JPH08140528A - 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物 - Google Patents

異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物

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JPH08140528A
JPH08140528A JP6289067A JP28906794A JPH08140528A JP H08140528 A JPH08140528 A JP H08140528A JP 6289067 A JP6289067 A JP 6289067A JP 28906794 A JP28906794 A JP 28906794A JP H08140528 A JPH08140528 A JP H08140528A
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JP6289067A
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Nils Lonberg
ロンバーグ ニルス
Robert M Kay
エム．カイ ロバート
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Genpharm International Inc
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒト以外の動物を利用してヒト抗体を得るた
めの新規な方法の提供。 【構成】 機能的に分断された内因性重鎖対立遺伝子の
同型接合対、機能的に分断された内因性軽鎖対立遺伝子
の同型接合対、非相同免疫グロブリン重鎖トランスジー
ンの少なくとも１つのコピー、及び異種性免疫グロブリ
ン重鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピーを含
み、抗原での免疫化に続いて抗体応答を行なう、トラン
スジェニックマウス；このマウスから得られるハイブリ
ドーマ、及びそれにより生産されるモノクローナル抗
体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、異種抗体を産生するこ
とができるトランスジェニック非ヒト動物、そのような
トランスジェニック動物を産生するのに使うトランスジ
ーン(transgene) 、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えにおいて異種Ｄ遺
伝子を機能的に再配列させることのできるトランスジー
ン、異種抗体を産生することのできる不死化Ｂ細胞、多
数のイソタイプの異種抗体を産生せしめる方法およびそ
のためのトランスジーン、内因性免疫グロブリン遺伝子
座の発現を不活性化または抑制する方法およびそのため
のトランスジーン、生殖細胞系列の再配列された可変領
域配列に比較すると可変領域配列が体細胞変異を含んで
成る異種抗体を産生せしめる方法およびそのためのトラ
ンスジーン、ヒト一次配列を有する抗体を産生し且つヒ
ト抗原に結合するトランスジェニック非ヒト動物、その
様なトランスジェニック動物のＢ細胞から作られたハイ
ブリドーマ、並びに該ハイブリドーマにより発現される
モノクローナル抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトにおけるモノクローナル抗体の生体
内治療および診断用途の開発に直面する主な障害の１つ
は、非ヒト免疫グロブリンの本質的免疫原性である。例
えば、免疫寛容性のヒト患者に治療量の齧歯類モノクロ
ーナル抗体を投与すると、患者は齧歯類免疫グロブリン
配列に対して抗体を産生し、それらのヒト抗マウス抗体
（HAMA）は治療抗体を中和し、急性毒性を引き起こし得
る。よって、有望な治療および／または診断上の標的で
ある特異的ヒト抗体と反応性であるヒト免疫グロブリン
を作製することが望ましい。
【０００３】モノクローナル抗体を作製するための現在
の技術は、動物（通常はラットまたはマウス）を抗原に
予備暴露するか、または抗原で感作せしめ、該動物から
Ｂ細胞を収得し、そしてハイブリドーマクローンのライ
ブラリーを作製することを伴う。ハイブリドーマ集団を
抗原結合特異性（イディオタイプ）についてスクリーニ
ングし、更に免疫グロブリンクラス（イソタイプ）につ
いてもスクリーニングすることにより、所望の抗体を分
泌するハイブリドーマクローンを選択することが可能で
ある。
【０００４】しかしながら、モノクローナル抗体を作製
する現行法を、ヒト抗原に対して結合特異性を有するヒ
ト抗体を産生せしめる目的に適用すると、ヒトは典型的
には自己抗原に対しては免疫応答を生じないであろうか
ら、ヒト免疫グロブリンを産生するＢリンパ球を得るこ
とは深刻な妨げになる。よって、ヒト抗原と特異的に反
応するヒトモノクローナル抗体を作製する現行法は明ら
かに不十分である。ハイブリドーマを作製するためのＢ
細胞源として非ヒト種を使用する場合にも、真の自己抗
原に対するモノクローナル抗体を作製することに同じ制
限が当てはまる。
【０００５】機能的異種免疫グロブリントランスジーン
を含有するトランスジェニック動物の作製は、自己抗原
と反応する抗体を産生させることができる方法である。
しかしながら、療法上有用な抗体の発現、またはそのよ
うな抗体を産生するハイブリドーマクローンを得るため
には、トランスジェニック動物がＢリンパ球発生過程を
経て成熟することのできるトランスジェニックＢ細胞を
産生しなければならない。そのような成熟はトランスジ
ェニックＢ細胞上の表面IgＭの存在を必要とするが、療
法利用にはIgＭ以外のイソタイプが所望される。よっ
て、機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列を受けて組換え多様性と接
合多様性を生じることのできるトランスジーンおよびそ
のようなトランスジーンを有する動物が要求される。更
に、そのようなトランスジーンとトランスジェニック動
物は、好ましくは、Ｂ細胞成熟に必要とされる第一のイ
ソタイプから優れた療法的効用を有する次なるイソタイ
プへのイソタイプ転換を促進するシス作用性配列を含有
する。
【０００６】多数の実験は、Ｉｇ遺伝子再配列に必要な
特異的ＤＮＡ配列を決定するためのトランスフェクトさ
れた細胞系の使用を報告している〔Lewis およびGeller
t (1989), Cell, 59, 585-588 〕。そのような報告は推
定上の配列を同定し、そして再配列に使う組換え酵素へ
のそれらの配列の近づきやすさ(accesibility)が転写に
より変更されると結論づけている〔Yancopoulos および
Alt (1985), Cell, 40, 271-281 〕。Ｖ（Ｄ）Ｊ結合の
ための配列は、報告によれば、高度に保存されたほぼ回
文式のヘプタマーと、12または23 bp のいずれかのスペ
ーサーにより隔てられたあまり保存されていない高ＡＴ
ナノマーである〔Tonegawa(1983), Nature, 302, 575-5
81 ; Hesseら(1989), Genes in Dev., 3, 1053-1061
〕。効率的組換えは、伝えられるところによれば、異
なる長さのスペーサー領域を有する組換えシグナル配列
を含む部位の間でのみ起こる。
【０００７】Ｉｇ遺伝子再配列は、組織培養細胞におい
て研究されているが、トランスジェニックマウスでは詳
しく研究されていない。マウス中に導入された再配列試
験構成物を記載している少数の報告が発表されているに
過ぎない〔Buchini ら、Nature, 326: 409-411 (1987)
（再配列されていないニワトリλトランスジーン）；Go
odhartら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4229-4233
(1987) （再配列されていないウサギκ遺伝子）；およ
び Bruggemann ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 86:6
709-6713 (1989) （ハイブリッドマウス−ヒト重
鎖）〕。しかしながら、そのような実験の結果は変動的
であり、場合によって、トランスジーンの不完全なまた
は最小の再配列を生じることがある。
【０００８】更に、分子のＦｃ部分により抗体分子の多
様な生物学的機能、例えばＦｃεを介したマスト細胞ま
たは好塩基球との相互作用、およびＦｃμまたはＦｃγ
による補体の結合、が発揮され、イソタイプの変化によ
り特定の特異性を有する機能的に多様な抗体を生成せし
めることが更に望ましい。異種抗体の１または複数の鎖
をコードするトランスジーンを含むトランスジェニック
動物は作製されているけれども、好結果のイソタイプス
イッチを受ける異種トランスジーンについての報告は全
くない。イソタイプをスイッチすることのできないトラ
ンスジェニック動物は単一のイソタイプの異種抗体を産
生するものに限定され、より詳しくは、Ｂ細胞成熟に不
可欠であるイソタイプ、例えばIgＭとおそらくIgＤを産
生するものに限定され、それらの抗体は療法的効用が限
定され得る。
【０００９】上記に基づくと、第二の種において産生さ
れる第一の種の遺伝子配列によってコードされる異種抗
体を効率的に産生せしめる方法に対する要求が存在する
ことは明らかである。より詳しくは、組換え多様性に貢
献するＤセグメントの全部または一部を含む機能的Ｖ−
Ｄ−Ｊ遺伝子再配列を受けることができる異種免疫グロ
ブリントランスジーンおよびトランスジェニック動物に
対する要求が当業界に存在する。更に、（１）機能的な
Ｂ細胞発達が起こり、そして（２）療法上有用な異種抗
体が産生されるようにＶ−Ｄ−Ｊ組換えとイソタイプス
イッチングを支えることができるトランスジーンおよび
トランスジェニック動物に対する要求が当業界に存在す
る。抗体が設計される特定の種において療法または診断
用のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製
造することができるＢ細胞源に対する要求も存在する。
機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよび／またはイソタイプスイ
ッチングを受けることができる異種免疫グロブリントラ
ンスジーンはそれらの要求を満たすことができる。
【００１０】上記目的に従って、異種抗体、例えばヒト
抗体、を産生することができるトランスジェニック非ヒ
ト動物が提供される。更に、異種抗体を発現することが
できるそのようなトランスジェニック動物からのＢ細胞
であって、特定抗原に特異的なモノクローナル抗体の源
を提供するために不死化されている前記Ｂ細胞を提供す
ることが本発明の目的である。
【００１１】この上記目的に従って、そのような異種モ
ノクローナル抗体を産生することができるハイブリドー
マ細胞を提供することが本発明の更なる目的である。更
にまた、上述の非ヒトトランスジェニック動物の製造に
有用な再配列されていないおよび再配列された異種免疫
グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを提供するこ
とが本発明の目的である。
【００１２】更にまた、トランスジェニック動物中の内
因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊する方法を提供する
ことが本発明の目的である。更にまた、上述のトランス
ジェニック非ヒト動物において異種抗体産生を誘導する
方法を提供することが本発明の目的である。本発明の更
なる目的は、本発明の１または複数のトランスジーンを
作製するために使われる免疫グロブリン可変領域遺伝子
セグメントレパートリーを作製する方法を提供すること
である。
【００１３】上記の参考文献は、単に本出願の出願日よ
り前のそれらの開示のために提供される。本発明者らが
先行発明によってそのような開示より以前は権利がない
と認めることと解釈してはならない。
【００１４】
【発明の要約】異種抗体、例えばヒト抗体を産生するこ
とのできるトランスジェニック非ヒト動物が提供され
る。そのような異種抗体は、IgG1, IgG2, IgG3, IgG4,
IgM, IgA1, IgA2, IgAsec , IgD またはIgE を含む様々
なイソタイプのものであることができる。そのようなト
ランスジェニッグ非ヒト動物が免疫応答を行うには、Ｂ
細胞の発達と抗原刺激成熟を果たすためにトランスジェ
ニックＢ細胞および前Ｂ細胞が表面結合型免疫グロブリ
ン、特にIgＭ（ことによるとIgＤ）イソタイプのものを
産生することが必要である。そのようなIgＭ（またはIg
Ｄ）表面結合型免疫グロブリンの発現はＢ細胞発達の抗
原刺激成熟期の間にのみ要求され、一時期には一回スイ
ッチしたイソタイプだけが産生されるが、成熟Ｂ細胞は
他のイソタイプを産生し得る。
【００１５】典型的には、Ｂ細胞系統の細胞は一時期に
単一のイソタイプだけを産生するだろうが、μS （分泌
型μ）およびμM （膜結合型μ）型、並びにμおよびδ
免疫グロブリン鎖で天然に起こるような、シスまたはト
ランス二者択一ＲＮＡスプライシングは、単一細胞によ
る複数のイソタイプの同時代発現をもたらし得る。従っ
て、複数のイソタイプの異種抗体、特に療法上有用なIg
Ｇ，IgＡおよびIgＭイソタイプの異種抗体を産生せしめ
るためには、イソタイプスイッチングが起こることが必
要である。そのようなイソタイプスイッチングは古典的
クラススイッチであってもよく、または１もしくは複数
の非古典的イソタイプスイッチ機構から生じてもよい。
【００１６】本発明は、異種免疫グロブリントランスジ
ーンおよびそのようなトランスジーンを有するトランス
ジェニック動物を提供し、ここで該トランスジェニック
動物はイソタイプスイッチを受けることにより複数のイ
ソタイプの異種抗体を産生することができる。古典的イ
ソタイプスイッチは、トランスジーン中の少なくとも１
つのスイッチ配列領域を巻き込む組換え現象によって起
こる。非古典的イソタイプスイッチは、例えば、ヒトσ
μ配列とヒトΣμ配列の間の相同組換え（δ−関連欠
失）により起こり得る。別の非古典的スイッチ機構、例
えば特にトランスジーン間および／または染色体間組換
えは、イソタイプスイッチを果たすことができる。
【００１７】そのようなトランスジーンおよびトランス
ジェニック動物は、抗原刺激型Ｂ細胞成熟に必要である
第一の免疫グロブリンイソタイプを産生し、そして療法
的および／または診断的効用を有する１または複数の第
二の異種イソタイプをコードし産生するようにスイッチ
することができる。よって本発明のトランスジェニック
非ヒト動物は、一態様では、ヒト免疫グロブリン遺伝子
配列によりコードされ且つ高親和力で特異的ヒト抗原に
結合するIgＧ，IgＡおよび／またはIgＥ抗体を産生する
ことができる。
【００１８】本発明は、様々なイソタイプの異種抗体を
発現することのできるトランスジェニック動物からのＢ
細胞にも関し、そのようなＢ細胞は、特定抗原に対して
特異的なモノクローナル抗体の源を提供するために不死
化される。そのようなＢ細胞から誘導されたハイブリド
ーマ細胞は、そのような異種モノクローナル抗体の１つ
の源として働くことができる。
【００１９】本発明は、上述の非ヒトトランスジェニッ
ク動物中でまたはそのようなトランスジェニック動物か
ら外植されたＢ細胞系統のリンパ球中で生体内イソタイ
プスイッチを受けることができる、再配列されていない
および再配列された異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖
トランスジーンを提供する。そのようなイソタイプスイ
ッチは自然に起こるか、またはトランスジェニック動物
もしくは外植されたＢ細胞系統リンパ球をイソタイプス
イッチ促進剤、例えばＴ細胞由来のリンホカイン（例え
ばIL-4および IFNγ）で処理することによって誘導する
ことができる。
【００２０】更に、本発明は、上述のトランスジェニッ
ク非ヒト動物中での異種抗体産生を誘導する方法を包含
し、ここでそのような抗体は様々なイソタイプのもので
