JPH08131196A

JPH08131196A - 臨床検査用複合酵素含有組成物

Info

Publication number: JPH08131196A
Application number: JP6277617A
Authority: JP
Inventors: Ryoji Aoki; 亮治青木; Shigeru Ueda; 成植田
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1994-11-11
Filing date: 1994-11-11
Publication date: 1996-05-28
Anticipated expiration: 2020-03-02
Also published as: EP0791658A1; EP0791658A4; WO1996015256A1; US6350601B1; DE69527366D1; JP3625503B2; EP0791658B1; DE69527366T2

Abstract

(57)【要約】【構成】安定化剤としてトレハロースおよびソルビト
ールより選ばれた糖類およびアルブミンを含み、少なく
ともアルカリホスファターゼ、クレアチンキナーゼおよ
びアラニンアミノトランスフェラーゼからなる群より選
ばれる２種以上の酵素および含水媒体を含有する安定化
された臨床検査用複合酵素組成物。【効果】複合酵素含有液状組成物は、−２０℃以下の
凍結では、少なくとも１５ヶ月の長期にわたり、また解
凍後では２〜８℃保存で少なくとも７日間、いずれの酵
素においても活性の低下が認められない、安定で、経済
性に富む組成物となし得た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、安定化剤としてトレハ
ロースおよびソルビトールより選ばれた糖類およびアル
ブミンを含み、少なくともアルカリホスファターゼ、ク
レアチンキナーゼおよびアラニンアミノトランスフェラ
ーゼからなる群より選ばれる２種以上の酵素および含水
媒体を含有する安定化された臨床検査用複合酵素組成物
であって、臨床検査において、精度管理や検量用等に用
いられる有用な組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、臨床検査用酵素含有組成物とし
て、精度管理のためのコントロール（管理血清）ならび
に、各施設間差是正のために用いられるリファレンス・
マテリアル（標準物質）、さらに両者の中間的なものと
して酵素活性値を得るために行う目盛り付けのための試
料であるキャリブレーターが、多数市販されている。ま
た、これらは、ヒトプール血清、動物プール血清、ヒト
アルブミン、またはウシ血清アルブミン等をマトリック
スとし、これに検査すべき酵素成分に対応する酵素を添
加し調製される。

【０００３】添加される酵素の由来は、種々の動物臓器
やヒト由来のものが報告されている。例えば、現在市販
されているものとして、動物由来酵素をヒトプール血清
に添加した「モニトロール」（登録商標；国際試薬
（株））が凍結乾燥品で、「モニトロールＬ」（国際試
薬（株））が凍結液状品で、コントロールとして用いら
れている。また、リファレンスとしては、ヒトプール血
清にヒト赤血球由来酵素やヒト株化細胞由来酵素を添加
した「セラクリアＨＥ」（商品名；日本商事（株）製）
や、ウシ血清アルブミンに上記ヒト由来酵素を添加した
「酵素リファレンス」等が市販されている。この中でヒ
トプール血清をマトリックスに用いる場合は、ＨＩＶを
始め、既知、未知のウイルスの混入の危険性が皆無では
なく、バイオハザード面での細心の注意が必要である。

【０００４】これらの酵素含有組成物は、それに対応す
る酵素活性測定試薬により酵素活性を測定するが、その
使用目的により求められる性能が異なる。一般的に、酵
素活性のような触媒能の量を測定する場合、基質の濃度
や種類、またｐＨ、温度等の反応環境により、大きく値
が異なる。従って、臨床診断薬のように、血清等の検体
の中の酵素活性の値を、病態把握の判定の一助として用
いる場合、前述のように測定環境により値が異なるとい
うことは致命的である。現実に、種々の測定試薬が多数
のメーカーより市販されており、そのため、例えば、同
じ検体を、複数の試薬で測定した場合、その試薬の反応
環境に著しく差がある場合、異なる値が得られ、徒に混
乱を招くだけとなる。

【０００５】そのため、測定法の細部にわたる条件の統
一を合意に基づいて定めた、いわゆる勧告法（ｒｅｃｏ
ｍｍｅｎｄｅｄｍｅｔｈｏｄ）が学会により決められ
ている。その例として、国際臨床化学連合（ＩＦＣＣ）
勧告法、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法等がある。
ところが、この勧告法は、用手法であり、一日に膨大な
数の検査をとりおこなう検査室ではとうてい実施できる
ものではない。そこで、勧告法の有する正確さを直接伝
えるものとして、リファレンス・マテリアルの必要性が
生じる。これにより、リファレンス・マテリアルを用い
て勧告法にて測定された値を、日常一般に自動分析機を
用いて測定される市販試薬との校正に用いれば、反応環
境の差異によらず同一検体の酵素活性をより正確に求め
得ることができる。

【０００６】このように、リファレンス・マテリアル
は、勧告法と日常一般法とのバイアスとなるもので、そ
れに求められる性能としては、ヒトの検体と同じ性質を
示すものが望まれる。近年、検査データの互換性の面か
ら、リファレンス・マテリアルの重要性が特に強調され
てきており、ヒト由来酵素を用いた製品も市販されてい
る。しかしながら、一口に、ヒト由来酵素といっても、
臓器特異性などの面から、酵素作用は同一でも性質の違
うアイソザイムとして複数種存在する酵素もあり、さら
に、個人、病態により、血清に含まれる量も異なり、そ
の事情は複雑である。

