JPH0812195B2 - 時間分解発光結合イムノアッセイ、それに使用する金属標識された結合パートナー、および該パートナーの製造方法 - Google Patents

時間分解発光結合イムノアッセイ、それに使用する金属標識された結合パートナー、および該パートナーの製造方法

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JPH0812195B2
JPH0812195B2 JP62500894A JP50089487A JPH0812195B2 JP H0812195 B2 JPH0812195 B2 JP H0812195B2 JP 62500894 A JP62500894 A JP 62500894A JP 50089487 A JP50089487 A JP 50089487A JP H0812195 B2 JPH0812195 B2 JP H0812195B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、時間分解発光結合イムノアッセイ（time−
resolved luminescence binding immunoassay）および
それに使用する試薬に関する。
時間分解発光結合アッセイは知られている。
英国特許明細書1560402号（アナリティカル・ラジエ
ーション・コーポレーション）には、イムノアッセイに
螢光標識を用いること、特に、螢光寿命が比較的長い標
識を使用することが記載されている。このようにして、
標識からの螢光を、サンプル、検定試薬などからの競合
する短寿命の螢光から区別することができ、その結果ア
ッセイのシグナル／ノイズ比が向上する。述べられてい
る具体的な標識は、ピレンブチレートと希土類のキレー
トに代表される有機螢光化合物、特にユウロピウムとテ
ルビウムのキレートである。
公開されたヨーロッパ特許明細書EP−A2−0103558（W
allac Oy）には、均一系時間分解螢光イムノアッセイが
記載され、それにおいてはランタニドキレートで標識さ
れた免疫化学化合物が用いられており、この標識化合物
が螢光を発するのであるが、その諸性質は該免疫化学化
合物を特定の結合パートナーに結合させることによって
調整されている。
時間分解螢光イムノアッセイの公知の技術は、専らと
いってよい程、ユーロピウム（Eu（III））およびテル
ビウム（Tb（III））に依存している。これらの金属は
高螢光のキレートを形成し、いずれのキレートも長い螢
光寿命（100〜1,000μｓ）、広い励起波長域、大きなス
トークスシフト（励起波長と発光波長の差−典型的に
は、250nmより大）および狭い発光波長域を示す。希土
類キレートの螢光寿命は、例えば生物学的サンプルで見
られるバックグランドの平均的螢光（１〜20nsが典型
的）よりも数オーダーが長い。しかし、希土類キレート
には、いくつかの不利がある。これらは動的に不安定
で、水の消光および分解の性質を受け易い。
これらの不利を解消するために、希土類キレートの安
定化およびその使用のプロトコールの改良を目的とする
研究がかなり行なわれた。公開された国際特許出願WO 8
4/03698には、とりわけランタニドのための改良された
キレート化化合物が記載されている。公開されたヨーロ
ッパ特許出願EP−A2−0064484には、アッセイの成分に
結合された非螢光キレートからランタニドイオンを解離
させるプロトコールが記載されている。そのランタニド
イオンは、次いで溶液中でβ−ジケトンのようなキレー
ト化剤と高螢光のキレートを形成するのである。米国特
許明細書4374120号には、β−ジケトンもしくはジヒド
ロキシ化合物とアミノポリカルボン酸アナローグとから
なる。ユーロピウムまたはテルビウムのためのキレート
化剤が記載されている。
フルオロイムノアッセイを一般的レビューするには、 Hemmila,I.Clin.Chem.（1985）31(3),359〜370を参照さ
れたい。
従来技術の希土類金属キレートの標識は完全には満足
できるものではないことがわかっている。従来技術か
ら、希土類キレートの安定性を改良するために相当の努
力がこれまでなされてきたことがわかるが、不安定性
は、試薬のコストおよび毒性と同様になお問題である。
必要とされる発光減衰特性を有する螢光遷移金属錯体
は安定であることが知られている。特に、発光性のオス
ミウムおよびルテニウム錯体がこれまでに広範囲に研究
されてきた（例えば、Ackermannほか、Inor.Chem.（198
4）23,3904〜3911参照）。しかし、これらの研究は、そ
れらの非通常の励起状態特性、および太陽エネルギーの
光化学的あるいは光電子化学的変換における光増感剤と
しての使用可能性に限られていた。米国特許明細書4205
952号には、金属標識を結合アッセイ（binding assay）
に使用することが記載されている。この明細書は、特に
金属標識を検出、測定するために原子吸収を使用するこ
とに関するものである。遷移金属およびそれらの錯体の
使用が広く開示されている。このような遷移金属錯体
が、時間分解発光イムノアッセイに利用するのに卓越し
て適していることが見出された。
ヨーロッパ特許出願EP−A2−0178450（1986年４月23
日公開）には、免疫学的に活性な物質に結合された種々
のルテニウム錯体で、時間分解螢光イムノアッセイに使
用するものが記載されている。
本発明によると、金属標識された結合パートナーを伴
なう時間分解発光結合イムノアッセイ方法であって、該
金属標識が二座リガンドを有する発光性遷移金属錯体
（ただし、一般式： Ru2+L1L2L3 〔ここで、L1，L2およびL3は同一か異なるもので、各
々、含窒ヘテロ環を少なくとも２個含む二環式または多
環式のリガンドを意味し、これらリガンドの少なくとも
１つは少なくとも１つの水溶性を付与する基によって置
換され、またこれらリガンドの少なくとも１つは少なく
とも１つの反応性の基によって置換され（介在基を介し
ていてもよい）、さらにリガンドL1，L2およびL3は窒素
原子を介してルテニウムに結合されている〕 で表わされるルテニウム錯体を除く）を含んでなること
を特徴とする方法が提供される。
該金属標識は、１または２以上の二座リガンド（配位
子）で錯体化された遷移金属を有している。それらリガ
ンドの少なくとも１つは、そのリガンドを（したがって
その錯体を）結合パートナーに共有結合で結合する化学
的結合（linkage）を備えている。
発光性遷移金属錯体は、検定環境におけるバックグラ
ウンドの発光の寿命よりも実質的に長寿命の発光を示す
ように選ばれる。生物学的サンプルについて行なわれる
典型的なイムノアッセイでは、発光の寿命は20nsより長
いことが適切である。好ましくは、その寿命は、100ns
より長くて５μｓまでである。錯体により示される発光
は螢光でもリン光でもあるいはこの２現象が組合わさっ
たものでもよい。
遷移金属は、周期律表においてｄ−ブロック元素の３
列中の１列から選ばれるｄ−ブロック元素であり、これ
は錯体において必要とされる発光特性を示す。疑問を避
けるために、ここで使用の“遷移金属”の語からは、ラ
