体
のレベルで疾患を理解することの重要性が高まってお
り、その診断においても遺伝子および染色体を直接対象
とする必要性が強く指摘されている。
【０００３】従来、遺伝性疾患の原因と考えられる染色
体異常については、標準的な細胞遺伝学的方法の幾つか
を組み合わせることによって診断がなされてきた。しか
しながら、発生初期の染色体再編成によって生じる余分
な微小染色体対（double mi-nutes ）は従来の細胞遺伝
学的な方法では診断が不可能であり、疾患と染色体異常
との関係を完全に理解するうえでの障害となっていた。
体異常については、標準的な細胞遺伝学的方法の幾つか
を組み合わせることによって診断がなされてきた。しか
しながら、発生初期の染色体再編成によって生じる余分
な微小染色体対（double mi-nutes ）は従来の細胞遺伝
学的な方法では診断が不可能であり、疾患と染色体異常
との関係を完全に理解するうえでの障害となっていた。
【０００４】この微小染色体対は、ヒトおよび動物の腫
瘍細胞に存在することが知られ（Wahl: Cancer Res., 4
9, p1333-1340, 1989)、しかもヒトの急性骨髄性白血病
細胞株から単離した微小染色体対は、癌遺伝子 c-mycが
存在する染色体部位（8q24.1-q24.2）にその起源を有す
ることも明らかになっている（Sen et al,: Genomics,
19, p542-551, 1994）。さらに、この微小染色体対は癌
をはじめとする遺伝性疾患に対してハイリスクなヒト細
胞においても存在が報告されている（例えば、Madhavi
et al.:Cancer Genet.Cytogenet., 83, p83-90, 1990;
Buckton and Evans:In Hsu TC(ed)Cytogenetic assay
for environmental mutagens, Allnheld, Osmun, p183-
202, 1982; Nichols:Annu.Rev.Microbiol., 24, p479-
500, 1970; Speevak et al.:Karyogram, 15, p51-53, 1
089)。
瘍細胞に存在することが知られ（Wahl: Cancer Res., 4
9, p1333-1340, 1989)、しかもヒトの急性骨髄性白血病
細胞株から単離した微小染色体対は、癌遺伝子 c-mycが
存在する染色体部位（8q24.1-q24.2）にその起源を有す
ることも明らかになっている（Sen et al,: Genomics,
19, p542-551, 1994）。さらに、この微小染色体対は癌
をはじめとする遺伝性疾患に対してハイリスクなヒト細
胞においても存在が報告されている（例えば、Madhavi
et al.:Cancer Genet.Cytogenet., 83, p83-90, 1990;
Buckton and Evans:In Hsu TC(ed)Cytogenetic assay
for environmental mutagens, Allnheld, Osmun, p183-
202, 1982; Nichols:Annu.Rev.Microbiol., 24, p479-
500, 1970; Speevak et al.:Karyogram, 15, p51-53, 1
089)。
【０００５】このように、微小染色体対の存在は染色体
異常の一つの表現型と考えられることから、それらが細
胞染色体のどの部位に起源を有するものであるかを知る
ことができれば、染色体特定部位の異常と疾患との関係
を理解するための、あるいは遺伝性疾患の危険性を出生
以前に診断するための有効な手段になると考えられる。
しかしながら、上記のとおり、従来の標準的な方法では
この微小染色体対が染色体のどの部位に由来するかを同
定することは不可能であった。
異常の一つの表現型と考えられることから、それらが細
胞染色体のどの部位に起源を有するものであるかを知る
ことができれば、染色体特定部位の異常と疾患との関係
を理解するための、あるいは遺伝性疾患の危険性を出生
以前に診断するための有効な手段になると考えられる。
しかしながら、上記のとおり、従来の標準的な方法では
この微小染色体対が染色体のどの部位に由来するかを同
定することは不可能であった。
【０００６】一方、最近になって、染色体を部位特異的
に標識するプローブが作成され（Trautman et al,:Hum.
Genet., 87, p495-497, 1990）、このプローブを用いた
方法によって起源未知の染色体部分を特定化することが
可能になっている（Meltzeret al.:Nature Genetics,
1, p24-28, 1992; Ohta et al.:Hum.Genet., 92, p1-5,
1993; Vierbach et al.:Hum.Genet, 93, p663-667, 19
94）。すなわち、この方法は、患者の異常染色体部位を
微細断片化し、この断片化した染色体ＤＮＡをポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、これらの増幅さ
れたＤＮＡ断片をプローブとして患者および遺伝的に正
常なヒト細胞から単離した染色体に対して蛍光 in situ
ハイブリダイゼイション（fluoresence in situ hybrid
ization:ＦＩＳＨ）を行い、異常染色体部位が染色体の
どの領域に由来するかを診断するというものである。
に標識するプローブが作成され（Trautman et al,:Hum.