【０００７】例えば、アルカリホスファターゼは、骨、
肝、胎盤、小腸、腫瘍細胞からの逸脱、等の由来があ
り、これらの酵素は、使用する緩衝液の種類によって得
られる活性値が大きく異なることが知られている。一
方、コントロールは日常検査において各測定現場での精
度管理のために用いられており、試薬や機器類の異常を
チェックするためのものであり、酵素活性の値そのもの
よりもその値のが測定期間中変動しないことが要求され
る。さらに、キャリブレーターは、リファレンス・マテ
リアルとコントロールの中間に位置づけることができ、
ある特定の試薬を使用した場合の検量用物質として用い
られる。

【０００８】これらの臨床検査用酵素含有組成物は、通
常、凍結乾燥品や液状品、凍結品として流通されてい
る。このうち凍結乾燥品は、凍結乾燥品としての保存安
定性にはすぐれているものの、凍結乾燥時のリポ蛋白の
変性により、溶解時に濁りが生じたり、容量誤差が生じ
やすい等の問題点がある。また、含有する酵素の溶解課
程における活性の変動が少なくなかった。例えば、凍結
乾燥品の場合、同一ロットでのバイアル間差が大きいこ
とが報告されている（検査と技術、ｖｏｌ．２０、Ｎ
ｏ．１２、１０４１、１９９２）。また、より具体的に
は、特にアルカリホスファターゼが大きな問題を抱えて
いる。例えば、アルカリホスファターゼは血清中のリポ
蛋白の影響を受けて可逆的に失活するという現象が指摘
されている。また、市販管理血清の凍結乾燥品におい
て、溶解後２５℃、２４時間以内にかなりの活性上昇が
認められている（生物試料分析、ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．
２、１９９１）。このように凍結乾燥品に限れば、アル
カリホスファターゼに関しては、溶解後の活性値変動に
関して満足な性能を有するものは皆無であった。また、
溶解液（通常は水）の温度と活性値への影響も指摘され
ている。例えば、クレアチンキナーゼに関して、２〜８
℃の溶解液で溶解したもののほうが室温の溶解液で溶解
した場合よりも高活性値を示したとの報告もある（臨床
検査機器．試薬、ｖｏｌ．１５、Ｎｏ．４、１９９
２）。これらを総合すると、凍結乾燥品の場合、溶解後
の安定性について、おおむね１日から２日程度の使用に
限られていた。

【０００９】これに対して、液状品や凍結品は溶解液
（通常は水）に溶かす必要がないため操作が簡便であ
り、溶解時の誤差がなく、上記凍結乾燥品の課題であっ
た溶解過程における酵素活性の変動は少なくなった。凍
結品の場合は使用に際して解凍操作が必要であるのに対
し、液状品は、手を加えずにそのまま使用することがで
きるため、近年、臨床生化学検査分野でもその比率が高
まりつつあり、そのまま使用できることから無調製試薬
という呼び方もされている。この無調製試薬は、溶解や
解凍の手間が省けるので、ひいては検査室の省力化、合
理化につながる。

【００１０】従って管理血清においても無調製化は必然
の方向である。しかし、コントロール、リファレンス・
マテリアル等の酵素含有組成物の場合は現状では無調整
試薬としての技術レベルには達しておらず、流通と保存
は凍結品の形態をとっているのが現状である。しかし、
これらの製品でもアルカリホスファターゼに関して、溶
解後の活性が徐々に上昇するとの報告が（検査と技術、
ｖｏｌ．２０、Ｎｏ．１２、ｐ１０３９、１９９２
年）、また、クレアチンキナーゼに関しても−２０℃の
凍結で、１〜３ヶ月間以降は活性が低下するとの報告
（検査と技術、ｖｏｌ．２１、Ｎｏ．５、１９９３年増
刊号）もあり、必ずしも満足のいくものではない。

【００１１】臨床意義としてのアルカリホスファターゼ
は、腫瘍マーカーのみならず、各種病態情報としてきわ
めて多彩である。また、クレアチンキナーゼは、３種の
アイソザイムをもち、現在臨床検査で広く測定されてい
る酵素、例えばアラニンアミノトランスフェラーゼ、ア
スパラギン酸アミノトランスフェラーゼなどと比較して
その局在臓器の特異性がきわめて高く、骨格筋、心筋、
平滑筋、脳にその大部分が存在する。従って、クレアチ
ンキナーゼを測定することによりこれに関連した損傷臓
器の推定が容易に可能である。従って、特に、凍結品や
液状品としてのアルカリホスファターゼ、クレアチンキ
ナーゼの安定化酵素含有組成物が望まれている。

【００１２】一般に、酵素はタンパク質であり、その溶
液は不安定である。その解決のための一手段として、酵
素を好熱性の微生物の培養により取得することが行われ
ている。これは、これらの微生物が作る酵素がもともと
熱に対し安定であるためである。また、タンパク質工学
等の手法を用い、熱に安定なタンパク質を遺伝子、アミ
ノ酸、立体構造などの情報をもとにデザインし、改変す
ることも近年可能になりつつある。また、他の手段とし
ては酵素溶液の環境を整えることで安定化が図られてい
る。