あることができる。それらの方法は、異種抗体、特にス
イッチされたイソタイプ（IgＧ．IgＡおよびIgＭ）の異
種抗体の産生のためにトランスジェニック非ヒト動物に
おいて抗原刺激型免疫応答を生じさせることを含む。
【００２１】本発明は、トランスジェニック動物中で産
生される異種免疫グロブリンおよび前記動物のＢ細胞か
ら誘導されるモノクローナル抗体クローンが多様なイソ
タイプのものであり得るように、トランスジーンがイソ
タイプスイッチを果たす配列を含む方法を提供する。本
発明は更に、特定のイソタイプ間のスイッチが、生殖細
胞免疫グロブリン遺伝子座中で典型的に起こるよりもず
っと高頻度もしくは低頻度でおこるかまたは異なる時間
順序で起こるように、トランスジーンのイソタイプスイ
ッチを促進する方法を提供する。スイッチ領域は、様々
なＣH 遺伝子から移植しそしてトランスジーン構成物中
の別のＣH 遺伝子に連結せしめることができる。そのよ
うな移植スイッチ配列は典型的には結合されたＣH 遺伝
子とは独立的に機能し、そのため、トランスジーン構成
物中でのスイッチは結合されたスイッチ領域の元の機能
であろう。あるいはまた、スイッチ配列と共に、δ−結
合欠失配列が様々なＣH遺伝子に連結され、２つのδ−
結合欠失配列の間の配列の欠失により非古典的スイッチ
を果たすことができる。よって、特定のＣH 遺伝子が異
なるスイッチ配列に連結され、それによって天然に結合
されたスイッチ領域を使用した時に起こるよりも頻繁に
スイッチされるトランスジーンを作製することができ
る。
【００２２】本発明はまた、免疫グロブリントランスジ
ーンを含有するトランスジェニック動物においてトラン
スジーン配列のイソタイプスイッチが起こったかどうか
を決定する方法を提供する。本発明は、その内の幾つか
は生殖細胞の免疫グロブリン遺伝子座配列（欠失を含ん
でもよい）のサブセットを含有する免疫グロブリントラ
ンスジーン構成物、および免疫グロブリントランスジー
ン構成物の作製方法を提供する。本発明は、免疫グロブ
リントランスジーンの容易なクローニングと作製のため
の特別な方法であって、２つのユニークNotI部位により
隣接されたユニークXhoIおよびSalI制限部位を使用する
ベクターを必要とする方法を包含する。
【００２３】本発明のトランスジーンは、少なくとも１
つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメン
トおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードする
ＤＮＡを含んで成る重鎖トランスジーンを包含する。免
疫グロブリン軽鎖トランスジーンは、少なくとも１つの
可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントお
よび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮ
Ａを含んで成る。軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコ
ードする遺伝子セグメントは、それらが誘導されるトラ
ンスジェニック非ヒト動物にとって異種であるか、また
はトランスジェニック非ヒト動物から成らない種からの
免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコー
ドするＤＮＡに相当する。
【００２４】本発明の一観点によれば、個々の遺伝子セ
グメントが再配列されておらず、即ち機能的な免疫グロ
ブリン軽鎖または重鎖をコードするようには再配列され
ていないようなトランスジーンが作製される。そのよう
な再配列されていないトランスジーンは、トランスジェ
ニック非ヒト動物が抗原に暴露されると、前記動物中で
の該遺伝子セグメントの組換え（機能的再配列）並びに
生成した再配列された免疫グロブリン重鎖および／また
は軽鎖の発現を可能にする。
【００２５】本発明の一観点によれば、異種重鎖および
軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、再配列された異
種ＤＮＡの比較的大きい断片を含んで成る。そのような
断片は、典型的には異種免疫グロブリン遺伝子座からの
Ｃ，Ｊ（および重鎖の場合にはＤ）セグメントの実質的
部分を含む。加えて、そのような断片は可変遺伝子セグ
メントの実質的部分も含んで成る。
【００２６】一態様では、そのようなトランスジーン構
成物は、調節配列、例えばプロモーター、エンハンサ
ー、クラススイッチ領域、組換えシグナル、異種ＤＮＡ
から誘導された対応配列等を含んで成る。あるいは、そ
のような調節配列を、本発明に使われる非ヒト動物と同
一のまたは関連の種からのトランスジーン中に組み込む
ことができる。例えば、トランスジェニックマウスに使
うために、齧歯類免疫グロブリンエンハンサー配列を有
するトランスジーン中にヒト免疫グロブリン遺伝子セグ
メントを組み合わせることができる。
【００２７】本発明の方法では、生殖細胞再配列されて
いない軽鎖および重鎖免疫グロブリントランスジーン─
即ちＤ細胞分化中にＶＤＪ結合を受けるもの─を抗原と
接触せしめ、二次レパートリーＢ細胞における異種抗体
の産生を誘導する。本発明に使われる非ヒト動物中の内
因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊するベクターおよび
方法も本発明に包含される。そのようなベクターおよび
方法は、トランスジーン、好ましくはポジティブ−ネガ
ティブ(positive-negative）選別ベクターを使用し、該
ベクターは、それが本発明において使用する非ヒト動物
にとって内因性である重鎖および／または軽鎖免疫グロ
ブリンをコードする遺伝子セグメントのクラスの機能的
破壊を標的するように構成される。そのような内因性遺
伝子セグメントとしては、多様性領域、連結領域および
定常領域遺伝子セグメントが挙げられる。
【００２８】本発明のこの観点によれば、ポジティブ−
ネガティブ選別ベクターを少なくとも１つの非ヒト動物
の胎児性幹細胞と接触させた後、ポジティブ−ネガティ
ブ選別ベクターが相同組換えによって非ヒト動物のゲノ
ム中に組み込まれている細胞を選択する。移植後、得ら
れたトランスジェニック非ヒト動物は、該ベクターの相
同組み込みの結果として、免疫グロブリン媒介の免疫応
答を開始することが実質的に不可能である。そのような
免疫不全非ヒト動物は、その後、免疫不全症の研究に使
うことができ、または異種免疫グロブリン重鎖および軽
鎖トランスジーンの受容体として使うことができる。
【００２９】本発明はまた、内因性免疫グロブリン遺伝
子座を破壊することなく、１または複数の種の免疫グロ
ブリン鎖の発現を抑制するのに有用なベクター、方法お
よび組成物を提供する。そのような方法は、トランスジ
ーンによってコードされる１または複数の免疫グロブリ
ン鎖の発現を許容しながら、トランスジーンによってコ
ードされる１または複数の免疫グロブリン鎖の発現を抑
制するのに有用である。内因性免疫グロブリン鎖遺伝子
座の遺伝的破壊とは異なり、免疫グロブリン鎖発現の抑
制は、破壊された内因性Ｉｇ遺伝子座についてホモ接合
性であるトランスジェニック動物の確立に必要である時
間のかかる飼育を必要としない。
【００３０】内因性Ｉｇ遺伝子破壊法に比較した時の抑
制法の追加の利点は、ある態様では、個体動物内で鎖抑
制が可逆的であることである。例えば、Ｉｇ鎖抑制は、
（１）内因性Ｉｇ鎖遺伝子配列に特異的にハイブリダイ
ズするアンチセンスＲＮＡをコードし発現するトランス
ジーン、（２）内因性Ｉｇ鎖遺伝子配列に特異的にハイ
ブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド、およ
び（３）内因性Ｉｇ鎖ポリペプチドに特異的に結合する
免疫グロブリン、を使って達成することができる。
【００３１】本発明は、機能的に分断された内因性重鎖
対立遺伝子の同型接合対、機能的に分断された内因性軽
鎖対立遺伝子の同型接合対、非相同免疫グロブリン重鎖
トランスジーンの少なくとも１つのコピー、及び非相同
免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも１つの
コピーを含み、ヒト抗原（例えばCD４）といった抗原で
の免疫化に続いて抗体応答を行なう、ヒト以外のトラン
スジェニック動物を提供する。本発明は同様に、前記機
能的に分断された内因性重鎖対立遺伝子がＪH領域相同
組換えノックアウトであり、前記機能的に分断された内
因性軽鎖対立遺伝子がＪk 領域相同組換えノックアウト
であり、前記非相同免疫グロブリン重鎖トランスジーン
がHC１又はHC２ヒトミニ遺伝子トランスジーンであり、
前記非相同軽鎖トランスジーンがKC２又はKCleヒトκト
ランスジーンであり、前記抗原がヒト抗原であるよう
な、ヒト以外のトランスジェニック動物をも提供する。
【００３２】本発明は同様に、内因性ヒト免疫グロブリ
ン遺伝子座を抑制、切除及び／又は機能的に分断するた
めのさまざまな実施態様をも提供している。本発明は同
様に、ヒト配列重鎖可変領域及びマウス配列重鎖恒常領
域を含むキメラ重鎖及びヒト配列重鎖の両方を発現する
トランスジェニックマウスをも提供する。このようなキ
メラ重鎖は一般に、機能的に再配置されたヒトトランス
ジーンと内因性マウス重鎖恒常領域（γ１，γ２ａ，γ
２ｂ，γ３）の間でのトランススイッチにより産生され
る。標準的にはトランスジーンコードされたヒト配列軽
鎖又は内因性マウス軽鎖と組合わされたこのようなキメ
ラ重鎖を含む抗体は、予め定められた抗原での免疫化に
応答して形成される。これらの実施態様のトランスジェ
ニックマウスは、第１の時点でヒト配列重鎖を産生（発
現）し、第２（次に続く）時点でヒト可変領域及びマウ
ス恒常領域（例えば、γ１，γ２ａ，γ２ｂ，γ３）か
ら成るキメラ重鎖を産生（発現）するべくトランススイ
ッチするＢ細胞を含むことができる；このようなヒト配
列及びキメラ重鎖は軽鎖をもつ機能的抗体内に組込まれ
る：このような抗体は、かかるトランスジェニックマウ
スの血清中に存在する。
【００３３】かくして換言すると、これらの実施態様の
トランスジェニックマウスは、ヒト配列重鎖を発現しそ
の後、ヒト可変領域及び交互の恒常領域（例えばマウス
γ１，γ２ａ，γ２ｂ，γ３：ヒトγ，α，ε）から成
るキメラ又はアイソタイプスイッチを受けた重鎖を発現
するべくスイッチ（トランススイッチ又はシススイッチ
による）するＢ細胞を含むことができ；かかるヒト配列
及びキメラ又はアイソタイプスイッチされた重鎖は軽鎖
を伴う機能的抗体（ヒト又はマウス）の中に組込まれ；
かかる抗体はかかるトランスジェニックマウスの血清内
に存在する。
【００３４】本明細書中に引用された参考文献は本出願
の出願日より前にそれらの開示があったことを示すため
だけに提供される。先行発明によって本発明者らがその
ような開示よりも先であるという権利を与えられること
を認めるものと解釈してはならない。（化２）及び（化
３）はベクターpGPeの配列を示す。
【００３５】（化４）及び（化５）は遺伝子ＶH 49.8の
配列を示す。表１は本発明のトランスジェニックマウス
の血清中のヒトIgＭおよびIgＧの検出を示す。（化６）
及び（化７）はＶＤＪ接合の配列を示す。表２は、成人
の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において見つかるＪセグメ
ントに対する、pHC1トランスジーンによってコードされ
る転写物中に組み込まれたＪセグメントの分布を示す。
【００３６】表３は、成人の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）
において見つかるＤセグメントに対する、pHC1トランス
ジーンによってコードされる転写物中に組み込まれたＤ
セグメントの分布を示す。（化８）及び（化９）は、pH
C1トランスジェニックマウス中またはヒトＰＢＬ中のフ
レーム内ＶＤＪ接合を有する転写物からのCDR3ペプチド
の長さを示す。
【００３７】表４は、pHC1トランスジェニックマウスか
ら分析された30クローンのＶＤＪ領域の推定アミノ酸配
列を示す。表５は、指摘の実験において使用したライン
112 のトランスジェニックマウスを示す；（＋）は各ト
ランスジーンの存在を示し、（＋＋）は該動物がＪH Ｄ
突出トランスジーンについてホモ接合性であることを示
す。
【００３８】（表Ａ） 複数の0011マウスの遺伝子型を
示す。 ＜表７＞ トランスジェニックマウスにおけるHC２重鎖
トランスジーン内の体細胞突然変異の発生を示す。
【００３９】
【具体的な説明】上述したように、有望な治療および／
または診断上の標的である特異的ヒト抗原と反応するヒ
ト免疫グロブリンを製造することが望ましい。しかしな
がら、ヒト抗原と特異的に結合するヒト免疫グロブリン
は問題がある。第一に、Ｂ細胞源として働く免疫処置動
物が、与えられた抗原に対して免疫応答を生じなければ
ならない。動物が免疫応答を生じるには、与えられた抗
原が外来でなければならず、且つ動物が該抗原に寛容性
でなければならない。よって、例えばヒトタンパク質に
結合するイディオタイプを有するヒトモノクローナル抗
体を製造しようと所望するならば、自己寛容性がヒトタ
ンパク質に対する実質的な免疫応答を生じるのを妨げる
だろう。何故なら、免疫原性となり得る該抗原の唯一の
エピトープが、ヒト集団の中のタンパク質の多形性に由
来するもの（同種異系間エピトープ）であろうからであ
る。
【００４０】第二に、ハイブリドーマを形成させるため
のＢ細胞の源として働く動物（一例ではヒト）が真正自
己抗原に対して免疫応答を生じるならば、該動物におい
て深刻な自己免疫病が発生し得る。ハイブリドーマ用の
Ｂ細胞源としてヒトを使う場合には、そのような自己免
疫化は現代の道徳的規範により非論理的であると見なさ
れる。
【００４１】かくして予め定められたヒト抗原に対する
抗体応答を誘発できるヒト抗体分泌Ｂ細胞が必要とされ
ることから、予め定められたヒト抗原と特異的反応性を
もつヒト免疫グロブリン鎖を分泌するハイブリドーマを
開発することには問題が多い。ヒト抗原と特異的に反応
するヒト抗体を得るのに利用することができる１つの方
法論は、本発明のヒト免疫グロブリントランスジーン構
成物を含有するトランスジェニックマウスの製造であ
る。簡単に言えば、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖
遺伝子座の全部もしくは部分を含有するトランスジー
ン、またはヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の必須機能要素
を含んで成る合成「小遺伝子座」（下記、並びに1990年
８月29日に出願された同時係属米国出願第07/574,748号
および1990年８月31日に出願された同第07/575,962号、
並びに1991年８月28日に出願されたPCT/US91/06185号中
に記載されている）を含有するトランスジーンを使って
トランスジェニック非ヒト動物を作製する。
【００４２】そのようなトランスジェニック非ヒト動物
は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる免疫
グロブリン鎖を産生する能力を有し、その上、ヒト抗原
に対して免疫応答を生じることができるだろう。よっ
て、そのようなトランスジェニック非ヒト動物は特定の
ヒト抗原と反応する免疫血清の源として働くことがで
き、そのようなトランスジェニック動物からのＢ細胞を
ミエローマ細胞と融合せしめることにより、ヒト抗原と
特異的に反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブ
リドーマを製造することができる。
【００４３】様々な形の免疫グロブリン遺伝子を含有す
るトランスジェニックマウスの製造は以前に報告されて
いる。トランスジェニックマウスの製造には、再配列さ
れたマウス免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子が使わ
れている。加えて、μまたはγ１定常領域を含む機能的
に再配列されたヒトＩｇ遺伝子がトランスジェニックマ
ウス中で発現されている。しかしながら、トランスジー
