JPH0812595A - 慢性関節リウマチ治療薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ヒトＶＬＡ−２の細胞外領域を特異的に認識す
るモノクローナル抗体を有効成分とする慢性関節リウマ
チ治療薬。好適例として、特に、ヒトＶＬＡ−２のα鎖
の細胞外領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を
有効成分とする慢性関節リウマチ治療薬が挙げられる。 【効果】上記慢性関節リウマチ治療薬は、慢性関節リウ
マチによる関節炎の腫れを抑制し、また、低毒性であ
り、慢性関節リウマチの治療に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＶＬＡ−２の細胞
外領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を有効成
分とする慢性関節リウマチ治療薬に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】慢性関節リウマチ（以下ＲＡと略す）
は、関節滑膜を炎症の主座とする慢性炎症性疾患であ
り、種々の炎症細胞が滑膜の血管内皮細胞を通して、滑
液中に浸潤する。その病態には免疫学的機序が関与して
いると考えられるが、免疫応答のトリガーとなるものの
特定は未だ困難な状況である。また、本来終息すべき炎
症が滑膜を中心として持続するという病態も解決すべき
重要な問題である。このような一連の炎症のプロセス、
特にその慢性化、永続化には免疫担当細胞であるリンパ
球が深く関わっていると考えられる。

【０００３】パナイ（Ｐａｎａｙｉ Ｇ．Ｓ．）等は、
（ＲＡに伴う）「滑膜炎は、もはやリウマトイド因子や
免疫複合体などを介した液性免疫によるプロセスとは考
え難く、むしろ、Ｔ細胞、抗原提示細胞、マクロファー
ジ、滑膜細胞、サイトカインを介した細胞性免疫による
プロセスが関与している。」と述べている［Ａｒｔｈ．
Ｒｈｅｕｍ．、３５、７２９−７３５（１９９２）を参
照］。

【０００４】垣本（Ｋａｋｉｍｏｔｏ Ｋ．）等は、マ
ウスのコラーゲン誘導関節炎（以下ＣＩＡと略す）モデ
ルに対し、関節炎発症のインダクションフェイズ（ｉｎ
ｄｕｃｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）である抗原の初回感作時
から、抗ＩＣＡＭ−１抗体あるいは抗ＬＦＡ−１抗体を
投与することにより、いずれの場合もＣＩＡを抑制する
ことを報告している［Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１
４２、３２６−３３７（１９９２）を参照］。さらに、
垣本等は、第２３回日本免疫学会総会［日本免疫学会総
会・学術総会記録、第２３巻、５３０、Ｉ−２８（１９
９３）］において、抗原の初回感作時からの抗ＩＣＡＭ
−１抗体と抗ＬＦＡ−１抗体との併用投与は、それらの
抗体を単独で投与した場合よりも、よりいっそうラット
のＣＩＡに対する抑制作用を増大させることを報告して
いる。

【０００５】また、デューリエ（Ｄｕｒｉｅ Ｆ．
Ｈ．）等も、マウスのＣＩＡモデルに対し、関節炎発症
のインダクションフェイズからの抗ＣＤ４０リガンド
（ＣＤ４０Ｌ）抗体の投与で、ＣＩＡを抑制することを
報告している［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１、１３２８−１
３３０（１９９３）を参照］。一方、滑膜組織中のマト
リクス分子であるコラーゲン、フィブロネクチン、ラミ
ニンおよびプロテオグリカンはＶＬＡファミリーを介し
て、リンパ球およびマクロファージの組織への定着、保
持、さらには活性化に関与すると考えられている。これ
らはＲＡの滑膜病変の成立に深く関わっているため、そ
の機序を解明することがＲＡ治療のための大きな課題で
ある。

【０００６】三宅（Ｍｉｙａｋｅ Ｓ．）等は、固相化
したマトリクス分子上で、ＲＡ患者の滑液より分離した
単核球を一晩培養後ＲＮＡを抽出し、サイトカインのｍ
ＲＮＡの変化を調べ、抗インテグリンβ１抗体によりこ
れらのメッセージが減弱することを見い出した［Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７、８６３−８６８（１９９３）
を参照］。したがって、マトリクス分子はリンパ球のコ
スティムレイトリーファクター（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａ
ｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）として機能していると考えら
れる。