【００１３】例えば、一般的な安定化剤としてグリセロ
ールをはじめとするポリオール類が知られている。しか
し、酵素の種類は膨大であり、また、至適ｐＨが異なる
等その性質も多様であり、全てについて適応可能な安定
剤というものはない。実際に、特定の酵素に関しての安
定化方法についてはこれまでにも種々の報告がある。例
えば、特開平５−２０７８８０号公報には非反応性スル
フヒドリル基を有するタンパク質を用いるクレアチンキ
ナーゼの安定化組成物が、米国特許第５２９８４０６号
明細書には抗酸化剤としてアスコルビン酸、非還元性ポ
リオール、および抗菌剤を含有するクレアチンキナーゼ
の組成物が、クレアチンキナーゼ単独の安定化組成物と
して述べられている。これらは、いずれもクレアチンキ
ナーゼの活性発現に必須のＳＨ基を安定化させるための
組成物である。ところが、酵素が２種類以上共存する場
合、ある酵素にとっての安定化条件が、他の酵素にとっ
ての不安定化要素となることが多々あり、このため、含
有する酵素全てに対する安定化条件を見いだすことは困
難である。例えば、アルカリホスファターゼは、その活
性化にマグネシウムイオンが必須であることが知られて
おり（酵素ハンドブック（朝倉書店）、ｐ４３４、１９
８３）、また、マグネシウムイオンは安定化作用も有す
る。

【００１４】一方で、クレアチンキナーゼの保存安定性
はキレート試薬の添加により増大することが知られてい
る（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、２３、１１１９、１９７
７）。これは、キレート試薬によりマグネシウムイオン
等の金属がトラップされるためと考えられ、両酵素の安
定化剤は相反する性質をもつ。また、クレアチンキナー
ゼは前述したようにＳＨ酵素であるため、システイン、
メルカプトエタノール、Ｎ−アセチルシステインや上記
特許公開公報記載のシステイニル−ウシ血清アルブミン
等のチオール化合物の共存下で安定化される。ところ
が、Ｎ−アセチルシステインやシステイニル−ウシ血清
アルブミンはアルカリホスファターゼにとっては逆に不
安定化因子となる（実施例１参照）。

【００１５】また、溶液状態での安定化条件と、凍結状
態での安定化条件は、一般には異なり、両者を満足させ
る条件を見いだすこともまた困難である。例えば、アル
カリホスファターゼについて、シュクロースの添加によ
り溶液での安定性は向上するが、凍結保存安定性は逆に
低下した（実施例５参照）。また、酵素は一般にはより
低温の状態で安定であるが、乳酸デヒドロゲナーゼのよ
うに低温で不安定である（臨床化学、ｖｏｌ．１９、Ｎ
ｏ．２、１９９０）酵素も中には存在する。

【００１６】このような状況下、例えば、複数の酵素を
含む組成物において、全ての酵素活性を低下させること
のない安定化組成物が求められている。特に、リファレ
ンス・マテリアル、キャリブレーター、コントロールと
して精度管理や検量のために用いられる酵素含有組成物
は、通常の検査薬キットの分析試薬の場合のように、あ
らかじめ活性低下を見込んで大過剰量の酵素を添加すれ
ばよいというものではなく、酵素活性の力価そのものの
変動の有無がその商品価値を決める大きな要因となる。
近年、検査室の合理化、省力化のために、酵素をより安
定化させた即使用可能な無調製試薬キットが開発されて
いるが、精度管理や検量のための酵素含有組成物試薬は
これらに比べ、酵素濃度も極めて薄いこと、酵素活性の
わずかの低下でもその商品価値を失うことなどから、そ
の安定化はより困難であり、少なくともアルカリホスフ
ァターゼ、クレアチンキナーゼおよびアラニンアミノト
ランスフェラーゼからなる群より選ばれる２種以上の酵
素組成物、とりわけ、アルカリホスファターゼとクレア
チンキナーゼの混合組成物での両酵素共の安定化が望ま
れている。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、少な
くともアルカリホスファターゼ、クレアチンキナーゼお
よびアラニンアミノトランスフェラーゼからなる群より
選ばれる２種以上の酵素を含む複数の酵素含有組成物に
おいて、タンパク質としてアルブミンおよび糖としてソ
ルビトールまたはトレハロースを含む、調整後の溶液の
安定性と凍結保存安定性、および凍結保存を経た解凍後
の安定性に優れた実用性、経済性に富む臨床検査用酵素
含有液状組成物を提供することである。

【００１８】

【課題を解決するための手段】上記の状況に鑑み本発明
者らは、鋭意研究した結果、少なくともアルカリホスフ
ァターゼ、クレアチンキナーゼおよびアラニンアミノト
ランスフェラーゼからなる群より選ばれる２種以上の酵
素を含む精度管理または／および検量のための酵素含有
組成物の安定化組成物について、種々のマトリックスを
検討した結果、ある種の添加剤を組み合わせて用いるこ
とにより、凍結品としての安定性にすぐれ、かつ解凍液
の安定性にもすぐれた液状および凍結組成物となすこと
ができ、本発明を完成するに至った。

【００１９】即ち、本発明の目的は、少なくともアルカ
リホスファターゼ、クレアチンキナーゼおよびアラニン
アミノトランスフェラーゼからなる群より選ばれる２種
以上の酵素を含む複合酵素含有組成物に含まれるすべて
の酵素を安定化させることにより、従来に比し、経済性
に富み、かつ測定値の変動の範囲が狭く、検査精度を管
理する上で、信頼度の高い検査を行うことを可能とする
コントロール、キャリブレーター、またはリファレンス
・マテリアルとして有用な臨床検査用酵素含有液状組成
物を提供することにある。

