JPH0813279B2 - デスオキシリボ核酸の配列決定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はデスオキシリボ核酸の配列決定法に関する。

核酸のヌクレオチド配列の分析は分子生物学において
中心的な技術である。

従来技術 現在、慣用的なDNA配列決定のために２つの基本的な
技術がある。１つはマキサム（Maxam）及びギルバード
（Gilbert）の方法（Methods Enzymol.,第65巻、1980
年、第499〜560頁）であり、他の１つはザンガー（Sang
er）の方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第74巻、1977
年、第5463頁）である。

従来、DNA−配列決定のためにはほとんどザンガー配
列決定法が使用されており、この方法においてはその配
列が配列決定すべきDNA−鎖の一部に相補性であるオリ
ゴヌクレオチドプライマーから出発し、４種のデスオキ
シヌクレオチドトリフオスフエートと１つのジデスオキ
シヌクレオチドトリフオスフエートからなる混合物の存
在で、配列決定すべき連鎖の相補的コピーがポリメラー
ゼにより製造される。この際、ジデスオキシヌクレオチ
ドトリフオスフエートの使用が重要である。それという
のも、新しく合成されるDNA中にこのジデスオキシヌク
レオチドトリフオスフエートが組み込まれることにより
ヒドロキシル基がなくなり、連鎖伸長はもはや可能では
なくなり、このようにして配列特異的な連鎖中断が生じ
るためである。この連鎖伸長反応は一般に４種のデスオ
キシヌクレオチドトリホスフエートと１種のジデスオキ
シヌクレオチドトリホスフエートとからなる４種の可能
な混合物すべてに関して別々の配合において行なう。引
き続き、生じた核酸フラグメントの長さによる分離を通
常の電気泳動法で行ない、これによりヌクレオチド配列
の直接の読み取りが可能となる。新しく合成したDNAと
配列決定すべきDNAとの区別のためには、オリゴヌクレ
オチドプライマーを、又は少なくとも４種のデスオキシ
ヌクレオチドの１種又はジデスオキシヌクレオチドを例
えば放射性同位体又は最近では螢光染料で標識する。

現在最も使用されているすべての方法において、この
反応の実施は２又は３工程で行なわれる：第１の（一重
鎖−DNAにおいては必要でない）工程においては、配列
決定すべきDNAの両方の相補的連鎖の分離が高めたpH又
は温度により行なわれる。その後、高めた温度（約65
℃）でいわゆるアニーリング反応の始めにオリゴヌクレ
オチドプライマーの添加を行ない、次いでこのプライマ
ーは溶液の冷却の経過において配列決定すべき連鎖に結
合する。第３工程においては、使用したポリメラーゼに
好適な温度で、本来の配列決定反応が行なわれる。

現在、DNAの配列決定のために三種の異なるタイプの
ポリメラーゼのみが使用されている：大腸菌ポリメラー
ゼＩのクレノウ−フラグメント、T7−ポリメラーゼの改
変型及びテルムス・アクアチクス（Thermus aquaticu
s）からの熱安定タク（Taq）−ポリメラーゼ。

現在提供可能な方法で、すべての一重鎖DNA−サンプ
ル並びにスーパーコイル型で存在する二重鎖DNA−サン
プルを慣用的に配列決定することができる。ただし、こ
のスーパーコイル型で存在する二重鎖DNA−サンプルは
臨界の大きさ（約20キロ塩基）を越えてはならない。い
ずれにせよ、タク−ポリメラーゼを用いるスーパーコイ
ル−DNAの配列決定のための慣用的に有効な方法は現在
存在しない。この際可能なより高い反応温度により、第
２次構造の形成に起因する問題は除かれるので、このこ
とは特に望まれている。

前記の制限の他にも、特に線状二重鎖DNA−分子の配
列決定が問題を起こす。この種のDNA−分子は、特にい
わゆるポリメラーゼ−連鎖−反応（PCR）（例えばMulli
s等著、Methods Enzymol.第155巻、1987年、第1973〜19
77頁）の最終生成物として生じる。分子生物学的研究に
おける幅広い適用可能の他に、この高感度の方法は、DN
Aフラグメントの試験管内増大のために、特に遺伝病の
分子レベルでの分析において、裁判同定問題において、
かつ出生前診断学において著しく重要である。それとい
うのも前記のすべての場合において、非常に僅かな量の
核酸が提供され、こうして従来の方法による配列決定分
析のためには十分でないのである。