【０００７】マトリクス分子と細胞の相互作用にはイン
テグリン分子を中心としてＣＤ２６、ＣＤ４４など様々
な分子が関与する。ハインズ（Ｈａｙｎｅｓ）等は、Ａ
型滑膜細胞、血管内皮細胞、マクロファージなど滑膜組
織を構成する細胞にＶＬＡファミリーに属する接着分子
が広く存在することを示している［ＳｐｒｉｎｇｅｒＳ
ｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、１１、１６３
（１９８９）を参照］。

【０００８】ＶＬＡファミリーに属する接着分子には、
ＶＬＡ−１、２、３、４、５、６が知られており、夫
々、β１鎖とα鎖（α１、α２、α３、α４、α５また
はα６）とが非共有結合によってヘテロダイマーを形成
している。ここで、α４はβ７と、α６はβ４とも会合
することから、α４β７およびα６β４もＶＬＡファミ
リーに属すると考えられる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、ある種
の接着因子を認識するモノクローナル抗体を利用してＲ
Ａの治療を行うことができないかと考え、ヒトＲＡに近
いモデルとして知られるマウスＣＩＡモデルを用い、各
種モノクローナル抗体について探索を行い、ある種のモ
ノクローナル抗体に所望の効果があることを見い出し
た。本発明は、ある種の接着因子を認識するモノクロー
ナル抗体を有効成分とする慢性関節リウマチ治療薬（以
下ＲＡ治療薬と略す）を提供することを目的とするもの
である。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記探索
の結果、ヒトＶＬＡ−２の細胞外領域を特異的に認識す
るモノクローナル抗体がＲＡに対して治療効果を有し、
上記の目的に適うことを見い出して本発明を完成した。

【００１１】即ち、本発明は、ヒトＶＬＡ−２の細胞外
領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を有効成分
とする慢性関節リウマチ治療薬に関する。

【００１２】以下本発明を詳細に説明する。

【００１３】本発明に用いられる抗体としては、ヒトＶ
ＬＡ−２の細胞外領域を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体であればいずれであってもよいが、ヒトＶＬＡ−
２のα鎖の細胞外領域を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体が好ましい。

【００１４】また、本発明に用いられる上記モノクロー
ナル抗体は、哺乳動物由来の抗体、キメラ抗体または擬
人化抗体のいずれであっても良い。

【００１５】本発明に用いられる哺乳動物由来の抗体は
公知であり、例えば、ピシェル（Ｋｅｎ Ｄ．Ｐｉｓｃ
ｈｅｌ）等によって、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８、
２２６−２３３（１９８７）に、カーター（Ｗｉｌｌｉ
ａｍ Ｇ．Ｃａｒｔｅｒ）等によって、Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．、１１０、１３８７−１４０４（１９９０）
等に記載されている。

【００１６】また、容易に入手できる以下の抗体を用い
ることもできる。

【００１７】抗ヒトＶＬＡ−２抗体［抗ヒトα２モノク
ロ−ナル抗体：クロ−ン Ｐ１Ｅ６（オンコジ−ンサイ
エンス社品番、ＣＰ１０、テリオス社品番、Ａ０４２、
ケミコン社品番、ＭＡＢ１９５０）、抗α２β１モノク
ロ−ナル抗体：クロ−ンの記載無し（ケミコン社品番、
ＭＡＢ１９６７）］。