【００２０】より具体的には、少なくともアルカリホス
ファターゼ、クレアチンキナーゼおよびアラニンアミノ
トランスフェラーゼからなる群より選ばれる２種以上の
酵素を含む複合酵素含有組成物に対して、意外にも、あ
る種の糖、アルブミンの併用により、凍結された状態で
の安定性のみならず、凍結を経る経ないにかかわらず冷
蔵溶液の状態での安定性においても優れていることを見
いだし本発明を完成させるに至った。

【００２１】本発明は、このような状況に鑑み完成され
たものであり、安定化剤としてトレハロースおよびソル
ビトールより選ばれた糖類およびアルブミンを含み、少
なくともアルカリホスファターゼ、クレアチンキナーゼ
およびアラニンアミノトランスフェラーゼからなる群よ
り選ばれる２種以上の酵素および含水媒体を含有する安
定化された臨床検査用複合酵素組成物である。

【００２２】本発明における該酵素組成物としてはアル
カリホスファターゼ（ＡＬＰ）（ＥＣ．３．１．３．
１）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）（ＥＣ．２．７．
３．２）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（Ａ
ＬＴ）（ＥＣ．２．６．１．２）からなる群より選ばれ
る２種以上の酵素を含む複合酵素含有組成物、好適には
ＡＬＰとＣＫの２種を包含する複合酵素含有組成物、Ａ
ＬＰとＣＫとＡＬＴの３種を包含する複合酵素含有組成
物が挙げられ、さらにこれらの複合酵素含有組成物以外
に、好ましくは、アスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼ（ＡＳＴ）（ＥＣ．２．６．１．１）、乳酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（ＥＣ．１．１．１．２７）、
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）
（ＥＣ．２．３．２．２）を含む組成物、アスパラギ
ン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を含む組成
物、を提供することである。

【００２３】次に、本発明に用いることのできるアルブ
ミンとしては、例えばヒトやウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）をはじめとした哺乳動物、またニワトリ血清アルブ
ミン等の鳥類等のアルブミンを使用することができる。
これらは市販されているものをそのまま用いればよく、
その濃度としては好ましくは、０．３〜７（Ｗ／Ｖ）
％、特に１〜５（Ｗ／Ｖ）％が好ましい。

【００２４】また、糖としては、ソルビトール、トレハ
ロースが特に好ましく、糖の濃度としては２〜１５％、
特に３〜１０％が好ましい。また、この糖濃度が低い場
合には、充分な安定化効果は示さず、高い場合には、粘
度調整が困難となるために、上記使用範囲内を使用す
る。これらは必要に応じ２種類の混合物として用いるこ
ともできる。

【００２５】また、本発明組成物に用いる酵素として
は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、クレアチンキ
ナーゼ（ＣＫ）およびアラニンアミノトランスフェラー
ゼ（ＡＬＴ）からなる群より選ばれる２種以上の酵素を
必須とする複合酵素組成物としてなり、好ましくは、
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）γ−グルタミルトラン
スペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）を含む組成物、アスパ
ラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を含む組
成物、が挙げられる。

【００２６】これらに記載の酵素としては、その起源に
ついては、液状および凍結組成物としての用途に合致す
れば特に限定されないが、動物起源、好ましくはヒト起
源が望ましい。動物由来としては、例えば、アルカリホ
スファターゼ（ＡＬＰ）についてはウシ腎臓（シグマ製
カタログナンバーＰ６６８０）、ウシ腸（シグマ製カタ
ログナンバーＰ０２８０）、ブタ腎臓（シグマ製カタロ
グナンバーＰ４４３９）、ニワトリ小腸（シグマ製Ｐ８
００８）などが、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）について
はウシ心臓（シグマ製Ｃ７８８６）、ブタ心臓（商品
名；モニトロール（Ｌ）（国際試薬））、ニワトリ心臓
（商品名；コントロールワコー（和光純薬工業
（株））、ウサギ筋肉（シグマ製Ｃ３７５５）などが、
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の
由来としてはウシ心臓（商品名；モニトロールＩＩ（国
際試薬））、ブタ心臓（シグマ製Ｇ２７５１）などが、
またアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）につ
いてはウシ心臓（商品名；モニトロールＩＩ（国際試
薬））、ブタ心臓（シグマ製Ｇ８２２５）などが、乳酸
デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）についてはニワトリ心臓
（シグマ製Ｌ９１２６）、ブタ心臓（シグマ製Ｌ２８８
１）などが、さらにγ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ（γ−ＧＴＰ）についてはウシ腎臓（シグマ製Ｇ４１
３５）、ブタ腎臓（シグマ製Ｇ２２６２）等が挙げられ
る。

【００２７】また、ヒト起源としては、血清、赤血球、
尿等の生体材料より取得したもののみならず、ヒト由来
細胞を培養したもの、またはヒト由来酵素の遺伝子を組
み込んだ形質転換体の培養により取得することもでき
る。例えば、生体材料として赤血球からＡＳＴ、ＬＤＨ
を、また尿からはγーＧＴＰを取得することができる。
ヒト由来細胞の好適な例としてはヒト肝癌細胞株ＢＲＬ
６８（ＡＴＣＣＣＬ−４８）、ヒトバーキットリンパ腫
細胞株ナマルバ細胞（ＡＴＴＣＣＲＬ−１４３２）、ヒ
ト骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０（ＡＴＴＣＣＣＬ−２
４０）等であり、これらの培養物から適宜上記の酵素を
取得することができる。