ンが再配列されていない（再配列されないＶ−Ｄ−Ｊま
たはＶ−Ｊ）免疫グロブリン遺伝子を含んで成る実験は
変動的であり、場合によって、トランスジーンの不完全
なまたは最少の再配列を生じることがあった。しかし、
トランスジーン中のＣH 遺伝子間での好結果のイソタイ
プスイッチを受ける再配列されたまたは再配列されてい
ない免疫グロブリントランスジーンの例は１つも報告さ
れていない。
【００４４】本発明は同様に、基本的にヒト恒常領域配
列に対するポリペプチド結合におけるヒトＶＤＪ配列か
ら成るヒト免疫グロブリン鎖を含むモノクローナル抗体
を分泌するハイブリドーマ候補を同定するための方法を
も提供する。かかるハイブリドーマ候補は、（１）基本
的にヒトＶＤＪ領域とヒト恒常領域から成る免疫グロブ
リン鎖を発現するハイブリドーマクローン、及び（２）
基本的にヒトＶＤＪ領域及びマウス恒常領域から成るヘ
テロハイブリッド免疫グロブリン鎖を発現するトランス
スイッチされたハイブリドーマを含むハイブリドーマク
ローンのプールから同定される。個々の又はプールされ
たハイブリドーマクローンの上清は、予め定められた抗
原結合特異性をもつ抗体を選択するための結合条件下
で、標準的には固定基質（例えばマイクロタイターウエ
ル）上に吸着により不動化される抗原である予め定めら
れた抗原と接触させられる。
【００４５】ヒト恒常領域に特異的に結合する抗原も同
様に、抗体が少なくとも１つのヒト恒常領域エピトープ
に選択的に結合するもののマウス恒常領域エピトープに
は結合しないような結合条件下で、ハイブリドーマ上清
及び予め定められた抗原と接触させられ、かくして予め
定められた抗原及び特異的にヒト恒常領域と結合する抗
体に結合されたハイブリドーマ上清（トランスジェニッ
クモノクローナル抗体）で基本的に構成されている複合
体を形成する（そして、これは検出可能な標識又はリポ
ーターで標識付け可能である）。このような複合体の形
成の検出は、ヒト免疫グロブリン鎖を発現するハイブリ
ドーマクローン又はプールを表わす）。
【００４６】定義 本明細書中で使用する時、用語「抗体」は、少なくとも
２本の同一の軽ポリペプチド鎖と２本の同一の重ポリペ
プチド鎖を含んで成る糖タンパク質を言う。重および軽
ポリペプチド鎖は各々、抗原と相互作用する結合ドメイ
ンを含む可変領域（通常はポリペプチド鎖のアミノ末端
部分）を含有する。重および軽ポリペプチド鎖は各々、
ポリペプチド鎖の定常領域（通常はカルボキシ末端部
分）も含んで成り、その配列の一部は、免疫系の種々の
細胞、或る種の食細胞および典型的補体系の第一成分
（C1q ）を含む宿主組織への免疫グロブリンの結合を媒
介する。
【００４７】本明細書中で使用する時、「異種抗体」
は、そのような抗体を産生するトランスジェニック非ヒ
ト生物に関連して定義される。それは、トランスジェニ
ック非ヒト動物から成らない生物において見つかるもの
に対応するアミノ酸配列を有するかまたはＤＮＡ配列を
コードする抗体である。本明細書中で使用する時、「ヘ
テロハイブリッド抗体」は、異なる生物体起源の軽鎖と
重鎖を有する抗体を言う。例えば、マウス軽鎖と会合さ
れたヒト重鎖を有する抗体はヘテロハイブリッド抗体で
ある。
【００４８】本明細書中で使用する時、「イソタイプ」
は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス
（例えばIgＭまたはIgG1）を言う。本明細書中で使用す
る時、「イソタイプスイッチ」は、抗体のクラスまたは
イソタイプが或るＩｇクラスから別のＩｇクラスのうち
の１つへ変化する現象を言う。
【００４９】本明細書中で使用する時、「非スイッチイ
ソタイプ」は、イソタイプスイッチが起こらなかった時
に産生される重鎖のクラスを言う。非スイッチイソタイ
プをコードするＣH 遺伝子は、典型的には機能的に再配
列されたＶＤＪ遺伝子のすぐ下流の最初のＣH 遺伝子で
ある。本明細書中で使用する時、用語「スイッチ配列」
は、スイッチ組換えを招くそれらのＤＮＡ配列を言う。
「スイッチ供与体」配列、典型的にはμスイッチ領域
は、スイッチ組換え中に欠失されるであろう定常領域の
５′（即ち上流）にあるだろう。「スイッチ受容体」領
域は、欠失されるであろう定常領域と代替定常領域（例
えばγ，ε等）との間であろう。組換えが常に起こる特
異部位は１つもないので、典型的には最終遺伝子配列は
構成物から予想不可能であろう。
【００５０】本明細書中で使用する時、「グリコシル化
パターン」は、タンパク質、より詳しくは免疫グロブリ
ンタンパク質に共有結合している炭化水素単位のパター
ンとして定義される。当業者が異種抗体のグリコシル化
パターンをトランスジーンのＣH 遺伝子が由来する種よ
りも非ヒトトランスジェニック動物の種の中のグリコシ
ル化パターンに一層類似していると認識するような時に
は、異種抗体のグリコシル化パターンは、非ヒトトラン
スジェニック動物の種によって産生される抗体上に天然
に存在するグリコシル化パターンと実質上類似している
と特徴付けることができる。
【００５１】本明細書中で使用する時、「特異的結合」
は、抗体が（１）予め決定された抗原に少なくとも１×
107 Ｍ-1の親和力で結合し、そして（２）予め決定され
た抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）
への結合親和力よりも少なくとも２倍大きい親和力で、
予め決定された抗原に優先的に結合する性質を言う。本
明細書中で使用する時「天然に存在する」という用語
は、対象物に用いた時に対象物が天然に見つけることが
できることを言う。例えば、天然源から単離することが
でき且つ人間によって実験室で故意に変更されていな
い、生物体（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチド配列は、「天然に存在する」
ものである。
【００５２】本明細書中で使用する時「再配列された」
という用語は、Ｖセグメントがそれぞれ本質的に完全な
ＶH またはＶL ドメインをコードする構造においてＤ−
ＪまたはＪセグメントのすぐ近くに位置する重鎖または
軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の配置を言う。再配列され
た免疫グロブリン遺伝子座は生殖細胞ＤＮＡとの比較に
よって同定することができ；再配列された遺伝子座は少
なくとも１つのヘプタマー／ナノマー相同性要素を有す
るだろう。
【００５３】Ｖセグメントに関して本明細書中で使用す
る時、「再配列されていない」または「生殖細胞配置」
なる用語は、ＤまたはＪセグメントのすぐ近くになるよ
うにＶセグメントが組換えられない配置を言う。核酸に
ついては、「実質的相同性」ともいうのは、最適な形で
整列され比較された場合、２つの核酸又はその指定配列
が、少なくとも約80％のヌクレオチド、通常は少なくと
も約90％〜95％、より好ましくは少なくとも約98〜99.5
％のヌクレオチドにおいて適当なヌクレオチド挿入又は
欠失を伴って同一であることを表わす。代替的には、選
択的ハイブリダイゼーション条件下でストランドの補体
に対しセグメントがハイブリッド形成するときに実質的
な相同性が存在する。核酸は、全細胞中に、細胞リゼイ
ト中に、又は部分的に精製された形又は実質的に純粋な
形で存在しうる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣS
Clバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロー
スゲル電気泳動及び当該技術分野において周知のその他
の技術を含む標準的技術により、例えばその他の細胞核
酸又はタンパク質といったその他の細胞成分はその他の
汚染物質から精製された時点で、「分離され」又は「実
質的に純粋な状態にされ」ている。F. Ausubel, et. a
l., ed.「分子生物学における現在のプロトコル」、Gre
ene,Publishing and Wiley-Interscience、ニューヨー
ク（1987）参照。
【００５４】本発明の核酸組成物は、往々にして、ｃＤ
ＮＡゲノミック又は混合物のいずれかからの未変性配列
（修正された制限部位などを除く）にあるものの、標準
的技術に従って遺伝子配列を提供するべくそこからの突
然変異を受けることができる。コーディング配列につい
ては、これらの突然変異は望まれるとおりにアミノ酸配
列に影響を及ぼしうる。特に、未変性にＤ，Ｊ．結合ス
イッチと実質的に相同な又はこれらから誘導されたＤＮ
Ａ配列及び本書に記されているその他のこのような配列
が考慮される（ここで「誘導された」というのは、１つ
の配列がもう１つの配列と同一であるか又はそれから修
正されたものであることを表わす）。
【００５５】核酸は、他の核酸と機能的関係におかれた
とき、それは「使用可能に連結される。」例えば、プロ
モーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響
を与えるとき、「作用可能に連結される。転写抑制配列
に関し、作用可能に連結されるとは、連結されたＤＮＡ
配列が隣接することを意味し、２つの蛋白質コード領域
を連結するのに必要な場合、隣接しており、そしてリー
ディングフレーム内にある。スイッチ配列については、
作用可能に連結されるとは、配列がスイッチ組換えを行
うことができることを意味する。
【００５６】異種抗体を産生することのできるトランス
ジェニック非ヒト動物 異種抗体レパートリーによる外来抗原刺激に応答するト
ランスジェニック非ヒト動物のデザインは、トランスジ
ェニック動物の内部に含まれた異種免疫グロブリントラ
ンスジーンがＢ細胞発達経路を通して正しく機能するこ
とを必要とする。好ましい態様では、異種重鎖トランス
ジーンの正しい機能がイソタイプスイッチを含む。従っ
て、イソタイプスイッチを生じ且つ下記のうちの１つま
たは複数をもたらすように本発明のトランスジーンが作
製される：（１）高レベルで且つ細胞型特異的な発現、
（２）機能的な遺伝子再配列、（３）対立遺伝子排除の
活性化およびそれに対する応答、（４）十分な一次レパ
ートリーの発現、（５）シグナル形質導入、（６）体細
胞高度突然変異（hyper-mutation）、および（７）免疫
応答の間のトランスジーン抗体遺伝子座の優性化。
【００５７】下記開示から明らかなように、上記の基準
の全てを満たす必要はない。例えば、トランスジェニッ
ク動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座が機能的に破壊
されるそれらの態様では、トランスジーンは対立遺伝子
排除を活性化する必要がない。更に、トランスジーンが
機能的に再配列された重鎖および／または軽鎖免疫グロ
ブリン遺伝子を含んで成る態様では、２番目の基準であ
る機能的な遺伝子再配列は、少なくとも既に再配列され
ているトランスジーンには不要である。分子免疫学に関
する背景については、Fundamental Immunolo- gy, 第２
版 (1989), Paul William E.編, Raven Press, N.Y. を
参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれ
る。
【００５８】本発明の一観点では、トランジェニック動
物の生殖細胞（ジャームライン）中に再配列された、再
配列されていない、または再配列されたものと再配列さ
れていないものとの組み合わせの、異種免疫グロブリン
重鎖および軽鎖トランスジーンを含有する、トランスジ
ェニック非ヒト動物が提供される。重鎖トランスジーン
の各々は少なくとも１つのＣH 遺伝子を含んで成る。加
えて、重鎖トランスジーンは、トランスジェニック動物
のＢ細胞中で多数のＣH 遺伝子をコードする異種トラン
スジーンのイソタイプスイッチを支持することができる
機能的イソタイプスイッチ配列を含んでもよい。そのよ
うなスイッチ配列は、トランスジーンＣH 遺伝子の源と
して働く種からの生殖細胞免疫グロブリン遺伝子座に天
然に存在するものであることができ、またはトランスジ
ーン構成物を受け入れることになっている種（トランス
ジェニック動物）に存在するものから誘導することもで
きる。
【００５９】例えば、トランスジェニックマウスを製造
するのに使われるヒトトランスジーン構成物は、それが
マウス重鎖遺伝子座中に天然に存在するものに類似した
スイッチ配列を含むならば、より高頻度のイソタイプス
イッチ現象をもたらすことができる。というのは、恐ら
くマウススイッチ配列はマウススイッチレコンビナーゼ
酵素系が機能するように最適化されるが、一方ヒトスイ
ッチ配列は最適化されないだろうからである。スイッチ
配列は、常用のクローニング法により単離しクローニン
グすることができ、または免疫グロブリンスイッチ領域
配列に関する発表された配列情報に基づいてデザインし
た重複合成オリゴヌクレオチドから初めから合成するこ
とができる（Mills ら、Nucl. Acids Res. 18:7305-73
16 (1991) ; Siderrasら、Intl. Immunol. 1:631-642
(1989)、これらは参考として本明細書中に組み込まれ
る）。
【００６０】上記トランスジェニック動物の各々につい
て、機能的に再配列された異種重鎖および軽鎖免疫グロ
ブリントランスジーンは、トランスジェニック動物の有
意な率（少なくとも10パーセント）のＢ細胞中に検出さ
れる。本発明のトランスジーンは、少なくとも１つの可
変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよ
び１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡ
を含んで成る重鎖トランスジーンを包含する。免疫グロ
ブリン軽鎖トランスジーンは、少なくとも１つの可変遺
伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１
つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含
んで成る。軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードす
る遺伝子セグメントは、それらが誘導されるトランスジ
ェニック非ヒト動物にとって異種であるか、またはトラ
ンスジェニック非ヒト動物から成らない種からの免疫グ
ロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコードする
ＤＮＡに相当する。
【００６１】本発明の一観点によれば、個々の遺伝子セ
グメントが再配列されておらず、即ち機能的な免疫グロ
ブリン軽鎖または重鎖をコードするようには再配列され
ていないようなトランスジーンが作製される。そのよう
な再配列されていないトランスジーンは、抗原に暴露さ
れると、トランスジェニック非ヒト動物内でＶ，Ｄおよ
びＪ遺伝子セグメントの組換え（機能的再配列）を支持
し、そして好ましくは結果として得られる再配列された
免疫グロブリン重鎖中へのＤ領域遺伝子セグメントの全
部または部分の組み込みを支持する。
【００６２】本発明の別の観点によれば、該トランスジ
ーンは、再配列された「小遺伝子座」を含んで成る。そ
のようなトランスジーンは、典型的にはＣ，ＤおよびＪ
セグメントの実質的部分並びにＶセグメントのサブセッ
トを含んで成る。そのようなトランスジーン構成物で
は、様々な調節配列、例えばプロモーター、エンハンサ
ー、クラススイッチ領域、ＲＮＡプロセシング用のスプ
ライス供与体およびスプライス受容体、組換えシグナル
等は、異種ＤＮＡから誘導された対応配列を含んで成
る。
【００６３】あるいは、そのような調節配列を本発明に
使われる非ヒト動物と同一のまたは関連の種からのトラ
ンスジーン中に組み込むことができる。例えば、トラン
スジェニックマウスに使うために、トランスジーン中に
ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを齧歯類免疫グロ
ブリンエンハンサー配列と組み合わせることができる。
あるいは、トランスジーン中に合成調節配列を組み込む
こともでき、この場合、そのような合成調節配列は哺乳
類のゲノム中に天然に存在することが知られている機能
