JPH08136540A

JPH08136540A - 免疫学的分析方法

Info

Publication number: JPH08136540A
Application number: JP27643194A
Authority: JP
Inventors: Hideo Okawa; 秀郎大川; Atsuji Kitajima; 厚次北島; Kenji Odaka; 建次小高; Yasunori Fumoto; 康紀麓; Takako Kumeta; 貴子粂田
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1994-11-10
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 1996-05-31

Abstract

(57)【要約】【目的】環境中の水、土壌、植物および食料中のピレ
スロイド系化合物を、簡便、経済的かつ迅速に分析する
方法を提供することを目的とする。【構成】２−（４−エトキシフェニル）−２−メチル
プロピル３−フェノキシベンジルエーテル及び２−
（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチルプロピル３
−フェノキシベンジルエーテルに特異的に結合するモ
ノクローナル抗体および該モノクローナル抗体を用いる
ことを特徴とする、２−（４−エトキシフェニル）−２
−メチルプロピル３−フェノキシベンジルエーテル
及び２−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチルプロ
ピル３−フェノキシベンジルエーテルの免疫学的分
析方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ピレスロイド系殺虫剤
２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロピル
３−フェノキシベンジルエーテル（以下エトフェンプ
ロックスという）とその誘導体に特異的に反応するモノ
クローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ、及びそのモノクローナル抗体を用いるエ
トフェンプロックスとその誘導体の分析方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】エトフェンプロックスは、薬剤耐性を獲
得したウンカ、ヨコバイを含む、多種類の昆虫に殺虫活
性を持ち、さらに光安定性が良いことや、低魚毒性であ
ることから特に世界中の水田で使用されている農薬であ
る。また本化合物は哺乳動物に対する毒性が低く、動物
及び人に寄生する内部あるいは外部寄生虫に効果を示す
ことから駆虫剤あるいは医薬としての利用が期待されて
いる。しかしながら、このように広範に使用されている
ことを考慮すると、環境や食品に関する安全性確保のた
めに、まずこれらに残留するエトフェンプロックスの量
を正確に測定することが必要である。一般に残留農薬の
分析法は、従来農薬が登録される時点において作物ごと
に定められており、主に試料から農薬を抽出し、精製
後、抽出物中の農薬含有量がガスクロマトグラフィーや
液体クロマトグラフィーにて測定されている。しかしエ
トフェンプロックスの場合、直接測定したのでは感度が
悪いことから、ヨウ素化３−フェノキシベンジルに誘導
したのちにエレクトロンキャプチャ検出器付きのガスク
ロマトグラフィーにて測定されている。この測定方法は
精度の点で問題はないものの、測定までの試料のクリー
ンアップが煩雑で長時間かかること、並びに測定装置や
設備等に高額な費用を要するという欠点があった。特に
残留農薬の分析は、分析件数が多大であるため、精度面
以外にも簡便性や迅速性が重要である。また、高価な測
定装置がなくても容易に分析できることが要求されてい
た。また生体試料中のエトフェンプロックスの分析にも
同様、簡便な分析法が望まれている。一方、近年中低分
子量の学物質に関し、免疫学的検出方法が応用されるよ
うになり、多岐に渡って応用検討されているが、エトフ
ェンプロックスとその誘導体を免疫学的、かつ選択的に
測定することについては、検討されていなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、エ
トフェンプロックスとその誘導体を高価な測定装置を使
用することなく、簡便かつ迅速なエトフェンプロックス
とその誘導体の免疫学的分析方法を提供することを課題
とする。また、本発明は、作物や土壌に残留するエトフ
ェンプロックスとその誘導体をを免疫学的に分析する場
合、被検試料からエトフェンプロックスとその誘導体を
抽出するのに有機溶媒の使用が避けられないので、有機
溶媒存在下においても抗原抗体反応が可能な、有機溶媒
にたいして耐性を示す抗体を提供することを課題とす
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、エトフェ
ンプロックスとその誘導体を免疫学的に測定するするこ
とを目的として鋭意検討を重ねた結果、エトフェンプロ
ックスとその誘導体に特異的に反応し、有機溶媒存在下
でも耐性を示すモノクロナール抗体の作成に成功し、本
発明を完成した。