【００２８】また、上記酵素に関しては、動物やヒト由
来ｃＤＮＡ遺伝子が種々報告されているので、これらの
遺伝子を組み込んだ形質転換体として酵素活性を発現さ
せることにより取得することもできる。この際、形質転
換体としては、ヒト細胞のみならず、チャイニーズハム
スター由来細胞ＣＨＯ等のヒト以外の動物細胞はもとよ
り大腸菌等の微生物を用いることもできる。これら動物
起源またはヒト生体材料や細胞培養等により生産された
各種の酵素は、市販されたもの以外の場合、カラムクロ
マトグラフィ法等の種々の確立された精製法を組合せ、
実用上問題にならない程度に純度を高め本目的に使用す
ればよい。

【００２９】本発明におけるこれらの酵素の添加量は、
ＡＬＰが９ｕ／ｌ〜６５００ｕ／ｌ、特に好ましくは４
５ｕ／ｌ〜１３００ｕ／ｌ、ＣＫが６ｕ／ｌ〜４０００
ｕ／ｌ、特に好ましくは３０ｕ／ｌ〜８００ｕ／ｌ、Ａ
ＬＴが３ｕ／ｌ〜１１５０ｕ／ｌ、特に好ましくは１３
ｕ／ｌ〜２３０ｕ／ｌ、ＡＳＴが３ｕ／ｌ〜１１５０ｕ
／ｌ、特に好ましくは１３ｕ／ｌ〜２３０ｕ／ｌ、ＬＤ
Ｈが８ｕ／ｌ〜４０００ｕ／ｌ、特に好ましくは４０ｕ
／ｌ〜８００ｕ／ｌ、γ−ＧＴＰが２ｕ／ｌ〜１２００
ｕ／ｌ、特に好ましくは１０ｕ／ｌ〜２４０ｕ／ｌであ
る。

【００３０】なお、酵素活性は３７℃にて１μｍｏｌの
基質を変化させる酵素量を１ｕとして、ＡＬＰ、ＣＫ、
ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨについては日本臨床化学会勧告
法（臨床化学、１９巻、ｐ２０９、ｐ１８４（１９９
０）、同１８巻、ｐ２１１、ｐ２２６（１９８９）、同
１９巻、ｐ２２８（１９９０）における測定温度３０℃
を３７℃にした常用基準法にて、またγ−ＧＴＰはγ−
グルタミル−３，５−ジブロム−４−ヒドロキシアニリ
ドを基質に用いる市販のキットで測定した（デタミナー
γ−ＧＴＰ（協和メディックス（株））。この基質は、
γ−ＧＴＰの作用により３，５−ジブロム−４−ヒドロ
キシアニリド（ＤＢＨＡ）を生成させ、生じたＤＢＨＡ
は、モノフェノールモノオキシゲナーゼ（ＭＰＯ）、例
えばアスコルビン酸オキシダーゼ、ラッカーゼなどによ
り１Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェノール）−Ｎ−
サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）と酸化縮合
し、７１０ｎｍに緑色の発色を示す。この発色強度を定
量することによりγ−ＧＴＰ活性値を求める。

【００３１】さらに、含水媒体としては、中性付近、好
適にはｐＨ７〜８付近の緩衝能を有する水性媒体であれ
ば良く、緩衝剤、例えばＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＢＥ
Ｓ等を蒸留水にて溶解し、ＮａＯＨでｐＨを調整したグ
ッド緩衝液や、リン酸緩衝液などを、５〜２００ｍＭ、
特に１０〜１００ｍＭの濃度で使用すればよい。また防
腐剤等も必要に応じて使用することができる。

【００３２】本発明の複合酵素含有組成物は、使用目的
が血清，血漿などの実際の検体との比較において用いら
れるため、粘度、比重等の物理化学的な性質は実際の検
体に近似することが望ましい。例えば、被検体（多くの
場合血清）との性状に差があると、自動分析機器のサン
プリング誤差を生じ、正確な測定をなしえない（検査と
技術、ｖｏｌ．１７、Ｎｏ．２、１９８９）。実際、こ
れらの物性が、安定化剤の添加によって逆に血清とかけ
離れてしまう場合も多々ある。

【００３３】本発明の液状組成物においては、このよう
な事情も考慮し、実際の検体である血清に粘度、比重等
を近似させることが容易にできる。実際の血清の粘度、
比重は個人により値が異なるが、粘度は１．０７〜１．
３９ｃＰ（３７℃にて測定）、比重は１．０１８０〜
１．０２４４（２５℃にて測定）であったとの報告があ
る（ＨＥＭ研究会記録集、ｐ２１、１９９２年６月）。
例えば、糖としてソルビトールまたはトレハロースを用
い、アルブミンとしてＢＳＡを用いた場合、ＢＳＡが３
％の時、ソルビトール３％で、粘度１．１８ｃＰ、比重
１．０１８３９であり、またソルビトール５％で、粘度
１．３０ｃＰ、比重１．０２５０８と上記血清値の範囲
内であった。尚、粘度は東機産業製バイオレオラザーを
用い、３７℃、５０ｒｐｍ、４８コーンの条件にて測定
し、比重はゲーリュサック型比重瓶を用い２５℃にて測
定した。