的ＤＮＡ配列とは相同でない。合成調節配列は共通規則
に従ってデザインされ、例えば、スプライス受容体部位
またはプロモーター／エンハンサーモチーフの許容配列
を特定するものである。
【００６４】例えば、ミニ遺伝子座は、天然に発生する
生殖細胞系Ｉｇ遺伝子座と異なり、可欠ＤＮＡ部分（例
えば介在配列；イントロン又はその一部分）の少なくと
も１つの内部（すなわちこの部分の末端にはない）の欠
失を有するゲノミック免疫グロブリン遺伝子座の一部分
を含む。本発明はまた、重鎖および軽鎖トランスジーン
を有する生殖細胞を含有するトランスジェニック動物に
も関し、ここで前記トランスジーンの一方は再配列され
た遺伝子セグメントを含み、他方は再配列されていない
遺伝子セグメントを含む。好ましい態様では、再配列さ
れたトランスジーンが軽鎖免疫グロブリントランスジー
ンであり、再配列されていないトランスジーンが重鎖免
疫グロブリントランスジーンである。
【００６５】抗体の構造および産生 全ての免疫グロブリンの基本構造は、２つの軽鎖ポリペ
プチドと２つの重鎖ポリペプチドとから成る単位に基づ
く。各軽鎖は、可変軽鎖領域および定常軽鎖領域として
知られる２つの領域を含んで成る。同様に、免疫グロブ
リン重鎖は、可変重鎖領域および定常重鎖領域と呼ばれ
る２つの領域を含んで成る。
【００６６】重鎖または軽鎖の定常領域は、重鎖または
軽鎖定常領域遺伝子（ＣH ）セグメントと呼ばれるゲノ
ム配列によりコードされる。特定の重鎖遺伝子セグメン
トの使用が免疫グロブリンのクラスを限定する。例え
ば、ヒトでは、μ定常領域遺伝子セグメントが抗体のIg
Ｍクラスを限定し、一方でγ，γ２，γ３またはγ４定
常領域遺伝子セグメントが抗体のIgＧクラス並びにIgＧ
のサブクラスIgＧ1 〜IgＧ4 を限定する。同様に、α1
またはα2 定常領域遺伝子セグメントの使用が抗体のIg
Ａクラス並びにIgＡ1 およびIgＡ2 サブクラスを限定す
る。δおよびε定常領域遺伝子セグメントがそれぞれIg
ＤおよびIgＥ抗体クラスを限定する。
【００６７】重鎖および軽鎖免疫グロブリンの可変領域
は、一緒になって抗体の抗原結合領域を含む。広範囲の
抗原を結合できるようにするために抗体のこの領域に多
様性が必要なため、初期または一次レパートリー可変領
域をコードするＤＮＡは、特定の可変領域遺伝子セグメ
ントのファミリーに由来する多数の異なるＤＮＡセグメ
ントを含んで成る。軽鎖可変領域の場合、そのようなフ
ァミリーは可変（Ｖ）遺伝子セグメントと連結（Ｊ）遺
伝子セグメントを含んで成る。よって、軽鎖の初期可変
領域は１つのＶ遺伝子セグメントと１つのＪ遺伝子セグ
メントによってコードされ、各セグメントはその生物の
ゲノムＤＮＡ中に含まれるＶおよびＪ遺伝子セグメント
のファミリーから選ばれる。重鎖可変領域の場合、重鎖
の初期または一次レパートリー可変領域をコードするＤ
ＮＡは、１つの重鎖Ｖ遺伝子セグメント、１つの重鎖多
様性（Ｄ）遺伝子セグメントおよび１つのＪ遺伝子セグ
メントを含んで成り、各セグメントはゲノムＤＮＡ中の
適当な免疫グロブリン遺伝子セグメントのＶ，Ｄおよび
Ｊファミリーから選ばれる。
【００６８】抗体結合部位の形成に貢献する配列の多様
性を増加させるために、重鎖トランスジーンが再配列さ
れたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子配列中にＤ領域の全部または部分
を組み込むことができる機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列を支持
するシス作用性配列を含むことが好ましい。典型的に
は、発現されたトランスジーンによってコードされる重
鎖（またはmRNA）の少なくとも約１％がＶ領域中に認識
可能なＤ領域配列を含有する。好ましくは、トランスジ
ーンによってコードされるＶ領域の少なくとも約10％、
より好ましくは少なくとも約30％、最も好ましくは50％
が認識可能なＤ領域配列を含有する。
【００６９】認識可能なＤ領域配列は一般に、重鎖トラ
ンスジーンのＤ領域遺伝子セグメント中に存在する配列
に相当する少なくとも約８個の連続するヌクレオチドお
よび／またはそのようなＤ領域ヌクレオチド配列により
コードされるアミノ酸配列である。例えば、トランスジ
ーンがＤ領域遺伝子DHQ52 を含むならば、Ｖ遺伝子セグ
メント配列とＪ遺伝子セグメント配列の間のＶ領域中に
配列 5'-TAACTGGG- 3'を含有するトランスジーンによっ
てコードされるmRNAは、Ｄ領域配列、特にDHQ52 配列を
含むものとして認識可能である。同様に、例えば、トラ
ンスジーンがＤ領域遺伝子DHQ52 を含むならば、Ｖ遺伝
子セグメントアミノ酸配列とＪ遺伝子セグメントアミノ
酸配列の間のＶ領域中に置かれたアミノ酸配列 -DAF-を
含有するトランスジーンによってコードされる重鎖ポリ
ペプチドは、Ｄ領域配列、特にDHQ52 配列を含むものと
して認識可能である。
【００７０】しかしながら、Ｄ領域セグメントをさまざ
まな程度までのさまざまな読み取り枠内でのＶＤＪジョ
イニング内に取り込むことができることから、特定のＤ
セグメントの取込みを見極めるには、トランスジーン内
に存在するＤ領域セグメントに対する重鎖可変領域のＤ
領域部域の比較が必要である。その上、組換え中の潜在
的エキソヌクレアーゼ消化は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え中の不
精確なＶ−Ｄ及びＤ−Ｊ連結を導く可能性がある。
【００７１】しかしながら、体細胞突然変異またはＮ領
域付加のために、幾つかのＤ領域は、認識可能であるが
連続するＤ領域配列と全く同一には一致しないことがあ
る。例えば、ヌクレオチド配列 5′-CTAAXTGGGG-3 ′
（ここでＸはＡ，ＴまたはＧであり、該配列は重鎖Ｖ領
域中にあり、Ｖ領域遺伝子配列とＪ領域遺伝子配列によ
って隣接されている）は、DH52配列 5′-CTAACTGGG- 3
′に相当すると認識され得る。同様に、例えば、Ｖ領
域中にありそしてアミノ末端側でトランスジーンＶ遺伝
子配列によってコードされるアミノ酸配列により隣接さ
れそしてカルボキシ末端側でトランスジーンＪ遺伝子配
列によってコードされるアミノ酸配列により隣接されて
いるポリペプチド配列 -DAFDI-, -DYFDY- または -GAFD
I-は、Ｄ領域配列として認識され得る。
【００７２】従って、体細胞突然変異やＮ領域付加はト
ランスジーンＤ領域に由来する配列中に変異をもたらし
得るので、認識可能なＤ領域配列の存在を決定するため
の指標として次の定義が与えられる。アミノ酸配列また
はヌクレオチド配列は次のような場合にＤ領域として認
識可能である：（１）該配列がＶ領域中に存在し、一方
の側がＶ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミ
ノ酸配列）により隣接されており、そして他方の側がＪ
遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配
列）により隣接されており、且つ（２）該配列が既知の
Ｄ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配
列）と実質的に同じであるかまたは実質的に相同である
場合。
【００７３】ここで使用する用語「実質的な同一」は、
ポリペプチド配列が参照配列に比較して少なくとも50％
の配列一致を有し、核酸配列が参照配列に比較して少な
くとも70％の配列一致を有する、ポリペプチド配列また
はヌクレオチド配列の特徴を表す。配列一致の％は、参
照配列の合計35％未満である小さな欠失または付加を除
いて計算される。参照配列は、より大きな配列のサブセ
ット、例えば完全なＤ遺伝子であってもよい；しかしな
がら、参照配列はポリヌクレオチドの場合長さが少なく
とも８ヌクレオチドであり、ポリペプチドの場合長さが
少なくとも３アミノ酸残基である。典型的には、参照配
列は少なくとも８〜12ヌクレオチドまたは少なくとも３
〜４アミノ酸であり、好ましくは12〜15ヌクレオチドも
しくはそれ以上または少なくとも５アミノ酸である。
【００７４】ここで使用する用語「実質的な相同」は、
ポリペプチド配列が参照配列に対して少なくとも80％の
相同性を有する、ポリペプチド配列の性質を表す。配列
相同性の％は、同一アミノ酸または位置保存性アミノ酸
置換を相同であるとして数えることにより算出される。
位置保存性アミノ酸置換は、単一ヌクレオチド置換から
生じ得るものである。単一ヌクレオチド置換により最初
のアミノ酸のコドンと二番目のアミノ酸のコドンが異な
り得る場合、最初のアミノ酸が二番目のアミノ酸と置き
換えられる。例えば、配列-Lys-Glu-Arg-Val- は配列 -
Asn-Asp-Ser-Val-と実質的に相同である。何故なら、コ
ドン配列 -AAA-GAA-AGA-GUU-は、わずか３つの置換変異
（２つの元のコドンのうちの３つに単一ヌクレオチド置
換）を導入することによって -AAC-GAC-AGC-GUU-に変異
せしめることができるからである。参照配列はより大き
な配列のサブセット、例えば完全なＤ遺伝子であっても
よい；しかしながら、参照配列は長さが少なくとも４ア
ミノ酸残基である。典型的には参照配列は少なくとも５
アミノ酸であり、好ましくは６アミノ酸またはそれ以上
である。
【００７５】一次レパートリー 重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子をコードするＤＮ
Ａを作製する方法は、主としてＢ細胞を発達させること
に存する。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの結
合前、Ｖ，Ｄ，Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメント
は、大部分、一次レパートリーＢ細胞の前駆体中にＶ，
Ｄ，ＪおよびＣ遺伝子セグメントのクラスターとして見
つかる。通常、重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントの全
てが単一の染色体上に比較的近くに密接して置かれてい
る。様々な免疫グロブリン遺伝子セグメントの組換え前
のそのようなゲノムＤＮＡは、本明細書中「再配列され
ていない」ゲノムＤＮＡと呼称される。Ｂ細胞分化の間
に、Ｖ，Ｄ，Ｊ（または軽鎖遺伝子の場合はＶとＪの
み）の適当なファミリーメンバーのいずれか１つの遺伝
子セグメントが組み換えられて機能的に再配列された重
鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を形成する。
【００７６】そのような機能的再配列は、機能的な可変
領域をコードするＤＮＡを形成する可変領域セグメント
の再配列である。この遺伝子セグメント再配列過程は連
続的であると思われる。最初に、重鎖Ｄ−Ｊ接合が作ら
れ、次いで重鎖Ｖ−ＤＪ接合と軽鎖Ｖ−Ｊ接合が作られ
る。軽鎖および／または重鎖中の機能的可変領域のこの
初期形態をコードするＤＮＡは、「機能的に再配列され
たＤＮＡ」または「再配列されたＤＮＡ」と呼ばれる。
重鎖の場合、そのようなＤＮＡは「再配列された重鎖Ｄ
ＮＡ」と呼ばれ、そして軽鎖の場合、そのようなＤＮＡ
は「再配列された軽鎖ＤＮＡ」と呼ばれる。本発明のト
ランスジーンの機能的再配列を記述するためにも同様な
用語が使われる。
【００７７】機能的な重鎖および軽鎖可変領域を形成す
るための可変領域遺伝子セグメントの組換えは、組換え
応答能のあるＶ，ＤおよびＪセグメントに隣接する組換
えシグナル配列（ＲＳＳ）により媒介される。組換えを
指令するのに必要且つ十分なＲＳＳは、二分子対称ヘプ
タマー、高ＡＴノナマー、および12塩基対または23塩基
対のいずれかの中断スペーサー領域を含んで成る。それ
らのシグナルは、Ｄ−Ｊ（またはＶ−Ｊ）組換えを行い
そして機能的に相互交換可能である異なる遺伝子座およ
び種の間で保存されている。Oettinger ら(1990), Scie
nce, 248, 1517-1523およびその中に引用された参考文
献を参照のこと。
【００７８】配列 CACAGTGまたはその類似体を含んで成
るヘプタマーの後に非保存性配列のスペーサー、次いで
配列 ACAAAAACCまたはその類似体を有するノナマーが存
在する。それらの配列は、各ＶおよびＤ遺伝子セグメン
トのＪ側、即ち下流側上に見つかる。生殖細胞型たおよ
びＪ遺伝子セグメントの直前に、再び２つの組換えシグ
ナル配列があり、最初にノナマーそして非保存性配列に
より隔てられて次にヘプタマーがある。ＶL ，ＶH また
はＤセグメントの後ろのヘプタマーおよびノナマー配列
は、それらが組み換わるＪL , ＤまたはＪH セグメント
の前方のものと相補的である。ヘプタマーとノナマー配
列との間のスペーサーは12塩基対の長さかまたは22〜24
塩基対の長さかのいずれかである。
【００７９】Ｖ，ＤおよびＪセグメントの再配列に加え
て、軽鎖のＶセグメントとＪセグメントとの間および重
鎖のＤセグメントとＪセグメントとの間の可変的組換え
によって、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の一次レパー
トリーにおいて更なる多様性が生まれる。そのような様
々な組換えは、そのようなセグメントが結合する正確な
場所の変位（ずれ）によって生成される。軽鎖における
そのようなずれは、典型的にはＶ遺伝子セグメントの最
後のコドンの内部およびＪセグメントの最初のコドンの
内部に起こる。同様な結合のずれは、重鎖染色体上では
ＤセグメントとＪH セグメントとの間に起こり、10ヌク
レオチドほどの多数に及ぶことがある。更に、Ｄセグメ
ントとＪH セグメントとの間およびＶH セグメントとＤ
セグメントとの間に、ゲノムＤＮＡによりコードされな
い幾つかのヌクレオチドが挿入されることがある。それ
らのヌクレオチドの付加はＮ領域多様性として知られて
いる。
【００８０】ＶＪおよび／またはＶＤＪ再配列の後、再
配列された可変領域遺伝子セグメントおよび再配列され
た可変領域の下流に置かれた１または複数の定常領域遺
伝子セグメントの転写は、一次ＲＮＡ転写物を生成し、
これが適当なＲＮＡスプライシングを受けると、全長の
重鎖または軽鎖免疫グロブリンをコードするmRNAを生じ
る。そのような重鎖および軽鎖は、Ｂ細胞の経膜領域中
への免疫グロブリンの挿入および／またはＢ細胞からの
分泌を行うリーダー配列を含む。このシグナル配列をコ
ードするＤＮＡは、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可
変領域を形成するのに使うＶセグメントの第一エクソン
の内部に含まれる。コードされる免疫グロブリン重鎖お
よび軽鎖ポリペプチド（これは互いとの適切な会合によ
って抗体分子を形成する）を生成するmRNAの翻訳を調節
するためにmRNA中に適当な調節配列も存在する。
【００８１】可変領域遺伝子セグメント中のそのような
再配列およびそのような連結中に起こり得る可変的組換
えの最終結果は、一次抗体レパートリーの生成である。
一般に、この段階まで分化された各Ｂ細胞は、単一の一
次レパートリー抗体を産生する。この分化過程の間に、
機能的に再配列されたIg遺伝子内に含まれるもの以外の
遺伝子セグメントの機能的再配列を抑制する細胞現象が
起こる。二倍体Ｂ細胞がそのような単一特異性を維持す
る過程は、対立遺伝子排除と呼ばれる。
【００８２】二次レパートリー 一次レパートリーを含んで成る配列の組の中からの免疫
グロブリンを発現するＢ細胞クローンは、外来抗原に応
答させるのにすぐに利用できる。単純なＶＪおよびＶＤ
Ｊ結合により生じる限定された多様性のため、いわゆる
一次応答によって産生される抗体は比較的低い親和性の
ものである。２つの異なる型のＢ細胞がこの初期応答を
作成する：一次抗体形成細胞の前駆体および二次レパト
リーＢ細胞の前駆体〔Lintonら、Cell, 59:1049-1059
(1989) 〕。最初の型のＢ細胞は或る種の抗原に応答し
てIgM 分泌性形質細胞に成熟する。他方のＢ細胞は、Ｔ
細胞依存性成熟過程に入ることにより、抗原への初期暴
露に応答する。
【００８３】抗原により感作されたＢ細胞クローンのＴ
細胞依存性成熟の間に、細胞表面上の抗体分子の構造が