ンタニドおよびアクチニドの元素を明確に除外するもの
とする。
ルテニウムとイリジウムが、それぞれ特にRu（II）お
よびIr（III）が特に好ましい。両元素とも非常に良好
な螢光特性を有する。ただし、イリジウム錯体が、特に
有用であり、また対応するルテニウム錯体よりもかなり
低波長域に最大励起波長を有することがわかった。これ
により、レーザー励起螢光光度計に使用することが容易
となる。興味のある他の遷移金属としては、種々の酸化
状態にあるオスミウム、モリブデン、タングステン、ク
ロム、インジウム、レニウムおよびロジウムがあり、特
にオスミウムとクロムである。オスミウムは高い毒性を
もつものとして知られている。しかし、錯体化すると、
毒性のレベルが著しく低下することが見出され、これに
より、このような錯体を通常の時間分解螢光結合イムノ
アッセイに標識として使用可能である。
リガンドは、錯体中で必要な配位子場を作ってその錯
体を発光性にすることができるリガンドから選ばれる。
適切なリガンドとしては、ピリジン、エチレンジアミ
ン、ジエチレンジアミン、ジメチルグリオキシム、アセ
チルアセトネート、エチレンジアミン四酢酸等があげら
れる。好ましいリガンドは、ビピリジル類、フェナント
ロリン類およびこれらの誘導体である。少なくとも１つ
のリガンドには、錯体を結合パートナーに共有結合で結
合させるための結合手（linker）が備わっている。この
結合手はそのリガンド上のカルボキシル基のような単純
な反応性官能基に由来するものでもよいし、あるいは２
価のブリッジでもよい。ブリッジの長さは、結合および
発光の双方の点で最良の特性が得られるように調節する
ことができる。ブリッジの長さは、アッセイが均一系結
合アッセイであるときに特に重要である。
結合イムノアッセイは、均一系結合イムノアッセイで
も不均一結合イムノアッセイでもよい。
私達は、ルテニウムおよびイリジウムの錯体が、時間
分解発光イムノアッセイに金属標識として使用するのに
特に適していることを見出した。
本発明の別の面により、私達は、時間分解発光結合イ
ムノアッセイに使用する金属標識された結合パートナー
であって、ルテニウムまたはイリジウムの二座リガンド
を有する発光錯体に共有結合で結合された結合パートナ
ーからなるものを提供する。ルテニウムは酸化状態II
が、またイリジウムは酸化状態IIIが好ましい。リガン
ドは上述のとおりでよい。特定の金属標識された結合パ
ートナーの例を下に示す。
結合パートナーは、抗原または抗体である。
さて、次の具体的な記載による例により本発明を説明
する。
記載されたリガンドを明確にするために次の略語を用
いる。
bipy 2,2′−ビピリジン phen 1,10−フェナントロリン dpphen 4,7−ジフェニル−1,10 フェナントロリン biquin 2,2′−ビキノリン Ｉ ４−（ｐ−メトキシフェニル）−1,10−フェナ
ントロリン II ４−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−1,10−フェ
ナントロリン III ４″−カルボキシベンジル−４′−〔４−（1,1
0−フェナントロリン）〕フェニルエーテル IV ４′−〔４−（1,10−フェナントロリン）〕−
フェノキシ酢酸 Ｖ ４−フェニル−７−フェニル（４′−フェニル
酢酸）−1,10 フェナントロリン 1.遷移金属キレートの製造 種々の遷移金属キレートを製造し、それらの螢光特性
を測定し比較した。
1.1 Ru(bipy)3CL2 最初にRu(bipy)2Clを製造し、次に第３のbipyリガン
ドを付加してRu(bipy)3Cl2を製造した。RuCl33H2O（0.7
8g,2.98×10-3モル）、2,2′−ジピリジル（0.94g,6.0
×10-3モル）および塩化リチウム（0.84g,2.0×10-2モ
ル）を、ジメチルホルムアミド（30ml）中、還流下、攪
拌しながら５時間加熱した。この混合物を真空下で約5.
0mlに濃縮し、アセトン（25ml）で処理し、次に０℃で
冷却した。紫−黒色の沈澱を濾別し、水で（３×25m
l）、次いでジエチルエーテルで（２×20ml）洗浄した
のち、真空下で乾燥した。（収量0.573g,37％） DMF（30ml）にbipy（0.21g,5.73×10-4モル）を溶解
してなる溶液を、エタノール（50ml）に Ru(bipy)2Cl2（0.27g,5.21×10-4モル）を溶解したもの
と水（50ml）との沸騰溶液に加え、この混合物を窒素
中、還流下で３時間加熱した。飽和NaCl水（1ml）を加
えたのち、混合物を真空下で濃縮してオレンジ色の固体
を得た。TLC（セルロース;2−ブタノール−水−酢酸,1
3:6:2）は、オレンジイエロー色の主成分Rf＝0.72を示
した。この混合物をSephadex LH20（商標）（エタノー
ル）でカラムクロマトグラフィーに供し、オレンジ色の
固体（0.24g,49％）を得た。
２配位子が配位したRu2+錯体に、第３のリガンドを付
加する上記方法は、一般的に適用することができる。
1.2 Ru(phen)3Cl2 最初にRu(phen)2Clを製造し、次に第３のphenリガン
ドを付加してRu(phen)3Cl2を製造した。
RuCl33H2O（0.78g,2.98×10-3モル）、1,10−フェナ
ントロリン（1.08,6.0×10-3モル）および塩化リチウム
（0.8μｇ）を、ジメチルホルムアミド（30ml）中、還
流下、攪拌しながら５時間加熱した。この混合物を冷却
し、真空下で5mlに濃縮し、次に水（25ml）で処理し
た。紫−黒色の沈澱を濾別し、水で（２×20ml）、次い
でジエチルエーテルで（３×25ml）洗浄したのち、真空
下で乾燥した。（収量:0.68g,43％）。
上記1.1項でbipyについて説明した一般的方法を用い
て、第３のphenリガンドを付加した。
1.3 Ir(bipy)3(NO3)3 J.Inorg.Nucl.Chem.,41,495−502,（1979）に記載さ
れている手順に本質的に従って、Ir(bipy)3(NO3)3を製
造した。
IrCl32.0g、KHSO424.0gおよびH2O20mlを入れた１ビ
ーカーを、攪拌しながらゆっくりと加熱して乾固させ
た。この混合物を、攪拌しながらKHSO4の融点（214℃）
に30分間加熱したのち（深緑）、室温に冷却した。この
硫酸水素イリジウム溶融物、K2S2O724.0g、ビピリジン
6.0gおよびH2O20mlを新しい反応フラスコに入れた。H2O
が除去されるまで窒素雰囲気下温度を120℃に保った。
温度を180℃に上げたのち、窒素をCO2で置換した。２層
をなす溶融物（１つは茶色、１つは黄色）を６時間230
℃に保った。
この溶融物を室温に冷却し、H2O200mlに溶解させた。
KHCO3を用いてpHを7.0に調節し、メタノール800mlを加
え、０℃に２時間冷却したのち、濾過してK2SO4を除去
した。濾液をフラッシュ蒸発させて90mlにし、５℃に１
時間冷却したのち、濾過して過剰のビピリジンを除去し
た。この濾液に0.2M HNO3600mlを加え、70℃でフラッシ
ュ蒸発させて10mlにしたのち40℃で乾固させた。得られ
た黄色の固体を0.2M HNO3600mlに再溶解し、上記のよう