【００１８】本発明に用いられるキメラ抗体作製には、
例えば上記のマウス抗ヒトモノクローナル抗体を産生す
るハイブリド−マを、先ず以下の製造方法によって得
る。

【００１９】即ち、ヒトメモリーＴ細胞、ヒト単球およ
びヒトＢ細胞リンパ腫のなかから選択されるヒトリンパ
球から、上記の抗ヒトＶＬＡ−２抗体が反応する細胞
を、フローサイトメトリー分析法により選出する（選出
された細胞は、ヒトＶＬＡ−２に対する抗原を発現して
いると考えられる）。上記のようにして選出される細胞
をリン酸緩衝生理食塩液などに懸濁し、これをマウスの
静脈内もしくは腹腔内に投与して該動物を免疫した後、
その脾臓を摘出して抗体産生脾細胞を調製する。あるい
は、ＶＬＡ−２を発現している癌細胞、例えば、ヒト肺
癌細胞ＰＣ７を用い、カマタ（Ｋａｍａｔａ Ｔ．）等
［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、２６００６−２
６０１０（１９９４）］の方法に準じて、まず、ＶＬＡ
−２のコラーゲン結合部位であるＩドメイン（Ｉ ｄｏ
ｍａｉｎ）と、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）との融合蛋白（Ｉ ｄｏｍａｉｎ−ＧＳＴ）
を得、得られたＩ ｄｏｍａｉｎ−ＧＳＴをマウスの静
脈内もしくは腹腔内に投与して該動物を免疫した後、そ
の脾臓を摘出して抗体産生脾細胞を調製する。上記のよ
うにして調製された抗体産生脾細胞は骨髄腫細胞と細胞
融合されるが、用いる骨髄腫細胞は、マウス由来のもの
が好ましい。細胞融合は、例えば、ミルスティン（Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ Ｃ．）等［Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９
５（１９７５）］が報告している方法に準じて行われ
る。即ち、３０％〜６０％ポリエチレングリコール（平
均分子量１０００〜４０００）を用いて３０℃〜４０℃
の温度で約１〜３分反応させることによって行われる。
このようにして得られるハイブリドーマが産生するモノ
クローナル抗体を、フローサイトメトリー分析法により
スクリーニングを行い、ヒトＶＬＡ−２（抗原）を特異
的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを選別する。

【００２０】このようにしてマウス抗ヒトモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを得、これから常法に
従ってｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡライブラリーを作製
する。次に、該ライブラリーからマウス抗体重鎖領域お
よび軽鎖領域の共通塩基配列部分に対するプライマーで
常法にしたがいＰＣＲ反応を行い、目的サイズのｃＤＮ
Ａをクローニングする。こうして得られたマウス抗体可
変領域をコードする重鎖ＤＮＡ断片あるいは軽鎖ＤＮＡ
断片と各々ヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡ断片
とをアミノ酸置換とフレームシフトが起きないように正
確に連結することにより、キメラ抗体ＤＮＡが得られ
る。

【００２１】上記のようにして得られたキメラ抗体の重
鎖ＤＮＡ断片あるいは軽鎖ＤＮＡ断片を各々公知の抗体
発現ベクターに組み込み、例えばマウス骨髄腫細胞など
の適当な宿主に同時にトランスフェクトすることにより
キメラ抗体産生クローンを得る。

【００２２】クローンが目的の抗体を産生するか否かは
ＥＬＩＳＡなどにより培養上清をスクリ−ニングすれば
よい。次いで、効率よくマウス−ヒトキメラ抗体を産生
するクローンを常法により培養し、培養液中のマウス−
ヒトキメラ抗体をプロテインＧカラムなどで分離精製す
る。最後に、ゲル濾過または透析法によって、マウス−
ヒトキメラ抗体のリン酸緩衝生理食塩液を得る。

【００２３】本発明に用いられる擬人化抗体の作製は、
クィーン（Ｃａｒｙ Ｑｕｅｅｎ）等［Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８６、１００２９−１００
３３（１９８９）］の方法に準じて、上記マウス抗ヒト
抗体産生ハイブリドーマＤＮＡ断片の相補性決定領域
（ＣＤＲ）の塩基配列を読み取り、適当なヒト抗体の相
補性決定領域に移植して擬人化抗体ＤＮＡを得る。この
際、相補性決定領域の３次元構造に歪みが生じる場合
は、フレームワーク領域の塩基を適当に入れ替え、相補
性決定領域の３次元構造の歪みを修正することができ
る。

【００２４】上記のようにして得られた擬人化抗体の重
鎖ＤＮＡ断片あるいは軽鎖ＤＮＡ断片を各々公知の抗体
発現ベクターに組み込み、マウス骨髄腫細胞などの適当
な宿主に同時にトランスフェクトすることにより擬人化
抗体産生クローンを得る。クローンが目的の抗体を産生
するか否かはＥＬＩＳＡなどにより培養上清をスクリ−
ニングすればよい。次いで、効率よく擬人化抗体を産生
するクローンを常法により培養し、培養液中の擬人化抗
体をプロテインＧカラムなどで分離精製する。最後に、
ゲル濾過または透析法によって、擬人化抗体のリン酸緩
衝生理食塩液を得る。