２つの経路で変化する。第一は、定常領域が非IgＭサブ
タイプにスイッチし、そして可変領域の配列が多数の単
一アミノ酸置換により変更されて一層高い親和性の抗体
分子を生成することができる。前に指摘したように、Ig
重鎖または軽鎖の各可変領域は、抗原結合領域を含む。
二次応答の間の体細胞突然変異は、アミノ酸および核酸
配列決定により、３つの相補性決定領域（CDR1, CDR2お
よびCDR3；これは超可変領域１，２または３とも呼ばれ
る）を含むＶ領域の至るところで起こることが決定され
ている〔Kabatら、Sequences of Proteins of Immunolo
gical Interest (1991) U.S. Department of Health an
d Human Services, Washington, DC ；これは参考とし
て本明細書中に組み込まれる〕。CDR1とCDR2は可変遺伝
子セグメント内部に位置し、一方CDR3は大部分がＶ遺伝
子セグメントとＪ遺伝子セグメントの間またはＶ，Ｄお
よびＪ遺伝子セグメントの間の組換えの結果である。
【００８４】CDR1, 2 または3 を構成しない可変領域の
部分は、一般に、FR1, FR2, FR3 およびFR4 と名付けら
れたフレームワーク領域と呼ばれる。図１を参照のこ
と。高度突然変異の間に、再配列されたＤＮＡが変異さ
れて異なるIg分子を有する新しいクローンを生じる。外
来抗原に対して一層高い親和性を有するそれらのクロー
ンがヘルパーＴ細胞によって選択的に増大されて、発現
抗体の親和力成熟を引き起こす。クローン選択は、典型
的にはCDR1, CDR2および／またはCDR3領域中に新規変異
を含むクローンの発現をもたらす。しかしながら、抗原
結合領域の特異性および親和性に影響を及ぼすようなそ
れらの領域の外側の変異も起こる。
【００８５】異種抗体を産生することができるトランス
ジェニック非ヒト動物 本発明の１観点では、トランスジェニック非ヒト動物
は、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリントランス
ジーン（後述）を非ヒト動物の接合子または初期胚中に
導入することにより製造される。本発明に有用である非
ヒト動物は、一般に、免疫グロブリン遺伝子セグメント
を再配列して一次抗体応答を生ぜしめることができる任
意の哺乳類を包含する。そのような非ヒトトランスジェ
ニック動物としては、例えば、トランスジェニックブ
タ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウ
サギ、トランスジェニックウシ、および当業界で既知で
ある他のトランスジェニック動物種、特に哺乳動物種が
挙げられる。特に好ましい非ヒト動物はマウスまたは齧
歯類の他のメンバーである。
【００８６】しかしながら、本発明はマウスの使用に限
定されない。むしろ、一次および二次抗体応答を開始す
ることができる任意の非ヒト哺乳動物を使うことができ
る。そのような動物としては、非ヒト霊長類、例えばチ
ンパンジー、ウシ、ヒツジおよびブタの種、齧歯科の他
のメンバー、例えばラット、並びにウサギおよびモルモ
ットが挙げられる。特に好ましい動物はマウス、ラッ
ト、ウサギおよびモルモットであり、最も好ましくはマ
ウスである。
【００８７】本発明の一態様では、ヒトゲノム由来の様
々な遺伝子セグメントが再配列されていない形で重鎖お
よび軽鎖トランスジーンに使われる。この態様では、そ
のようなトランスジーンがマウスに導入される。軽鎖お
よび／または重鎖トランスジーンの再配列されていない
遺伝子セグメントは、マウスゲノム中の内因性免疫グロ
ブリン遺伝子セグメントと識別可能である、ヒト種に固
有のＤＮＡ配列を有する。それらは生殖細胞やＢ細胞か
ら成らない体細胞では再配列されていない形態でそして
Ｂ細胞では再配列された形態で容易に検出することがで
きる。
【００８８】本発明の別の態様では、トランスジーン
は、再配列された重鎖および／または軽鎖免疫グロブリ
ントランスジーンを含んで成る。そのようなトランスジ
ーンの機能的に再配列されたＶＤＪまたはＶＪセグメン
トに相当する特定セグメントは、マウス中の内因性免疫
グロブリン遺伝子セグメントから明らかに識別可能であ
る免疫グロブリンＤＮＡ配列を含む。
【００８９】そういったＤＮＡ配列の相違は、マウスＢ
細胞によりコードされるアミノ酸配列に比較するとその
ようなヒト免疫グロブリントランスジーンによりコード
されるアミノ酸配列にも反映される。よって、ヒト免疫
グロブリン遺伝子セグメントによりコードされる免疫グ
ロブリンエピトープに特異的な抗体を使って、本発明の
トランスジェニック非ヒト動物において、ヒト免疫グロ
ブリンアミノ酸配列を検出することができる。
【００９０】ヒトまたは他の種由来の再配列されていな
いトランスジーンを含有するトランスジェニックＢ細胞
は、適当な遺伝子セグメントを機能的に組換えると、機
能的に再配列された軽鎖および重鎖可変領域を形成す
る。そのような再配列されたトランスジーンによりコー
ドされる抗体は、本発明を実施するのに用いる非ヒト動
物中で通常遭遇するものとは異種であるＤＮＡおよび／
またはアミノ酸配列を有することは容易に明らかであろ
う。
【００９１】再配列されていないトランスジーン 本明細書中で使用する時、「再配列されていない免疫グ
ロブリン重鎖トランスジーン」は、少なくとも１つの可
変遺伝子セグメント、１つの多様性遺伝子セグメント、
１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝
子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。前記重
鎖トランスジーンの各遺伝子セグメントは、前記トラン
スジーンが導入される非ヒト動物から成らない種の免疫
グロブリン重鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡか
ら誘導されるか、またはそれに相当する配列を有する。
【００９２】同様に、本明細書中で使用する時、「再配
列されていない免疫グロブリン軽鎖トランスジーン」
は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連
結遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの定常領域遺
伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。ここ
で、前記軽鎖トランスジーンの各遺伝子セグメントは、
前記軽鎖トランスジーンが導入される非ヒト動物から成
らない種の免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントをコー
ドするＤＮＡから誘導されるか、またはそれに相当する
配列を有する。
【００９３】本発明のこの観点でのそのような重鎖およ
び軽鎖トランスジーンは、再配列されていない形態で上
述の遺伝子セグメントを含有する。即ち、重鎖トランス
ジーン中のＶ，ＤおよびＪセグメントの間および軽鎖ト
ランスジーン中のＶとＪセグメントの間には、適当な組
換えシグナル配列（ＲＳＳ）が置かれる。加えて、その
ようなトランスジーンは、定常領域遺伝子セグメントを
ＶＪまたはＶＤＪ再配列された可変領域と結合するため
の適当なＲＮＡスプライシングシグナルも含む。
【００９４】複数のＣ領域遺伝子セグメント、例えばヒ
トゲノムからのＣμおよびＣγ1 を含む重鎖トランスジ
ーン内でのイソタイプスイッチを促進するために、各定
常領域遺伝子セグメントの上流で且つ可変領域遺伝子セ
グメントの下流に、免疫グロブリンクラススイッチ、例
えばIgＭからIgＧへのクラススイッチを考慮した前記定
常領域間の組換えを可能にするため、下記に説明するよ
うな「スイッチ」領域が組み込まれる。そのような重鎖
および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、可変領域
遺伝子セグメントの上流に置かれたプロモーター領域を
含む転写調節配列（典型的にはTATAモチーフを含む）も
含有する。
【００９５】プロモーター領域は、下流配列に作用可能
に連結されると該下流配列の転写を指令することができ
るＤＮＡ配列として大体定義することができる。プロモ
ーターは、効率的転写を指令するために連結された追加
のシス作用性配列の存在を必要とすることがある。更に
好ましくは、繁殖不能性転写物の転写に関係する他の配
列が含まれる。繁殖不能性転写物の発現に関係する配列
の例は、Rothman ら、Intl. Immunol. 2: 621-627 (19
90) ; Reidら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:840-844
(1989) ; Stavnezer ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:7704-7708 (1988) および Millsら、Nucl. Acids
Res. 18:7305-7316 (1991) （この各々は参考として本
明細書中に組み込まれる）を包含する、発表文献中に見
つけることができる。
【００９６】それらの配列は、典型的にはスイッチ領域
のすぐ上流の少なくとも約50 bp 、好ましくはスイッチ
領域の上流の少なくとも約200 bp、より好ましくはスイ
ッチ領域の少なくとも約200 〜1000 bp またはそれ以上
を含む。適当な配列はヒトＳγ1,Ｓγ2,Ｓγ3,Ｓγ4,Ｓ
α1,Ｓα2 およびＳεスイッチ領域のすぐ上流に存在す
るが、ヒトＳγ1 およびＳγ3 スイッチ領域のすぐ上流
の配列が好ましい。それに代えて、又はそれと組合わせ
て、ネズミＩｇスイッチ配列を用いることができる。ト
ランスジェニック非−ヒト動物と同じ種のＩｇスイッチ
配列を用いるのが、しばしば有利である。特に、インタ
ーフェロン（ＩＦＮ）誘導性転写調節要素、例えばＩＦ
Ｎ誘導性エンハンサーがトランスジーンスイッチ配列の
すぐ上流に含まれるのが好ましい。
【００９７】プロモーターに加えて、主にＢ系列細胞中
で機能する他の調節配列が使われる。例えば、軽鎖トラ
ンスジーン上の好ましくはＪセグメントと定常領域遺伝
子セグメントとの間に置かれた軽鎖エンハンサー配列
は、トランスジーンの発現を増強し、それによって対立
遺伝子排除を促進するために使われる。重鎖トランスジ
ーンの場合、調節エンハンサーも使われる。そのような
調節配列は、トランスジーンの転写および翻訳を最大に
し、その結果対立遺伝子排除を誘導しそして比較的高い
レベルのトランスジーン発現を提供するために用いられ
る。
【００９８】上述のプロモーターおよびエンハンサー調
節配列は包括的に記載されているけれども、そのような
調節配列は非ヒト動物に対して異種であることができ、
異種トランスジーン免疫グロブリン遺伝子セグメントが
得られるゲノムＤＮＡから誘導することができる。ある
いは、そのような調節遺伝子セグメントは、重鎖および
軽鎖トランスジーンを含む、非ヒト動物または密接に関
連した種のゲノム中の対応する調節配列から誘導され
る。
【００９９】好ましい態様では、遺伝子セグメントはヒ
トから誘導される。そのような重鎖および軽鎖トランス
ジーンを含有するトランスジェニック非ヒト動物は、そ
のような動物に投与される特異抗原に対してIg介在型免
疫応答を開始することができる。そのような動物中では
異種ヒト抗体を産生することのできるＢ細胞が産生され
る。不死化後、および適当なモノクローナル抗体（Mab
）、例えばハイブリドーマの選択後、治療用ヒトモノ
クローナル抗体の源が提供される。そういったヒトMab
は、ヒトに療法的に投与した時に実質的に減少された免
疫原性を有する。
【０１００】好ましい態様はヒト遺伝子セグメントを含
む重鎖および軽鎖トランスジーンの作製を開示するけれ
ども、本発明はそれに限定されない。この点に関して
は、本明細書中に記載される教示は、ヒト以外の種から
の免疫グロブリン遺伝子セグメントの使用に合わせて容
易に改変できると理解すべきである。例えば、本発明の
抗体によるヒトの療法的処置に加えて、適切な遺伝子セ
グメントによりコードされた療法的抗体を用いて獣医科
学において使用するためのモノクローナル抗体を生成せ
しめることができる。
【０１０１】再配列されたトランスジーン 別の態様では、トランスジェニック非ヒト動物は、トラ
ンスジェニック動物の生殖細胞中に機能的に少なくとも
１つの再配列された異種重鎖免疫グロブリントランスジ
ーンを含有する。そのような動物は上述のような再配列
された重鎖トランスジーンを発現する一次レパートリー
Ｂ細胞を含有する。そのようなＢ細胞は、好ましくは、
抗原と接触すると体細胞突然変異を受け、該抗原に対し
て高い親和性を特異性を有する異種抗体を形成すること
ができる。前記再配列されたトランスジーンは、少なく
とも２つのＣH 遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関
連配列を含むだろう。
【０１０２】本発明はまた、重鎖および軽鎖トランスジ
ーンを有する生殖細胞を含み、前記トランスジーンのう
ちの一方が再配列された遺伝子セグメントを含み、他方
が再配列されていない遺伝子セグメントを含む、トラン
スジェニック動物にも関する。そのような動物では、重
鎖トランスジーンが少なくとも２つのＣH 遺伝子とイソ
タイプスイッチに必要な関連配列を有するだろう。
【０１０３】本発明は更に、本発明のトランスジーンに
おいて使うことができる合成可変領域遺伝子セグメント
レパートリーを作製する方法にも関する。該方法は、免
疫グロブリンＶセグメントＤＮＡの集団を作製すること
を含んで成る。ここで前記ＶセグメントＤＮＡの各々は
免疫グロブリンＶセグメントをコードし、そして各末端
に制限エンドヌクレアーゼの開裂認識部位を含む。免疫
グロブリンＶセグメントＤＮＡの前記集団は、その後、
鎖状に連結されて合成免疫グロブリンＶセグメントレパ
ートリーを形成する。そのような合成可変領域重鎖トラ
ンスジーンは、少なくとも２つのＣH 遺伝子とイソタイ
プスイッチに必要な関連配列を有するだろう。
【０１０４】イソタイプスイッチ Ｂリンパ球の発達過程において、該細胞は、生産的に再
配列されたＶH およびＶL 領域によって決定される結合
特異性を有するIgＭを最初に産生する。続いて、各Ｂ細
胞とその子孫の細胞が同じＬおよびＨ鎖Ｖ領域を有する
抗体を合成するが、それらはＨ鎖のイソタイプをスイッ
チすることができる。
【０１０５】μまたはδ定常領域の使用は、大部分は、
IgＭおよびIgＤを単一細胞中で同時発現できるようにす
る、交互スプライシングによって決定される。その他の
重鎖イソタイプ（γ，αおよびε）は、遺伝子再配列現
象がＣμおよびＣδエクソンを欠失させた後で本質的に
のみ発現される。この遺伝子再配列過程はイソタイプス
イッチと呼ばれ、典型的には各重鎖遺伝子（δを除く）
のすぐ上流に置かれたいわゆるスイッチセグメントの間
での組換えによって起こる。
【０１０６】個々のスイッチセグメントは長さが 2〜10
kb であり、主として短い反復配列から成る。組換えの
正確な位置は個々のクラススイッチ現象ごとに異なる。
cDNA由来のＣH プローブを用いるサザンブロット法また
は溶液ハイブリダイゼーション速度論を使った実験は、
スイッチが細胞からのＣH 配列の消失に関係し得ること
を確証した。
【０１０７】μ遺伝子のスイッチ（Ｓ）領域、Ｓμは、
コード配列の約１〜２kb５′側に位置し、そして (GAGC
T)n (GGGGT) の形の配列の多数の縦列反復から成る。こ
こでｎは通常２〜５であるが、17ほどの大きさに及ぶこ
とができる。〔T. Nikaidoら、Nature, 292: 845-848(1
981)を参照のこと。〕 他のＣH 遺伝子の５′にも、数キロ塩基対に及ぶ同様な
内部反復性スイッチ配列が見つかっている。Ｓα領域は
配列決定されており、縦列に反復した80 bp の相同性単
位から成ることが判明した。一方、Ｓ2a，Ｓ2bおよびＳ
3 は全て、互いに非常に類似している反復した49 bp の
相同性単位を含む〔P. Szurek ら、J. Immunol, 135: 6
20-626 (1985) およびT. Nikaidoら、J. Biol. Chem.