に真空下で蒸発させた。
その固体をH2O100mlに溶解し、pH4.0に調節したのちC
ellex−Ｐでクロマトグラフィーに供した。カラムを1.0
4×10-4M HNO3、0.05M HNO3、次いで0.1M HNO3で溶離さ
せた。0.1M画分を中和し、真空下、70℃で蒸発させて10
mlとして、中性であることを調べたのち、真空下40℃で
蒸発乾固した。
0.1M画分からの固体をメタノールに溶解し、Sephadex
LH−20（商標）でクロマトグラフィーに供した。サン
プルは５つの帯に分離した。明るい緑色の発光帯の発光
スペクトルは、サンプルがIr(bipy)3 3+を含むことを示
した。この発光帯を、上記手順によって、さらに５回セ
ファデックスLH−20（商標）でクロマトグラフィーに供
した。セファデックスLH−20での最後のクロマトグラフ
ィーは、UVランプを使用しないで行なった。この部分か
ら、２−プロパノールを加えて蒸発したところ、Ir(bip
y)3(NO3)3の淡黄色結晶が得られた。
1.4 Ir(phen)3(NO3)3 Ir(bipy)3(NO3)3について上記1.3項で説明した一般的
手順にしたがってIr(phen)3(NO3)3を製造した。
1.5 Os(bipy)3Cl2 Buckinghamらの方法（Buckingham et al,Aust.J.Che
m.,17,325,（1964）に従って、Os(bipy)3Cl2を製造し
た。
1.6 Os(phen)3Cl2 Os(bipy)3Cl2と同様に、Os(phen)3Cl2を製造した（上
記1.5項参照）。
1.7 Cr(bipy)3(ClO4)3 次のようにしてCr(bipy)3(ClO4)3を製造した： 濃塩酸（5ml）および水（5ml）中に電解クロム（0.52
g,0.01モル）を溶解してなる溶液を超音波槽中で製造し
た。全金属が溶解しH2の放出が止まったのち、この溶液
を水（40ml）で希釈した。若干のメタノールに溶解した
2,2′−ビピリジン（4.7g）を、すばやく添加し深いワ
インレッド色の溶液が得られ、これを濾過した。次い
で、この濾液を、過塩素酸ナトリウム（2.00g）、70％
過塩素酸（1ml）、水（200ml）からなる溶液で処理し
た。黒色の結晶が沈澱し、濾過によって集めた。これら
の結晶はトリス（2,2′−ビピリジン）クロム（III）過
塩素酸塩と考えられるものであるが、酸素を溶液中に通
気しながら1M過塩素酸と共に１夜攪拌して黄色のクロム
（III）化合物に転化させた。この黄色沈澱を濾別し、
温水から再結晶させたところ、黄色針状結晶（1.73g）
を得た。
反応は、窒素雰囲気下で行われた。
1.8 Cr(phen)3(ClO4)3 次のようにしてCr(phen)3(ClO4)3を製造した： 使用前に、全溶液を超音波および窒素の通気により脱
気した。クロム（BDB）0.52gを、窒素下、濃塩酸2.5ml
と水2.5mlとに溶解させた。この溶液に３時間超音波を
かけ、全部のクロムを溶解させた。クロムが溶解したの
ち、水40mlを攪拌しながら加えた。この溶液は淡青／緑
の色から黒色に変色し、次に過塩素酸ナトリウム2.0gを
水5mlで加えた。すぐに暗緑色の沈澱が生成し、これを
窒素下で濾過した。この化合物はCr(phen)3 2+2ClO4 -で
あった。この固体をすばやく1M過塩素酸が入っているフ
ラスコに移し、酸素を３時間泡立たせて通じた。（窒素
はもはや必要ではない） 暗緑色の沈澱が黄色の固体に変化し、これを濾過によ
って集めた。この物質は未精製であり、そこで水で沈澱
を洗浄して精製した。不純物（淡いピンク色）が漏斗中
に残る一方、Cr(phen)3 3+3ClO4 -は濾液中に細かい黄色
沈澱として見出された。
上記1.1〜1.8項で製造された物質を、それらの螢光特
性について試験し、その結果を表１に示す。この結果
は、全ての錯体が時間分解螢光結合イムノアッセイとし
て受容可能な発光の半減期を有することを示している。
しかし、ルテニウムおよびイリジウムの錯体は、驚異的
に長い半減期を有し、このため、特に利用に適してい
る。
イリジウム錯体は、特に、最大の励起波長を示し、こ
のためにこの錯体は容易に入手できかつ安価な型のレー
ザーを使用するレーザー励起に特に適したものとなって
いる。
これらの錯体は、いずれも抗原物質、抗体または抗体
断片のような結合パートナーとの結合に適合した誘導錯
体の製造に有用である原料を提供するものである。
表１において、最大励起波長（λex）は、リン酸塩緩
衝食塩水（PBS）に溶かした錯体の10-4Ｍ溶液を用い
て、ブランクの緩衝液に対して、ルテニウムについては
250nmから600nm、イリジウムについて250nmから500nm、
クロムについて360nmから500nm、オスミウムについて30
0nmから600nm走査し、パーキン−エルマーλ5分光光度
計で測定した。最大発光波長（λem）は、PBS中に適度
に希釈された錯体の溶液を用い、ルテニウムについては
500から700nm（ex.450nm）まで、イリジウムに対して45
0から550nm（ex.366nm）、クロムに対して700から750nm
（ex.420nm）、そしてオスミウムに対して650から800nm
（ex.480nm）の螢光発光を走査して測定した。
量子収量（Ｑ）を次の関係： を用いて公知の量子収量を標準に対して計算した。
ここで、Ｉ＝螢光強度、Ａ＝吸収、およびＱ＝量子収
量である。硫酸キニンをイリジウム錯体に対する標準と
し、ローダミンＢをルテニウム錯体に対する標準とし
た。錯体の螢光寿命（YH2O）を、レーザー閃光励起後に
得られる螢光減衰のプロフィールから、即ちナノ秒寿命
螢光計での時間に相関した単一光電子の計数によって計
算した。
さらに一連のイリジウムおよびルテニウムの錯体を、
次のように製造した。
1.9 Ir(bipy)2（４′−〔４−1,10−フェナントロリ
ン）〕−フェノキシ−酢酸）3+ （Ir(bipy)2IV3+） Inorg.Chem,10，（９）,1971,2002−2009に記載され
ているように、最初にIr(biby)2を製造し、次にリガン
ドIVを付加してIr(bipy)2IV3+を製造した。リガンドIV
は次のようにして製造した。
４−（４′−ヒドロキシフェニル）−1,10−フェナン
トロリン（0.84g、3,272×10-3モル）をヘキサメチルフ
ォスホアミド（HMPA）（20ml）に溶解してなる溶液を、
HMPA（20ml）中に分散したカリウムtert−ブトキシド
（0.55g,4.91×10-3モル）の懸濁液に加え、この混合物
を20℃（N2雰囲気）で0.5時間攪拌した。α−ブロモ酢
酸リチウム（0.47g）を加え、この混合物を20℃で72時
間攪拌した。水（150ml）を加えた。2.5M HCl（aq）を
用いてpHを4.5に調節し混合物をｎ−ブタノール（３×7
0ml）で抽出した。ｎ−ブタノール抽出物を乾燥し（Na2
SO4）、真空下で40mlに濃縮し、次いでジエチルエーテ
ル（150ml）で処理した。黄かっ色の沈澱を濾過し、エ
ーテルで洗浄したのち、真空下で乾燥したところ、４′
−〔1,10−フェナントロリン）〕−フェノキシ酢酸（0.