ザンガーの方法を基礎としたPCR−フラグメントに関
する配列決定法はサイキ（Saiki）等により記載されて
いる（Science、第239巻、1988年、第487〜491頁）。い
ずれにしろ、この方法は個々の連続する反応工程の最適
な実施に強く依存するので、慣用法への適用はむずかし
い。更に、マキサム−ギルバート原理により化学的鎖片
上に製造する方法も記載されている（例えばKeohavong
等著、DNA、第７（１）巻、1988年、第63〜70頁;Voss等
著、Nucl.Acids.Res.第17（７）巻、1989年、第2517〜2
527頁）。この方法の欠点は、PCRに続いて手の込んだ化
学的反応を部分的に毒性の物質で実施しなければならな
いという必要性にある。更に、すでにPCRの際にチオー
デスオキシヌクレオチドの配列特異的組込みが行なわ
れ、これに続いてアルキル化反応を用いて定義された鎖
片が形成される、原理的に著しく優れた方法が報告され
た（Nakamaye等著、Nucl.Acids Res.,第16（21）巻、19
88年、第9947〜9959頁）。しかしながらこの方法は、非
常に僅かなシグナル強度のみが生じ、配列決定に使用可
能な範囲は最高で塩基250に制限されるという重大な欠
点を有する。

最近、タクポリメラーゼを用い、かつ通常の反応サイ
クルを僅かな回数実施する方法が報告された（Levedako
u等著、Bio Techniques、第７巻、1989年、第438〜422
頁;Carthers等著、Bio Techniques、第７巻、1989年、
第494〜499頁）。

発明が解決しようとする課題 新しく合成されたフラグメントの標識のために螢光染
料を使用する場合、従来の方法を用いるより何倍も高い
フラグメントの収量を得ることのできる方法を提供する
ことが著しく必要とされている。

課題を解決するための手段 本発明の課題はデスオキシリボ核酸の配列決定法であ
り、この方法はデスオキシリボ核酸に ａ）加熱変性工程、 ｂ）アニーリング工程及び ｃ）部分的な連鎖中断を伴なう核酸合成工程、 を施こし、工程ａ）〜ｃ）を10〜60回繰り返し、引き続
き得られたデスオキシ核酸フラグメント混合物を長さに
より分離し、このフラグメントスペクトルから配列を決
定することからなる。

１μあたり10^-16〜2.10^-14モルの濃度でDNAを工程
ａ）〜ｃ）に導びく。二重鎖で、スーパーコイル型で存
在しないDNAの場合、濃度は有利に低い部分の範囲、す
なわち１μあたり約10^-16〜3.10^-15モルである。

加熱変性工程は92〜98℃、有利に95℃の温度で行なわ
れる。

アニーリング工程は35℃〜75℃の温度で良好に達せら
れる。

核酸合成工程においてはオリゴヌクレオチドプライマ
ーから出発するが、このプライマーは配列決定すべき一
重鎖の一部分域と相補性でなければならない。ヌクレオ
チド約10〜50、有利に15〜30の長さのプライマーは分析
すべきDNAに結合される。オリゴヌクレオチドブライマ
ーと配列決定すべき配列とのモル比は有利に５〜30の間
である、すなわち配列決定すべき配列１モルあたりプラ
イマー５〜30モルを使用する。その後、このプライマー
を４種のデスオキシヌクレオチドトリホスフエートと少
なくとも１種のジデスオキシヌクレオチドトリホスフエ
ートとからなる混合物の存在において、配列決定すべき
DNA−鎖に相補的に伸長する。この伸長は酵素的に熱安
定ポリメラーゼ、例えばタク−ポリメラーゼで行なわれ
る。核酸合成工程はタク−ポリメラーゼの場合65〜85℃
の温度で良好に行なわれる。

工程ａ）〜ｃ）を約０〜60回、有利には10〜30回順次
実施する。

ジデスオキシヌクレオチドトリフオスフエートの添加
は、相補的DNAの合成を配列特異的に中断するために行
なわれる。連鎖中断のためには４種のジデスオキシヌク
レオチドトリフオスフエートの特定の１種を使用するこ
とができる。この場合DNA−合成は４回、すなわち各ジ
デスオキシヌクレオチドトリフオスフエートで１回、実
施しなければならない。