257:7322- 7329 (1982) を参照のこと；これらは参考と
して本明細書中に組み込まれる〕。全ての配列決定され
たＳ領域は、Ｓμ遺伝子の基本的反復配列であるペンタ
マーGAGCT およびGGGGT の多数の存在を含む〔T. Nikai
doら、J. Biol. Chem. 257: 7322-7329 (1982) ；これ
は参考として本明細書中に組み込まれる〕；他のＳ領域
では、それらのペンタマーはＳμのようには正確に縦列
に反復されていないが代わりに大きな反復単位中に埋も
れている。Ｓγ1 領域は追加の高次構造を有し、即ち、
２つの直接反復配列が49 bp の縦列反復の２つのクラス
ターの各々に隣接する〔M.R.Mowattら、J. Immunol. 13
6: 2674-2683 (1986) を参照のこと；これは引用して本
明細書中に組み込まれる〕。
【０１０８】ヒトＨ鎖遺伝子のスイッチ領域はそれらの
マウス同族体に非常に類似していることがわかってい
る。実際、ＣH 遺伝子の５′側のヒトクローンとマウス
クローンの間の類似性はＳ領域に限られることがわかっ
ており、これは、それらの領域の生物学的重要性を確証
する事実である。μ遺伝子とα遺伝子の間のスイッチ組
換えは複合Ｓμ−Ｓα配列をもたらす。典型的には、組
換えが常に起こるような特異部位はＳμ領域中にも他の
Ｓ領域中にも存在しない。
【０１０９】一般に、Ｖ−Ｊ組換えの酵素的機構とは異
なり、スイッチ機構は、明らかに生殖細胞Ｓ前駆体の反
復相同領域の種々の整列を適応させることができ、次い
で該配列を異なる位置で一直線上に連結することができ
る。〔T.H. Rabbitts ら、Nucleic Acids Res. 9: 450
9-4524 (1981) およびJ. Ravetchら、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 77:6734-6738 (1980) を参照のこと；こ
れらは参考として本明細書中に組み込まれる。〕 特定のイソタイプへのスイッチを選択的に活性化する機
構の詳細は未知である。リンホカインやサイトカインの
ような外因性影響物質はイソタイプ特異的レコンビナー
ゼを増加調節するかもしれないが、この酵素機構はあら
ゆるイソタイプへのスイッチを触媒し、そして特異性が
この酵素機構の標的を特定のスイッチ領域に向けること
にある可能性もある。
【０１１０】Ｔ細胞由来のリンホカインIL-4および IFN
γは、幾つかのイソタイプの発現を特異的に促進するこ
とが証明されている：IL-4はIgＭ，IgＧ2a, IgＧ2bおよ
びIgＧ3 発現を減少させ、IgＥおよびIgＧ1 発現を増加
させる； IFNγはIgＧ2a発現を選択的に刺激し拮抗する
一方、IgＥとIgＧ1 発現の増加を誘導する〔Coffman
ら、J. Immunol. 136: 949-954 (1986) およびSnapper
ら、Science 236: 944-947(1987)；これらは参考とし
て本明細書中に組み込まれる〕。
【０１１１】スイッチに関するＴ細胞作用に関係する実
験のほとんどは、特定のスイッチ組換えを有する細胞に
おいて観察される増加が事前スイッチされた細胞または
事前傾倒された細胞の選択を反映し得る可能性を無視す
ることができなかった。しかし、最もありそうな説明は
リンホカインが実際にスイッチ組換えを促進するという
ものである。
【０１１２】クラススイッチの誘導は、スイッチセグメ
ントの上流で始まる繁殖不能転写物(stelile transcrip
t)に関係があるらしい〔Lutzekerら、Mol. Cell Biol.
8:1849 (1988) ; Stavnezer ら、Proc. Natl．Acad. Sc
i. USA 85:7704 (1988) ; EsserおよびRadbruch, EMBO
J. 8: 483 (1989) ; Bertonら、Proc. Natl. Acad.Sc
i. USA 86:2829 (1989) ; Rothmanら、Int. Immunol.
2:621 (1990)；これらの各々は参考として本明細書中に
組み込まれる〕。例えば、観察されるIL-4によるγ１繁
殖不能転写物の誘導および IFNγによる阻害は、IL-4が
Ｂ細胞中でのγ１へのクラススイッチを促進し、 IFNγ
がγ１発現を阻害するという観察結果と一致する。従っ
て、繁殖不能転写物の転写に影響を及ぼす調節配列の包
含は、イソタイプスイッチの速度にも影響を及ぼし得
る。例えば、特定の繁殖不能転写物の転写を増加せしめ
ることが、典型的には近隣のスイッチ配列を伴うイソタ
イプスイッチ組換えの頻度を増加させると期待できる。
【０１１３】それらの理由により、トランスジーンがイ
ソタイプに使用する予定の各スイッチ領域の約１〜２ k
b 上流以内に転写調節配列を含むことが望ましい。それ
らの転写調節配列は、好ましくはプロモーターとエンハ
ンサー要素を含み、より好ましくはスイッチ領域と生来
関連している（即ち生殖細胞配置で存在する）５′隣接
（即ち上流）領域を含む。この５′隣接領域は、典型的
には長さが少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは長さ
が少なくとも約200 ヌクレオチド、より好ましくは少な
くとも500 〜1000ヌクレオチドである。
【０１１４】１つのスイッチ領域からの５′隣接配列を
トランスジーン構成物用の別のスイッチ領域に作用可能
に連結させることができる（例えば、ヒトＳγ1 スイッ
チからの５′隣接配列をＳα1 スイッチのすぐ上流に融
合させることができ；ネズミＳγ１フランキング領域を
ヒトγ１スイッチ配列の隣りに移植することができ；あ
るいはネズミＳγ１スイッチをヒトγ１コード領域に移
植することができる）けれども、或る態様では、トラン
スジーン構成物中に含まれる各スイッチ領域が、天然に
存在する生殖細胞配置においてすぐ上流に存在する５′
隣接配列を有することが好ましい。
【０１１５】モノクローナル抗体 モノクローナル抗体は、当業者にとっては周知のさまざ
まな技術によって得ることができる。簡単に言うと、望
ましい抗原で免疫化された動物からの脾細胞を、一般に
は骨髄腫細胞との融合によって不死化させる。（Kohler
及びMilstein,Eur. J. Immunol., ６； 511-519 (197
6）を参照のこと）。不死化の代替的方法としては、エ
プスタイン−バーウイルス、オンコ遺伝子又はレトロウ
イルスでの形質転換、又はその他の当該技術分野におい
て周知の方法が含まれる。
【０１１６】単一の不死化された細胞から発生したコロ
ニーは、抗原に対する望ましい特異性及び親和力を有す
る抗体の産生についてスクリーニングされ、かかる細胞
により産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動
物宿主の腹腔内への注入を含むさまざまな技術によって
増強できる。免疫グロブリンを産生するための動物の免
疫化、モノクローナル抗体の産生；プローブとしての使
用を目的とした免疫グロブリンの標識付け；イムノアフ
ィニティ精製；及び免疫学的検定法を含め、これらの技
術分野で有効なさまざまな技法が、例えば、Harlow及び
Lane、抗体：その研究室マニュアル、Cold Spring Harb
or, New York (1988）の中で論述されている。
【０１１７】トランスジェニック一次レパートリー Ａ．ヒト免疫グロブリン遺伝子座 トランスジーン機能のための重要な必要条件は、広範囲
の抗原に対して二次免疫応答を開始させるのに十分な程
度に多様である一次抗体レパートリーの作製である。再
配列された重鎖遺伝子は、シグナルペプチドエクソン、
可変領域エクソン、および各々が数個のエクソンにより
コードされる多ドメイン定常領域の縦列整列領域から成
る。定常領域遺伝子の各々は異なる免疫グロブリンクラ
スの定常部分をコードする。Ｂ細胞発達の間に、定常領
域に近いＶ領域が欠失されて新規重鎖クラスの発現をも
たらす。各重鎖クラスについては、ＲＮＡスプライシン
グの別パターンが経膜型と分泌型の両方の免疫グロブリ
ンをもたらす。
【０１１８】ヒト重鎖遺伝子座は、2 Mbにわたる約200
個のＶ遺伝子セグメント（今回のデーターは約50−100
Ｖ遺伝子セグメントの存在を支持している。）、約40 k
b にわたる約30個のＤ遺伝子セグメント、3 kbの範囲内
に密集した６個のＪセグメント、および約300 kbにわた
る９個の定常領域遺伝子セグメントから成ると予想され
る。全遺伝子座は、染色体14の長い方の腕の遠位部分約
2.5 Mbに及ぶ（図４）。
【０１１９】Ｂ．遺伝子断片トランスジーン １．重鎖トランスジーン 好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖および軽鎖トラ
ンスジーンは、ヒト由来の再配列されていないゲノムＤ
ＮＡを含んで成る。重鎖の場合、好ましいトランスジー
ンは670 〜830 kbの長さを有する NotＩ断片を含んで成
る。この断片の長さは、３′制限部位が実際にマッピン
グされていないため、不明瞭である。しかしながら、α
１とψα遺伝子セグメントとの間にあることが知られて
いる。この断片は、６つの既知ＶH ファミリーの全部の
メンバー、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、並びにμ，
δ，γ３，γ１およびα１定常領域を含む。Bermanら、
EMBOJ. 7:727-738 (1988)。このトランスジーンを含
有するトランスジェニックマウス系は、Ｂ細胞の発達に
必要とされる重鎖クラス（IgＭ）を正しく発現し、そし
てほとんどの抗原に対して二次応答を開始せしめのに十
分な程多数のレパートリーと共に、少なくとも１つのス
イッチされた重鎖クラス（IgＧ1 ）を発現する。
【０１２０】２．軽鎖トランスジーン ヒト軽鎖遺伝子座からの必要な遺伝子セグメントおよび
調節配列を全て含有するゲノム断片を同様に作製するこ
とができる。そのような構成物は本実施例中に記載のよ
うにして作製される。
【０１２１】Ｃ．生体内組換えにより細胞内的に作製さ
れるトランスジーン 単一ＤＮＡ断片上の重鎖遺伝子座の全部または一部分を
単離する必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖
遺伝子座からの670-830 kp NotＩ断片は、トランスジー
ン形成(transgenesis)の間に非ヒト動物の生体内で形成
させることができる。そのような生体内トランスジーン
作製は、２以上の重複するＤＮＡ断片を非ヒト動物の胎
児性核に導入することにより行われる。ＤＮＡ断片の重
複部分は、実質的に相同であるＤＮＡ配列を有する。胎
児性核内に含まれるレコンビナーゼに暴露されると、重
複しているＤＮＡ断片が適切な方向において相同的に組
み換わって670-830 kbの NotＩ重鎖断片を形成する。
【０１２２】生体内トランスジーン作製は、そのサイズ
のために現存の技術による作製または操作が困難である
かまたは不可能である多数の免疫グロブリントランスジ
ーンを形成せしめるのに使うことができると理解すべき
である。例えば、生体内トランスジーン作製は、ＹＡＣ
ベクター〔MurrayおよびSzostak, Nature 305:189-19
3 (1983)〕により操作することができるＤＮＡ断片より
も大きい免疫グロブリントランスジーンを作製するのに
有用である。そのような生体内トランスジーン作製は、
トランスジェニック非ヒト動物から成らない種の実質的
に完全な免疫グロブリン遺伝子座を非ヒト動物中に導入
する場合にも使うことができる。
【０１２３】ゲノム免疫グロブリントランスジーンを形
成させることに加えて、実施例に記載の如く「小遺伝子
座」トランスジーンを形成させるのにも生体内相同組換
えを使うことができる。生体内トランスジーン作製を利
用する好ましい態様では、各々の重複するＤＮＡ断片
は、好ましくは第一のＤＮＡ断片の末端部分と第二のＤ
ＮＡ断片の末端部分の間で重複する実質的に相同なＤＮ
Ａ配列を有する。ＤＮＡ断片のそのような重複部分は、
好ましくは約500 bp〜約2000 bp、最も好ましくは1.0
kb〜2.0 kbを含む。生体内でトランスジーンを形成させ
るための重複ＤＮＡ断片の相同組換えは、1992年３月19
日に公開された「哺乳類細胞における相同性組換え（Ho
mologous Recombination in Mammalian Cells)と称する
PCT 公開WO 92/03917 に更に詳しく記載されている。
【０１２４】Ｄ．小遺伝子座トランスジーン 本明細書中で使用する時、「免疫グロブリン小遺伝子
座」なる用語は、通常は約150 kb未満、典型的には約25
〜100 kbのＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡ配列が少な
くとも１つの実質的不連続性（例えば、相同ゲノムＤＮ
Ａ配列に関して、通常は少なくとも約 2〜5 kb、好まし
くは10〜25 kb またはそれ以上の欠失）を有するよう
な、次のものを各々少なくとも１つ含むＤＮＡ配列を言
う：機能的可変（Ｖ）遺伝子セグメント、機能的連結
（Ｊ）領域セグメント、少なくとも１つの機能的定常
（Ｃ）領域遺伝子セグメント、および重鎖小遺伝子座の
場合には、機能的多様性（Ｄ）領域セグメント。軽鎖小
遺伝子座トランスジーンは、長さが少なくとも25 kb 、
典型的には50〜80 kb であるだろう。重鎖トランスジー
ンは、スイッチ領域に作用可能に連結された２つの定常
領域を有する、典型的には約70〜80 kb 、好ましくは少
なくとも約60 kb の長さであろう。更に、小遺伝子座の
個々の要素は好ましくは生殖細胞（ジャームライン）配
置にあり、そして小遺伝子座の該要素により完全にコー
ドされる多様な抗原特異性を有する機能的抗体分子を発
現するように、トランスジェニック動物の前駆体Ｂ細胞
において遺伝子再配列を受けることができる。更に、少
なくとも２つのＣH 遺伝子と必要なスイッチ配列とを含
んで成る重鎖小遺伝子座は、典型的には、異なる免疫グ
ロブリンクラスの機能的抗体分子が生成されるように、
イソタイプスイッチを受けることができる。そのような
イソタイプスイッチは、トランスジェニック非ヒト動物
内に存在するＢ細胞中で生体内で起こるか、またはトラ
ンスジェニック非ヒト動物から外植されたＢ細胞系列の
培養細胞中で起こり得る。
【０１２５】他の好ましい態様では、免疫グロブリン重
鎖および軽鎖トランスジーンはＶH，ＤおよびＪH 遺伝