39g）を得た。
リガンドIVを、J.Inorg.Nucl.Chem.41,495−507（197
9）に記載され、および一般的に上記1.3項に記載されて
いるようにして、付加した。
1.10 Ir（bipy）２−（４″−カルボキシベンジル−
４′−〔４−（1,10−フェナントロリン）〕フェニルエ
ーテル3+ Ir(bipy)2III3+ 最初にIr(bipy)2 3+を製造し（上記1.3項参照）、次に
リガンドIIIを付加してIr(bipy)2III3+を製造した。リ
ガンドIIIは次のように、４−（ｐ−メトキシフェニ
ル）−1,10−フェナントロリン（リガンドＩ）および４
−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−1,10−フェナントロリ
ン（リガンドII）を経て製造した。
75％ヒ酸（9.5ml、0.10モル）および85％オルトリン
酸（50ml）に８−アミノキノリン（7.22g、0.05モル）
を懸濁してなる懸濁液を、溶解が起るまで100℃で攪拌
し、この溶液を100℃でｐ−メトキシ−β−クロロプロ
ピオフェノン（12.8g、0.07モル）を用いて、120℃の温
度（１時間）を維持するような速度で処理した。温度を
135−140℃に上げたのち、140℃に1.5時間保った。この
混合物を氷（400ml）に注ぎ、水溶液を30％水酸化カリ
ウムでアルカリ性（pH8.5に）にした。タール質の褐色
沈澱をセライトを通して濾過し、熱いベンゼン／トルエ
ン（４×200ml）およびCHCl3（20ml）中に抽出した。抽
出物を褐色タールに濃縮し、これをトルエン（300ml）
で処理したのち、2.0M HCl（aq）（３×250ml）で抽出
した（E1）。この2.0M HCl（aq）抽出物は、冷却すると
ゆっくりと柱状物を生じた。難水溶性の黄かっ色沈澱
と、褐色粘稠タールが溶媒層間に形成された。この沈澱
を2.0M熱HCl（aq）（２×300ml）中に抽出した（E2）。
抽出物E1およびE2を真空下で濃縮し、残渣を水（100m
l）で処理した。この懸濁液を30％水酸化カリウム（a
q）で中和したのち、CHCl3中に抽出した。E2は、淡褐色
油（4.51g）−t.1.c（中性アルミナ、CHCl3）、一つの
主な（螢光）成分RF0.7および褐色基線成分（複数）を
与えた。前記の油を乾燥カラムフラスコクロマトグラフ
ィー（塩基性アルミナ、CHCl3）にかけたところ、灰色
がかった白色（off white）の油状固体を得た（3.88g,2
7％）。
E1からは、黄色の半固体（3.0g）が得られ、これは少
量含まれている不純物からさらに精製することが困難で
あることがわかったが、所望の生成物である４−（ｐ−
メトキシフェニル）−1,10−フェナントロリン（リガン
ドＩ）を主成分として含んでいた。
ジメチルホルムアミド（10ml）中の水素化ナトリウム
（50％分散、5.76g、0.0127モル）の攪拌した懸濁液
を、エタンチオール（0.81ml、0.0115モル）のジメチル
ホルムアミド（10ml）溶液で20℃（N2雰囲気）で滴々処
理し、混合物を20℃で0.5時間攪拌した。４−（ｐ−メ
トキシフェニル）−1,10−フェナントロリン（0.55g、
1.92×10-3モル）を加えたのち、混合物を還流下３時間
加熱した。水（150ml）を加え、黄色の溶液をトルエン
で（４×100ml）、次にCHCl3で（100ml）抽出した。水
性層のpHを12.5〜7.0に、2.0M HCl（aq）で調節し、水
性層をクロロホルムで（６×100ml）抽出した。CHCl3抽
出物を乾燥し（MgSO4）、真空下で、黄かっ色固体であ
る４−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−1,10−フェナント
ロリン（リガンドII）（0.28g、54％）に濃縮した。T.
L.C.（中性アルミナ;2−BuOH−H2O−酢酸、（13:6:2）
により、非常に淡い黄色のスポットRF0.65が得られる。
４−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−1,10−フェナント
ロリン（0.51g）のヘキサメチルホスホルアミド（HMP
A）（20ml）溶液を、カリウムｔ−ブトキシド（0.32g、
2.82×10-3モル）で20℃（N2雰囲気）で処理したのち、
20℃で0.5時間攪拌した。その黄色溶液をリチウムα−
ブロモ−ｐ−トルエート（0.42g、1.90×10-3モル）で
処理したのち、混合物を20℃で24時間攪拌した。水（50
ml）を加え、pHを2.0M HCl（aq）を用いて4.5に調節し
た。この混合物を真空下で20mlに濃縮し、ジメチルエー
テル（120ml）を加えた。黄かっ色の沈澱をセルロース
によって濾過し、ジメチルエーテル（100ml）で洗浄し
た。このセルロースと残渣をDMFで（３×30ml）抽出
し、抽出物を黄かっ色の固体に濃縮した。
シリカゲル上でのT.L.C.（２−BuOH−H2O−酢酸、13:
6:2は、主要な螢光発光成分RF0.57、少量の成分RF0.86
および褐色の基線生成物を示す。
未精製の固体を乾燥カラムフラッシュクロマトグラフ
ィー（シリカゲル、CHCl3−MeOH（1:1）に供したとこ
ろ、淡い黄かっ色の固体である４″−カルボキシベンジ
ル−４′−〔４−（1,10−フェナントロリン）〕フェニ
ルエーテル（リガンドIII）（0.52g、75％）を得た。T.