Genet., 87, p495-497, 1990）、このプローブを用いた
方法によって起源未知の染色体部分を特定化することが
可能になっている（Meltzeret al.:Nature Genetics,
1, p24-28, 1992; Ohta et al.:Hum.Genet., 92, p1-5,
1993; Vierbach et al.:Hum.Genet, 93, p663-667, 19
94）。すなわち、この方法は、患者の異常染色体部位を
微細断片化し、この断片化した染色体ＤＮＡをポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、これらの増幅さ
れたＤＮＡ断片をプローブとして患者および遺伝的に正
常なヒト細胞から単離した染色体に対して蛍光 in situ
ハイブリダイゼイション（fluoresence in situ hybrid
ization:ＦＩＳＨ）を行い、異常染色体部位が染色体の
どの領域に由来するかを診断するというものである。
【０００７】しかしながら、この微細断片化／ＰＣＲ増
幅プローブを用いるＦＩＳＨ診断方法を微小染色体対に
適用することは以下の理由により困難であった。すなわ
ち、染色体に比べて遙に小型の微小染色体対は、通常の
方法ではそれを単離して微細断片化することが困難であ
る。また、このように断片化した微小染色体対はその塩
基配列が未知であるため、一部既知配列をプライマーと
する一般的なＰＣＲ法が適用できない。しかも、その断
片は極めて微量なため一度ベクターにクローニングして
その配列を確認することも不可能である。
幅プローブを用いるＦＩＳＨ診断方法を微小染色体対に
適用することは以下の理由により困難であった。すなわ
ち、染色体に比べて遙に小型の微小染色体対は、通常の
方法ではそれを単離して微細断片化することが困難であ
る。また、このように断片化した微小染色体対はその塩
基配列が未知であるため、一部既知配列をプライマーと
する一般的なＰＣＲ法が適用できない。しかも、その断
片は極めて微量なため一度ベクターにクローニングして
その配列を確認することも不可能である。
【０００８】このような理由から、ＰＣＲ増幅プローブ
を用いるＦＩＳＨ診断法も、微小染色体対の起源を同定
するには不適切であると考えられてきた。この発明は、
以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来
の方法では不可能であった微小染色体対の起源を正確に
同定することによって、どのような遺伝性疾患の危険性
があるかを出生以前に診断することのできる新しい方法
を提供することを目的としている。
を用いるＦＩＳＨ診断法も、微小染色体対の起源を同定
するには不適切であると考えられてきた。この発明は、
以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来
の方法では不可能であった微小染色体対の起源を正確に
同定することによって、どのような遺伝性疾患の危険性
があるかを出生以前に診断することのできる新しい方法
を提供することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、ヒト細胞から単離した微小染色
体対をレーザー染色体切断法により微細断片化し、これ
らの断片化したＤＮＡを配列番号１記載のオリゴヌクレ
オチドをプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応法ＳＵ
Ｐ−ＰＣＲによって増幅し、この増幅されたＤＮＡ断片
の集合をプローブとして上記ヒト細胞の染色体および／
または遺伝的に正常なヒト細胞染色体を蛍光 in situハ
イブリダイゼイションすることにより、上記の微小染色
体対が由来する染色体位置を同定することを特徴とする
染色体診断方法を提供する。
を解決するものとして、ヒト細胞から単離した微小染色
体対をレーザー染色体切断法により微細断片化し、これ
らの断片化したＤＮＡを配列番号１記載のオリゴヌクレ
オチドをプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応法ＳＵ
Ｐ−ＰＣＲによって増幅し、この増幅されたＤＮＡ断片
の集合をプローブとして上記ヒト細胞の染色体および／
または遺伝的に正常なヒト細胞染色体を蛍光 in situハ
イブリダイゼイションすることにより、上記の微小染色