４種のジデスオキシヌクレオチドトリフオスフエート
の混合物を使用することもできる。この場合、合成は１
回だけ実施する。

新たに合成された核酸を認識するためには、これが標
識されていなければならない。このことは標識オリゴヌ
クレオチドプライマー又は標識デスオキシ−もしくはジ
デスオキシヌクレオチドトリホスフエートの使用により
行なうことができる。標識は放射性同位体、酵素、検出
可能な分子のための特異的結合位又は有利に螢光染料で
行なうことができる。

前記の個々の工程の実施は公知である（例えば、Tabo
r等著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第84巻、1987年、第4
767〜4771頁）。

本発明による方法は現在提供可能なDNAの配列決定法
に対して次のような利点を有する： ａ）この方法により信頼でき、かつ簡単な方法でPCR−
生成物を配列決定することができる（例１）、 ｂ）この方法は高分子、二重鎖DNA−サンプル、例えば
λ−DNA（例２）の配列決定並びに一般に二重鎖DNAがス
ーパーコイル型で存在しない場合でも二重鎖DNAの配列
決定を可能とする。

ｃ）この方法は一重鎖−DNAにも適用可能であり、すべ
てのDNA−サンプルで従来の方法にくらべて著しく高い
反応生成物収量に導びき、従つて、相応してより僅かな
DNA量が配列決定に十分であり、かつ特に螢光標識の適
用可能性がもはや提供されるDNA−量により制限されな
い。

線状二重鎖−DNAの配列決定の場合、より高いフラグ
メント収量が特に重要である。それというのも、この種
のサンプルの信頼度の高い配列決定は十分に低いDNA−
濃度を使用する時だけ成功するためである。配列決定の
ために使用するDNA−量の配列決定反応の質に対する影
響は例４から明らかである。

本発明による方法と現在常用のザンガーによるDNA−
配列決定法との間の決定的な差異は配列決定反応の非常
に多くの回数の循環を行なう、循環実施であり、かつ付
加的に配列決定すべきDNA−分子に対するプライマー分
子の著しく高い比による非常にわずかなDNA濃度であ
る。非常に多くの回数の循環は一方では大過剰のオリゴ
ヌクレオチドプライマーの使用において比較的高いフラ
グメント収量を可能とする。特に、非常に僅かなDNA−
濃度及びプライマーとDNA−濃度との間に著しく大きな
比の組合わせにより、非常に重大なDNA−サンプル例え
ば二重鎖PCR−生成物を配列決定するための可能性が生
じる。

例 １ PCR−生成物の配列決定 PCR マルチ−クローニング部位に長さ600bpの挿入物を含
有するpUC18−誘導体0.1fMolを（−21）−スタンダード
−プライマー（５′−GGT TGT AAA ACG ACG GCC AGT−
３′）及びリバース−プライマー（５′−CAC ACA GGA
AAC AGC TAT GAC−３′）各4pMolの存在で、並びに４種
のデスオキシヌクレオチドトリホスフエート各20nMolの
存在で、PCR−緩衝液（50mM KCl、10mMトリス−HCl、1.
5mM MgCl₂、0.01％ゼラチン、pH8.3）100μの容量
で、タク−ポリメラーゼ（Cetus）５単位で増大させ
た。

このために、この反応混合物を鉱油100μで被覆
し、温度プログラミング可能なブロツク（Programmable
Dri−Block PHC−１、Techne）中で96℃、１分;37℃、
0.5分；及び72℃、1.0分からなる温度循環30回をこれに
行なつた。

引き続き、ビオスピン（Biospin）p30−カラム（Bior
ad）を用いて製造者による使用法に従い、反応溶液の水
相のためのPCR−緩衝液でカラムを平衡にした後、デス
オキシヌクレオチドトリホスフエートの分離を行なつ
た。