【００３４】本発明組成物を調整するには、例えば、低
温、好ましくは２〜８℃にて、上記濃度範囲の物質を各
々秤量し、含水媒体に溶解させ、ｐＨを合わせ液状組成
物とすればよい。さらに、該組成物をバイアル瓶等のガ
ラス製容器に１〜１０ｍｌずつ分注し、そのまま使用に
供するか、または−２０℃以下の冷凍機にてできるだけ
速やかに凍結し、保存すれば良い。この凍結組成物を解
凍するには、室温にて、好ましくは２〜２５℃にて自然
解凍させ、よく均一化したのち使用に供すればよい。

【００３５】これらの酵素含有組成物の具体的な使用方
法としては、上記バイアル瓶に分注された該組成物を、
溶液の場合はそのまま、また凍結の場合は解凍させたの
ち、その一部を測定のため、例えば自動分析装置用サン
プルカップに０．１〜０．５ｍｌ程度取り出し、自動分
析装置にセットし、血清等検体と同じように各々の酵素
活性測定試薬にて測定に供すれば良い。このようにして
実際に使用すれば、調製後、１週間以内に使用する場合
は、使用時まで冷蔵にて保存（例えば２〜８℃）すれば
よく、この場合その期間内で、いずれの酵素についても
活性の低下が認められず安定であった。また、すぐに使
用しない場合には、−２０℃以下の凍結状態で保存し、
使用時に解凍して用いればよい。この場合−２０℃以下
の保存で少なくとも１５ヶ月はいずれの酵素においても
活性の低下が認められず、また解凍後の２〜８℃におけ
る安定性についても調製時と同様１週間活性を保持する
ことができた。

【００３６】すなわち、本発明による複合酵素含有液状
組成物は、−２０℃以下の凍結では、少なくとも１５ヶ
月の長期にわたり、また解凍後では２〜８℃保存で少な
くとも７日間、いずれの酵素においても活性の低下が認
められない、安定で、経済性に富む組成物となし得た。
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する
が、これにより本発明はなんら限定されることはない。

【００３７】

【実施例】各酵素の活性測定は、３７℃にて、以下の市
販試薬を用いて、γ-ＧＴＰは測定試薬に添付されたキ
ャリブレータを用いて、またそれ以外の酵素は実測Ｋフ
ァクター（検査と技術、ｖｏｌ．２５、Ｎｏ．５、ｐ２
２３，１９９３年増刊号）法を用いて酵素活性を算出し
た。尚、測定機器は日立７０７０型自動分析装置を使用
した。ＡＳＴ；ＧＯＴＩＩ−ＨＡテストワコー（和光純薬工
業（株）製）ＡＬＴ；ＧＰＴＩＩ−ＨＡテストワコー（和光純薬工
業（株）製） γ−ＧＴＰ；デタミナ−γ−ＧＴＰ（協和メディックス
（株）製）ＡＬＰ；ＡＬＰＩＩ−ＨＡテストワコー（和光純薬工
業（株）製）ＣＫ；ＣＰＫＩＩ−ＨＡテストワコー（和光純薬工
業（株）製）ＬＤＨ；ＬＤＨＩＩ−ＨＡテストワコー（和光純薬工
業（株）製）

【００３８】

【実施例１】２０ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）３％ＢＳＡ（シグマ製）５００ｕ／ｌ・ＡＬＰ（ブタ腎由来；シグマ製）２５０ｕ／ｌ・ＣＫ（ウサギ筋肉由来；ベーリンガー
マンハイム製）上記組成のＡＬＰ、ＣＫ複合酵素含有組成物、及び上
記組成物に１ｍＭのＮ−アセチルシステイン（シグマ
製）を加えたもの、上記組成物に０．５ｍＭ塩化マグ
ネシウムを加えたもの、上記組成物に５％ソルビトー
ル（和光純薬工業（株）製）を加えたもの、上記組成
物に０．５ｍＭ塩化マグネシウムと３％ソルビトールを
加えたもの、を各々調製した。３７℃１日保存後の
残存酵素活性を測定した。各々の組成物につきＡＬＰ、
ＣＫの残存活性（％）を表１に示した。

【００３９】

【表１】

【００４０】表１に示したとおり、ＢＳＡのみの組成物
に比べＮ−アセチルシステイン添加のはＣＫの残存
率は改善されているもののＡＬＰに関してはさらに残存
率が低下していた。また、塩化マグネシウム添加のに
ついては逆にＣＫの残存率が低下していた。これに対し
て本発明のおよびの組成についてはＡＬＰ、ＣＫと
もに殆ど活性の低下が認められなかった。

【００４１】

【実施例２】２０ｍＭＢＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）３％ＢＳＡ（シグマ製）０．５ｍＭ塩化マグネシウム２ｍＭアラニン５２６ｕ／ｌ・ＡＬＰ（ブタ腎由来；シグマ製）３０３ｕ／ｌ・ＣＫ（ウサギ筋肉由来；ベーリンガー
マンハイム製）１０８ｕ／ｌ・ＡＬＴ（ブタ心臓；シグマ製）上記組成の複合酵素含有組成物に、おのおの５％になる
ようにトレハロース、ソルビトール、マンニトール、ガ
ラクトース、ラクトースを添加して、溶液での安定性を
５℃保存にて、また凍結での安定性を−２０℃保存にて
調べた。表２に５℃、３週間後の残存活性（％）を、表
３には−２０℃、３週間後の残存活性（％）を示した。