【００２５】本発明のＲＡ治療薬は、通常注射剤として
用いられる。注射剤の調製は、常法によって行うことが
できる。即ち、注射剤の調製は、上記のようにして得ら
れるモノクローナル抗体が溶解しているリン酸緩衝生理
食塩液を濾過滅菌することによって行われる。また、こ
のようにして濾過滅菌した抗体溶液を凍結乾燥し、用時
溶解用の注射剤とすることもできる。

【００２６】本発明のＲＡ治療薬をＲＡ患者に投与する
場合、例えば皮下、筋肉内、静脈内または関節内に投与
されるが、特に、静脈内または関節内投与が好ましい。
本発明のＲＡ治療薬の投与量は、ＲＡ患者の症状、年
齢、体重、有効成分の抗体の種類およびその投与方法な
どによっても異なるが、通常、有効成分の抗体（ヒトＶ
ＬＡ−２の細胞外領域を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体）量として１日１回、０．０１ｍｇ／ｋｇ から
１０ｍｇ／ｋｇ を、１週間に１回〜２回の割合で投与
する。

【００２７】

【発明の効果】本発明のＲＡ治療薬に用いるモノクロー
ナル抗体は、ＲＡによる関節炎の腫れを強く抑制し、そ
の作用はヒトＶＬＡファミリーに属する接着分子の細胞
外領域を特異的に認識するモノクローナル抗体のなかで
も特に強いものであると考えられる（試験例１、２参
照）。また、本発明のＲＡ治療薬に用いるモノクローナ
ル抗体は、前述の、抗ＩＣＡＭ−１抗体と抗ＬＦＡ−１
抗体との等量混合抗体または抗ＣＤ４０Ｌ抗体と比べて
もＲＡによる関節炎の腫れを強く抑制する（試験例１、
２参照）。

【００２８】本発明のＲＡ治療薬に用いるモノクローナ
ル抗体は、低毒性である。

【００２９】以上のことから本発明のＲＡ治療薬は、Ｒ
Ａ治療に有用である。

【００３０】以下に試験例を挙げて説明する。 試験例１マウスＣＩＡモデルに対する治療効果： （１）供試抗体 ・抗ＶＬＡ−２抗体［ハムスター抗マウスＶＬＡ−２モ
ノクロ−ナル抗体、クロ−ン：ＨＭα２、住友電気工業
株式会社（ＳＥ−Ａ１０１４）］ ・抗ＶＬＡ−１抗体［ハムスタ−抗マウスＶＬＡ−１モ
ノクロ−ナル抗体、クロ−ン：ＨＭα１、住友電気工業
株式会社（ＳＥ−Ａ１０１３）］（比較抗体） ・抗ＶＬＡ−６抗体［ハムスター抗マウスＶＬＡ−６モ
ノクロ−ナル抗体、クロ−ン：ＨＭα６、住友電気工業
株式会社（ＳＥ−Ａ１０１５）］（比較抗体） ・抗ＩＣＡＭ−１抗体［ラット抗マウスＩＣＡＭ−１モ
ノクロ−ナル抗体、クロ−ン：ＫＡＴ−１、ブリティッ
シュバイオテクノロジー社（ＢＳＡ２）］と抗ＬＦＡ−
１抗体［ラット抗マウスＬＦＡ−１抗体、クロ−ン：Ｋ
ＢＡ、ブリティッシュバイオテクノロジー社（ＢＳＡ
５）］との等量混合抗体（比較抗体）

【００３１】（２）試験方法 ０．０５Ｎ酢酸に溶解したウシ由来のＩＩ型コラーゲン
溶液（４ｍｇ／ｍｌ）を、等容量のＦｒｅｕｎｄの完全
アジュバント（ＤＩＦＣＯ，ＦＣＡ）に混じてエマルジ
ョン化し、それを雄性ＤＢＡ／１Ｊマウス（８週齢、１
群５〜１０匹）の尾根部に、コラーゲンとして２００μ
ｇ／マウスの割合で注射し、マウスを感作した。３週間
後に上記と同じコラーゲン溶液と等容量のＦｒｅｕｎｄ
の不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ，ＦＩＡ）とで調製
したエマルジョンで追加免疫を行った。この追加免疫１
日前から、各供試抗体のマウスへの腹腔内投与（１日当
たり投与量、２５０μｇ／マウス、２回／週）を開始し
た。