体対が由来する染色体位置を同定することを特徴とする
染色体診断方法を提供する。
【００１０】またこの発明の染色体診断方法において
は、上記微小染色体対を、妊婦の羊水細胞培養から単離
することを好ましい態様としてもいる。以下、この発明
の方法についてさらに詳しく説明する。この発明の染色
体診断方法では、先ず、細胞核中に微小染色体対が存在
することを確認したのち、この微小染色体対をレーザー
染色体切断法（Hadano et al.:Genomics, 11, p364-37
3, 1991）により微細断片化する。この染色体切断方法
は、アルゴンイオンレーザービームを用いて顕微鏡の試
料台に置かれた染色体の任意部分を切断、あるいは任意
領域を昇華する方法であり、専用の装置（浜松ホトニク
ス社製）も開発されている。このレーザー染色体切断装
置は、レーザービームの位置、パワー、フォーカス、お
よび試料ステージの位置等が全てコンピューターにより
高精度に制御されていること、また種々の自動スキャン
ニングモードが予めプログラム化されていること、そし
て各種の操作を高解像度ディスプレイでモニターしなが
ら行える等の特徴により、簡便かつ効率的な染色体切断
が可能である。従って、この装置を用いることにより、
極めて微量かつ小型の微小染色体対であっても、その任
意の領域を微細切断化することができる。なお、このよ
うにして単離された微小染色体対の微細ＤＮＡ断片は、
界面活性剤と蛋白質分解酵素を含む微小量（１μｌ以
下）の回収液を用いてスライドグラスより回収すること
ができる。
は、上記微小染色体対を、妊婦の羊水細胞培養から単離
することを好ましい態様としてもいる。以下、この発明
の方法についてさらに詳しく説明する。この発明の染色
体診断方法では、先ず、細胞核中に微小染色体対が存在
することを確認したのち、この微小染色体対をレーザー
染色体切断法（Hadano et al.:Genomics, 11, p364-37
3, 1991）により微細断片化する。この染色体切断方法
は、アルゴンイオンレーザービームを用いて顕微鏡の試
料台に置かれた染色体の任意部分を切断、あるいは任意
領域を昇華する方法であり、専用の装置（浜松ホトニク
ス社製）も開発されている。このレーザー染色体切断装
置は、レーザービームの位置、パワー、フォーカス、お
よび試料ステージの位置等が全てコンピューターにより
高精度に制御されていること、また種々の自動スキャン
ニングモードが予めプログラム化されていること、そし
て各種の操作を高解像度ディスプレイでモニターしなが
ら行える等の特徴により、簡便かつ効率的な染色体切断
が可能である。従って、この装置を用いることにより、
極めて微量かつ小型の微小染色体対であっても、その任
意の領域を微細切断化することができる。なお、このよ
うにして単離された微小染色体対の微細ＤＮＡ断片は、
界面活性剤と蛋白質分解酵素を含む微小量（１μｌ以
下）の回収液を用いてスライドグラスより回収すること
ができる。
【００１１】ただし、このようにして回収したＤＡＮ断
片は極微量（１０-14 −１０-13 ｇ）であり、通常の遺
伝子操作によるクローニングに必要な量（１０-9−１０
-8ｇ）をはるかに下回る。また、ＰＣＲ法を用いれば極
微量なＤＮＡ断片を増幅することは可能であるが、通常
のＰＣＲ法の場合にはプライミング部位（鋳型ＤＮＡの
両端の塩基配列）が既知であることが必要であり、不特
定多数かつ配列未知の微小染色体対断片の増幅には適用
不可能である。
片は極微量（１０-14 −１０-13 ｇ）であり、通常の遺
伝子操作によるクローニングに必要な量（１０-9−１０
-8ｇ）をはるかに下回る。また、ＰＣＲ法を用いれば極
微量なＤＮＡ断片を増幅することは可能であるが、通常
のＰＣＲ法の場合にはプライミング部位（鋳型ＤＮＡの
両端の塩基配列）が既知であることが必要であり、不特
定多数かつ配列未知の微小染色体対断片の増幅には適用
不可能である。
【００１２】そこで、この発明の方法では、１種類のプ
ライマーを用いて塩基配列未知のＤＮＡを増幅すること
のできるＰＣＲ法、すなわちＳＵＰ（Single Unique Pr
imer）−ＰＣＲ（Hadano et al.: Genomics, 11, p364-
373, 1991)によりＤＮＡ断片を増幅する。このＳＵＰ−
ＰＣＲ法では、配列番号１に記載の２２塩基からなる合
成オリゴヌクレオチド（以下、ＢＶＥ２２ｃｃと記載す
ることがある）を単一のプライマーとして２種類のＰＣ