【０００５】すなわち本発明は、２−（４−エトキシフ
ェニル）−２−メチルプロピル３−フェノキシベンジ
ルエーテル及び２−（４−ヒドロキシフェニル）−２
−メチルプロピル３−フェノキシベンジルエーテル
（以下、エトフェンプロックスおよびその誘導体とい
う）に特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。
また、本発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ、と前記モノクローナル抗体を用いるエト
フェンプロックスおよびその誘導体の免疫学的分析方法
に関する。

【０００６】以下に、本発明に係わるモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマの分離とモノクローナル抗
体の調製、および免疫学的分析方法の順に説明する。本
発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マの分離は、常法、例えば続生化学実験講座、免疫生化
学研究法（日本生化学会編）に記載の方法で行うことが
できる。以下具体的にモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマの分離方法を示す。まず免疫原として、２
−（４−ヒドロキシカルボニルメチルオキシフェニル）
−２−メチルプロピル３−フェノキシベンジルエー
テルなるハプテン化合物を生体高分子（例えば、血清ア
ルブミンまたは免疫グロブリン等）に結合させたものを
用いる。

【０００７】これらの免疫原溶液を用いて哺乳動物や鳥
類（例えば、マウス、ラット、または鶏等）をイン・ビ
ボ免疫法により免疫する。例えば、免疫原溶液を等量の
フロイントの完全アジュバンドまたは不完全アジュバン
ドと乳化混合し、マウスの皮下に投与する（初回免
疫）。以後、２〜４週間の間隔で同様の操作を行い、数
回免疫する。最終免疫から数日後に脾臓を無菌的に取り
出し、ステンレスメッシュなどで押しつぶして脾臓細胞
を調製し、細胞融合工程に用いる。

【０００８】細胞融合のもう一方の親細胞であるミエロ
ーマ細胞（骨髄腫細胞）としては、各種の公知の細胞
株、例えば、ｐ３・ＮＳ−１／１・Ａｇ４．１（Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５；５１１−５１７（１９
７５））、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Ｎａｔｕｒｅ，２７
６；２６９−２７０（１９７８））、Ｐ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３；１５４
８−１５５０（１９７９））、ＮＳＯ（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９８
１））等を使用することができる。

【０００９】細胞融合は通常の方法、例えば、公知の融
合促進剤（ポリエチレングリコールなど）を用いて行う
ことができ、細胞の使用比率も常法と同様に、例えば、
マウスの脾臓細胞に対してミエローマ細胞を約１／５〜
１／１０程度の数で用いる。細胞融合用培地としては、
例えば、市販の細胞融合用ポリエチレングリコール分子
量１５００（ベーリンガーマンハイム社製）を用いるこ
とができる。融合は、前記の培地内で免疫脾臓細胞とミ
エローマ細胞とをよく混合することによって行う。

【００１０】続いて、選別用培地（例えば、ＨＡＴ培
地）を用いてハイブリドーマ以外の細胞を除去し、ハイ
ブリドーマ培養上清の抗体産生の有無を、例えばＥＬＩ
ＳＡ法によって測定し、目的とするハイブリドーマを分
離する。抗体を産生するハイブリドーマは細胞クローニ
ング法を用いてクローン化することによりモノクローナ
ル抗体産生細胞であることが確認できる。また有機溶媒
に対して耐性を有するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを選別する場合には、各種濃度で有機溶媒
を含む水性溶液にエトフェンプロックスを添加し、これ
にモノクローナル抗体を加えた後に、抗原抗体反応が正
常に進行することを確認することによって、有機溶媒耐
性モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを分離
する。分離できたハイブリドーマは通常の培地で継代培
養することができ、液体窒素等の中で容易に長期保存す
ることができる。

【００１１】また本発明によるモノクローナル抗体は、
目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
培養することにより、容易に調製することができる。ハ
イブリドーマの培養は、イン・ビトロの場合、例えば５
％二酸化炭素及び３７℃の条件下で培養に適した任意の
培地を用いて行えるが、好適にはイスコフ改変ダルベコ
培地（以下イスコフ培地という）に１０％ウシ胎児血清
（以下ＦＢＳという）を含む培地（以下イスコフ／１０
％ＦＢＳ培地という）が用いられる。またイン・ビボの
場合には例えばマウスの腹腔中で培養するのが好まし
い。