L.C.−１スポット（螢光発光性）（シリカゲル、CHCl3
−MeOH（1:1）−１％酢酸）、RF0.62。
リガンドIIIをIr(bipy)2に、J.Inorg.Nucl.Chem.,41,
495−507,（1979）に実質的に記載され、および上記1.3
項に一般的に記載されているようにして、付加した。
1.11 Ir(bipy)2(4,7-シ゛フェニル-1,10-フェナントロリン)3+ （Ir(bipy)2DPPhen3+） 最初にIr(bipy)2 3+を製造し（上記1.3項参照）、次
に、J.Inorg.Nucl.Chem.,41,495−507,（1979）に記載
され、かつ上記1.3項に一般的に記載されているように
して、DPPhenを付加してIr(bipy)2DPPhen3+を製造し
た。
1.12 Ir(bipy)2（2,2′−ビキノリン）3+ Ir(bipy)2Biquin3+ 最初にIr(bipy)2 3+を製造し（上記1.3項参照）、次
に、J.Inorg.Nucl.Chem.,41,495−507,（1979）に記載
され、かつ上記1.3項に一般的に記載されているように
して、Biquinを付加してIr(bipy)2Biquin3+を製造し
た。
1.13 Ir(phen)2（４′−〔４−（1,10−フェナントロ
リン）〕−フェニオキシ酢酸3+ （Ir(phen)2IV3+ 最初にIr(phen)2 3+を製造し（上記1.4項参照）、次に
J.Inorg.Nucl.Chem.,41,495−507,（1979）に実質的に
記載され、かつ上記1.3項に一般的に記載されているよ
うにして、リガンド（IV）（上記1.9項参照）を付加し
てIr）phen)2IV3+を製造した。
1.14 Ru(bipy)2（４−（３−ヒドロキシプロピル）−
４′−メチル−2,2′−ビピリジン）2+ (Ru(bipy)2(bipyMe((CH2)3OH))2+） 最初に(Ru(bipy)2 3+を製造し（上記1.1項参照）、次
にbipyMe((CH2)3OH)を付加してRu(bipy)2(bipyMe((CH2)
3OH)2+を製造した。
Ｎ−ブチルリチウム（1.57Mを18ml）を乾燥THF（5m
l）中のジイソプロピルアミン（4ml）の溶液を加え、得
られた混合物を15分間攪拌に供した。次に、乾燥THF（1
25ml）中の4,4′−ジメチル−2,2′−ビピリジン（5g,
0.03モル）をゆっくり加えた。２時間後、エチレンオキ
サイド（THF 10ml中1.26g、0.03モル）飽和溶液を約０
℃で加え、冷時、30分間攪拌を続けたのち、15分間、穏
やかに還流した。このあと、反応混合物は赤変し、水を
この溶液に加え、次にエーテルを用いて抽出した。この
エーテルを無水Na2SO4で乾燥し、濾過したのち、真空下
で、除去したところ、白色固体（出発物質）を含む褐色
油を得た。次に、この油を少量のエタノールとともにこ
ねり、白色固体を沈澱させた。これを濾過し、エタノー
ルを減圧下で除去したところ、褐色の半固体状油を得
た。
1.15 Ru(phen)2（４″−カルボキシベンジル−４′−
〔４−（1,10）−フェナントロリン）〕フェニルエーテ
ル2+ Ru(phen)2III2+） 最初にRu(phen)2 2+を製造し（上記1.2項参照）、次
に、次のようにリガンドIIを付加してRu(phen)2III2+を
製造した。
沸騰するエタノール−水（1:1）（40ml）中のRu(phe
n)2Cl2（0.65g、1.508×10-3モル）の溶液を、熱エタノ
ール（40ml）中の４−（４′−ヒドロキシフェニル）−
1,10−フェナントロリン（0.45g、1.508×10-3モル）で
処理し、混合物を還流下（N2雰囲気）３時間加熱した。
真空下での濃縮によって固体を生じ、これをセファデッ
クスLH20（EtOH）でクロマトグラフィーにかけ、オレン
ジ色の固体として所望の錯体を得た（1.1g 100％）。
次に、Ru(phen)2II2+を、次のようにしてRu(phen)2II
I2+に変えた。： ジメチルホルムアミド（5ml）中の水素化ナトリウム
（0.078g、1.615×10-3モル）の懸濁液を、ジメチルホ
ルムアミド（10ml）中のRu(phen)2〔４−（４′−ヒド
ロキシフェニル）−1,10−フェナントロリン〕Cl2（0.1
3g、3.23×10-4モル）の溶液で、20℃（N2雰囲気）でゆ
っくりと処理し、混合物を20℃で0.5時間攪拌した。α
−ブロモ−ｐ−トルイル酸（0.069g、3.23×10-4モル）
を加え、この混合物を20℃で48時間攪拌した。水（100m
l）を加え、2.0M塩酸でpHを1.5に調節し、真空下で溶媒
を除去した。褐色の残渣を、セルロース（２−ブタノー
ル−水−酢酸、8:1:1）でのクロマトグラフィーにかけ
たところ、黄色の固体として所望の錯体を得た（0.07g,
46％）。
1.17 Ru(phen)2（４′−〔４−（1,10−フェナントロ
リン）〕−フェノキシ酢酸 Ru(phen)2IV2+ 最初にRu(phen)2 2+を製造し、次に上記1.16項に記載
したようにリガンドIIを付加してRu(phen)2IV2+を製造
した。次いで、次のようにしてRu(phen)2II2+をRu(phe
n)2IV2+に変えた。
ジメチルホルムアミド（DMF）（20ml）中の水素化ナ
トリウム（0.18g、3.42×10-3モル）の溶液を、DMF（25
ml）中のRu(phen)2〔４−（４′−ヒドロキシフェニ
ル）−1,10−フェナントロリン〕Cl2（0.43g、5.34×10
-4モル）の溶液を用いて、20℃で（N2雰囲気）ゆっくり
と処理し、混合物を20℃で0.5時間攪拌した。α−ブロ
モ酢酸（0.13g、9.18×10-4モル）および追加の水素化
ナトリウムを加え、この混合物を140℃で18時間加熱し
た。水（100ml）を加え、2.5M塩酸でpHを3.0に調節した
のち、真空下で溶媒を除去した。エタノール抽出物を真
空下で濃縮し、褐色の残渣をセファデックスLH20（溶離
剤EtOH）およびセルロース（２−ブタノール−水−酢
酸、13:6:2）でのクロマトグラフィーに供したところ、
黄色固体として所望の錯体を得た（0.12g、26.5％）。
上記のエタノール中の４′−〔４−（1,10−フェナン
トロリン）〕−フェノキシ酢酸を用いての、エタノール
−水（1:1）中のRu(phen)2Cl2の処理もまた、所望の錯
体を与えた。
1.18 Ru(phen)2（4,7ジフェニルフェナントロリンジス
ルホン酸）2+ Ru(phen)2dpphen(OSO3H)2 2+ Ru(phen)2Cl22H2O（mw568）0.20gを、バソフェナント
ロリンスルホン酸ナトリウム塩、水和物0.30g（mw536.