Ｒサイクルを行う。先ず、第１サイクルでは、アニール
反応促進剤（ポリエチレングリコール等）を含む反応溶
液中で、低温・長時間のアニーリング反応を特徴とする
ＰＣＲを行う。この条件では、増幅の特異性は低くな
り、プライマーＢＶＥ２２ｃｃの３’側の幾つかの塩基
が鋳型ＤＮＡの相補配列にアニールする。このような相
補配列は鋳型ＤＮＡ中にランダムに存在するため、その
塩基配列情報を必要とすることなく鋳型ＤＮＡをＰＣＲ
増幅することができる。
ライマーを用いて塩基配列未知のＤＮＡを増幅すること
のできるＰＣＲ法、すなわちＳＵＰ（Single Unique Pr
imer）−ＰＣＲ（Hadano et al.: Genomics, 11, p364-
373, 1991)によりＤＮＡ断片を増幅する。このＳＵＰ−
ＰＣＲ法では、配列番号１に記載の２２塩基からなる合
成オリゴヌクレオチド（以下、ＢＶＥ２２ｃｃと記載す
ることがある）を単一のプライマーとして２種類のＰＣ
Ｒサイクルを行う。先ず、第１サイクルでは、アニール
反応促進剤（ポリエチレングリコール等）を含む反応溶
液中で、低温・長時間のアニーリング反応を特徴とする
ＰＣＲを行う。この条件では、増幅の特異性は低くな
り、プライマーＢＶＥ２２ｃｃの３’側の幾つかの塩基
が鋳型ＤＮＡの相補配列にアニールする。このような相
補配列は鋳型ＤＮＡ中にランダムに存在するため、その
塩基配列情報を必要とすることなく鋳型ＤＮＡをＰＣＲ
増幅することができる。
【００１３】そして、このようにして増幅したＤＮＡ断
片を第２のＰＣＲサイクルでさらに増幅する。この第２
サイクルでは、第１サイクルと同一のＢＶＥ２２ｃｃを
プライマーとして通常の特異的なＰＣＲを行う。すなわ
ち、第１サイクルのＰＣＲ産物である２本鎖ＤＮＡは両
端の配列がＢＶＥ２２ｃｃとその相補配列であることが
わかっているため、通常の手続きによるＰＣＲ増幅が可
能である。以上の通りのＳＵＰ−ＰＣＲによって、微細
切断した微小染色体対のＤＮＡ断片を、プローブとして
用いるのに十分な量にまで増やすことができる。
片を第２のＰＣＲサイクルでさらに増幅する。この第２
サイクルでは、第１サイクルと同一のＢＶＥ２２ｃｃを
プライマーとして通常の特異的なＰＣＲを行う。すなわ
ち、第１サイクルのＰＣＲ産物である２本鎖ＤＮＡは両
端の配列がＢＶＥ２２ｃｃとその相補配列であることが
わかっているため、通常の手続きによるＰＣＲ増幅が可
能である。以上の通りのＳＵＰ−ＰＣＲによって、微細
切断した微小染色体対のＤＮＡ断片を、プローブとして
用いるのに十分な量にまで増やすことができる。
【００１４】次に、微小染色体対から増幅したＤＮＡ断
片を例えばビオチン等で蛍光標識してプローブとし、そ
の微小染色体対を単離したのと同一個体の細胞染色体お
よび／または遺伝的に正常な個体の染色体にハイブリダ
イズする（in situ ハイブリダイゼイション）。蛍光顕
微鏡で染色体を観察することによってプローブの結合位
置を知ることができ、微小染色体対が細胞染色体のどの
部位に由来するものであるかを同定することができる。
片を例えばビオチン等で蛍光標識してプローブとし、そ
の微小染色体対を単離したのと同一個体の細胞染色体お
よび／または遺伝的に正常な個体の染色体にハイブリダ
イズする（in situ ハイブリダイゼイション）。蛍光顕
微鏡で染色体を観察することによってプローブの結合位
置を知ることができ、微小染色体対が細胞染色体のどの
部位に由来するものであるかを同定することができる。
【００１５】以下、実施例を示してこの発明の染色体診
断方法についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、こ
の発明は以下の例に限定されるものではない。
断方法についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、こ
の発明は以下の例に限定されるものではない。
【００１６】
【実施例】高齢の妊婦２人から単離した細胞について、
この発明の方法による染色体診断を実施した。 （１） 検査対象 高齢出産のために染色体の出生前診断を受けた２人の妊
婦（被験者１、２）から単離した細胞を対象とした。出
生前診断の要約は以下の通りであった。
この発明の方法による染色体診断を実施した。 （１） 検査対象 高齢出産のために染色体の出生前診断を受けた２人の妊
婦（被験者１、２）から単離した細胞を対象とした。出