【００１２】さらに前記の培養液もしくは腹水を、直接
抗体溶液として用いるほか、これらを出発材料に、目的
とするモノクローナル抗体を分離・精製しても良い。培
養液またはマウスの腹水からモノクローナル抗体を分
離、精製するためには、タンパク質の単離、精製に一般
的な方法を使用できる。このような方法としては硫安塩
析、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩ゲルを用い
る分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡまた
はプロテインＧ結合ポリマー等を用いるアフィニティー
クロマトグラフィー、透析等の方法がある。

【００１３】本発明による、免疫学的分析方法は、前記
のモノクローナル抗体を用いて実施するので、エトフェ
ンプロックスおよびその誘導体を正確に分析することが
できる。また、本発明分析方法は、有機溶媒耐性モノク
ローナル抗体を用いるので、分析対象のエトフェンプロ
ックスおよびその誘導体を充分に溶解することのできる
有機溶媒を含有する有機水性系中でも正確な抗原抗体反
応を進行させることができる。

【００１４】本発明方法は、エトフェンプロックスとそ
の誘導体に反応するモノクローナル抗体を用いること、
そして好ましくは有機溶媒耐性抗体を用いること（従っ
て、有機溶媒の存在下で抗原抗体反応を実施すること）
を除けば、それ以外の点では従来公知の免疫学的分析方
法にそのまま適用することができる。分析方法には、例
えば、エトフェンプロックスとその誘導体に対して反応
すると共に前記有機溶媒に耐性を持つ抗体を直接標識し
て、固相化した抗原及び試料中のエトフェンプロックス
やその誘導体とを競合反応させる、直接競合法と呼ばれ
るものや、或いは、上記抗体を固相化し、標識化した抗
原と試料中のエトフェンプロックスやその誘導体とを競
合させる、抗原標識法と呼ばれるものなどがあるが、こ
こでは本発明方法を、通常、抗体標識法の内、間接競合
法と呼ばれる測定方法について以下に説明する。

【００１５】本発明によりエトフェンプロックスとその
誘導体を測定する場合、（１）２−（４−ヒドロキシカルボニルメチルオキシフ
ェニル）−２−メチルプロピル３−フェノキシベンジ
ルエーテルなるハプテンと生体高分子（例えば、血清
アルブミンまたは免疫グロブリン等）との結合体を固相
化する（以下固相化抗原という）工程（２）有機溶媒（特には、水混和性有機溶媒）に溶解し
たエトフェンプロックスやその誘導体を、エトフェンプ
ロックスとその誘導体に対して反応すると共に有機溶媒
に耐性を有する抗体（以下第１抗体という）と、混合し
反応させる工程（３）第１抗体とエトフェンプロックスやその誘導体と
の反応物を前記固相化抗原に接触させる工程（４）固相化抗原と結合した第１抗体と、試料中のエト
フェンプロックスやその誘導体と結合した第１抗体とを
分離する工程（５）標識化した抗マウス抗体（以下第２抗体という）
を、固相化抗原と結合した第１抗体に接触させる工程（６）固相化した第１抗体に結合した第２抗体と、第１
抗体に結合していない第２抗体とを分離する工程（７）前記工程（６）で分離したいずれか一方、好まし
くは第１抗体と結合した第２抗体が有する標識からの信
号を測定する工程を含む、試料中のエトフェンプロック
スやその誘導体の分析方法からなる。

【００１６】本発明で用いる有機溶媒は、エトフェンプ
ロックスとその誘導体を溶解できる溶媒である。水混和
性の有機溶媒を用いると、有機溶媒抽出液を水で適当に
希釈してから、抗原抗体反応を行えるので好ましい。有
機溶媒としては、例えば、アルコール化合物（例えば、
炭素原子１〜３個の低級アルコール、特には、メチルア
ルコール、エチルアルコール、）、ケトン化合物（特に
は、アセトン）、アセトニトリル、ジメチルサルフォオ
キシドあるいはこれらの混合物を挙げることができる。

【００１７】本発明方法を実施する場合には、既知量の
標識化第２抗体を用いてエトフェンプロックスとその誘
導体の確認または定量を行うことができる。抗体の標識
には、公知の標識体、例えば、放射性同位体（例えば、
³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ）、酵素（例えば、ペルオキシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ）、ビタミン（例えば、
ビオチン）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ）、化学発光
物質（例えば、アクリジニウム）等を用いることができ
る。