5、アルドリッチ）に加え、これらを水30mlおよびメタ
ノール5mlの中に溶解させた。この混合物を還流温度で
２時間加熱したところ、赤色の懸濁液を生じた。
この混合物を冷却し、赤色沈澱を濾過し、エーテルで
（４×40ml）洗浄した。次に、この固体を水から再結晶
させ、P2O5上真空下で一晩乾燥した。（収量0.20g） 1.19 Ru(phen)2（4,7ジフェニルフェナントロリンジス
ルホニルクロリド酸）2+ Ru(phen)2dpphen(OSO2Cl)2 2+ Ru(phen)2dpphen(OSO3H)2 2+2Cl-3H2O（1.18項参照）
0.05gをクロロスルホン酸10mlに注意して溶解させた。
これを窒素下、２時間、120℃に加熱した。RuIIからRuI
IIへの酸化に対応して、色が赤から緑に変化した。この
混合物を０℃に冷却し、次に約300mlの氷に注意深く、
滴下して加えた。すぐに赤色の溶液が生成し、これをジ
クロロメタンで（２×150ml）抽出した。抽出物を塩化
カルシウムを用いて２日間乾燥した。乾燥剤を除去した
のち、抽出物をロータリー蒸溜で固体にした。赤色の固
体が種々の収量で製造され（反応を数回繰り返した）、
P2O5上真空下で乾燥した。
（収量１−15mg）。
螢光測定は、この化合物が典型的なRuトリス−フェナ
ントロリン化合物であることを示したが、その短い寿命
（表II参照）は共有結合で結合したハロゲン（Cl）が存
在することを示し、これが、抗体との結合時に失われる
と元のスルホン酸に類似した長い寿命を示した。
1.9から1.19項に記載された錯体の螢光特性を測定し
た。表IIに示す。
2.錯体／抗体接合体（conjugates）の製造 上記1.1項から1.19項までに記載されている錯体を、
リガンドの１つを誘導（即ち活性化）して抗体に共有結
合させることができる。
このような誘導体の適当なものとしては、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル（NHS）のような活性エス
テル、およびクロロホルメート、イソチオシアンテ（is
othiocyantes）のような他の反応基があげられる。
2.1 一般的な接合（conjugation）方法 抗体金属キレートの純粋な未反応キレートを含まない
接合体を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、遷
移金属キレートのクロロホルメートまたはイソチオシア
ネートおよび抗体を用いて製造した。
材料および方法 ジメチルホルムアミド（DMF） 0.05M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液 pH9.6 セファデックスＧ−25 リン酸塩緩衝食塩水（PBS） 接合 200,100または500モル過剰のキレートをDMF溶液とし
て、0.05M炭酸塩／重炭酸塩pH9.6を溶媒とする抗体溶液
に、活性化キレートに対する抗体の体積比が5:1で過剰
割合で、滴下して加えた。反応液を室温で１晩、暗所
で、穏やかに攪拌しながら置いた。
反応条件 Ab:キレート 1:50/100/200 M:M 50:1 vol/vol 分離 反応後、混合物を12,000×ｇで３分間遠心分離機にか
け、生成したペレットはすべて捨てた。上清をセファデ
ックスＧ−25カラム（１×30cm）で、PBS中、0.5ml分で
分画した。1mlの画分（複数）を集めた。
溶出した画分のO.D.を、280nmおよび各キレートごと
の最大λexで読み取った。タンパク質を含む画分を貯
め、アミコン（Amicon）CM30濃縮機を用いて濃縮した。
結果 ２つのピークがカラムから溶出され、小さい方の先行
ピークはタンパク質画分に対応し、大きい方の第２のピ
ークは非接合キレートに対応した。タンパク質画分中に
存在するキレートのλex最大値におけるすべての吸収は
抗体への金属キレートの共有結合による結合を示してい
ると考えられ、このことはベックマン（Beckman）SPE−
IIシステムでのゲル電気泳動によって確認された。
2.2 Ru(bipy)2IIICl2／抗体接合体 乾燥アセトニトリル（30ml）中のRu(bipy)2IIICl
2（0.24g,2.82×10-4モル）をジスクシンイミダル（dis
uccinimidal）カーボネート（0.36g,1.41×10-3モル）
と共に加熱し、混合物を50℃で（N2雰囲気）24時間攪拌
した。この混合物を真空下で濃縮し、オレンジ色の残渣
をセファデックスLH20（メタノール，溶離剤）でクロマ
トグラフィーに供したところ、オレンジ色の固体（0.2
g）を得た。T.L.C.（セルロース；CHCl3−MeOH（1:1）
は１つのスポットRF0.9を与えた。この生成物を上記2.1
項に記載された一般的方法によって、抗甲状腺刺激ホル
モン（TSH）モノクローナル抗体と接合させた。
2.3 Ir(bipy)2４−フェニル−７−フェニル（４′−フ
ェニル酢酸）、1,10 フェナントロリン3+／抗体接合体 Ir(bipy)2V3+／抗体接合体） 次のようにしてIr(bipy)2V3+を製造した。
Ir(bipy)2dpphen3+（50mgの攪拌されたクロロホルム
（10ml）溶液に酢酸カリウム（8.6mg）および４−ジア
ゾフェニル酢酸（27mg）を加え、混合物を室温で１時間
攪拌した。真空下での蒸留によって、残渣が生じ、これ
をMeOHに溶解し、LH−20でメタノールを溶離液とするク
ロマトグラフィーに供した。
緑がかった螢光帯を集め、それにイソプロパノール
（20ml）を加えた。真空下での蒸留によって、黄色固体
を得た。（収量:30mg）。
この錯体を上記2.2項に記載されたように、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルに活性化し、抗TSH モ
ノクローナル抗体に接合させた。
2.4 Ru(bipy)2bipy(CONCS)2 2+／抗体接合体 ジアシルクロリド誘導体を経て、2,2′−ビピリジン
4,4′ジアシルイソチオシアンテリガンドを製造した。
2,2′ビピリジン4,4′ジカルボン酸1.0gを乾燥トルエ
ン200mlおよび塩化チオニル25ml中に懸濁させた。この
混合物を、全固体が溶解しピンク／オレンジ色の溶液に
なるまで、窒素下、還流温度で加熱した。塩化チオニル
をこの溶液から分別蒸留し、さらにトルエンを加えた
（100ml）。この分別蒸留を溶液約50mlが残るまで繰り
返した。これをロータリー蒸発で固体になるまで減量し
たところ、クリーム／黄の固体が残った。これを４時間
ポンプダウンして乾燥した。（収量:0.5g） 分析：赤外−1708cm-1に塩化アシルの特性ピーク 2,2′−ビピリジン4,4′ジアシルクロリド0.20gを乾
燥アセトン800ml中のカリウムチオシアンテ0.42gに加え
た。この溶液を加熱し、１時間攪拌し、そののち、まだ
熱いうちに濾過した。この溶液を冷却したのち、ロータ
リー蒸発で溶媒を除去したところ、アセトンによく溶け
る黄色固体を得た（出発物質は、アセトンに難溶にすぎ
ぬものであった）。（収量:0.31g） 分析：赤外は、1630cm-1（芳香族Ｃ−Ｃ）および2064
cm-1（Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）に芳香族およびイソチオシアネート
化合物に特徴的伸縮を示す。
Ru(bipy)2Cl22H2O 0.25gを、2,2′ビピリジン4,4′ジ
アシルイソチオシアネート0.31gに加えた。これらをHPL
C等級のアセトニトリル（Rathburn）50mlに溶解させ、
窒素下、還流温度で２日間加熱した。次に、約3ml残る
まで、ロータリー蒸発で、溶媒を除去した。水200mlを
攪拌しながら加えた。未反応のRu(bipy)2Cl2H2Oおよびb
ipy(CONCS)2が沈殿した。これらを迅速に除去したとこ
ろ、赤色の溶液が残った。（水溶液を扱うこの作業部分
は錯体上のイソチオシアンテ基の加水分解を最小にする
ために迅速に行わねばならない）。この赤色溶液に過剰
のアンモニウムヘキサフルオルホスフェート（0.5g）を
加えたところ、瞬間的に赤色沈殿を生成した。この沈殿
を濾過によって回収し、シリカ上で真空下24時間乾燥し
た。（収量:0.15g）。
分析：赤外は、2101cm-1に−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ特性ピークを示
した。文 献値の範囲2150−205cm-1（−Ｓ−Ｃ−Ｎ異
性体は2170−2135cm-1に認められず、また−CH3CNも226
0−2240cm-1に認められない）。
2.5 Ru(bipy)2bipy(Me)(CH2)3OH／抗体接合体 シス−ジクロロビス（2,2′−ビピリジンルテニウム
（II））（484mg,1ミリモル）および４−（３−ヒドロ
キシプロピル）−４′−メチル−2,2′−ビピリジン
（0.2739g,1.2×10-3モル）（不純物が存在してもよい
ように、少し過剰に使用）を加熱し、窒素下、エタノー
ル（250ml）中で19時間還流させた。19時間後、TLCは基
線にオレンジ色の主スポット（生成物）を示し、次に非
常に弱く早い反応混合物を熱濾過し、アンモニウムヘキ
サフルオロホスフェート（1.00g）のメタノール（20c
m3）溶液で処理したのち、冷却した。冷却すると、赤色
の結晶がゆっくりと析出し、これを濾過によって集め
た。
ビス（2,2′−ビピリジン）（４−〔３−ヒドロキシ
プロピル〕−４′−メチル−2,2′−ビピリジン）ルテ
ニウム （II）ヘキサフルオロホスフェート（0.1151g,1.15×10
-4モル）を、可能な最少量の乾燥THFに溶解させた。次
に、これをトルエン（5ml）中の12.5％W/W）ホスゲンに
滴下して加えた。添加後、この溶液をさらに半時間攪拌
し、次に未反応のホスゲンを水ポンプを用いて除去し
た。次に、反応混合物を蒸発乾涸したところ、少量のオ
レンジ色の固体が残った。
電子スペクトル：励起最大480nm 発光最大610nm IgG（2.82mg,1.88×10-8モル）を標識用緩衝液（pH9.