生前診断の要約は以下の通りであった。
【００１７】被験者１では、羊水細胞培養の７３％に微
小染色体対が観察された。そして、選択流産後の検査で
は、胎児は正常な表現型を示していたが、皮膚細胞の６
０％に微小染色体対が確認された。この微小染色体対は
ＣバンドおよびＮＯＲ染色の両方に対して陰性であっ
た。また、ヒトの全セントロメア・プローブであるＯＮ
ＣＯＲを用いて調べたところ、この微小染色体対にはセ
ントロメア配列が検出された。
小染色体対が観察された。そして、選択流産後の検査で
は、胎児は正常な表現型を示していたが、皮膚細胞の６
０％に微小染色体対が確認された。この微小染色体対は
ＣバンドおよびＮＯＲ染色の両方に対して陰性であっ
た。また、ヒトの全セントロメア・プローブであるＯＮ
ＣＯＲを用いて調べたところ、この微小染色体対にはセ
ントロメア配列が検出された。
【００１８】一方、被験者２の場合には、羊水細胞の９
０％に微小染色体対が観察された。出産後の新生児は正
常な表現型を有していたが、その末梢リンパ球の８３％
に微小染色体対が確認された。この微小染色体対はＮＯ
Ｒには陰性であったが、小さなＣバンドが検出された。
また、ＯＮＣＯＲによってセントロメア配列も検出され
た。なお、この新生児は、５歳齢の現在まで身体的およ
び精神的に正常な発育を遂げている。 （２） 微小染色体の微細断片化 被験者１の胎児の培養皮膚細胞、被験者２の羊水細胞、
および遺伝的に正常な新生児のそれぞれから分裂中期の
細胞を回収した。低張溶液（１％クエン酸ナトリウム含
有）で処理したのち、メタノールと酢酸を７：１の割合
で有する固定液で細胞をスライドグラスに固定した。ス
ライドグラスは−２０℃で保管し、ギムザ染色の直後の
染色体を以下の手順でレーザー切断した。先ず、染色体
周囲の広い領域（１×１．５ｍｍ）を自動焼却モードで
除去し、次いで微小染色体対の回りの個々の染色体を手
動モードで除去した（図１ａ、１ｂ）。切断した微小染
色体対はシリコン壁で囲い、その内側に５５℃の回収液
（0.1% proteinase K, 10mM Tris HCl, 0.1%SDS 含有）
を滴下した。 （３） ＳＵＰ−ＰＣＲ 以上の通りに切断した微小染色体対のＤＮＡ断片を回収
し、文献（Hadano etal.: Genomics, 11, p364-373, 19
91)記載の方法により、ＢＶＥ２２ｃｃをプライマーと
する３段階サイクルのＳＵＰ−ＰＣＲで各試料を増幅し
た。すなわち、第１段階の非特異的ＰＣＲサイクルは、
１２％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む反応
溶液中で６回のＰＣＲ反応（９０℃、５分間；２２℃、
１２０分間；５０℃、２０分間）を繰り返し、鋳型ＤＮ
Ａの任意の配列領域を増幅した。次いで、ＰＥＧを含ま
ない反応溶液中で１１回のＰＣＲ反応（９２℃、１．５
分間；５０℃、１分間；７２℃、２分間）からなる第２
段階ＰＣＲ、および３０回の反応（９２℃、１．５分
間；５５℃、１分間；７２℃、２分間）からなる第３段
階ＰＣＲを行い、第１段階のＰＣＲ産物を特異的に増幅
した。
０％に微小染色体対が観察された。出産後の新生児は正
常な表現型を有していたが、その末梢リンパ球の８３％
に微小染色体対が確認された。この微小染色体対はＮＯ
Ｒには陰性であったが、小さなＣバンドが検出された。
また、ＯＮＣＯＲによってセントロメア配列も検出され
た。なお、この新生児は、５歳齢の現在まで身体的およ
び精神的に正常な発育を遂げている。 （２） 微小染色体の微細断片化 被験者１の胎児の培養皮膚細胞、被験者２の羊水細胞、
および遺伝的に正常な新生児のそれぞれから分裂中期の
細胞を回収した。低張溶液（１％クエン酸ナトリウム含
有）で処理したのち、メタノールと酢酸を７：１の割合
で有する固定液で細胞をスライドグラスに固定した。ス
ライドグラスは−２０℃で保管し、ギムザ染色の直後の
染色体を以下の手順でレーザー切断した。先ず、染色体
周囲の広い領域（１×１．５ｍｍ）を自動焼却モードで
除去し、次いで微小染色体対の回りの個々の染色体を手
動モードで除去した（図１ａ、１ｂ）。切断した微小染
色体対はシリコン壁で囲い、その内側に５５℃の回収液
（0.1% proteinase K, 10mM Tris HCl, 0.1%SDS 含有）
を滴下した。 （３） ＳＵＰ−ＰＣＲ 以上の通りに切断した微小染色体対のＤＮＡ断片を回収