【００１８】標識化第２抗体は、第１抗体とエトフェン
プロックスやその誘導体並びに固相化抗原との接触工程
が終了してから反応系に加えることができる。すなわち
第１抗体をエトフェンプロックスやその誘導体並びに固
相化抗原と接触させた後、固相化抗原と結合しなかった
第１抗体を分離除去してから標識化第２抗体を加える
と、固相化抗原と結合した第１抗体に対して標識化第２
抗体が結合する。

【００１９】本発明方法では、第１抗体とエトフェンプ
ロックスやその誘導体、並びに固相化抗原との競合反応
が終了した後で、固相化抗原に結合した第１抗体を分離
する。分離は、例えば、濾過、遠心処理または緩衝液に
よる洗浄によって行うことができる。更に、固相化抗原
に結合した第１抗体と標識化第２抗体との反応が終了し
た後で、第１抗体と結合しなかった標識化第２抗体を分
離し、続いて、例えば第１抗体と結合した標識化第２抗
体の標識からの信号を測定する。信号を測定する際に
は、標識化第２抗体を含む反応系を信号測定に好ましい
条件に変えるのが好ましい。例えば、標識として蛍光ま
たは化学発光物質を用いた場合には、消光が起こらない
条件で信号を測定する。

【００２０】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１ハプテン化合物２−（４−ヒドロキシカルボ
ニルメチルオキシフェニル）−２−メチルプロピル３
−フェノキシベンジルエーテルの製造３−フェノキシベンジル２−（４−ヒドロキシフェニ
ル）−２−メチルプロピルエーテル３．０ｇ、水素化ナ
トリウム０．３６ｇ、アセトニトリル２０ｍｌを約２０
分間加熱還流した後、室温でブロモ酢酸メチル２ｍｌ
を滴下し、６０℃で２０分間攪拌した。反応液を濃縮
し、酢酸エチル約５０ｍｌを加え、水洗、乾燥、濃縮
後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精
製して３−フェノキシベンジル２−（４−メトキシカ
ルボニルメチルオキシフェニル）−２−メチルプロピル
エーテル３．０ｇを得た。ＮＭＲ：δTMS(CDCl₃)(ppm):1.30(6H,s),3.40(2H,s),
3.79(3H,s),4.43(2H,s),4.59(2H,s),6.81-7.35(13H,m) ＩＲ：ν_MAX(neat)(cm^-1):1763,1585,1488,1252,12
13,1080 屈折率：１．５６４１（２１．６℃）３−フェノキシベンジル２−（４−メトキシカルボニ
ルメチルオキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテ
ル２．２ｇ、水酸化ナトリウム２．５ｇ、水７．５ｇ、
エチレングリコール１０ｍｌを２．５時間加熱還流し
た。反応液に希塩酸を加え、酸性にして酢酸エチルで抽
出、水洗、乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーにより分離精製して０．９ｇの３−フェノキシ
ベンジル２−（４−ヒドロキシカルボニルメチルオキシ
フェニル）−２−メチルプロピルエーテルを得た。ＮＭＲ：δTMS(CDCl₃)(ppm):1.30(6H,s),3.41(2H,s),
4.43(2H,s),4.62(2H,s),6.81-7.35(13H,m),9.10-9.90(1
H,br) ＩＲ：ν_MAX(neat)(cm^-1):3041,1733,1585,1488,12
50,1188,1076 屈折率：１．５６８０（２１．６℃）

【００２１】実施例２モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマの作成とモノクローナル抗体溶液の調製２−（４−ヒドロキシカルボニルメチルオキシフェニ
ル）−２−メチルプロピル３−フェノキシベンジル
エーテルの２５ｍｇを無水ジオキサン２ｍｌに溶解した
後、Ｎ−メチルモルホリン５０μｌを添加し、１０℃で
１０分間攪拌した。ついでイソブチルクロロカーボネイ
ト２０μｌを少しずつ添加し２０分間攪拌した。一方、
牛血清アルブミン８０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解した
後、１ＮＮａＯＨでｐＨ９に調製し、更に１０℃でジ
オキサン２．６ｍｌを滴下し、再び１ＮＮａＯＨでｐ
Ｈ９に調製した。この牛血清アルブミン溶液に、先に調
製した２−（４−ヒドロキシカルボニルメチルオキシフ
ェニル）−２−メチルプロピル３−フェノキシベンジル
エーテル溶液を１ＮＮａＯＨでｐＨ９に保ちながら
徐々に滴下し、４℃で４時間反応させた後、蒸留水に対
して透析した。こうして作製した２−（４−ヒドロキシ
カルボニルメチルオキシフェニル）−２−メチルプロピ
ル３−フェノキシベンジルエーテルと牛血清アルブ
ミンの結合体は、凍結乾燥後、免疫原及び分析用抗原と
して用いた。