4）（1ml）に溶解した。100モル過剰のDMF（1/10ml）中
の錯体（2.00mg,1.88×10-6モル）を、IgG溶液にゆっく
りと加え、発生する熱によってタンパク質が変性するの
を避けるようにした。
次に得られた溶液を１晩冷蔵庫中に置いた。
PBS緩衝液（pH7.4）を溶離液として用い、標識用溶液
をカラム（セファデックスＧ−25）を通過させた。この
カラムは明るく着色したバンドを示し、これを集めた。
この画分は抗体を含むことを示した。
電子スペクトル：励起最大469nm 発光最大610nm 2.6 Ru(phen)2dpphen(SOCl2)2 2+／抗体接合体 Ru(phen)2dpphen(SO2Cl2)2 2+（1.18項参照）をヒトガ
ンマグロブリンに接合させた。
2.1項から2.6項までに記載した接合体の螢光特性を表
IIIに示す。
2.2および2.3 抗TSH MAbに接合された。
2.4〜2.6 ヒトガンマグロブリンに接合された。
3.ルテニウム（II）トリスビピリジル誘導体を製造し、
この誘導体をモノクローナル抗体に結合する合成を行な
った。イソチオシアネートおよびビピリジンの活性エス
テル誘導体を製造し、ビピリジル分子に抗体上のアミノ
基に共有結合により結合するようにビピリジル分子に官
能基を設けた。
この合成を式１に概略的に示す。
1.合成のステップは次のように行なった。
ステップ（ａ）4,4′ジメチル2,2ビピリジンの合成。
新たに蒸留した４−ピコリン（600ml）をカーボン担
持パラジウム10％（W/W）とともに５日間還流させた。
この混合物に熱いベンゼン100mlを加えた後、さらに１
時間還流させた。次いで、カーボン担持パラジウムを濾
過（ガラスファイバー濾紙）により除去した。透明な黄
色溶液が得られるまで濾過をくり返した。溶液の体積を
回転エバポレータで約200mlに減らし、24時間放置し
た。現れた白色結晶を収集した後、エチルアセテートか
ら再結晶させた。無色の固体を回収した。
収量:17g。
ステップ（ｂ）4,4′−ジカルボキシ−2,2′−ビピリジ
ルの製造 水400mlを4,4′ジメチル2,2′ビピリジル4gと過マン
ガン酸カリウム25gに加えた。この混合物を14時間還流
させた。茶色の二酸化マンガンを沈殿させ、還流後濾過
で除去した。濾液をエーテルで３回洗浄して（未反応の
出発物質を除去し）、次に水相を保持した。次に、微細
な白色沈殿が残存するに至るまで、濃硫酸を該水相に攪
拌下滴下した。この沈殿を濾過で集め、真空下シリカで
24時間乾燥した。
収量:1.7（24％） ステップ（ｃ） ルテニウムビスビピリジルジクロリド Ru(bipyl)2Cl2・2H2Oの製造 ルテニウムクロリド３水和物（2.5g）、2,2′ビピリ
ジル（3.0g）およびリチウムクロリド（5.0g）の混合物
を、窒素下でDMF50mlに加えた。この混合物を７時間攪
拌し還流させた。生じた紫／黒の溶液を攪拌を継続しな
がら約150℃まで徐々に冷却した。次に、アセトン250ml
を加え、フラスコに窒素下で栓をした。この溶液を０℃
に24時間置いた。黒色の微細結晶質の固体を濾過で回収
し、これを水で３回、ジエチルエーテルで３回洗浄し
た。
収量:3.0g ステップ（ｄ） ルテニウム トリスビピリジル ジカ
ルボン酸 〔Ru(bipy)2bipy(CO2H)2〕2+の製造 ルテニウム ビス ビピリジル ジクロリド（520m
g）、4,4′ジカルボキシ2,2′ビピリジル（300mg）およ
び重炭酸ナトリウム（330mg）を水15mlおよびメタノー
ル10mlに加えた。この混合物を攪拌下で２時間還流させ
た。溶液の色が黒／紫から明るい赤色の溶液に変化し
た。この溶液を冷却し、ヘキサフルオロリン酸アンモニ
ウムの飽和水溶液25mlを加えた。生じた溶液を０℃に18
時間置き、次に溶液を室温で数時間大気中に開放し、濾
過して結晶を集めることによりオレンジ色の結晶を回収
した。
収量:0.2g 螢光励起 288nm 456nm 466nm 発光 638ブロード ステップ（ｅ）ルテニウム トリス ビピリジル Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド誘導体の製造 ルテニウムビピリジル二酸38mg、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド18mgおよびジシクロヘキシルカルボジイミド
（DDCI）32mg（過剰）を一緒に、DMF中、室温で攪拌し
た。DCCIは反応してDCUになる。次に、活性エステル
（0.1ml）のDMF溶液を抗体（抗体を含む塩基の水溶液1m
l）に加える。
螢光の分析： 発光 647nm 溶媒 DMF 励起 475nm 上記のステップ（ｅ）で製造した化合物を抗体に加え
て接合体を生成させた。
塩基水溶液、例えば、0.1MのNa2CO3である標識用溶液1m
l中にわかっている重量の抗体を加えた。この重量がわ
かっている抗体に、DMF0.1mlを溶媒とする標識を10倍過
剰量加えた。DMF溶液は、抗体を損なわないように非常
にゆっくり加えた。次に、標識した溶液を０℃に18時間
置いて、接合を起させた。
未反応の標識の分離は、次の３方法の１つを使用して
行なった。
1.標識した溶液をPIOカラム（セファデックス）に通
し、リン酸塩緩衝液（PBS）で溶出させる。
2.標識した溶液をPBS中で透析した後、その溶液を上記P
IOカラムを通過させる。
3.標識した溶液をG25セファデックス・カラム（10mlピ
ペット中）を通し、PBSで溶出させる。
方法２と３はこれら溶液の分離に満足できる結果が得
られることがわかった。方法１は、カラムの長さが不十
分であるため、各画分の分離が若干不確かである。上記
の分離方法を、抗体とRu(bipy)2bipy(CO2H)2+の溶液で
試した。これら方法は、抗体からルテニウム錯体を完全
に除去することが求められる。このことは方法２および
３によってなし遂げられた。
答えの“イエス”は、ルテニウム・トリス・ビピリジ
ル誘導体が分離後に抗体画分に若干保持されたことを示
す。このことは肉眼でしばしば見られ、螢光分光法では
常に確認される。
この金属標識された抗体は、現存の装置に用いて時間
分解発光イムノアッセイを行なうことができる。
共有結合により抗体に結合させられた錯体は、該錯体
接合体を、空気を飽和させたpH約7.5の塩基水溶液に溶
解することで試験することができる。この溶液は、その
錯体の励起波長について、光学的密度が１のはずであ
る。また、レーザーまたは閃光源を使用して、発行の寿
命を記録することができる。
4.検定方法 4.1 一般的方法 ２−サイト（two−site）イムノアッセイを、マイク
ロタイターフォーマットで行なうことができる。これ
は、被検体分子上の別々の抗原決定基（epitopes）に結
合する２種のモノクロナール抗体を使用するものであ
る。
被検体の濃度は、マイクロタイターの穴に固定化され
た抗−被検体モノクローナル抗体とのインキュベーショ
ンにより定量される。次に、螢光標識された２番目の抗
体を、穴中の抗体−抗原複合体に加える。第２のインキ
ュベーション工程の後、未反応標識を洗い去り、固体化
抗体−抗原−抗体・螢光団（fluorophor）複合体をプレ
ートから塩溶液に溶離された後、螢光を測定する。