【００３２】感作後２０日目から、関節炎の強さを以下
のようにスコアー（一肢当り０〜４点、四肢合計最高で
１６点）化し評価した。

【００３３】（関節炎スコアー） ０点 ： 変化なし １点 ： 全体的に弱い腫脹あるいは指の腫脹 ２点 ： 全体的に軽度の腫脹 ３点 ： 全体的に明らかな腫脹 ４点 ： 全体的に強度の腫脹

【００３４】（３）試験結果 試験結果を以下の表１に示した。表１に示される通り、
抗ＶＬＡ−２抗体投与群は、抗ＶＬＡ−１抗体投与群、
抗ＶＬＡ−６抗体投与群または抗ＩＣＡＭ−１抗体と抗
ＬＦＡ−１抗体との等量混合抗体投与群のいずれと比べ
ても、関節炎の腫れが強く抑制された。

【００３５】また、本試験中、抗体投与による毒性の発
現（特異な副作用／死亡例など）は何れの抗体において
も認められなかった。

【００３６】

【表１】 試験例２マウスＣＩＡモデルに対する治療効果： （１）供試抗体 ・抗ＶＬＡ−２抗体［ハムスター抗マウスＶＬＡ−２モ
ノクロ−ナル抗体、クロ−ン：ＨＭα２、住友電気工業
株式会社（ＳＥ−Ａ１０１４）］ ・抗ＶＬＡ−４抗体［ラット抗マウスＶＬＡ−４モノク
ロ−ナル抗体、順天堂大学医学部免疫学講座］（比較抗
体） ・抗ＶＬＡ−５抗体［ハムスター抗マウスＶＬＡ−５モ
ノクロ−ナル抗体、クロ−ン：ＨＭα５−１、住友電気
工業株式会社（ＳＥ−Ａ１００２）］（比較抗体） ・抗ＣＤ４０Ｌ抗体［ハムスター抗マウスＣＤ４０Ｌモ
ノクロ−ナル抗体、クロ−ン：ＨＭ４０Ｌ−１、住友電
気工業株式会社（ＳＥ−Ａ１０２０）］（比較抗体）

【００３７】（２）試験方法 試験例１に同じ。

【００３８】（３）試験結果 試験結果を以下の表２に示した。表２に示される通り、
抗ＶＬＡ−２抗体投与群は、抗ＶＬＡ−４抗体投与群、
抗ＶＬＡ−５抗体投与群、抗ＣＤ４０Ｌ抗体投与群のい
ずれと比べても、関節炎の腫れが強く抑制された。

【００３９】また、本試験中、抗体投与による毒性の発
現（特異な副作用／死亡例など）は何れの抗体において
も認められなかった。

【００４０】

【表２】

【００４１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を説明する。

【００４２】実施例１ 注射剤：ヒトＶＬＡ−２の細胞外領域を特異的に認識す
るモノクロ−ナル抗体が溶解しているリン酸緩衝生理食
塩液（１ｍｇ ／ｍｌ）を濾過滅菌した後、１アンプル
に５ｍｌずつ分注することにより、ヒトＶＬＡ−２の細
胞外領域を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体を含有
する注射剤（５ｍｇ／アンプル）が調製される。 実施例２ 注射剤：ヒトＶＬＡ−２のα鎖の細胞外領域を特異的に
認識するモノクロ−ナル抗体が溶解しているリン酸緩衝
生理食塩液（１ｍｇ／ｍｌ）を濾過滅菌した後、１アン
プルに５ｍｌずつ分注することにより、ヒトＶＬＡ−２
のα鎖の細胞外領域を特異的に認識するモノクロ−ナル
抗体を含有する注射剤（５ｍｇ／アンプル）が調製され
る。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＶＬＡ−２の細胞外領域を特異的に
   認識するモノクローナル抗体を有効成分とする慢性関節
   リウマチ治療薬。
2. 【請求項２】 ヒトＶＬＡ−２のα鎖の細胞外領域を特
   異的に認識するモノクローナル抗体を有効成分とする慢
   性関節リウマチ治療薬。
3. 【請求項３】 モノクローナル抗体が哺乳動物由来の抗
   体である請求項１または請求項２に記載の慢性関節リウ
   マチ治療薬。
4. 【請求項４】 モノクローナル抗体がキメラ抗体である
   請求項１または請求項２に記載の慢性関節リウマチ治療
   薬。
5. 【請求項５】 モノクローナル抗体が擬人化抗体である
   請求項１または請求項２に記載の慢性関節リウマチ治療
   薬。