【００２２】マウスへの免疫は、２−（４−ヒドロキシ
カルボニルメチルオキシフェニル）−２−メチルプロピ
ル３−フェノキシベンジルエーテルと牛血清アルブ
ミンの結合体１００μｇを免疫原として、ダルベコＰＢ
Ｓ（−）５０μｌに溶解し、等量のフロイントの完全ア
ジュバンドと混合したのち、マウスに皮下接種すること
によって行った。１ヶ月後と２ヶ月後にそれぞれ初回免
疫量の１／５量を追加免疫した。

【００２３】細胞融合は、最終免疫後３日目のマウスの
脾臓を用いて行った。まず摘出した脾臓をイスコフ培地
にて３回洗浄後、組織中の脾臓細胞をイスコフ培地中に
取り出した。この細胞懸濁液をステンレスメッシュで濾
過して大きな固形物を除き、得られた脾臓細胞とマウス
のミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３を各々
イスコフ培地で３回洗浄後、細胞数の比で５：１（脾臓
細胞：ミエローマ細胞）になるように混ぜ、遠心（１，
０００ｒｐｍ，５分）して細胞沈さを得た。これに３７
℃に暖めておいた５０％ポリエチレングリコール（分子
量１，５００）溶液１ｍｌを、遠心管を回転させなが
ら、６０秒かけてゆっくり加え、細胞を融合した。細胞
融合は、融合が進行している遠心管に、イスコフ培地１
０ｍｌを１ｍｌ当たり３０秒かけて添加した後、ＦＢＳ
を１ｍｌ添加することにより停止した。これを遠心し、
得られた細胞を細胞数が２×１０⁵ 個／ｍｌになるよう
にＨＡＴ培地（イスコフ／１０％ＦＢＳ培地にヒポキサ
ンチン・アミノブテリン・チミジンを添加）に懸濁し
た。この細胞懸濁液を９６ウェルのポリスチレンプレー
トに２５０μｌ／ウェルの量で分注して、３７℃にて５
％二酸化炭素−９５％空気の気相で１０日間から１４日
間培養した。培養後、液中に分泌された２−（４−ヒド
ロキシカルボニルメチルオキシフェニル）−２−メチル
プロピル３−フェノキシベンジルエーテルと牛血清
アルブミンの結合体に対する抗体の活性を調べた。

【００２４】抗体の活性はＥＬＩＳＡ法によって測定し
た。まず、２−（４−ヒドロキシカルボニルメチルオキ
シフェニル）−２−メチルプロピル３−フェノキシベ
ンジルエーテルと牛血清アルブミンの結合体を０．５
μｇ／ｍｌの濃度でコーティングバッファー（１０ｍＭ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．５，１
００ｍＭＮａＣｌ）に溶解し、９６ウェルのポリスチ
レンプレートに１００μｌ／ウェルで添加した後、４℃
で１晩静置することにより固相化した。次に２５０μｌ
／ウェルで１％スキムミルクを添加した燐酸バッファー
（１０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ
７．２，０．８％ＮａＣｌ，０．０２％ＫＣｌ）（以下
ブロッキングバッファーという）に置き換え、室温で１
時間ブロッキングした。このウェルを洗浄液（燐酸バッ
ファーに０．０２％ｔｗｅｅｎ２０を添加）にて３回洗
浄した。これにハイブリドーマの培養上清を１００μｌ
／ウェルで加え、室温で１時間反応した。再び洗浄液で
３回洗浄してから、抗体希釈液（燐酸バッファー，０．
１％スキムミルク，０．０５％ＥＤＴＡ）で１０，００
０倍に希釈したパーオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗
体を１００μｌ／ウェルで加え、１時間反応した。洗浄
液で３回洗浄した後、パーオキシダーゼの基質溶液（１
００ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｃｉｔｒａｔｅｂｕ
ｆｆｅｒ、ｐＨ５．０、０．２％Ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎ
ｅｄｉａｍｉｎｅ、０．００３％Ｈ₂Ｏ₂）で発色させ、
４９２ｎｍの吸光度を測定した。