螢光は、相分解螢光分光法（Phase−Resolved fluove
scence spectroscopy）で測定した。“ヒト血清アルブ
ミンの相分解フルオロイムノアッセイ”、Tahout,Y.R.,
McGowen,L.B.（1986）,Analytical Chemistry Acta Vo
l.182,185−191。
4.2 Ir(bipy)2ジェニルフェナントロリン／抗体接合体
を螢光標識抗体として用いるTSH IFMA 材料 TSH抗原 抗−TSHモノクローナル抗体 96穴マイクロタイタープレートNUNC 0.25Mトリス塩酸pH8.5緩衝液、２％BS含有（BS＝加熱
不活性化ウシ血清） 0.1Mグリシン/HCl pH2.5緩衝液 0.05M重炭酸塩（ナトリウム） 洗浄緩衝液:0.1M酢酸塩／くえん酸塩、pH60、5mM ED TA
及び0.05％Tweeem20含有 方法 1.プレートのコーティング 抗TSHモノクローナル抗体10μg/ml含有する50mM重炭
酸塩溶液200μｌを各穴に加え、37℃で16〜20時間イン
キュベートした。これらの穴を0.2％BSA及び0.1％ラク
トースを含有する上記の重炭酸塩溶液中で一度洗浄した
後、この溶液中に30分間置いた。最後に、プレートを50
mM重炭酸塩中で洗浄し、軽く打いて水切りし、空気中で
乾燥し、密封し、４℃で保管しておいて使用に供した。
2.検定 0.25Mトリス塩酸（pH8.5）で２％ウシ血清を含むもの
に濃度10μg/mlで加えたイリジウム標識モノクローナル
抗体を用いた。
TSH抗原は、上記トリス緩衝液に、500,250,100,50,25,0
mU/Lに希釈して用いた。１抗原点につき５回反復した。
TSH標準0.1mlを各穴に加え、振とうしながら室温で30
分間反応させた。穴を洗浄緩衝液で３回洗浄した後、軽
く打たいて水切りした。次に、標識した抗体0.2mlを各
穴に加え、振とうしながら室温で、１時間反応させた。
未結合標識を洗浄緩衝液中３回の洗浄で洗い去った後、
プレートを軽く打いて水切りをした。
該アッセイの生成物を、0.1Mグリシン−HCl（pH2.4）
0.2mlを30分間加えておくことにより溶離させた。
各抗原点について５回の反復試験体を貯めておき、螢
光を測定した。
結果 様々な螢光強度の応答が、TSH 500mU/Lの量まで検出
された。
本発明は上記に単に例示されただけで、本発明の範囲
内において詳細な改変をなし得ることは理解できよう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−73066（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−10796（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−186170（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−500663（ＪＰ，Ａ) Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔｅｒｓ, 79（１），Ｐ．169−73，（1981) Ａｕｓｔｒａｌｏａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，17，Ｐ. 325−36，（1964) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｏｅｇａｎ ｉｃ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ，41，Ｐ．495−502，（1979)

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】金属標識された結合パートナーを伴なう時
    間分解発光結合イムノアッセイ方法であって、該金属標
    識が二座リガンドを有する発光性遷移金属錯体（ただ
    し、一般式： Ru2+L1L2L3 〔ここで、L1，L2およびL3は同一か異なるもので、各
    々、含窒ヘテロ環を少なくとも２個含む二環式または多
    環式のリガンドを意味し、これらリガンドの少なくとも
    １つは少なくとも１つの水溶性を付与する基によって置
    換され、またこれらリガンドの少なくとも１つは少なく
    とも１つの反応性の基によって置換され（介在基を介し
    ていてもよい）、さらにリガンドL1，L2およびL3は窒素
    原子を介してルテニウムに結合されている〕 で表わされるルテニウム錯体を除く）を含んでなること
    を特徴とする方法。
  2. 【請求項２】請求の範囲第１項記載の時間分解発光結合
    イムノアッセイ方法であって、遷移金属がルテニウム、
    イリジウム、オスミウムまたはクロムである方法。
  3. 【請求項３】請求の範囲第１項記載の時間分解発光結合
    イムノアッセイ方法であって、金属標識が１または２以
    上のリガンドと錯体化された遷移金属を含み、それらリ
    ガンドの少なくとも１つは該錯体を前記結合パートナー
    に共有結合により結合させる化学結合を備えている方
    法。
  4. 【請求項４】二座配位子を有する発光性ルテニウム錯体
    （ただし、一般式： Ru2+L1L2L3 〔ここで、L1，L2およびL3は同一か異なるもので、各
    々、含窒ヘテロ環を少なくとも２個含む二環式または多
    環式のリガンドを意味し、これらリガンドの少なくとも
    １つは少なくとも１つの水溶性を付与する基によって置
    換され、またこれらリガンドの少なくとも１つは少なく
    とも１つの反応性の基によって置換され（介在基を介し
    ていてもよい）、さらにリガンドL1，L2およびL3は窒素
    原子を介してルテニウムに結合されている〕 で表わされるルテニウム錯体を除く）またはイリジウム
    錯体に共有結合で結合された結合パートナーからなる、
    時間分解発光結合イムノアッセイ用の金属標識された結
    合パートナー。
  5. 【請求項５】請求の範囲第４項記載の金属標識された結
    合パートナーであって、該結合パートナーが抗原または
    抗体であるもの。
  6. 【請求項６】二座配位子を有する発光性遷移金属錯体
    （ただし、一般式： Ru2+L1L2L3 〔ここで、L1，L2およびL3は同一か異なるもので、各
    々、含窒ヘテロ環を少なくとも２個含む二環式または多
    環式のリガンドを意味し、これらリガンドの少なくとも
    １つは少なくとも１つの水溶性を付与する基によって置
    換され、またこれらリガンドの少なくとも１つは少なく
    とも１つの反応性の基によって置換され（介在基を介し
    ていてもよい）、さらにリガンドL1，L2およびL3は窒素
    原子を介してルテニウムに結合されている〕 で表わされるルテニウム錯体を除く）を結合パートナー
    に共有結合で結合する工程を有する、時間分解発光結合
    イムノアッセイ用の金属標識された結合パートナーの製
    造方法。
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