し、文献（Hadano etal.: Genomics, 11, p364-373, 19
91)記載の方法により、ＢＶＥ２２ｃｃをプライマーと
する３段階サイクルのＳＵＰ−ＰＣＲで各試料を増幅し
た。すなわち、第１段階の非特異的ＰＣＲサイクルは、
１２％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む反応
溶液中で６回のＰＣＲ反応（９０℃、５分間；２２℃、
１２０分間；５０℃、２０分間）を繰り返し、鋳型ＤＮ
Ａの任意の配列領域を増幅した。次いで、ＰＥＧを含ま
ない反応溶液中で１１回のＰＣＲ反応（９２℃、１．５
分間；５０℃、１分間；７２℃、２分間）からなる第２
段階ＰＣＲ、および３０回の反応（９２℃、１．５分
間；５５℃、１分間；７２℃、２分間）からなる第３段
階ＰＣＲを行い、第１段階のＰＣＲ産物を特異的に増幅
した。
【００１９】微小染色体対を鋳型とするＰＣＲ産物は、
アガロース電気泳動により２００〜８００塩基対の断片
であることが確認され、また放射線標識したヒト全ＤＮ
Ａプローブによるサザンブロット法により、それらがヒ
ト染色体を起源とすることも確認された。 （４） 蛍光 in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ） 各ＤＮＡ断片から得られた全ＰＣＲ産物に、BRL Biopri
me labelling Kitを用いてビオチン１４−ｄＵＰＴを標
識し、エタノール沈殿させ、１００ｎｇ／μｌの濃度で
水に溶解した。次いで、２μｇの乾燥Ｃｏｔ−１ＤＮ
Ａ、１μｌのサーモンＤＮＡ（10mg/ml)、1 μl の水、
7 μl のハイブリダイゼーション溶液（６０％ホルマリ
ン、１０％デキストラン硫酸、２ｘＳＳＣ）に１μｌの
標識プローブを添加した。プローブを１０分間、７０℃
で変性させ、予め冷エタノールで３回洗浄して脱水化
し、かつ７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣで変性させた
スライドグラスに固定した。ハイブリダイゼーション
は、３７℃で１６時間行い、次いで、５０％ホルムアミ
ド／２ｘＳＳＣ（１０分間）、２ｘＳＳＣ（１０分
間）、５％ Triton X 100/４ｘＳＳＣ（５分間）を用い
て４２℃で洗浄した。
アガロース電気泳動により２００〜８００塩基対の断片
であることが確認され、また放射線標識したヒト全ＤＮ
Ａプローブによるサザンブロット法により、それらがヒ
ト染色体を起源とすることも確認された。 （４） 蛍光 in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ） 各ＤＮＡ断片から得られた全ＰＣＲ産物に、BRL Biopri
me labelling Kitを用いてビオチン１４−ｄＵＰＴを標
識し、エタノール沈殿させ、１００ｎｇ／μｌの濃度で
水に溶解した。次いで、２μｇの乾燥Ｃｏｔ−１ＤＮ
Ａ、１μｌのサーモンＤＮＡ（10mg/ml)、1 μl の水、
7 μl のハイブリダイゼーション溶液（６０％ホルマリ
ン、１０％デキストラン硫酸、２ｘＳＳＣ）に１μｌの
標識プローブを添加した。プローブを１０分間、７０℃
で変性させ、予め冷エタノールで３回洗浄して脱水化
し、かつ７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣで変性させた
スライドグラスに固定した。ハイブリダイゼーション
は、３７℃で１６時間行い、次いで、５０％ホルムアミ
ド／２ｘＳＳＣ（１０分間）、２ｘＳＳＣ（１０分
間）、５％ Triton X 100/４ｘＳＳＣ（５分間）を用い
て４２℃で洗浄した。
【００２０】プローブのハイブリダイゼーションは、ON
COR In situ kit を用いて確認し、蛍光シグナルは蛍光
顕微鏡により可視化した。 （５） 結果 被験者１の微小染色体対から増幅したＤＮＡ断片の集合
をプローブして正常な繊維芽細胞染色体にＦＩＳＨを行
った結果、Ｄ群およびＧ群染色体のセントロメアに強い
シグナルが観察された。また、被験者１の繊維芽細胞染
色体に標識プローブをハイブリダイズした場合には、微
小染色体対に同様のシグナルが観察された（図２ａ）。
染色体１３／２１および１４／２２に対するプローブＯ
ＮＣＯＲを被験者１の細胞にハイブリダイズしたとこ
ろ、１３／２１プローブによってのみ微小染色体対にシ
グナルが観察された（図２ｂ）。従って、被験者１の微