【００２５】この結果、目的とする抗体を産生している
ウェルの細胞について、限界希釈法によって細胞クロー
ニングを行った。細胞クローニングの結果、２−（４−
ヒドロキシカルボニルメチルオキシフェニル）−２−メ
チルプロピル３−フェノキシベンジルエーテルと牛
血清アルブミンの結合体と反応するが牛血清アルブミン
単独では反応しない抗体を産生しているハイブリドーマ
を８株得た。これらのハイブリドーマのイスコフ／１０
％ＦＢＳ培地で培養した培養上清を抗体溶液として以下
の実験に用いた。

【００２６】実施例３間接競合ＥＬＩＳＡ法による各
モノクローナル抗体のエトフェンプロックスとの反応性２−（４−ヒドロキシカルボニルメチルオキシフェニ
ル）−２−メチルプロピル３−フェノキシベンジル
エーテルと牛血清アルブミンの結合体を０．５μｇ／ｍ
ｌの濃度になるようコーティングバッファーに溶解し、
９６ウェルのポリスチレンプレートに１００μｌ／ウェ
ルで添加した後、４℃で１晩静置することにより固相化
した。次に２５０μｌ／ウェルでブロッキングバッファ
ーに置き換え、室温で１時間ブロッキングした。このウ
ェルを洗浄液にて３回洗浄した。一方、所定濃度のエト
フェンプロックス溶液を抗体希釈液にて適当な濃度に希
釈した抗体溶液と混合し、室温にて１時間反応させた。
これを先のブロッキング済みのプレートへ１００μｌ／
ウェルで加え、室温で１時間反応した。再び洗浄液で３
回洗浄してから、抗体希釈液で１０，０００倍に希釈し
たパーオキシダーゼ結合マウスＩｇＧ抗体を１００μｌ
／ウェルで加え、１時間反応した。洗浄液で３回洗浄し
た後、パーオキシダーゼの基質溶液で発色させ、４９２
ｎｍの吸光度を測定した。エトフェンプロックスにより
阻害を受けて減った吸光度から、その阻害率を％阻害と
して示した。

【００２７】この結果を第１表（表１）に示した。第１
表からすべてのモノクローナル抗体がエトフェンプロッ
クスと反応することが明かとなった。

【００２８】

【表１】

【００２９】実施例４モノクローナル抗体のメチルア
ルコール耐性８株のモノクローナル抗体の内、エトフェンプロックス
に対する感度の高い抗体ｃｌ８−２、ｃｌ２０５−
６５、ｃｌ２２１−８９について、実施例２に示した
ＥＬＩＳＡ法を用いてメチルアルコールへの耐性を調べ
た。各々ハイブリドーマの培養上清をｃｌ８−２が
１：１００、ｃｌ２０５−６５が１：１００、そして
ｃｌ２２１−８９が１：１５０の希釈率となるように
抗体希釈液をもちいて希釈し、同時にメチルアルコール
の最終濃度が各々０〜９０％となるように添加して使用
した。このようにメチルアルコールの濃度による、モノ
クローナル抗体と、２−（４−ヒドロキシカルボニルメ
チルオキシフェニル）−２−メチルプロピル３−フェ
ノキシベンジルエーテルと牛血清アルブミンの結合体
との反応性の変化を調べた結果を図１に示した。図１か
らｃｌ８−２とｃｌ２０５−６５は、４０％メチル
アルコール濃度まで比較的安定でそれより高濃度で急速
に反応性が低下すること、ｃｌ２２１−８９は、３０
％まで比較的安定でそれより高濃度で急速に反応性が低
下することが明かとなった。

【００３０】実施例５エトフェンプロックスの反応性実施例３で示した間接競合ＥＬＩＳＡ法を用いてｃｌ
８−２、ｃｌ２０５−６５、ｃｌ２２１−８９につ
いてエトフェンプロックスの測定感度を調べた。各モノ
クローナル抗体の希釈率は、実施例４と同様に行い、メ
チルアルコールは、最終濃度で１０％添加した。結果を
図２に示した。図２からｃｌ８−２とｃｌ２０５−
６５は１〜１，０００ｎｇ／ｍｌ程度まで、ｃｌ２２
１−８９は、１〜１００ｎｇ／ｍｌ程度まで定量的にエ
トフェンプロックスを測定できることが明かとなった。