配列決定 ビオスピンカラムからの溶離液を更に処理することな
く配列決定に使用した。４種の配列決定反応のためには
次の配合を使用した。

４種の反応配合物のそれぞれにPCR−反応と同様にし
て96℃、1.0分;55℃、0.5分；及び72℃、1.0分からなる
循環40回を行なつた。

引き続き、４種の反応配合物の水相を順次3M NaOAc
（pH7.8）20μ上にピペツトで入れた。その後、この
溶液に温度−20℃としたエタノール500μを加え、こ
の溶液を混合し、ドライアイス上に15分間置いて、1300
0rpm及び室温で15分間、エツペンドルフ（Eppendorf）
遠心分離機5415c中で遠心分離した。もう１回80％エタ
ノール800μで洗浄したペレツトをその後２分間真空
中で乾燥し、50mM EDTA（pH7.5）２μ及び脱イオンホ
ルムアミド６μ中に取り込み、95℃に２分間加熱し、
氷水中で冷却し、DNA−配列決定装置（Sequencer）370A
（Applied Bio−systems）中で電気泳動（アクリルアミ
ド（AA）６％、AA/ビス−AA:40:2のPAG;緩衝液:0.089M
トリス、0.089M硼酸塩、2MEDTA、7M尿素、pH8.3;電力:2
0W）にかける。配列決定機の制御並びにエレクトロフエ
ログラム（Electropherogram）の評価は製造業者のソフ
トウエア解説1.30で行なつた。

得られた結果を第１図に示す。判明した配列とあらか
じめすでに公知の配列との比較は、２つの問題の部位を
除いて少なくとも塩基400を前記方法により調べること
ができることを示した。

例 ２ λ−DNAの配列決定 λ−DNA（λ−ZAP、Stratagene）の配列決定を例１と同
様に実施した。PCR−生成物のかわりに相当量のλ−DNA
を使用しただけで、すべて他のパラメーターはそのまま
に保持した。

結果を第２図に示した。この場合にも記載した方法で
少なくとも塩基400の信頼のおける調査が行なわれた。

例 ３ 線状プラスミドの配列決定 プラスミドpUC18を制限エンドヌクレアーゼXmn Iで線
状にし、例１と同様に配列決定した。例１と異なるのは
DNA0.1pMol（Ａ−及びＣ−反応）もしくは0.2pMol（Ｇ
−及びＴ−反応）、並びにプライマー2pMol（A,C）もし
くは4pMol（G,T）を使用し、かつ例１のPCRにおけると
同様に、しかし温度循環10回のみを適用した。

結果を第３図に示した。三つの関係づけできなかつた
塩基を除いて、この実験においては同様に信頼できる少
なくとも塩基400の決定が可能であつた。

例 ４ 異なるDNA−量のPCR−生成物の配列決定 塩基1450のPCR−フラグメントを例１と完全に同様に
配列決定した、この際使用DNAの量を0.05〜0.8pMolの間
で変化させた。最初の約130塩基に関して得られた結果
を第４図に示した。DNA量が上昇するにつれ、非特異的
中断が明らかに上昇する。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の結果を示すエレクロトフエログラム
の図であり、第２図は実施例２の結果を示すエレクトロ
フエログラムの図であり、第３図は実施例３の結果を示
すエレクトロフエログラムの図であり、第４図は実施例
４の結果を示すエレクトロフエログラムの図である。 なお、図面のエレクトロフエログラム中−はＴを表わ
し、−‐‐−はＣを表わし、−‐−はＡを表わし、−−
−はＧを表わす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７ （1989）Ｐ．438−442 Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７ （1989）Ｐ．494−499 藤永薫編「遺伝子増幅ＰＣＲ法基礎と新 しい展開」（平２−12−10）共立出版 Ｐ．19−22

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】デスオキシリボ核酸を配列決定する方法に
   おいて、デスオキシリボ核酸に１μｌあたり10^-16〜2.1
   0^-14モルの濃度で、スーパーコイル型で存在しない二重
   鎖のデスオキシ核酸の場合有利に１μｌあたり10^-16〜
   3.10^-15モルの濃度で、 ａ）加熱変性工程、 ｂ）アニーリング工程及び ｃ）部分的な連鎖中断を伴なう核酸合成工程、 を施こし、工程ａ）〜ｃ）を10〜60回繰り返し、引き続
   き得られたデスオキシ核酸フラグメント混合物を長さに
   より分離し、かつこのフラグメントスペクトルから配列
   を決定することを特徴とするデスオキシリボ核酸の配列
   決定法。