小染色体対は１３番染色体または２１番染色体に起源を
有するものであることが確認された。
COR In situ kit を用いて確認し、蛍光シグナルは蛍光
顕微鏡により可視化した。 （５） 結果 被験者１の微小染色体対から増幅したＤＮＡ断片の集合
をプローブして正常な繊維芽細胞染色体にＦＩＳＨを行
った結果、Ｄ群およびＧ群染色体のセントロメアに強い
シグナルが観察された。また、被験者１の繊維芽細胞染
色体に標識プローブをハイブリダイズした場合には、微
小染色体対に同様のシグナルが観察された（図２ａ）。
染色体１３／２１および１４／２２に対するプローブＯ
ＮＣＯＲを被験者１の細胞にハイブリダイズしたとこ
ろ、１３／２１プローブによってのみ微小染色体対にシ
グナルが観察された（図２ｂ）。従って、被験者１の微
小染色体対は１３番染色体または２１番染色体に起源を
有するものであることが確認された。
【００２１】被験者２の場合には、その羊水細胞から単
離した微小染色体対の増幅ＤＮＡ断片をプローブとする
ＦＩＳＨの結果から、微小染色体対とＣ群染色体のセン
トロメアにシグナルが観察された。このＣ群染色体は、
その形態と不鮮明なＲバンドとから１０番または１２番
染色体と同定された。そこで、１０番および１２番染色
体のプローブＯＮＣＯＲを被験者２の羊水細胞染色体に
ハイブリダイズさせたところ、１２番染色体プローブに
よってのみ微小染色体にシグナルが検出された（図
３）。従って、被験者２の微小染色体対は１２番染色体
のセントロメアに起源を有することが確認された。
離した微小染色体対の増幅ＤＮＡ断片をプローブとする
ＦＩＳＨの結果から、微小染色体対とＣ群染色体のセン
トロメアにシグナルが観察された。このＣ群染色体は、
その形態と不鮮明なＲバンドとから１０番または１２番
染色体と同定された。そこで、１０番および１２番染色
体のプローブＯＮＣＯＲを被験者２の羊水細胞染色体に
ハイブリダイズさせたところ、１２番染色体プローブに
よってのみ微小染色体にシグナルが検出された（図
３）。従って、被験者２の微小染色体対は１２番染色体
のセントロメアに起源を有することが確認された。
【００２２】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明の
方法によって、染色体異常の一つである微小染色体対
が、染色体のどの部位に由来するものであるかを簡単か
つ高精度に知ることができる。これによって、微小染色
体の存在がどのような遺伝性疾患をもたらす危険性があ
るかを出生以前に診断することが可能となり、出生の前
後における対策および治療手段を選択する際の重要な情
報が提供される。
方法によって、染色体異常の一つである微小染色体対
が、染色体のどの部位に由来するものであるかを簡単か
つ高精度に知ることができる。これによって、微小染色
体の存在がどのような遺伝性疾患をもたらす危険性があ
るかを出生以前に診断することが可能となり、出生の前
後における対策および治療手段を選択する際の重要な情
報が提供される。
【００２３】
配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAGATCTGAT ATCTGAATTC CC 22
【図１】（ａ）は、微小染色体対（矢印）を含む染色体
の分布を示す図面に代わる顕微鏡写真であり、（ｂ）は
微小染色体対以外の染色体をレーザービームにより除去
した状態を示す図面に代わる顕微鏡写真である。
の分布を示す図面に代わる顕微鏡写真であり、（ｂ）は
微小染色体対以外の染色体をレーザービームにより除去
した状態を示す図面に代わる顕微鏡写真である。
【図２】実施例の被験者１から単離した分裂中期細胞の
染色体に対するＦＩＳＨの結果を示す図面に代わる蛍光
顕微鏡写真である。（ａ）は、ＰＣＲ増幅してビオチン
標識した微小染色体対ＤＮＡをプローブとした場合の結
果であり、図中矢印は、各々、微小染色体対（太い矢
印）、Ｄ群染色体のセントロメア（細い長矢印）、およ
びＧ群染色体のセントロメア（細い短矢印）のシグナル
を示す。（ｂ）は、染色体１２／２１に対するプローブ
ＯＮＣＯＲを用いた場合の結果であり、図中矢印は、各
々、微小染色体対（太い矢印）、１３番色体のセントロ
メア（細い長矢印）、および２１番色体のセントロメア
（細い短矢印）のシグナルを示す。
染色体に対するＦＩＳＨの結果を示す図面に代わる蛍光
顕微鏡写真である。（ａ）は、ＰＣＲ増幅してビオチン
標識した微小染色体対ＤＮＡをプローブとした場合の結