【００３１】実施例６エトフェンプロックスの誘導体
及び類縁農薬との交差反応性実施例５で示した条件を用い、エトフェンプロックスの
代わりにその誘導体や類縁農薬を反応させ、交差反応性
を調べた。結果は、これらの化合物を加えずに反応させ
た場合の吸光度を１００％として、その５０％を阻害す
る化合物のモル濃度を各々ＩＣ₅₀濃度とし、さらにエト
フェンプロックスのＩＣ₅₀濃度を１００％としたときの
各化合物のＩＣ₅₀濃度の比を以下の式（数１）により求
め、交差反応性値（％）を算出した。

【００３２】

【数１】交差反応性値（％）＝（エトフェンプロックス
のＩＣ₅₀／化合物のＩＣ₅₀）×１００この結果、モノクロナール抗体ｃｌ８−２、ｃｌ２
０５−６５、ｃｌ２２１−８９は、エトフェンプロッ
クスの誘導体である２−（４−ヒドロキシフェニル）−
２−メチルプロピル３−フェノキシベンジルエーテ
ルと高い交叉反応性を示したがが、エトフェンプロック
スの主要代謝産物である２−（４−エトキシフェニル）
−２−メチルプロピル３−（４−ヒドロキシフェノキ
シ）ベンジルエーテル、２−（４−エトキシフェニ
ル）−２−メチルプロピル３−ヒドロキシベンジル
エーテル、２−（４−メトキシフェニル）−２−メチル
プロピル３−フェノキシベンゾエートに交叉反応性を
示さなかった。

【００３３】

【発明の効果】従来エトフェンプロックスの測定は、こ
れをヨウ素化３ーフェノキシベンジルに誘導したのちに
エレクトロンキャプチャ検出器付きのガスクロマトグラ
フィーを用いて測定する方法が採用されていたが、その
分析には相当の時間と手間を要していた。一方、本発明
の２−（４−ヒドロキシカルボニルメチルオキシフェニ
ル）−２−メチルプロピル３−フェノキシベンジル
エーテルをハプテンとして得られたモノクローナル抗体
を用いた免疫学的分析法により、２−（４−エトキシフ
ェニル）−２−メチルプロピル３−フェノキシベンジ
ルエーテル及び２−（４−ヒドロキシフェニル）−２
−メチルプロピル３−フェノキシベンジルエーテル
を各々直接特異的にかつ簡便に測定することができた。
さらに２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロ
ピル３−フェノキシベンジルエーテルは、測定限界
約１ｎｇ／ｍｌと高感度で測定できることができた。ま
たメチルアルコールを１０％添加してもエトフェンプロ
ックスとその誘導体を測定できたことから水田水や水道
水の試料ばかりでなく、生体試料、作物や土壌などから
の抽出試料についても容易に測定できる。従って本発明
方法を用いることにより、エトフェンプロックスとその
誘導体測定の大幅な簡略化と測定時間の短縮が可能とな
り、多量の検体を迅速かつ安価に測定することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】各モノクロナール抗体のメチルアルコールに対
する耐性を、ＥＬＩＳＡ法を用い、メチルアルコールの
濃度に対して、４９２ｎｍの吸光度をプロットしたもの
である。

【図２】各モノクロナール抗体の２−（４−エトキシフ
ェニル）−２−メチルプロピル３−フェノキシベンジル
エーテル（エトフェンプロックス）に対する反応性
を、間接競合ＥＬＩＳＡ法を用いて測定したものであ
る。

【符号の説明】

■印はモノクロナール抗体ｃｌ８−２を、□印はモノク
ロナール抗体ｃｌ２０５−６５を、●印はモノクロナー
ル抗体ｃ２２１−８９を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者麓康紀千葉県茂原市東郷1144番地三井東圧化学株式会社内 (72)発明者粂田貴子千葉県茂原市東郷1144番地三井東圧化学株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】２−（４−エトキシフェニル）−２−メ
チルプロピル３−フェノキシベンジルエーテル及び
２−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチルプロピル
３−フェノキシベンジルエーテルに特異的に結合す
るモノクローナル抗体。
【請求項２】請求項１記載のモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ。
【請求項３】請求項１記載のモノクローナル抗体を用
いることを特徴とする、２−（４−エトキシフェニル）
−２−メチルプロピル３−フェノキシベンジルエー
テル及び２−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル
プロピル３−フェノキシベンジルエーテルの免疫学
的分析方法。