JPH08129017A - 液中観察機能付き走査型近視野原子間力顕微鏡 - Google Patents
液中観察機能付き走査型近視野原子間力顕微鏡Info
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- JPH08129017A JPH08129017A JP7237730A JP23773095A JPH08129017A JP H08129017 A JPH08129017 A JP H08129017A JP 7237730 A JP7237730 A JP 7237730A JP 23773095 A JP23773095 A JP 23773095A JP H08129017 A JPH08129017 A JP H08129017A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 液体中で生物試料や有機薄膜試料を観察でき
る液中観察機能付き走査型近視野原子間力顕微鏡を実現
する。 【解決手段】 試料表面の形状および光学的特性を観察
する走査型近視野原子間力顕微鏡において、試料下面に
は液体および試料を保持する液体保持試料皿２と、試料
上面には液体の液面を保持する液面保持窓板１０とを、
互いに接触しないように独立して、かつ、前記液体保持
試料皿と前記液面保持窓板の間で液体を表面張力で維持
し得る位置に設置し、液中での試料の観察を行う。
る液中観察機能付き走査型近視野原子間力顕微鏡を実現
する。 【解決手段】 試料表面の形状および光学的特性を観察
する走査型近視野原子間力顕微鏡において、試料下面に
は液体および試料を保持する液体保持試料皿２と、試料
上面には液体の液面を保持する液面保持窓板１０とを、
互いに接触しないように独立して、かつ、前記液体保持
試料皿と前記液面保持窓板の間で液体を表面張力で維持
し得る位置に設置し、液中での試料の観察を行う。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料表面の形状お
よび光学的特性を観察するための走査型近視野原子間力
顕微鏡を用いて、液体中の生物試料や有機薄膜試料等の
観察を可能にする技術分野に属する。
よび光学的特性を観察するための走査型近視野原子間力
顕微鏡を用いて、液体中の生物試料や有機薄膜試料等の
観察を可能にする技術分野に属する。
【０００２】
【従来の技術】微生物や細胞などの生物試料やＬＢ膜な
どの有機薄膜試料を観察するのに有効な顕微鏡として、
蛍光顕微鏡がある。蛍光顕微鏡では、蛍光色素染色によ
り目的物質のコントラストが倍増されることを利用して
いる。近年、これらの試料の観察に、より分解能の高い
近視野顕微鏡が利用されつつある。
どの有機薄膜試料を観察するのに有効な顕微鏡として、
蛍光顕微鏡がある。蛍光顕微鏡では、蛍光色素染色によ
り目的物質のコントラストが倍増されることを利用して
いる。近年、これらの試料の観察に、より分解能の高い
近視野顕微鏡が利用されつつある。
【０００３】近視野顕微鏡は近接場光学効果を用いるこ
とにより、光の回折制限の限界を超えて、波長を超えた
空間分解能を得ることができ、蛍光色素染色を施した生
物試料や有機薄膜試料の観察においても極めて有効であ
ると考えられる。近接場光学効果を用いる近視野顕微鏡
を構成するために、非常に重要な点は、光ファイバーで
構成されたプローブの先端と試料表面との距離を高精度
で所定の値以下に制御しなければならないことで、ここ
で所定の値とは、用いる光の波長の１／１０程度であ
る。このためにBetzigらは、プローブを試料表面に対し
て平行な面内で振動させ、プローブに作用するせん断応
力による振動の振幅および位相の変化を検出することに
より、プローブの位置制御を行う構成を示している（E.
Betzig et al., Appl. Phys. Lett. 60(20), pp.2484-2
486, 18 May 1992；特開平6-50750）。
とにより、光の回折制限の限界を超えて、波長を超えた
空間分解能を得ることができ、蛍光色素染色を施した生
物試料や有機薄膜試料の観察においても極めて有効であ
ると考えられる。近接場光学効果を用いる近視野顕微鏡
を構成するために、非常に重要な点は、光ファイバーで
構成されたプローブの先端と試料表面との距離を高精度
で所定の値以下に制御しなければならないことで、ここ
で所定の値とは、用いる光の波長の１／１０程度であ
る。このためにBetzigらは、プローブを試料表面に対し
て平行な面内で振動させ、プローブに作用するせん断応
力による振動の振幅および位相の変化を検出することに
より、プローブの位置制御を行う構成を示している（E.
Betzig et al., Appl. Phys. Lett. 60(20), pp.2484-2
486, 18 May 1992；特開平6-50750）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】生物試料等に蛍光色素
染色を行う場合、蛍光物質が乾くと蛍光を発しないとい
う特性から、試料を液体中に浸漬しておかなければなら
ない。また、微生物や細胞等の生物試料の場合、生物試
料を生存させておくためには、液体中に保管しておくこ
とが必要である。
染色を行う場合、蛍光物質が乾くと蛍光を発しないとい
う特性から、試料を液体中に浸漬しておかなければなら
ない。また、微生物や細胞等の生物試料の場合、生物試
料を生存させておくためには、液体中に保管しておくこ
とが必要である。
【０００５】さらに、蛍光物質はｐＨ値により、その発
光状態が変化するという特性を持っており、試料を浸漬
する溶液の種類を変えることにより、試料の様々な光学
的特性を得ることができる。ここで、近視野顕微鏡で
は、前述のように、プローブと試料表面との距離の制御
を行うためにせん断力を利用している。このせん断力の
主要な発生機構が試料表面における吸着水であるため、
液中において動作させようとしても、液中では吸着水が
存在しないため、十分なせん断力の変化を得ることはで
きないと考えられる。
光状態が変化するという特性を持っており、試料を浸漬
する溶液の種類を変えることにより、試料の様々な光学
的特性を得ることができる。ここで、近視野顕微鏡で
は、前述のように、プローブと試料表面との距離の制御
を行うためにせん断力を利用している。このせん断力の
主要な発生機構が試料表面における吸着水であるため、
液中において動作させようとしても、液中では吸着水が
存在しないため、十分なせん断力の変化を得ることはで
きないと考えられる。
【０００６】そこで、従来の近視野顕微鏡を用いて蛍光
色素染色された試料、あるいは微生物や細胞等の生物試
料を観察する場合、試料を湿らせた状態にしてガラスプ
レート等に固定して観察するなどの方法が採られてい
た。このようにして観察した場合、試料の湿度が徐々に
低下していくことは避けられず、蛍光の発光や、生物の
生存状態を長時間一定に持続させるのは困難であった。
色素染色された試料、あるいは微生物や細胞等の生物試
料を観察する場合、試料を湿らせた状態にしてガラスプ
レート等に固定して観察するなどの方法が採られてい
た。このようにして観察した場合、試料の湿度が徐々に
低下していくことは避けられず、蛍光の発光や、生物の
生存状態を長時間一定に持続させるのは困難であった。
【０００７】そこで、本発明の目的は、従来の近視野顕
微鏡の持つ上記のような課題を解決するため、生物試料
や有機薄膜試料等を液体中で観察することができる近視
野顕微鏡を実現することにある。
微鏡の持つ上記のような課題を解決するため、生物試料
や有機薄膜試料等を液体中で観察することができる近視
野顕微鏡を実現することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明では、液中観察機能付き走査型近視野原子間
力顕微鏡として、試料を液体中に浸漬して保持する液体
保持試料皿と、前記液体保持試料皿の上方に配置され前
記液体の液面を覆うように保持する液面保持窓板と、先
端部に光を透過する透過孔と一部に光反射手段を有し前
記先端部が前記液体中に浸漬して前記試料の上面に配置
されるプローブと、前記プローブを支持するプローブ支
持体と、前記透過孔から前記試料に照射する光を発生す
る光源と、前記照射された光により生じる前記試料から
の光情報を検出して電気信号に変換する検出手段と、前
記試料との相互作用により生じる前記プローブのたわみ
量を検出するために前記光反射手段に照射するレーザー
光を発生するレーザー光源と、前記光反射手段からの反
射光を受けて電気信号に変換する光電変換素子と、前記
試料と前記プローブを相対的に移動させる移動手段と、
前記試料の表面と前記プローブの先端の間の距離を制御
する距離制御手段とを有する構成とした。
に、本発明では、液中観察機能付き走査型近視野原子間
力顕微鏡として、試料を液体中に浸漬して保持する液体
保持試料皿と、前記液体保持試料皿の上方に配置され前
記液体の液面を覆うように保持する液面保持窓板と、先
端部に光を透過する透過孔と一部に光反射手段を有し前
記先端部が前記液体中に浸漬して前記試料の上面に配置
されるプローブと、前記プローブを支持するプローブ支
持体と、前記透過孔から前記試料に照射する光を発生す
る光源と、前記照射された光により生じる前記試料から
の光情報を検出して電気信号に変換する検出手段と、前
記試料との相互作用により生じる前記プローブのたわみ
量を検出するために前記光反射手段に照射するレーザー
光を発生するレーザー光源と、前記光反射手段からの反
射光を受けて電気信号に変換する光電変換素子と、前記
試料と前記プローブを相対的に移動させる移動手段と、
前記試料の表面と前記プローブの先端の間の距離を制御
する距離制御手段とを有する構成とした。
【０００９】そして、前記液体保持試料皿と前記液面保
持窓板は互いに接触しないように配置した。また、前記
液面保持窓板は、前記液体保持試料皿との間で前記液体
を表面張力で維持する位置に配置するようにした。
持窓板は互いに接触しないように配置した。また、前記
液面保持窓板は、前記液体保持試料皿との間で前記液体
を表面張力で維持する位置に配置するようにした。
【００１０】また、前記照射された光により生じる前記
試料からの光情報は、前記試料を透過した光情報とし
た。また、前記照射された光により生じる前記試料から
の光情報は、前記試料から反射した光情報とした。
試料からの光情報は、前記試料を透過した光情報とし
た。また、前記照射された光により生じる前記試料から
の光情報は、前記試料から反射した光情報とした。
【００１１】また、前記液面保持窓板は前記レーザー光
を透過する材料で形成され、前記レーザー光の光軸を調
節するための角度調節機構を有する構成を加えた。ま
た、前記プローブを前記試料の表面に対して垂直な面内
で振動させるための振動機構を加えた。
を透過する材料で形成され、前記レーザー光の光軸を調
節するための角度調節機構を有する構成を加えた。ま
た、前記プローブを前記試料の表面に対して垂直な面内
で振動させるための振動機構を加えた。
【００１２】また、前記プローブは、少なくとも前記液
体に浸漬する部分に前記液体による腐食を防ぐための耐
食コートを施すようにした。
体に浸漬する部分に前記液体による腐食を防ぐための耐
食コートを施すようにした。
【００１３】
【発明の実施の形態】従来の近視野顕微鏡に対して、本
発明者らの提案している走査型近視野原子間力顕微鏡
は、近視野顕微鏡に原子間力顕微鏡の特徴を複合化した
顕微鏡である。原子間力顕微鏡とは、プローブ先端を試
料表面から数十〜数百ｎｍ程度の距離に接近させたとき
に働く原子間力を利用するものである。方法としては、
原子間力のうち斥力を利用する場合は、斥力によってプ
ローブが変位するときの変位量を検出することにより、
プローブの位置制御を行い、この位置制御のための信号
を試料表面の形状として表現するというものである。
発明者らの提案している走査型近視野原子間力顕微鏡
は、近視野顕微鏡に原子間力顕微鏡の特徴を複合化した
顕微鏡である。原子間力顕微鏡とは、プローブ先端を試
料表面から数十〜数百ｎｍ程度の距離に接近させたとき
に働く原子間力を利用するものである。方法としては、
原子間力のうち斥力を利用する場合は、斥力によってプ
ローブが変位するときの変位量を検出することにより、
プローブの位置制御を行い、この位置制御のための信号
を試料表面の形状として表現するというものである。
【００１４】また、原子間力のうちの引力を利用する場
合は、プローブを試料面に対して垂直な面内で振動さ
せ、プローブに作用する引力による振動の振幅の変化を
検出することにより、プローブの位置制御を行い、この
位置制御のための信号を試料表面の形状として表現する
方法が採られる。
合は、プローブを試料面に対して垂直な面内で振動さ
せ、プローブに作用する引力による振動の振幅の変化を
検出することにより、プローブの位置制御を行い、この
位置制御のための信号を試料表面の形状として表現する
方法が採られる。
【００１５】近視野原子間力顕微鏡は、この、原子間力
顕微鏡のプローブを光ファイバーなどの光伝搬体で構成
することにより、近視野顕微鏡の機能をも合わせ持たせ
たものであり、この２つの機能により、試料表面の光の
吸収、発光などにともなう”光像”と試料表面の”形状
像”を独立に、かつ、同時に観察できる。
顕微鏡のプローブを光ファイバーなどの光伝搬体で構成
することにより、近視野顕微鏡の機能をも合わせ持たせ
たものであり、この２つの機能により、試料表面の光の
吸収、発光などにともなう”光像”と試料表面の”形状
像”を独立に、かつ、同時に観察できる。
【００１６】具体的には、近視野原子間力顕微鏡で蛍光
色素染色を施した生物試料を観察すると、試料表面の蛍
光強度分布像（蛍光顕微鏡像）を得ることができる。そ
れと同時に、その表面形状像も観察することができる。
近視野原子間力顕微鏡では、前述したように、プローブ
と試料表面との距離制御にプローブと試料表面間に発生
する原子間力を使用している。原子間力はせん断力と異
なり、液体中でも大気中と同様に働く。したがって、近
視野原子間力顕微鏡は、生物試料等の液中観察に適した
ものである。
色素染色を施した生物試料を観察すると、試料表面の蛍
光強度分布像（蛍光顕微鏡像）を得ることができる。そ
れと同時に、その表面形状像も観察することができる。
近視野原子間力顕微鏡では、前述したように、プローブ
と試料表面との距離制御にプローブと試料表面間に発生
する原子間力を使用している。原子間力はせん断力と異
なり、液体中でも大気中と同様に働く。したがって、近
視野原子間力顕微鏡は、生物試料等の液中観察に適した
ものである。
【００１７】そこで本発明の、液中観察機能付き走査型
近視野原子間力顕微鏡において、試料は、液体保持試料
皿に保持された任意の液体中に浸漬される。特に透過光
を光情報とする場合には、液体保持試料皿は試料からの
透過光を集光するための光学系の上に置かれる。この状
態で、試料上面に設置したプローブの先端が試料表面近
傍に接近するようにプローブ支持体と液体保持試料皿と
の距離を接近させる。このときにプローブは液体中に浸
漬されることとなる。
近視野原子間力顕微鏡において、試料は、液体保持試料
皿に保持された任意の液体中に浸漬される。特に透過光
を光情報とする場合には、液体保持試料皿は試料からの
透過光を集光するための光学系の上に置かれる。この状
態で、試料上面に設置したプローブの先端が試料表面近
傍に接近するようにプローブ支持体と液体保持試料皿と
の距離を接近させる。このときにプローブは液体中に浸
漬されることとなる。
【００１８】ここで、液体保持試料皿に保持されている
液体の液体表面は、表面張力により、液体保持試料皿の
最大高さ以上の高さを維持しており、この高さの差は、
液体が水である場合は１〜２ｍｍ程度である。液面保持
窓板は、浸漬されるプローブの上方にあって、プローブ
支持体に角度調整が可能なように設置されており、か
つ、プローブの先端を試料表面近傍に接近させた際に、
液体の表面に接触するような高さにある。プローブの先
端が試料表面近傍に接近すると、液体表面は液面保持窓
板に接触し、液面保持窓板と液体保持試料皿の間に液体
の層ができる。このとき、液体が水であれば、液面保持
窓板と液体保持試料皿の間には約１〜２ｍｍの水の層が
できることになる。
液体の液体表面は、表面張力により、液体保持試料皿の
最大高さ以上の高さを維持しており、この高さの差は、
液体が水である場合は１〜２ｍｍ程度である。液面保持
窓板は、浸漬されるプローブの上方にあって、プローブ
支持体に角度調整が可能なように設置されており、か
つ、プローブの先端を試料表面近傍に接近させた際に、
液体の表面に接触するような高さにある。プローブの先
端が試料表面近傍に接近すると、液体表面は液面保持窓
板に接触し、液面保持窓板と液体保持試料皿の間に液体
の層ができる。このとき、液体が水であれば、液面保持
窓板と液体保持試料皿の間には約１〜２ｍｍの水の層が
できることになる。
【００１９】このような構成とすることによって、液体
は液面保持窓板の下に常に層状に保持されるため、プロ
ーブの走査を常に液面下で行うことができる。また、液
面保持窓板と液体保持試料皿の間は、液体の層がある以
外は開放されているため、プローブにつながる光伝搬部
を導くことができる。
は液面保持窓板の下に常に層状に保持されるため、プロ
ーブの走査を常に液面下で行うことができる。また、液
面保持窓板と液体保持試料皿の間は、液体の層がある以
外は開放されているため、プローブにつながる光伝搬部
を導くことができる。
【００２０】そして、特に透過光を光情報とする場合、
液体保持試料皿は光学的に透明な材料で構成されてお
り、試料上面から照射され、試料を透過した光を下方の
光学系へ伝搬できるようになっている。
液体保持試料皿は光学的に透明な材料で構成されてお
り、試料上面から照射され、試料を透過した光を下方の
光学系へ伝搬できるようになっている。
【００２１】液面保持窓板も同様に光学的に透明な材料
でできており、平板形状をしている。 これにより、プ
ローブの変位を検出するためのレーザー光などが透過で
きるようになっており、さらに、液体層に密着している
ため、液面が露出している場合と異なり、レーザー光の
光軸を安定に確保できるとともに、光の乱反射の発生を
抑えることができる。加えて、その角度を調節すること
によって、レーザー光源からのレーザー光の入射角度ま
たはプローブ上の反射面で反射したレーザー光の出射角
度を調節することができる。
でできており、平板形状をしている。 これにより、プ
ローブの変位を検出するためのレーザー光などが透過で
きるようになっており、さらに、液体層に密着している
ため、液面が露出している場合と異なり、レーザー光の
光軸を安定に確保できるとともに、光の乱反射の発生を
抑えることができる。加えて、その角度を調節すること
によって、レーザー光源からのレーザー光の入射角度ま
たはプローブ上の反射面で反射したレーザー光の出射角
度を調節することができる。
【００２２】また、プローブ支持体にプローブを試料表
面に対して垂直な面内で振動させるための振動子を設置
することにより、原子間力のうちの引力を利用したプロ
ーブの位置制御を行うことができる。この方法では、プ
ローブと試料表面は周期的に近接するため、走査時にプ
ローブおよび試料が破壊される危険が少ないといった利
点がある。
面に対して垂直な面内で振動させるための振動子を設置
することにより、原子間力のうちの引力を利用したプロ
ーブの位置制御を行うことができる。この方法では、プ
ローブと試料表面は周期的に近接するため、走査時にプ
ローブおよび試料が破壊される危険が少ないといった利
点がある。
【００２３】さらに、プローブ先端に微小開口を形成す
るための金属コートを、液体による腐食から防ぐための
耐食コートを施すことにより、保護することができ、長
時間におよぶ試料の観察が可能である。
るための金属コートを、液体による腐食から防ぐための
耐食コートを施すことにより、保護することができ、長
時間におよぶ試料の観察が可能である。
【００２４】
【実施例】以下に、この発明の実施例を図に基づいて説
明する。図１は、本発明の第１の実施例であり、透過光
を観察する場合の液中観察機能付き走査型近視野原子間
力顕微鏡の構成を示した模式図である。
明する。図１は、本発明の第１の実施例であり、透過光
を観察する場合の液中観察機能付き走査型近視野原子間
力顕微鏡の構成を示した模式図である。
【００２５】図１において、試料１は、液体保持試料皿
２に保持された任意の液体３の中に浸漬される。液体保
持試料皿２は第一のレンズ４の上に置かれている。第一
のレンズ４はミラー５の上に設置されており、さらにミ
ラー５は縦横高さ方向の移動が可能なＸＹＺスキャナー
６上に設置されている。
２に保持された任意の液体３の中に浸漬される。液体保
持試料皿２は第一のレンズ４の上に置かれている。第一
のレンズ４はミラー５の上に設置されており、さらにミ
ラー５は縦横高さ方向の移動が可能なＸＹＺスキャナー
６上に設置されている。
【００２６】プローブ７はバイモルフ振動子８を介して
プローブ支持体９に固定される。液面保持窓板１０は、
プローブ７の上方にあって、プローブ支持体９の前方に
配置されており、プローブ７の先端を試料１の表面近傍
に接近させた際に、液体保持試料皿２との間に表面張力
によって液体層が形成されるような高さにある。
プローブ支持体９に固定される。液面保持窓板１０は、
プローブ７の上方にあって、プローブ支持体９の前方に
配置されており、プローブ７の先端を試料１の表面近傍
に接近させた際に、液体保持試料皿２との間に表面張力
によって液体層が形成されるような高さにある。
【００２７】プローブ７の上側の一部には反射面１１が
構成されており、反射面１１の上方にレーザー光源１
２、上下２分割された光電変換素子１３が設置されてい
る。レーザー光源１２から放出された光は、液面保持窓
板１０を透過して反射面１１に到達し、反射して、再度
液面保持窓板１０を透過し、光電変換素子１３に導入さ
れ、電気信号に変換される。この際、液体の屈折率等の
影響でレーザー光の光路が変化する場合に対処するため
に、液面保持窓板１０は、レーザー光源１２からの入射
光路または反射面１１で反射したレーザー光の出射光路
に対してその角度を調整できるようにプローブ支持体９
に設置されている。
構成されており、反射面１１の上方にレーザー光源１
２、上下２分割された光電変換素子１３が設置されてい
る。レーザー光源１２から放出された光は、液面保持窓
板１０を透過して反射面１１に到達し、反射して、再度
液面保持窓板１０を透過し、光電変換素子１３に導入さ
れ、電気信号に変換される。この際、液体の屈折率等の
影響でレーザー光の光路が変化する場合に対処するため
に、液面保持窓板１０は、レーザー光源１２からの入射
光路または反射面１１で反射したレーザー光の出射光路
に対してその角度を調整できるようにプローブ支持体９
に設置されている。
【００２８】光電変換素子１３で得られた電気信号は、
コントローラ１４に送られる（配線は図示せず）。この
信号をもとにコントローラ１４は、プローブ７の試料へ
の接近や表面観察の際に、プローブ７のたわみが規定値
を越えないようにＸＹＺスキャナー６で高さを制御する
ようになっており、また、その制御信号から、表面形状
の画像化を行っている。
コントローラ１４に送られる（配線は図示せず）。この
信号をもとにコントローラ１４は、プローブ７の試料へ
の接近や表面観察の際に、プローブ７のたわみが規定値
を越えないようにＸＹＺスキャナー６で高さを制御する
ようになっており、また、その制御信号から、表面形状
の画像化を行っている。
【００２９】光情報測定用の光源１５から放出された光
はＡＯモジュレータ（音響光学変調器）１６で変調さ
れ、次に、第二のレンズ１７によって集光されてプロー
ブ７に導入され、さらに、プローブ７の先端より試料１
に照射される。プローブ７の先端から試料１に照射され
た光は、試料１および液体保持試料皿２を透過して第一
のレンズ４に到達し、平行光となり、ミラー５によって
その方向を変換して第三のレンズ１８に達する。第三の
レンズ１８により集光された光はハーフミラー１９を通
り、一部はＣＣＤ２０に到達し、他方はピンホール２１
を通りフォトマルチプライヤー２２に導入される。ＡＯ
モジュレータ１６、ＣＣＤ２０、およびフォトマルチプ
ライヤー２２は、コントローラ１４に接続される。
はＡＯモジュレータ（音響光学変調器）１６で変調さ
れ、次に、第二のレンズ１７によって集光されてプロー
ブ７に導入され、さらに、プローブ７の先端より試料１
に照射される。プローブ７の先端から試料１に照射され
た光は、試料１および液体保持試料皿２を透過して第一
のレンズ４に到達し、平行光となり、ミラー５によって
その方向を変換して第三のレンズ１８に達する。第三の
レンズ１８により集光された光はハーフミラー１９を通
り、一部はＣＣＤ２０に到達し、他方はピンホール２１
を通りフォトマルチプライヤー２２に導入される。ＡＯ
モジュレータ１６、ＣＣＤ２０、およびフォトマルチプ
ライヤー２２は、コントローラ１４に接続される。
【００３０】光情報の検出を試料表面の二次元走査によ
る形状観察と同時に行うことによって、光学像を得るこ
とができる。ここで、光源１５の光に変調をかけている
か、あるいは、プローブ７と試料１の間に振動を与えて
いる場合は、コントローラ１４に内蔵されるロックイン
アンプによってＳＮ比を改善することができる。光源１
５の光に変調等をかけていない場合は、光電変換素子１
３の信号はロックインアンプを介さずに直接読み込まれ
る。
る形状観察と同時に行うことによって、光学像を得るこ
とができる。ここで、光源１５の光に変調をかけている
か、あるいは、プローブ７と試料１の間に振動を与えて
いる場合は、コントローラ１４に内蔵されるロックイン
アンプによってＳＮ比を改善することができる。光源１
５の光に変調等をかけていない場合は、光電変換素子１
３の信号はロックインアンプを介さずに直接読み込まれ
る。
【００３１】蛍光観察において、フォトンカウンティン
グを行う場合、ロックインアンプは使用しない。この場
合はフォトンのカウント数によって、光学像が構成され
ることになる。また、ＡＯモジュレーター１６による照
射光の変調は、プローブ７を振動させる場合には、プロ
ーブ７の振動と同期させることで試料１に対する照射振
動を制御できるため有効である。
グを行う場合、ロックインアンプは使用しない。この場
合はフォトンのカウント数によって、光学像が構成され
ることになる。また、ＡＯモジュレーター１６による照
射光の変調は、プローブ７を振動させる場合には、プロ
ーブ７の振動と同期させることで試料１に対する照射振
動を制御できるため有効である。
【００３２】図１に示した装置による測定例を以下に示
す。 （測定例１）まず、本測定例において使用する装置の諸
元について説明する。プローブ７は光ファイバに炭酸ガ
スレーザを照射しながら引張して溶断し尖鋭化する。そ
して、先端部分にさらに炭酸ガスレーザを照射して鉤状
に曲げ、図１に示すような先端形状を持ったカンチレバ
ー状のプローブ７を得る。先端部分は化学的エッチング
により、必要な径までさらに尖鋭化される。プローブ７
の先端の光を透過する部分以外は２００ｎｍのアルミニ
ウム膜をコーティングして遮光性を持たせている。
す。 （測定例１）まず、本測定例において使用する装置の諸
元について説明する。プローブ７は光ファイバに炭酸ガ
スレーザを照射しながら引張して溶断し尖鋭化する。そ
して、先端部分にさらに炭酸ガスレーザを照射して鉤状
に曲げ、図１に示すような先端形状を持ったカンチレバ
ー状のプローブ７を得る。先端部分は化学的エッチング
により、必要な径までさらに尖鋭化される。プローブ７
の先端の光を透過する部分以外は２００ｎｍのアルミニ
ウム膜をコーティングして遮光性を持たせている。
【００３３】プローブ７の長さを２〜４ｍｍにした場
合、その弾性定数は２〜２０Ｎ／ｍであり、空気中での
プローブ７の代表的な共振周波数およびＱ値はそれぞれ
１７ｋＨｚおよび２４０程度である。このプローブ７を
液中に入れると共振周波数が１４ｋＨｚ程度に減少し、
Ｑ値は２８程度すなわち８分の１に減少するが、本発明
の応用に際しては、この程度の特性で充分である。この
プローブ７をバイモルフ振動子８で励振する場合、空気
中と同じ振幅を得るためには、液中では空気中にくらべ
て約１０倍の励振電圧をバイモルフ振動子に加える必要
がある。具体的には、本測定例においてプローブ７の先
端で２０〜２００ｎｍの振幅を、液中で得たい場合、バ
イモルフ振動子８には実効値で１〜１０Ｖ、周波数１０
〜４０ｋＨｚの交流電圧を加える。ここでプローブ７の
カンチレバーとして機能する部分の長さは２〜４ｍｍで
ある。
合、その弾性定数は２〜２０Ｎ／ｍであり、空気中での
プローブ７の代表的な共振周波数およびＱ値はそれぞれ
１７ｋＨｚおよび２４０程度である。このプローブ７を
液中に入れると共振周波数が１４ｋＨｚ程度に減少し、
Ｑ値は２８程度すなわち８分の１に減少するが、本発明
の応用に際しては、この程度の特性で充分である。この
プローブ７をバイモルフ振動子８で励振する場合、空気
中と同じ振幅を得るためには、液中では空気中にくらべ
て約１０倍の励振電圧をバイモルフ振動子に加える必要
がある。具体的には、本測定例においてプローブ７の先
端で２０〜２００ｎｍの振幅を、液中で得たい場合、バ
イモルフ振動子８には実効値で１〜１０Ｖ、周波数１０
〜４０ｋＨｚの交流電圧を加える。ここでプローブ７の
カンチレバーとして機能する部分の長さは２〜４ｍｍで
ある。
【００３４】上記のような構成の液中観察機能付き走査
型近視野原子間力顕微鏡によって、液体中に浸漬した試
料を観察した結果を図２（ａ）、（ｂ）に示す。試料
は、石英板に、一ます１μｍ×１μｍのチェッカーボー
ド状のパターンを、２０ｎｍの厚みのクロム層で形成し
たものである。
型近視野原子間力顕微鏡によって、液体中に浸漬した試
料を観察した結果を図２（ａ）、（ｂ）に示す。試料
は、石英板に、一ます１μｍ×１μｍのチェッカーボー
ド状のパターンを、２０ｎｍの厚みのクロム層で形成し
たものである。
【００３５】図２（ａ）は原子間力を用いて測定した表
面形状像である。すなわち、図１に示したようにプロー
ブ７の振幅の変化をレーザ光源１２、反射面１１、光電
変換素子１３によって変換した電気信号によって検出す
る。この振幅を一定に保つように、試料の凹凸に応じて
試料をＸＹＺスキャナー６に設けたＺ方向のピエゾ素子
により上下させる。この際ピエゾ素子に加えた電気信号
を、コンピュータによる画像処理技術を用いてＣＲＴ上
に表示させたものが図２（ａ）である。図２（ｂ）は近
視野効果による透過光像である。同様に、図１に示した
ように試料の透過光をフォトマルチプライヤー２２によ
って電気信号に変換し、変換した電気信号を、コンピュ
ータによる画像処理技術を用いてＣＲＴ上に表示させた
ものである。図２（ａ）の表面形状像の突出している部
分が、厚み２０ｎｍのクロム層である。そして、図２
（ｂ）の透過光像のクロム層に対応する部分は、光を透
過しないため暗くなっていることがわかる。この場合、
平面的な測定分解能は１００ｎｍ以下であった。
面形状像である。すなわち、図１に示したようにプロー
ブ７の振幅の変化をレーザ光源１２、反射面１１、光電
変換素子１３によって変換した電気信号によって検出す
る。この振幅を一定に保つように、試料の凹凸に応じて
試料をＸＹＺスキャナー６に設けたＺ方向のピエゾ素子
により上下させる。この際ピエゾ素子に加えた電気信号
を、コンピュータによる画像処理技術を用いてＣＲＴ上
に表示させたものが図２（ａ）である。図２（ｂ）は近
視野効果による透過光像である。同様に、図１に示した
ように試料の透過光をフォトマルチプライヤー２２によ
って電気信号に変換し、変換した電気信号を、コンピュ
ータによる画像処理技術を用いてＣＲＴ上に表示させた
ものである。図２（ａ）の表面形状像の突出している部
分が、厚み２０ｎｍのクロム層である。そして、図２
（ｂ）の透過光像のクロム層に対応する部分は、光を透
過しないため暗くなっていることがわかる。この場合、
平面的な測定分解能は１００ｎｍ以下であった。
【００３６】（測定例２）上記測定例１は、本発明の装
置の測定原理を確認するために行ったものであるが、図
３（ａ）、（ｂ）、図４（ａ）、（ｂ）は細胞を水中で
観察したものである。試料は、マウスの表皮細胞を５ｍ
ｍ×５ｍｍのカバーガラス上で培養したものである。そ
の細胞は、観察前に２％のパラホルムアルデヒド水溶液
で固定されている。図３（ａ）、（ｂ）はその細胞を広
い範囲で観察したときの表面形状像と透過光像である。
ＣＲＴ上に５０μｍ×５０μｍの範囲の映像が得られ
る。この程度の広範囲の観察では、測定点数が粗くなる
ため細部が表示されないことから図３（ａ）の表面形状
像と図３（ｂ）の透過光像に顕著な相違はない。
置の測定原理を確認するために行ったものであるが、図
３（ａ）、（ｂ）、図４（ａ）、（ｂ）は細胞を水中で
観察したものである。試料は、マウスの表皮細胞を５ｍ
ｍ×５ｍｍのカバーガラス上で培養したものである。そ
の細胞は、観察前に２％のパラホルムアルデヒド水溶液
で固定されている。図３（ａ）、（ｂ）はその細胞を広
い範囲で観察したときの表面形状像と透過光像である。
ＣＲＴ上に５０μｍ×５０μｍの範囲の映像が得られ
る。この程度の広範囲の観察では、測定点数が粗くなる
ため細部が表示されないことから図３（ａ）の表面形状
像と図３（ｂ）の透過光像に顕著な相違はない。
【００３７】一方、図４（ａ）、（ｂ）はその細胞を狭
い範囲で観察したときの表面形状像と透過光像である。
ＣＲＴ上に１０μｍ×１０μｍの範囲の映像が得られ
る。この場合、逆に図４（ａ）の表面形状像と図４
（ｂ）の透過光像には大きな違いがみられる。図４
（ｂ）の透過光像には、細胞中の繊維構造が確認される
が、図４（ａ）の表面形状像にはそのような構造は見ら
れない。すなわち、図４（ｂ）の透過光像は、細胞内の
構造に起因する光学的な特性の差異を強く反映している
ものである。本測定例程度の分解能があり、かつ狭い範
囲の走査が可能であれば、上記の様な細胞内の情報をＣ
ＲＴ上に表示することが可能となる。
い範囲で観察したときの表面形状像と透過光像である。
ＣＲＴ上に１０μｍ×１０μｍの範囲の映像が得られ
る。この場合、逆に図４（ａ）の表面形状像と図４
（ｂ）の透過光像には大きな違いがみられる。図４
（ｂ）の透過光像には、細胞中の繊維構造が確認される
が、図４（ａ）の表面形状像にはそのような構造は見ら
れない。すなわち、図４（ｂ）の透過光像は、細胞内の
構造に起因する光学的な特性の差異を強く反映している
ものである。本測定例程度の分解能があり、かつ狭い範
囲の走査が可能であれば、上記の様な細胞内の情報をＣ
ＲＴ上に表示することが可能となる。
【００３８】上記測定例により、本発明の液中観察機能
付き走査型近視野原子間力顕微鏡を用いて、細胞表面近
傍の繊維構造を、生の状態で細胞の外側から観察できる
ことが確認された。これは従来の光学顕微鏡では、分解
能やコントラストの限界から観察できないものである。
付き走査型近視野原子間力顕微鏡を用いて、細胞表面近
傍の繊維構造を、生の状態で細胞の外側から観察できる
ことが確認された。これは従来の光学顕微鏡では、分解
能やコントラストの限界から観察できないものである。
【００３９】図５は、本発明の第２の実施例であり、反
射光を観察する場合の液中観察機能付き走査型近視野原
子間力顕微鏡の構成を示した模式図である。図５におい
て、試料１は、液体保持試料皿２に保持された任意の液
体３の中に浸漬される。液体保持試料皿２は縦横高さ方
向の移動が可能なＸＹＺスキャナー６の上に置かれてい
る。プローブ７はバイモルフ振動子８を介してプローブ
支持体９に固定される。液面保持窓板１０は、プローブ
７の上方にあって、プローブ支持体９の前方に配置され
ており、プローブ７の先端を試料１の表面近傍に接近さ
せた際に、液体保持試料皿２との間に表面張力によって
液体層が形成されるような高さにある。
射光を観察する場合の液中観察機能付き走査型近視野原
子間力顕微鏡の構成を示した模式図である。図５におい
て、試料１は、液体保持試料皿２に保持された任意の液
体３の中に浸漬される。液体保持試料皿２は縦横高さ方
向の移動が可能なＸＹＺスキャナー６の上に置かれてい
る。プローブ７はバイモルフ振動子８を介してプローブ
支持体９に固定される。液面保持窓板１０は、プローブ
７の上方にあって、プローブ支持体９の前方に配置され
ており、プローブ７の先端を試料１の表面近傍に接近さ
せた際に、液体保持試料皿２との間に表面張力によって
液体層が形成されるような高さにある。
【００４０】プローブ７の上側の一部には反射面１１が
構成されており、反射面１１の上方にレーザー光源１
２、上下２分割された光電変換素子１３が設置されてい
る。レーザー光源１２から放出された光は、液面保持窓
板１０を透過して反射面１１に到達し、反射して、再度
液面保持窓板１０を透過し、光電変換素子１３に導入さ
れ、電気信号に変換される。この際、液体の屈折率等の
影響でレーザー光の光路が変化する場合に対処するため
に、液面保持窓板１０は、レーザー光源１２からの入射
光路または反射面１１で反射したレーザー光の出射光路
に対してその角度を調整できるようにプローブ支持体９
に設置されている。
構成されており、反射面１１の上方にレーザー光源１
２、上下２分割された光電変換素子１３が設置されてい
る。レーザー光源１２から放出された光は、液面保持窓
板１０を透過して反射面１１に到達し、反射して、再度
液面保持窓板１０を透過し、光電変換素子１３に導入さ
れ、電気信号に変換される。この際、液体の屈折率等の
影響でレーザー光の光路が変化する場合に対処するため
に、液面保持窓板１０は、レーザー光源１２からの入射
光路または反射面１１で反射したレーザー光の出射光路
に対してその角度を調整できるようにプローブ支持体９
に設置されている。
【００４１】光電変換素子１３で得られた電気信号は、
コントローラ１４に送られる（配線は図示せず）。この
信号をもとにコントローラ１４は、プローブ７の試料へ
の接近や表面観察の際に、プローブ７のたわみが規定値
を越えないようにＸＹＺスキャナー６で高さを制御する
ようになっており、また、その制御信号から、表面形状
の画像化を行っている。
コントローラ１４に送られる（配線は図示せず）。この
信号をもとにコントローラ１４は、プローブ７の試料へ
の接近や表面観察の際に、プローブ７のたわみが規定値
を越えないようにＸＹＺスキャナー６で高さを制御する
ようになっており、また、その制御信号から、表面形状
の画像化を行っている。
【００４２】光情報測定用の光源１５から放出された光
はＡＯモジュレータ（音響光学変調器）１６で変調さ
れ、次に、第二のレンズ１７によって集光されてプロー
ブ７に導入され、さらに、プローブ７の先端より試料１
に照射される。プローブ７の先端から試料１に照射され
た光は、試料１の表面で反射し、液面保持窓板１０へ到
達する。液面保持窓板１０の上側前方にはプリズム２３
が設置してあり、プリズム２３の射出光の軸線上に第四
のレンズ２４、第五のレンズ２５、ハーフミラー１９、
ピンホール２１、フォトマルチプライヤー２２が設置し
てある。
はＡＯモジュレータ（音響光学変調器）１６で変調さ
れ、次に、第二のレンズ１７によって集光されてプロー
ブ７に導入され、さらに、プローブ７の先端より試料１
に照射される。プローブ７の先端から試料１に照射され
た光は、試料１の表面で反射し、液面保持窓板１０へ到
達する。液面保持窓板１０の上側前方にはプリズム２３
が設置してあり、プリズム２３の射出光の軸線上に第四
のレンズ２４、第五のレンズ２５、ハーフミラー１９、
ピンホール２１、フォトマルチプライヤー２２が設置し
てある。
【００４３】液面保持窓板１０を透過した光は第四のレ
ンズ２４、第五のレンズレンズ２５によって集光され、
ハーフミラー１９を通り、一部はＣＣＤ２０に到達し、
他方はピンホール２１を通りフォトマルチプライヤー２
２に導入される。ＡＯモジュレータ１６、ＣＣＤ２０、
およびフォトマルチプライヤー２２は、コントローラ１
４に接続される。
ンズ２４、第五のレンズレンズ２５によって集光され、
ハーフミラー１９を通り、一部はＣＣＤ２０に到達し、
他方はピンホール２１を通りフォトマルチプライヤー２
２に導入される。ＡＯモジュレータ１６、ＣＣＤ２０、
およびフォトマルチプライヤー２２は、コントローラ１
４に接続される。
【００４４】本実施例における、光情報の検出および形
状観察の機構は基本的に第１の実施例と同様である。本
実施例で使用しているプローブは、基本的にアルミコー
トを施し、先端に微小開口を形成したものであるが、ア
ルミコートのうえからさらに金コートを行うことによっ
て、液中での耐食性を向上させることが可能である。こ
の耐食コートとしては、金以外にも白金、チタン、Ｓｉ
Ｏ2 、Ｓｉ3 Ｎ4 、Ａｌ2 Ｏ3 、ポリエチレンなどの被
覆膜が利用可能である。
状観察の機構は基本的に第１の実施例と同様である。本
実施例で使用しているプローブは、基本的にアルミコー
トを施し、先端に微小開口を形成したものであるが、ア
ルミコートのうえからさらに金コートを行うことによっ
て、液中での耐食性を向上させることが可能である。こ
の耐食コートとしては、金以外にも白金、チタン、Ｓｉ
Ｏ2 、Ｓｉ3 Ｎ4 、Ａｌ2 Ｏ3 、ポリエチレンなどの被
覆膜が利用可能である。
【００４５】
【発明の効果】この発明は、以上説明したように、生物
試料や有機薄膜試料等の観察において期待されている近
視野顕微鏡の課題を解決するため、試料表面の形状およ
び光学的特性を観察する構成であることを特徴とする走
査型近視野原子間力顕微鏡を応用し、試料下面には液体
および試料を保持する液体保持試料皿と、試料上面には
液体の液面を保持する液面保持窓板を互いに接触しない
ように独立して、かつ、前記液体保持試料皿と前記液面
保持板の間で液体を表面張力で維持しうる位置に設置し
てあるような構成にしたので、液体は液面保持窓板の下
に常に層状に保持されるため、プローブの走査を常に液
面下で行うことができ、生物試料や有機薄膜試料等を液
体中で観察することができるという効果がある。
試料や有機薄膜試料等の観察において期待されている近
視野顕微鏡の課題を解決するため、試料表面の形状およ
び光学的特性を観察する構成であることを特徴とする走
査型近視野原子間力顕微鏡を応用し、試料下面には液体
および試料を保持する液体保持試料皿と、試料上面には
液体の液面を保持する液面保持窓板を互いに接触しない
ように独立して、かつ、前記液体保持試料皿と前記液面
保持板の間で液体を表面張力で維持しうる位置に設置し
てあるような構成にしたので、液体は液面保持窓板の下
に常に層状に保持されるため、プローブの走査を常に液
面下で行うことができ、生物試料や有機薄膜試料等を液
体中で観察することができるという効果がある。
【図１】本発明の液中観察機能付き走査型近視野原子間
力顕微鏡のうち、透過光を観察する場合の構成の一例を
示した模式図である。
力顕微鏡のうち、透過光を観察する場合の構成の一例を
示した模式図である。
【図２】本発明の液中観察機能付き走査型近視野原子間
力顕微鏡による測定例の図面代用写真であり、（ａ）は
表面形状像を示す図面代用写真、（ｂ）は透過光像を示
す図面代用写真である。
力顕微鏡による測定例の図面代用写真であり、（ａ）は
表面形状像を示す図面代用写真、（ｂ）は透過光像を示
す図面代用写真である。
【図３】本発明の液中観察機能付き走査型近視野原子間
力顕微鏡による細胞の測定例の図面代用写真であり、
（ａ）は表面形状像を示す図面代用写真、（ｂ）は透過
光像を示す図面代用写真である。
力顕微鏡による細胞の測定例の図面代用写真であり、
（ａ）は表面形状像を示す図面代用写真、（ｂ）は透過
光像を示す図面代用写真である。
【図４】本発明の液中観察機能付き走査型近視野原子間
力顕微鏡による細胞の他の測定例の図面代用写真であ
り、（ａ）は表面形状像を示す図面代用写真、（ｂ）は
透過光像を示す図面代用写真である。
力顕微鏡による細胞の他の測定例の図面代用写真であ
り、（ａ）は表面形状像を示す図面代用写真、（ｂ）は
透過光像を示す図面代用写真である。
【図５】本発明の液中観察機能付き走査型近視野原子間
力顕微鏡のうち、反射光を観察する場合の構成の一例を
示した模式図である。
力顕微鏡のうち、反射光を観察する場合の構成の一例を
示した模式図である。
１ 試料 ２ 液体保持試料皿 ３ 液体 ４ 第一のレンズ ５ ミラー ６ ＸＹＺスキャナー ７ プローブ ８ バイモルフ振動子 ９ プローブ支持体 １０ 液面保持窓板 １１ 反射面 １２ レーザー光源 １３ 光電変換素子 １４ コントローラ １５ 光源 １６ ＡＯモジュレータ １７ 第二のレンズ １８ 第三のレンズ １９ ハーフミラー ２０ ＣＣＤ ２１ ピンホール ２２ フォトマルチプライヤー ２３ プリズム ２４ 第四のレンズ ２５ 第五のレンズ
Claims (8)
- 【請求項１】 試料を液体中に浸漬して保持する液体保
持試料皿と、前記液体保持試料皿の上方に配置され前記
液体の液面を覆うように保持する液面保持窓板と、先端
部に光を透過する透過孔と一部に光反射手段を有し前記
先端部が前記液体中に浸漬して前記試料の上面に配置さ
れるプローブと、前記プローブを支持するプローブ支持
基板と、前記透過孔から前記試料に照射する光を発生す
る光源と、前記照射された光により生じる前記試料から
の光情報を検出して電気信号に変換する検出手段と、前
記試料との相互作用により生じる前記プローブのたわみ
量を検出するために前記光反射手段に照射するレーザー
光を発生するレーザー光源と、前記光反射手段からの反
射光を受けて電気信号に変換する光電変換素子と、前記
試料と前記プローブを相対的に移動させる移動手段と、
前記試料の表面と前記プローブの先端の間の距離を制御
する距離制御手段とを有することを特徴とする液中観察
機能付き走査型近視野原子間力顕微鏡 - 【請求項２】 前記液体保持試料皿と前記液面保持窓板
は互いに接触しないように配置されている請求項１記載
の液中観察機能付き走査型近視野原子間力顕微鏡 - 【請求項３】 前記液面保持窓板は、前記液体保持試料
皿との間で前記液体を表面張力で維持する位置に配置さ
れている請求項１記載の液中観察機能付き走査型近視野
原子間力顕微鏡 - 【請求項４】 前記照射された光により生じる前記試料
からの光情報は、前記試料を透過した光情報である請求
項１記載の液中観察機能付き走査型近視野原子間力顕微
鏡 - 【請求項５】 前記照射された光により生じる前記試料
からの光情報は、前記試料から反射した光情報である請
求項１記載の液中観察機能付き走査型近視野原子間力顕
微鏡 - 【請求項６】 前記液面保持窓板は前記レーザー光を透
過する材料で形成され、前記レーザー光の光軸を調節す
るための角度調節機構を有する請求項１記載の液中観察
機能付き走査型近視野原子間力顕微鏡 - 【請求項７】 前記プローブを前記試料の表面に対して
垂直な面内で振動させるための振動機構を有する請求項
１記載の液中観察機能付き走査型近視野原子間力顕微鏡 - 【請求項８】 前記プローブは、少なくとも前記液体に
浸漬する部分に前記液体による腐食を防ぐための耐食コ
ートが施されている請求項１記載の液中観察機能付き走
査型近視野原子間力顕微鏡
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7237730A JP2936311B2 (ja) | 1994-09-09 | 1995-08-23 | 液中観察機能付き走査型近視野原子間力顕微鏡 |
| US08/525,348 US5821409A (en) | 1994-09-09 | 1995-09-07 | Scanning near-field optic/atomic-force microscope with observing function in liquid |
| DE69515574T DE69515574T2 (de) | 1994-09-09 | 1995-09-08 | Kombiniertes optisches Nahfeld-Rastermikroskop und Rasterkraftmikroskop mit Beobachtung in einer Flüssigkeit |
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