果であり、図中矢印は、各々、微小染色体対（太い矢
印）、Ｄ群染色体のセントロメア（細い長矢印）、およ
びＧ群染色体のセントロメア（細い短矢印）のシグナル
を示す。（ｂ）は、染色体１２／２１に対するプローブ
ＯＮＣＯＲを用いた場合の結果であり、図中矢印は、各
々、微小染色体対（太い矢印）、１３番色体のセントロ
メア（細い長矢印）、および２１番色体のセントロメア
（細い短矢印）のシグナルを示す。
【図３】実施例の被験者２から単離した分裂中期細胞の
染色体に対し、１２番染色体に対するプローブＯＮＣＯ
Ｒを用いた場合のＦＩＳＨの結果を示す図面に代わる蛍
光顕微鏡写真である。図中矢印は、各々、微小染色体対
（太い矢印）、および１２番色体のセントロメア（細い
矢印）のシグナルを示す。
染色体に対し、１２番染色体に対するプローブＯＮＣＯ
Ｒを用いた場合のＦＩＳＨの結果を示す図面に代わる蛍
光顕微鏡写真である。図中矢印は、各々、微小染色体対
（太い矢印）、および１２番色体のセントロメア（細い
矢印）のシグナルを示す。
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒト細胞から単離した微小染色体対をレ
ーザー染色体切断法により微細断片化し、これらの断片
化したＤＮＡを配列番号１記載のオリゴヌクレオチドを
プライマーとするポリメラーゼ連鎖反応法ＳＵＰ−ＰＣ
Ｒによって増幅し、この増幅されたＤＮＡ断片の集合を
プローブとして上記ヒト細胞の染色体および／または遺
伝的に正常なヒト細胞染色体を蛍光 in situハイブリダ
イゼイションすることにより、上記の微小染色体対が由
来する染色体位置を同定することを特徴とする染色体診
断方法。 - 【請求項２】 微小染色体対を、妊婦の羊水細胞培養か
ら単離する請求項１の染色体診断方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25091694A JPH08112100A (ja) | 1994-10-17 | 1994-10-17 | 染色体診断方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25091694A JPH08112100A (ja) | 1994-10-17 | 1994-10-17 | 染色体診断方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08112100A true JPH08112100A (ja) | 1996-05-07 |
Family
ID=17214932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25091694A Pending JPH08112100A (ja) | 1994-10-17 | 1994-10-17 | 染色体診断方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08112100A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009517054A (ja) * | 2005-12-02 | 2009-04-30 | サイモンズ ハプロミクス リミテッド | 遺伝子マッピング及びハプロタイプ決定の方法 |
-
1994
- 1994-10-17 JP JP25091694A patent/JPH08112100A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009517054A (ja) * | 2005-12-02 | 2009-04-30 | サイモンズ ハプロミクス リミテッド | 遺伝子マッピング及びハプロタイプ決定の方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
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|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040427 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20040907 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |