JPH0812594A - アンジオテンシンｉ変換酵素阻害ペプチド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 より活性の高いアンジオテンシンＩ変換酵素
阻害ペプチド誘導体を提供する。 【構成】 下記式（１）に示す構造を有し、構成アミノ
酸はＬ体の構造を持つアンジオテンシンＩ変換酵素阻害
ペプチド誘導体。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高血圧の治療に有用で
あると考えられるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプ
チド誘導体に関する。

【０００２】

【従来の技術】高血圧症は、最大血圧が１６０ｍｍＨｇ
以上か、最小血圧が９５ｍｍＨｇ以上または両者がそれ
以上の状態である。わが国では患者数が約２０００万人
であるといわれ、り患率の高い疾病である。高血圧症
は、脳出血、脳梗塞、クモ膜下出血、狭心症、心筋梗
塞、腎硬化症、腎不全、網膜静脈閉塞症など広範囲の臓
器にわたって様々な合併症を生じることが知られてお
り、有効な治療薬が望まれている。

【０００３】生体内において血圧を調節するメカニズム
の一つとして、昇圧系であるレニン−アンジオテンシン
系と降圧系であるカリクレイン−キニン系がある。レニ
ン−アンジオテンシン系では酵素レニンが腎臓の傍糸球
体細胞（Ｊ．Ｇ細胞）で生成され、血管でレニン基質で
あるところのアンジオテンシノーゲンに作用してアンジ
オテンシンＩを生成する。このアンジオテンシンＩをア
ンジオテンシンＩＩに変換する酵素がアンジオテンシン
Ｉ変換酵素であり、生じたアンジオテンシンＩＩは細動
脈に作用して収縮を起こさせる。

【０００４】また、アンジオテンシンＩＩは副腎皮質に
も作用してアルドステロンの合成と分泌を促し、腎臓で
のナトリウムの再吸収を促進し、体液量を保持する働き
もある。このようにしてアンジオテンシンＩＩによって
血圧が上昇する。一方、カリクレイン−キニン系では、
蛋白分解酵素であるカリクレインが、基質であるところ
のキニノーゲンに作用してキニンを生じる。キニンは血
管を拡張させ、血圧を下げる働きを有するが、キニナー
ゼＩＩによって分解を受ける。キニナーゼＩＩはアンジ
オテンシンＩ変換酵素と同一物質であることが知られて
いる。以上のことから、アンジオテンシンＩ変換酵素を
阻害することによる高血圧の治療を行うことができると
考えられる。

【０００５】この考え方により現在、カプトプリル、エ
ナラプリル、アラセプリル等の合成医薬が開発されてい
る。また、天然物からはカゼインやゼラチン、魚肉、家
畜の血液などに由来するペプチドも、アンジオテンシン
Ｉ変換酵素を阻害する働きがあることが知られている。
（特開昭５９−４４３２４号、特開昭６４−５４９７
号、特開平０１−３１３４９８号、特開平０５−３０６
２９５号他）

【０００６】

【発明が解決しようとしている課題】カプトプリルは、
内服で強力な血圧降下作用を示す。しかし、使用量が不
適当であると腎機能障害や低血圧をもたらす。また、分
子内に存在するＳＨ基のため、発疹や味覚異常を引き起
こすとも言われている。

【０００７】安価な天然物であるカゼイン、ゼラチン、
魚肉などに由来するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペ
プチドも多く見いだされてきている。しかし、これらは
分離精製が困難な上、収率が悪いので、精製ペプチドと
しての実用化はされておらず、合成医薬と比較するとｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでの活性は弱い。本発明は、より高い活
性を有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド誘
導体を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため検討を進め、最近多数見出されている天
然物由来のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドの
構造を比較した結果、Ｃ末端は大きなアミノ酸の方がよ
いことがわかった。そこで、既報のアンジオテンシンＩ
変換酵素阻害ペプチドＩｌｅ−Ａｒｇ−ＰｒｏのＣ末端
をアミド化して、より高いアンジオテンシンＩ変換酵素
阻害活性を得ることができ、本発明を完成するに至った
のである。すなわち、本発明は、下記式（１）に示す構
造を有し、構成アミノ酸はＬ体であるアンジオテンシン
Ｉ変換酵素阻害ペプチド誘導体である。

【０００９】

【化２】

【００１０】本ペプチドは、ｔ−Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシ
カルボニル）−アミノ酸を用いる固相合成法などの既知
の化学合成法［生化学実験講座１，タンパク質の化学Ｉ
Ｖ第ＩＩ部 ペプチド合成（Ｐ．４０１），日本生化学
会編 東京化学同人、続生化学実験講座２ タンパク質
の化学下，２０章ペプチド合成（Ｐ．６４１），日本生
化学会編 東京化学同人］で製造することができる。す
なわち、以下のとおりである。まず、固相合成法により
ベンズヒドリルアミン樹脂にペプチド誘導体のＣ末端の
ペプチドを導入し、Ｎ末側に向かって順次導入してい
く。導入にはｔ−Ｂｏｃアミノ酸を用い、Ｂｏｃ基を除
去しつつペプチド鎖を延長する。次に、ペプチドの脱保
護および樹脂からの切り出しを行なうが、これは無水フ
ッ化水素法による。ここで得られた粗ペプチドをＨＰＬ
Ｃにより精製する。ここで用いる樹脂およびｔ−Ｂｏｃ
アミノ酸は（株）国産化学で入手でき、ペプチド自動合
成装置を用いて簡便に合成可能である。

【００１１】

【発明の効果】本発明によれば、既報のアンジオテンシ
ンＩ変換酵素阻害ペプチドＩｌｅ−Ａｒｇ−ＰｒｏのＣ
末端をアミド化することにより、さらに活性の高いペプ
チドを得ることができる。

【００１２】

【実施例】以下、実施例を述べて本発明を具体的に説明
する。 （実施例１）アプライド バイオシステム社のペプチド
合成機 ペプチドシンセサイザー４３０Ａを使用し、原
料として、実施例１ではベンズヒドリルアミン（ＢＨ
Ａ）レジン（ｐ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＢＨＡ−Ｒｅｓｉｎ，
ＡＢＩｃａｔ＃４００２２９）を、比較例ではＰＡＭプ
ロリンレジン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＰＡＭ−Ｒｅｓｉ
ｎ，ＡＢＩｃａｔ＃４００１０４）を用い、さらに、双
方ともｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、ｔ−Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏ
ｓ）、ｔ−Ｂｏｃ−Ｉｌｅ（それぞれ国産化学ｃａｔ＃
２５−０５０２９、＃２５−０５７６２、＃２５−０４
６７７）を用いて、ｔ−Ｂｏｃ固相合成法により式
（１）で示されるペプチド誘導体および比較のためのペ
プチドＩｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを合成した。Ｉｌｅ−Ａ
ｒｇ−ＰｒｏはＰＡＭプロリンレジンをスタートレジン
として用い、以下、Ａｒｇ、Ｉｌｅの順にアミノ酸を結
合させ、最後に合成機上でアミノ基の脱保護を行なっ
た。さらに、これを無水フッ化水素（ＨＦ）で処理する
ことによって、樹脂からの切り出しと側鎖の脱保護を行
い、Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの粗ペプチドを得た。式
（１）で示されるペプチド誘導体は、ＢＨＡレジンをス
タートレジンとして用い、以下，Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｉｌ
ｅの順にアミノ酸を結合させ、最後に合成機上でアミノ
基の脱保護を行なった。さらに、これをＨＦ処理する
と、Ｃ末アミド体の粗ペプチド誘導体が得られた。これ
までに得られた粗ペプチドおよび粗ペプチド誘導体を、
下記条件のＨＰＬＣで分取し、精製した。

【００１３】 ＨＰＬＣ条件１ カラム ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ Ｒ−ＯＤＳ Ｓ−５ １２０ ２５０×２０ｍｍ 流速 ７．０ ｍｌ／ｍｉｎ 溶離液 Ａ： ０．１％ トリフルオロ酢酸 Ｂ： ０．１％ トリフルオロ酢酸 ７０％アセトニトリル Ａ９９％から２５ｍｉｎ後Ａ７４％になるような 直線グラジエント 得られたペプチドおよびペプチド誘導体の純度を、下記
条件のＨＰＬＣで検定した。

【００１４】 ＨＰＬＣ条件２ カラム ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ Ｒ−ＯＤＳ Ｓ−５ １２０ ２５０×４．６ｍｍ カラム温度 ３５℃ 流速 １．０ ｍｌ／ｍｉｎ 溶離液 Ａ： ０．１％ トリフルオロ酢酸 Ｂ： ０．１％ トリフルオロ酢酸 ７０％アセトニトリル Ａ１００％から２５ｍｉｎ後Ｂ１００％になるような 直線グラジエント 検出 ＵＶ２１０ｎｍ

【００１５】その結果、得られたペプチドおよびペプチ
ド誘導体の純度は，ほぼ１００％であった。さらに、ア
ミノ酸組成は、下に記したようにペプチドの配列から期
待される値とよく一致した。 式（１）で示されるペプチド誘導体 計算値 Ｉｌｅ（１．０）、Ａｒｇ（１．０）、Ｐｒｏ
（１．０） 実測値 Ｉｌｅ（１．１）、Ａｒｇ（１．０）、Ｐｒｏ
（１．１） Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ 計算値 Ｉｌｅ（１．０）、Ａｒｇ（１．０）、Ｐｒｏ
（１．０） 実測値 Ｉｌｅ（１．０）、Ａｒｇ（１．３）、Ｐｒｏ
（１．０）

【００１６】また、ペプチド誘導体については、フィニ
ガン・マット社のレーザーディソープション飛行時間型
質量分析計ＬＡＳＥＲＭＡにより質量分析を行なった。
イオン化法はレーザーディソープション法を用いた。こ
の時、式（１）で示されるペプチド誘導体のプロトン化
分子イオンピーク（ＭＨ⁺ ）にあたる３８４のピークを
確認した（図１）。これにより、式（１）で示される構
造のペプチド誘導体が生成していることを確認した。ペ
プチドおよびペプチド誘導体の合成および分析は、以下
の文献を参照した。

【００１７】Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ．Ｂ．，Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４、
（１９６３）、Ｋｅｎｔ Ｓ．ｅｔ ａｌ，ｉｎ ”Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８４”，ｅ
ｄ．ｂｙ Ｉｚｕｍｉｙａ Ｎ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ＯｓａｋａＪ
ａｐａｎ，（１９８５），ｐ２１７ー、ｉｎ ”Ｓｏｌ
ｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ”，ｅｄ．ｂｙ Ｓ
ｔｅｗａｒｔ Ｊ．Ｍ，Ｙｏｕｎｇ Ｊ．Ｄ．，Ｐｉｅ
ｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋ
ｆｏｒ．Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ，（１９８４）、相
本三郎 実験化学講座２２「有機合成ＩＶ」（ｐ．３０
４）日本化学会編（１９９２）、熊谷久美子 榊原俊平
「タンパク質、ペプチドの高速液体クロマトグラフィ
ー」（ｐ．１０１）化学増刊１０２（１９８４）、相本
三郎「タンパク質、ペプチドの高速液体クロマトグラフ
ィー（ＩＩ）」（ｐ．１７３）化学増刊１１７（１９９
０）。

【００１８】〔アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性の
測定〕アンジオテンシンＩ変換酵素阻害の測定は、カッ
シュマンらの方法（バイオケミカル・ファーマコロジー
２０巻 １６３７〜１６４８頁（１９７１））を改良
した丸山らの方法（アグリカルチュアル・バイオロジカ
ル・ケミストリー４６巻５号（１３９３〜１３９４（１
９８２））に従った。

【００１９】試験管に本ペプチド水溶液３０μｌと酵素
基質として、Ｌ−ヒプリルヒスチジルロイシン（シグマ
社製）とＮａＣｌを含有したｐＨ８．３のほう酸バッフ
ァー２５０μｌを加えて、３７℃で１０分間プレインキ
ュベーションした。その後、アンジオテンシンＩ変換酵
素含有液１００μｌを加え、酵素反応を開始した。この
時、ほう酸バッファーの濃度は０．１ Ｍ 、Ｌ−ヒプ
リルヒスチジルロイシン濃度は５ｍＭ、ＮａＣｌ ３０
０ｍＭであり、阻害がかからない場合の酵素活性は８ｍ
Ｕである。

【００２０】３７℃、ｐＨ８．３で３０分間インキュベ
ートしながら反応させた後、１ＮＨＣｌ ２５０μｌを
加えて反応を停止させた。なお、盲検としては、アンジ
オテンシンＩ変換酵素含有液を加える前に１ＮＨＣｌを
加え、同様に処理した。酢酸エチル１．５ｍｌを加え、
１５秒振盪させて酵素反応で生じた馬尿酸を抽出し、２
０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、酢酸エチル層１．
０ｍｌを試験管に採取した。酢酸エチルをホットドライ
バスのなかで１２０℃、３０分間加熱し完全に除去した
後、室温で５分間放置した。そして、水１．０ｍｌを加
え、生成した馬尿酸の量を２２８ｎｍの吸光度を測定し
て求めた。酵素反応に使用したアンジオテンシンＩ変換
酵素含有液は、ラビットラングアセトンパウダー（シグ
マ社製）１ｇを０．１Ｍほう酸バッファー（ｐＨ ８．
３）１０ｍｌに溶かし、よく攪拌した後、４℃、４００
００ｇで４０分間遠心分離した。その上澄を０．１Ｍほ
う酸バッファー（ｐＨ８．３）で希釈して作成した。

【００２１】アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性は、
下記の数１式を使用して求めた。

【数１】 Ａ：蒸留水添加時の吸光度 （２２８ｎｍ） Ｂ：阻害剤添加時の吸光度 （２２８ｎｍ） ａ，ｂ：それぞれに対する盲検の吸光度 （２２８ｎ
ｍ） この方法で測定すると式（１）で示されるペプチド誘導
体およびＩｌｅ−Ａｒｇ−ＰｒｏのＩＣ₅₀は、それぞれ
０．８７μＭ、１．８μＭであった。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１において質量分析を行なった結果を示
すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式（１）に示す構造を有し、構成ア
   ミノ酸はＬ体の構造を持つアンジオテンシンＩ変換酵素
   阻害ペプチド誘導体。 【化１】