【００４２】

【表２】

【００４３】

【表３】

【００４４】表２に示したとおり溶液の場合は、糖を添
加しなかったもの、およびガラクトース、ラクトースで
ＡＬＴが１０％程度、マンニトールで５％程度活性が低
下していた。ＡＬＰについては、糖の種類によらず、糖
無添加も含めほぼ１００％活性を保持していた。また、
ＣＫについては本発明以外の組成で約５％の活性低下が
認められた。次に、表３に示したとおり、−２０℃にお
いては、糖無添加のものについてＣＫが５％、マンニト
ールではＡＬＴが１８％、ＡＬＰが６％、ＣＫが８％低
下した。一方で、本発明組成物であるソルビトール、ト
レハロースの添加においては、５℃および−２０℃にい
ずれの条件下においても含有する酵素すべてにおいて活
性を保持していた。

【００４５】

【実施例３】２０ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）０．３％ＢＳＡ（シグマ製）０．５ｍＭ塩化マグネシウム０．５ｍＭ塩化カルシウム１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム５３６ｕ／ｌ・ＡＬＰ（ブタ腎由来；シグマ製）３０１ｕ／ｌ・ＣＫ（ウサギ筋肉由来；ベーリンガー
マンハイム製）１００ｕ／ｌ・ＡＳＴ（ブタ心臓由来；シグマ製）１０８ｕ／ｌ・ＡＬＴ（ブタ心臓；シグマ製）上記組成の複合酵素含有組成物に、５％シュクロースを
添加したもの、５％トレハロースを添加したもの、糖を
添加しないもの、をそれぞれ調整し、−２０℃で凍結保
存した。表４に６カ月保存後の残存活性を示した。

【００４６】

【表４】

【００４７】シュクロース添加のものは、ＡＬＰに約１
５％の活性低下が認められ、また糖の無添加のものも同
様ＡＬＰに１０％程度の低下が認められた。これに対
し、本発明組成物であるトレハロース添加のものは、Ａ
ＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ、ＣＫいずれの酵素についても活
性低下が認められなかった。

【００４８】

【実施例４】２０ｍＭＢＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）３％ＢＳＡ（シグマ製）２ｍＭ塩化マグネシウム０．０５％アジ化ナトリウム１０９ｕ／ｌ・ＡＬＰ（ＢＲＬ６８由来）（参考例
２）６１ｕ／ｌ・ＣＫ（ＨＬ−６０由来）（参考例１）３８ｕ／ｌ・ＡＳＴ（ＨＬ−６０由来）（参考例１）３４ｕ／ｌ・ＡＬＴ（ブタ心臓由来；シグマ製）３１ｕ／ｌ・γ−ＧＴＰ（ウシ腎臓由来；シグマ製）１０３ｕ／ｌ・ＬＤＨ（ＨＬ−６０由来）（参考例
１）上記組成の複合酵素含有組成物に、トレハロースを
０．５％添加したもの、２％添加したもの、５％添
加したものをそれぞれ調整し、５℃および−２０℃の各
温度で７日間保存し、その残存活性を測定し、トレハロ
ース濃度の影響を調べた。結果を表５（−２０℃、７日
後の残存活性（％））、表６（５℃、７日後の残存活性
（％））に示した。

【００４９】

【表５】

【００５０】

【表６】

【００５１】表５に示したように−２０℃では、０．５
％トレハロースで若干ＡＬＴの活性低下が認められた他
はほぼ両者ともで安定であった。ところが、表６のとお
り、５℃保存では０．５％トレハロースでＬＤＨが１０
％活性低下しており、０．５％濃度のトレハロース添加
の効果が認められていなかった。尚、２５℃、７日間保
存においては、ＬＤＨは、０．５％、２％、５％のどの
トレハロース濃度でも活性を保持しており、低温で不安
定であることが示唆された。そして、このＬＤＨの低温
失活は、本発明組成物である２％および５％トレハロー
ス添加のものでは認められず、安定化には、２％以上の
トレハロースが必要であった。尚、ＡＳＴ、ＣＫ、ＬＤ
Ｈは、参考例１の方法で、ヒト由来細胞株ＨＬ−６０を
培養することにより、またＡＬＰは、参考例２の方法で
ヒト由来細胞株ＢＲＬ６８を培養することにより取得し
た。

【００５２】

【実施例５】２０ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）３％ＢＳＡ（シグマ製）２ｍＭ塩化マグネシウム０．０５％アジ化ナトリウム４６２ｕ／ｌ・ＡＬＰ（ＢＲＬ６８由来）（参考例
２）２８２ｕ／ｌ・ＣＫ（ＨＬ−６０由来）（参考例
１）１００ｕ／ｌ・ＡＳＴ（ＨＬ−６０由来）（参考例
１）１１８ｕ／ｌ・ＡＬＴ（ブタ心臓由来；シグマ製）１４６ｕ／ｌ・γ−ＧＴＰ（ウシ腎臓由来；シグマ製）２３５ｕ／ｌ・ＬＤＨ（ＨＬ−６０由来）（参考例
１）上記組成の複合酵素含有組成物に、おのおの５％になる
ようにソルビトール、トレハロース、マンニトール、シ
ュクロースを添加して、凍結での安定性を−２０℃保存
にて調べた。表７に−２０℃、９ヶ月後の残存活性
（％）を示した。

【００５３】

【表７】

【００５４】表７に示すように、−２０℃においては、
糖無添加のものがＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ、ＣＫ、ＬＤ
Ｈで８〜３４％の活性低下を、マンニトールはＡＬＴ、
ＣＫで１０％の活性低下を、シュクロースはＡＬＴ、Ａ
ＬＰ、ＣＫで４〜２４％の活性の低下が認められたのに
対し、本発明組成物であるソルビトール、トレハロース
の添加においては、含有する酵素すべてにおいて活性を
保持していた。

【００５５】更に、本発明のソルビトール、トレハロー
ス含有組成物について、調整直後の溶液と、−２０℃で
９ヶ月保存したのち解凍した溶液との５℃、１週間後の
溶液安定性を比較し、結果（残存活性（％））を表８に
示した。

【００５６】

【表８】

【００５７】表８に示したとおり、両者に差異は認めら
れず、−２０℃、９ヶ月保存後に解凍したものについて
も、調整時同様、５℃、１週間安定であった。

【００５８】

【参考例１】ヒト前骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ−２４０）をウシ胎児血清１０％（Ｖ／
Ｖ）を添加した市販のＲＰＭＩ−１６４０培地に細胞密
度１ｘ１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように分散させ、
この細胞分散液を２Ｌのスピンナーフラスコに１．５Ｌ
分仕込み、温度３７℃、空気９５％及びＣＯ₂、５％に
セットした炭酸ガスインキュベーター中にて５日間浮遊
撹拌培養した。増殖した細胞を遠心分離機により分離
し、超音波処理により細胞を破砕した。上清中の酵素活
性を測定し、細胞密度１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍｌ当たりの
溶液の酵素活性を調べたところ、６４３５ｕ／ｌのＬＤ
Ｈ、２６０ｕ／ｌのＡＳＴ、５３００ｕ／ｌのＣＫ、を
検出した。これらの、細胞破砕液上清を硫安分画後、Ｄ
ＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ（ファルマシ
ア）カラムにてＡＳＴ、ＬＤＨ混合画分とＣＫ画分を得
た。更に、ＡＳＴ、ＬＤＨ混合画分はＢｌｕｅ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ（ファルマシア）カラムにより、
素通り画分からＡＳＴを、吸着画分よりＬＤＨを取得し
た。

【００５９】

【参考例２】ヒト胎児肝細胞株ＢＲＬ６８（ＡＴＣＣ
ＣＬ−４８）をウシ胎児血清１０％（Ｖ／Ｖ）を添加し
た市販のＭＥＭ培地に細胞密度２．５ｘ１０⁴ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌになるように分散させ、この分散液を２００ｍ
ｌずつを２２５ｍｌの組織培養用フラスコ（住友ベーク
ライト（株）製）に仕込み、温度３７℃、空気９５％お
よび、ＣＯ₂、５％にセットした炭酸ガスインキュベー
ター内にて４日間静置培養した。増殖した細胞を０．０
１％（Ｗ／Ｖ）トリプシン液（ＧＩＢＣＯ社製）で剥離
させ遠心分離機により細胞を集め、超音波処理により細
胞を破砕した。上清中の酵素活性を測定し、細胞密度１
０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍｌ当たりの溶液の酵素活性を調べた
ところ、１４６５０ｕ／ｌのＬＤＨ、８１１ｕ／ｌのＡ
ＳＴ、１４７３ｕ／ｍｌのＡＬＰを検出した。細胞破砕
液上清を硫安分画後、Ｂｌｕｅ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣ
Ｌ６Ｂ（ファルマシア）カラムの素通り画分としてＡＬ
Ｐを取得した。

【００６０】

【発明の効果】本発明による複合酵素含有液状組成物
は、−２０℃以下の凍結では、少なくとも１５ヶ月の長
期にわたり、また解凍後では２〜８℃保存で少なくとも
７日間、いずれの酵素においても活性の低下が認められ
ない、安定で、経済性に富む組成物となし得た。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】安定化剤としてトレハロースおよびソル
ビトールより選ばれた糖類およびアルブミンを含み、少
なくともアルカリホスファターゼ、クレアチンキナーゼ
およびアラニンアミノトランスフェラーゼからなる群よ
り選ばれる２種以上の酵素および含水媒体を含有する安
定化された臨床検査用複合酵素組成物。
【請求項２】請求項１において、マグネシウムイオン
を含む組成物。
【請求項３】請求項１において、アスパラギン酸アミ
ノトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、および
γ−グルタミルトランスペプチダーゼを含む組成物。
【請求項４】請求項１において、アスパラギン酸アミ
ノトランスフェラーゼを含む組成物。
【請求項５】アルブミンが、０．３〜７（Ｗ／Ｖ）％
含有してなる請求項１記載の組成物。
【請求項６】トレハロースおよびソルビトールより選
ばれた糖類が、２〜１５（Ｗ／Ｖ）％含有してなる請求
項１記載の組成物。
【請求項７】請求項１ないし４のいずれかひとつの項
において、該酵素がヒト生体材料またはヒト由来細胞培
養、遺伝子組み換え技術によりヒト遺伝子を組み込まれ
た形質転換体細胞培養により取得されたものである組成
物。
【請求項８】組成物が、液状または凍結組成物である
請求項１記載の組成物。
【請求項９】液状または凍結組成物の解凍液の比重が
１．０１５〜１．０３０（２５℃）、粘度が１．０５〜
１．４０ｃＰ（３７℃）である請求項８記載の組成物。