子セグメントを各々１つまたは複数並びにＣH 遺伝子を
２つ以上含んで成る。適当なタイプの遺伝子セグメント
の少なくとも１つが小遺伝子座トランスジーンに組み込
まれる。重鎖トランスジーンのＣH セグメントに関して
は、トランスジーンが少なくとも１つのμ遺伝子セグメ
ントと、少なくとも１つの他の定常領域遺伝子セグメン
ト、より好ましくはγ遺伝子セグメント、最も好ましく
はγ３またはγ１遺伝子セグメントとを含むことが好ま
しい。この優先性は、コードされる免疫グロブリンのIg
Ｍ形とIgＧ形の間のクラススイッチおよび分泌形の高親
和性非IgＭ免疫グロブリンの産生を考慮したものであ
る。他の定常領域遺伝子セグメント、例えばIgＤ，IgＡ
およびIgＥの産生をコードするものも使うことができ
る。
【０１２６】当業者は、重鎖ＣH 遺伝子の発生の順序が
該ＣH 遺伝子の供与体として働く種の生殖細胞において
見つかる天然に存在する空間的順序とは異なるであろう
トランスジーンも作製するだろう。更に、当業者は、１
つの種の複数の個体からＣH 遺伝子を選択することがで
き（例えば、同種異系ＣH 遺伝子）、そしてイソタイプ
スイッチを受けることができる過剰のＣH 遺伝子として
前記遺伝子をトランスジーン中に組み込むことができ
る。次いで、結果として生じたトランスジーン非ヒト動
物は、或る態様では、トランスジーンＣH 遺伝子を得た
前記種に象徴されるアロタイプの全てを包含する様々な
クラスの抗体を生産することができる。
【０１２７】更にまた、当業者は、異なる種からＣH 遺
伝子を選択してトランスジーン中に組み込むことができ
る。各ＣH 遺伝子と共に機能的スイッチ配列が含まれる
が、使用するスイッチ配列は必ずしもＣH 遺伝子の隣に
天然に存在するものである必要はない。種間のＣH 遺伝
子組み合わせは、様々な種からのＣH 遺伝子に相当する
多様なクラスの抗体を産生することのできるトランスジ
ェニック非ヒト動物をもたらすだろう。種間ＣH トラン
スジーンを含有するトランスジェニック非ヒト動物は、
獣医学用のモノクローナルを産生するハイブリドーマを
作製するためのＢ細胞の源として働くことができる。
【０１２８】ヒトの重鎖Ｊ領域セグメントは、３kbのＤ
ＮＡ長さにおいて密集した６個の機能的Ｊセグメントと
３個の偽遺伝子を含んで成る。それが比較的小さいサイ
ズであることとそれらのセグメントがμ遺伝子およびδ
遺伝子の５′部分と一緒に単一の23 kb SFiI／SpeI断片
として単離できること〔Sadoら、Biochem. Biophys.Re
s. Commun.154:246-271 (1988)；これは参考として本明
細書中に組み込まれる〕を仮定すれば、小遺伝子座構成
物において全部のＪ領域遺伝子セグメントを使うことが
好ましい。更に、この断片はμ遺伝子とδ遺伝子の間の
領域に広がるため、μ発現に必要とされるシス結合した
３′調節要素の全部を含むことが適当である。
【０１２９】更に、この断片は完全なＪ領域を含むた
め、重鎖エンハンサーとμスイッチ領域を含む〔Mills
ら、Nature 306:809 (1983) ; Yancopoulosおよび Al
t, Ann.Rev. Immunol. 4:339-368 (1986)；これらは参
考として本明細書中に組み込まれる〕。それは、ＶＤＪ
結合を開始させて一次レパートリーＢ細胞を形成させる
転写開始部位も含む〔Yancopoulos およびAlt, Cell
40:271-281 (1985) ；これは参考として本明細書中に組
み込まれる〕。あるいは、23 kb SfiI/SpeI 断片の代わ
りに、Ｄ領域の一部を含む36 kb BssHII/SpeI 断片を使
うことができる。そのような断片の使用は、効率的Ｄ−
Ｊ結合を促進させる５′隣接配列の量を増加させる。
【０１３０】ヒトＤ領域は、縦列に結合した４または５
個の相同な9 kbの亜領域から成る〔Siebenlistら、Natu
re 294:631-635 (1981)〕。各亜領域は10個までの個々
のＤセグメントを含む。それらのセグメントの一部はマ
ッピングされており、それを図４に示す。２つの異なる
方策を使って小遺伝子座Ｄ領域を作製する。第一の方策
は、１つまたは２つの反復Ｄ亜領域を含む短いＤＮＡの
連続鎖の中に置かれたそれらのＤセグメントのみを使う
ものである。候補となるのは、12個の個々のＤセグメン
トを含む単一の15 kb 断片である。
【０１３１】ＤＮＡのこの断片は２つの連続するEcoRI
断片から成り、そして完全に配列決定されている〔Ichi
haraら、EMBO J. 7:4141-4150 (1988)〕。12のＤセグメ
ントが一次レパートリーに十分であろう。しかしなが
ら、Ｄ領域の分散性質があるとすれば、別の方策は、幾
つかの不連続Ｄ断片含有断片を一緒に連結して、より多
数のセグメントを有する一層小型のＤＮＡ断片を作製す
ることである。例えば、特徴的な隣接ノナマーまたはヘ
プタマー配列（前傾）の存在により、および文献への参
照により、追加のＤセグメント遺伝子を同定することが
できる。
【０１３２】重鎖小遺伝子座トランスジーンを作製する
のには、少なくとも１つ、好ましくは複数のＶ遺伝子セ
グメントが使われる。隣接配列を伴うまたは伴わない、
再配列されたまたは再配列されていないＶセグメント
は、「異種性抗体を生産することができるトランスジェ
ニック非−ヒト動物」（Transgenic Non-Human AnimalC
apable of Producing Heterologous Artibodies) と称
する。1992年３月19日に公開されたPCT 公開WO 92/0391
8 に記載の通りに単離することができる。
【０１３３】隣接配列を伴うまたは伴わない、再配列さ
れたまたは再配列されていないＶセグメント、Ｄセグメ
ント、ＪセグメントおよびＣ遺伝子は、1992年３月19日
に公開されたPCT 公開WO 92/03918 に記載の通りに単離
することができる。小遺伝子座軽鎖トランスジーンは、
ヒトλまたはκ免疫グロブリン遺伝子座から同様にして
作製することができる。すなわち、例えば、複数のＤＮ
Ａ断片、少なくとも２つ、３つまたは４つのＤＮＡ断片
から、Ｖ，Ｄ，Ｊおよび定常領域配列（各配列はヒト遺
伝子配列に実質的に相同である）をコードする、例えば
約75kbの、免疫グロブリン重鎖小遺伝子座トランスジー
ン構成物を形成せしめることができる。好ましくは、前
記配列は転写調節配列に作用可能に連結され、そして再
配列を受けることができる。２以上の適当に置かれた定
常領域配列（例えばμおよびγ）およびスイッチ領域で
は、スイッチ組換えも起こる。典型的な軽鎖トランスジ
ーン構成物は、1990年８月29日出願の同時係属出願 USS
N 07/574,748に記載の通りに、ヒトＤＮＡに実質的に相
同であり且つ再配列を受けることのできる複数のＤＮＡ
断片から同様に形成せしめることができる。
【０１３４】Ｅ．イソタイプスイッチを受けることがで
きるトランスジーン構成物 理想的には、クラススイッチを受けることになっている
トランスジーン構成物は、繁殖不能転写物を調節するの
に必要なシス作用性配列の全てを含むべきである。天然
に存在するスイッチ領域並びに上流のプロモーターおよ
び調節配列（例えばＩＦＮ誘導性要素）は、イソタイプ
スイッチを受けることができるトランスジーン構成物中
に含まれる好ましいシス作用性配列である。スイッチ領
域、好ましくはヒトγ１スイッチ領域のすぐ上流の少な
くとも約50塩基対、好ましくは少なくとも約200 塩基
対、より好ましくは少なくとも500 〜1000塩基対または
それ以上の配列が、スイッチ配列、好ましくはヒトγ１
スイッチ配列に作用可能に連結されるだろう。更に、ス
イッチ領域は、特定のスイッチ領域の隣に天然には存在
しないＣH 遺伝子の上流に（且つ近隣に）連結せしめる
ことができる。例えば、限定のつもりでないが、ヒトγ
１スイッチ領域をヒトα２ＣH 遺伝子の上流に連結して
もよく、またはマウスγ１スイッチ領域をヒトＣH 遺伝
子に連結してもよい。
【０１３５】トランスジェニックマウスにおいて非古典
的イソタイプスイッチ（例えばδ−関連欠失）を得るた
めの別法は、ヒトμ遺伝子に隣接する400 bpの直接反復
配列（σμおよびεμ）〔Yasui ら、Eur. J. Immunol.
19:1399 (1989)〕の包含を伴う。それらの二配列の間
の相同組換えはIgＤ型のみのＢ細胞においてμ遺伝子を
欠失せしめる。重鎖トランスジーンは、次の式によって
表すことができる： (VH ) x-(D) y-(JH ) z -(S D ) m -(C1) n -[(T)-
(SA ) p -(C2)]q 上式中、ＶH は重鎖可変領域遺伝子セグメントであり、
Ｄは重鎖Ｄ（多様性）領域遺伝子セグメントであり、Ｊ
H は重鎖Ｊ（連結）領域遺伝子セグメントであり、
【０１３６】ＳD はイソタイプスイッチが起こるような
Ｓa 受容体領域セグメントとの組換え現象に参加するこ
とのできる供与体領域セグメントであり、Ｃ1 はＢ細胞
発達において使われるイソタイプ（例えばμまたはδ）
をコードする重鎖定常領域遺伝子セグメントであり、Ｔ
は少なくともプロモーターを含有するシス作用性転写調
節領域セグメントであり、ＳA はイソタイプスイッチが
起こるような選択されたＳD 供与体領域セグメントとの
組換え現象に参加することのできる受容体領域セグメン
トであり、
【０１３７】Ｃ2 はμ以外のイソタイプ（例えばγ1 ，
γ2 ，γ3 ，γ4 ，α1 ，α2 ，ε）をコードする封鎖
定常領域遺伝子セグメントであり、ｘ，ｙ，ｚ，ｍ，
ｎ，ｐおよびｑは整数であり、ｘは１〜100 、ｎは０〜
10、ｙは１〜50、ｐは１〜10、ｚは１〜50、ｑは０〜5
0、ｍは０〜10である。典型的には、トランスジーンが
イソタイプスイッチを受けることができる時、ｑは少な
くとも１であり、ｍは少なくとも１であり、ｎは少なく
とも１であり、そしてｍはｎと等しいかまたはそれより
大きくなければならない。
【０１３８】ＶH ，Ｄ，ＪH ，ＳD ，Ｃ1 ，Ｔ，ＳA お
よびＣ2 セグメントは様々な種、好ましくは哺乳動物
種、より好ましくはヒトおよびマウス生殖細胞ＤＮＡか
ら選択することができる。ＶH セグメントは、ヒト生殖
細胞中に天然に存在するＶH セグメント、例えばＶH251
から選択することができる。典型的には、約２個のＶH
セグメント、好ましくは約４個、より好ましくは少なく
とも約10個のＶH セグメントが含まれる。
【０１３９】典型的には少なくとも１個のＤセグメント
が含まれるが、好ましくは少なくとも10個のＤセグメン
トが含まれ、態様によっては、10個以上のＤセグメント
が含まれる。幾つかの好ましい態様はヒトＤセグメント
を含む。典型的には少なくとも１個のＪH セグメントが
トランスジーンに含まれるが、約６個のＪH セグメント
を含むことが好ましく、幾つかの好ましい態様は約６個
以上のＪH セグメントを含み、非ヒトＪH セグメントを
１つも含まない。
【０１４０】ＳD セグメントは該トランスジーンのＳA
セグメントとの組換え現象に参加することができる供与
体領域である。古典的なイソタイプスイッチでは、ＳD
およびＳA 領域はＳμ，Ｓγ1 ，Ｓγ2 ，Ｓγ3 ，Ｓγ
4 ，Ｓα，Ｓα2 およびＳεといったスイッチ領域であ
る。好ましくは、スイッチ領域はマウスまたはヒトであ
り、より好ましくはＳD がヒトまたはマウスＳμであ
り、ＳA がヒトまたはマウスＳγ1 である。非古典的イ
ソタイプスイッチ（δ関連欠失）では、ＳD およびＳA
領域は、好ましくはヒトμ遺伝子に隣接する400 塩基対
の直接反復配列である。
【０１４１】Ｃ1 セグメントは、典型的にはμまたはδ
遺伝子であり、好ましくはμ遺伝子であり、より好まし
くはヒトまたはマウスμ遺伝子である。Ｔセグメント
は、典型的には天然に存在する（即ち生殖細胞）スイッ
チ領域に隣接する５′隣接配列を含む。Ｔセグメントは
典型的には長さが少なくとも約50ヌクレオチド、好まし
くは長さが少なくとも約200 ヌクレオチド、より好まし
くは長さが少なくとも500 〜1000ヌクレオチドである。
好ましくはＴセグメントは、生殖細胞配置においてヒト
またはマウススイッチ領域のすぐ上流に存在する５′隣
接配列である。前記Ｔセグメントが動物の生殖細胞に天
然に存在しないシス作用性転写調節配列（例えばウイル
スのエンハンサーおよびプロモーター、例えばSV40、ア
デノウイルス、および真核細胞に感染する他のウイルス
中に見つかるもの）を含んでもよいことは当業者にとっ
て明白である。
【０１４２】Ｃ2 セグメントは、典型的にはγ1 ，
γ2 ，γ3 ，γ4 ，α1 ，α2 またはεＣH 遺伝子であ
り、好ましくはそれらのイソタイプのヒトＣH 遺伝子で
あり、より好ましくはヒトγ1 またはγ3 遺伝子であ
る。様々な種からの下流（スイッチされる）イソタイプ
遺伝子としてマウスγ2aおよびγ2bを使ってもよい。重
鎖トランスジーンが免疫グロブリン重鎖小遺伝子座を含
む場合、該トランスジーンの全長は典型的には150 キロ
塩基対未満であろう。
【０１４３】一般に、該トランスジーンは、生来の重鎖
Ｉｇ遺伝子座以外のものであるだろう。例えば、不必要
な領域の欠失または他の種からの対応領域との置換が存
在するだろう。
【０１４４】Ｆ．Ｉｇトランスジーン中の機能的イソタ
イプスイッチを決定する方法 トランスジェニック非ヒト動物におけるイソタイプスイ
ッチの発生は、当業界で公知である任意の方法によって
同定することができる。好ましい態様としては次のもの
が挙げられ、それらは単独でまたは組み合わせて使用さ
れる。 1. δ以外の少なくとも１つのトランスジーン下流ＣH
遺伝子に相同である配列とトランスジーンＶH −ＤH −
ＪH 再配列された遺伝子に相同である隣接配列とを含有
するmRNA転写物の検出；そのような検出はノーザンハイ
ブリダイゼーション、Ｓ1 ヌクレアーゼ保護アッセイ、
ＰＣＲ増幅、cDNAクローニングまたはその他の方法によ
ることができる。
【０１４５】2. トランスジェニック動物の血清中の、
または該トランスジェニック動物のＢ細胞から作製した
ハイブリドーマ細胞の培養上清中の、下流ＣH 遺伝子に
よりコードされる免疫グロブリンタンパク質の検出。こ
こで免疫化学的方法により、そのようなタンパク質が機
能的可変領域を含んで成ることを証明することもでき
る。
【０１４６】3. トランスジェニック動物のＢ細胞から
のＤＮＡ中の、またはハイブリドーマ細胞からのゲノム
ＤＮＡ中の、該トランスジーン中のイソタイプスイッチ
の発生と一致するＤＮＡ再配列の検出。そのような検出
はサザンブロットハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増
幅、ゲノムクローニングまたは他の方法によって達成す
ることができる。
【０１４７】4. イソタイプスイッチの他の徴候、例え
ば繁殖不能転写物の産生、スイッチに関与する特徴的な
酵素の産生（例えば「スイッチレコンビナーゼ」）、あ
るいは現行技術によって検出、測定または観察され得る
他の徴候の同定。各々のトランスジェニック系列はトラ
ンスジーンの異なる組み込み部位とトランスジーン挿入
断片の潜在的に異なる縦列整列を表し、そしてトランス
ジーンと隣接ＤＮＡ配列の各々の異なる配置は遺伝子発
現に影響を与え得るため、高レベルのヒト免疫グロブリ
ン、特にIgＧイソタイプのものを発現し、且つ最少コピ
ー数の該トランスジーンを含有するマウスの系統を同定
しそれを使用することが好ましい。単一コピーのトラン
スジェニック動物は、起こり得る不完全な対立遺伝子発
現の問題を最少にする。
【０１４８】トランスジーンは典型的には宿主染色体Ｄ
ＮＡ中、最も普通には生殖細胞ＤＮＡ中に組み込まれ、
そしてその後の生殖細胞系列トランスジェニック飼育用
動物の飼育によって繁殖される。しかしながら、実施者
は、適宜および所望により、当業界において既知である
かまたは後に開発される他のベクターおよびトランスジ
ェニック法に置換することができる。
【０１４９】内因性非ヒト重鎖恒常領域遺伝子に対する
トランススイッチが起こって、キメラ重鎖及びかかるキ
メラヒト／マウス重鎖を含む抗体を産生する可能性があ
る。かかるキメラ抗体は、本書で記述するいくつかの用
途には望まれるかもしれないが、望ましくない場合もあ
る。
【０１５０】Ｇ．内因性免疫グロブリン遺伝子鎖の機能
的破壊 好結果に再配列された免疫グロブリン重鎖および軽鎖ト
ランスジーンの発現は、トランスジェニック非ヒト動物
中の内因性免疫グロブリン遺伝子の再配列を抑制するこ
とにより優性作用を有すると予想される。しかしなが
ら、内因性抗体を欠く非ヒト動物を生成せしめる別の方
法は、内因性免疫グロブリン遺伝子座を突然変異せしめ
ることによるものである。胎児性幹細胞技術および相同
組換えを使って、内因性免疫グロブリンレパートリーを
容易に排除することができる。下記はマウス免疫グロブ
リン遺伝子座の機能的破壊を説明する。しかしながら、
開示されるベクターおよび方法は、他の非ヒト動物にお
ける使用に合わせて容易に改変することができる。
【０１５１】簡単に言えば、この技術は、生殖細胞組織
に分化することができる多分化能性細胞系における、相
同組換えによる遺伝子の不活性化を包含する。マウス免
疫グロブリンの変更コピーを含むＤＮＡ構成物を胎児性
幹細胞の核に導入する。その細胞の一部において、導入
されたＤＮＡマウス遺伝子の内因性コピーと組み換わ
り、それを変更コピーで置き換える。新たに操作された
遺伝的損傷を含む細胞を宿主マウス胚に注入し、それを
受容体の雌に再移植する。それらの胚の一部が変異細胞
系に完全に由来する生殖細胞を有するキメラマウスに発
達する。従って、キメラマウスを交配することにより、
導入された遺伝的損傷を含むマウスの新規系列を獲得す
ることが可能である〔Capecchi (1989) Science, 244,
1288-1292により概説されている〕。
【０１５２】マウスλ遺伝子座は免疫グロブリンのわず
か５％に寄与するため、重鎖および／またはκ軽鎖遺伝
子座の不活性化で十分である。それらの遺伝子座の各々
を破壊するのには３つの方法があり、Ｊ領域の欠失、Ｊ
−Ｃイントロンエンハンサーの欠失、および終結コドン
の導入による定常領域コード配列の破壊である。ＤＮＡ
構成物デザインの見地から、最後の方法の選択が最も簡
単である。μ遺伝子の排除はＢ細胞の成熟を破壊し、そ
れによっていずれかの機能的重鎖セグメントにクラスス
イッチすることを防ぐ。それらの遺伝子座を破壊（ノッ
クアウト）する方策を下記に概説する。
【０１５３】マウスμおよびκ遺伝子を破壊するために
は、Jaenischおよび共同研究者〔Zijlstraら(1989), Na
ture, 342, 435-438〕によりマウスβ２ミクログロブリ
ン遺伝子の好結果の破壊に使われたデザインを基にした
標的ベクターを用いる。プラスミドpMCIneo からのネオ
マイシン耐性遺伝子（neo ）を標的遺伝子のコード領域
中に挿入する。pMCIneo 挿入断片は neo発現を指令する
のにハイブリッドウイルスプロモーター／エンハンサー
配列を使う。このプロモーターは胎児性幹細胞中で活性
である。従って、破壊（ノックアウト）構成物の組込み
のための選択マーカーとしてneo を使うことができる。
ランダム挿入現象に対する陰性選択マーカーとしてHSV
チミジンキナーゼ(tk)遺伝子を該構成物の末端に付加す
る（Zijlstraら、前掲）。
【０１５４】重鎖遺伝子座を破壊するための好ましい方
策はＪ領域の削除である。この領域はマウスではかなり
小さく、わずか1.3 kbに及ぶ。遺伝子標的ベクターを作
製するために、分泌されるＡ定常領域エクソンの全部を
含む15 kb の KpnＩ断片をマウスゲノムライブラリーか
ら単離する。1.3 kbのＪ領域をpMCIneo からの1.1 kb挿
入断片により置き換える。次いで該 KpnＩ断片の５′末
端にHSV tk遺伝子を付加する。相同組換えによるこの構
成物の正しい組込みは、 neo遺伝子によるマウスＪH 領
域の置換をもたらすだろう。neo 遺伝子を基にしたプラ
イマーとＤ領域中の KpnＩ部位の５′のマウス配列に相
同のプライマーとを使って、ＰＣＲにより組換え体をス
クリーニングする。
【０１５５】あるいは、μ遺伝子のコード領域を破壊す
ることにより重鎖遺伝子座を破壊（ノックアウト）す
る。このアプローチは、上記のアプローチで使ったもの
と同じ15 kb のKpn Ｉ断片を必要とする。pMCIneo から
の1.1 kb挿入断片をエクソンII中のユニークBamHI 部位
のところに挿入し、そしてHSK tk遺伝子を３′Kpn Ｉ末
端に付加する。neo 挿入断片の片側における二重交差
（これはtk遺伝子を削除する）を選択する。それらは、
選択されたクローンのプールからＰＣＲ増幅により検出
される。ＰＣＲプライマーの一方はneo 配列に由来し、
そして他方は標的ベクターの外側のマウス配列に由来す
る。マウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的破壊は実施
例に記載される。
【０１５６】Ｇ．内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現
の抑制 内因性Ｉｇ遺伝子座の機能的破壊に加えて、内因性Ｉｇ
遺伝子座の発現を防ぐ別の方法は抑制である。内因性Ｉ
ｇ遺伝子の抑制は、１または複数の組み込まれたトラン
スジーンから産生されるアンチセンスＲＮＡにより、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドにより、および／または
１または複数の内因性Ｉｇ鎖に特異的な抗血清の投与に
より達成することができる。アンチセンスポリヌクレオチド 特定の遺伝子の発現を部分的または全体的に破壊するた
めにアンチセンスＲＮＡトランスジーンを使うことがで
きる〔Pepin ら(1991)Nature 355: 725 ; Helene, C.
およびToulme, J. (1990) Biochi- mica Biophys. Acta
1049: 99 ; Stout, J.およびCaskey, T.(1990)Somat.
Cell Mol. Genet. 16: 369 ; Munirら (1990) Soma
t. Cell Mol. Genet. 16: 383 ; これらの各々は参考
として本明細書中に組み込まれる〕。
【０１５７】「アンチセンスポリヌクレオチド」は、
（１）参照配列、例えば内因性IgのＣ H またはＣL 領域
配列の全部または一部に相補的であり、且つ（２）相補
的な標的配列、例えば染色体遺伝子座またはIg mRNA に
特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
そのような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、関
連する標的配列への特異的ハイブリダイゼーションが該
ポリヌクレオチドの機能的性質として保持される限り、
ヌクレオチド置換、付加、欠失または転位を含んでもよ
い。
【０１５８】相補的アンチセンスポリヌクレオチドとし
ては、個々のmRNA種に特異的にハイブリダイズしそして
該mRNA種の転写および／またはＲＮＡプロセシングおよ
び／またはコードされるポリペプチドの翻訳を防ぐこと
ができる、可溶性アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡオリ
ゴヌクレオチドが挙げられる〔Ching ら、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:10006-10010 (1989) ; Broderら、
Ann. Int. Med. 113:604-613 (1990) ; Loreau ら、FE
BS Letters 274: 53-56 (1990) ; Holcenbergら、 W09
1/11535 ; U.S.S.N 07/530,165（「新規ヒトCRIPTO遺伝
子」）; WO91/09865 ; WO91/04753 ; WO90/ 13641 およ
びEP 386563 ；これらの各々は参考として本明細書中に
組み込まれる〕。
【０１５９】アンチセンス配列は、長さが少なくとも約
15の連続ヌクレオチド、より好ましくは長さが約30以上
の連続ヌクレオチドの少なくとも１つの免疫グロブリン
遺伝子配列に相補的であるポリヌクレオチド配列であ
る。しかしながら、或る態様では、アンチセンスポリヌ
クレオチドの特性として特異的ハイブリダイゼーション
が保持される限り、アンチセンス配列は相補的免疫グロ
ブリン遺伝子配列に比較して置換、付加または欠失を有
することができる。一般的に、アンチセンス配列は、免
疫グロブリン鎖をコードするか、またはＤＮＡ再配列後
に免疫グロブリン鎖をコードする潜在能力を有する内因
性免疫グロブリン遺伝子配列に相補的である。ある場合
には、免疫グロブリン遺伝子配列に一致するセンス配列
が特に転写を妨害することによって発現を抑制する働き
をすることがある。
【０１６０】従ってアンチセンスポリヌクレオチドは、
コードされるポリペプチドの産生を阻害する。この点に
関して、１または複数の内因性Ｉｇ遺伝子座の転写およ
び／または翻訳を阻害するアンチセンスポリヌクレオチ
ドは、内因性Ｉｇ遺伝子座によりコードされる免疫グロ
ブリン鎖を産生する非ヒト動物の能力および／または特
異性を変更することができる。
【０１６１】アンチセンスポリヌクレオチドは、トラン
スフェクタント細胞またはトランスジェニック細胞中、
例えば個体の造血幹細胞集団の全部または一部を再構成
するのに使われるトランスジェニック多分化能性造血幹
細胞中、あるいはトランスジェニック非ヒト動物中で異
種発現カセットから生産され得る。あるいは、アンチセ
ンスポリヌクレオチドは、試験管内では培地中または生
体内では循環系もしくは間質液中のいずれかの外部環境
に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含んで成るこ
とができる。外部環境中に存在する可溶性アンチセンス
オリゴヌクレオチドは、細胞質に接近しそして特定のmR
NA種の翻訳を阻害することが証明されている。
【０１６２】ある態様では、アンチセンスポリヌクレオ
チドがメチルホスホネート成分を含んで成るか、あるい
はホスホロチオネートまたはＯ−メチルリボヌクレオチ
ドを使用してもよく、そしてキメラオリゴヌクレオチド
を使用してもよい〔Dagle ら(1990) Nucleic Acids Re
s. 18: 4751〕。ある用途には、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドはポリアミド核酸を含んでもよい〔Nielsen
ら (1991) Science254: 1497 〕。アンチセンスポリヌ
クレオチドに関する一般法については、Antisense RNA
and DNA (1988), D.A. Melton編, Cold Spring Harbor
Labo-ratory, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと。
【０１６３】１または複数の配列に相補的なアンチセン
スポリヌクレオチドを使って、転写、ＲＮＡプロセシン
グ、および／または同起源のmRNA種の翻訳を阻害し、そ
れによってコードされる各ポリペプチドの量を減少させ
る。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、生体
内で１または複数の内因性Ｉｇ遺伝子座の形成を阻害す
ることにより治療機能を提供することができる。
【０１６４】可溶性アンチセンスポリヌクレオチドとし
てまたはアンチセンストランスジーンから転写されたア
ンチセンスＲＮＡとしてのいずれにせよ、本発明のアン
チセンスポリヌクレオチドは、生体内の生理的状態にお
いて内因性Ｉｇ配列に優先的にハイブリダイズするよう
に選択される。最も典型的には、選択されたアンチセン
スポリヌクレオチドは、本発明の重鎖または軽鎖トラン
スジーンによりコードされる異種Ｉｇ配列にそれほど多
くはハイブリダイズしないだろう（即ち、アンチセンス
オリゴヌクレオチドは約25〜35％以上トランスジーンＩ
ｇｆ発現を阻害しないであろう）。抗血清抑制 内因性Ｉｇ鎖発現の部分的または完全な抑制は、マウス
に１または複数の内因性Ｉｇ鎖に対する抗血清を注入す
ることにより達成することができる〔Weiss ら(1984) P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 81:211；これは参考とし
て本明細書中に組み込まれる〕。抗血清は、１または複
数の内因性Ｉｇ鎖とは特異的に反応するが本発明のＩｇ
トランスジーンによりコードされる異種Ｉｇ鎖とは最少
の反応性を有するかまたは全く反応性を持たないように
選択される。よって、Weiss ら（前掲）のものにより代
表されるようなスケジュールに従った選択抗血清の投与
は、内因性Ｉｇ鎖発現を抑制するが本発明のトランスジ
ーンによりコードされる１または複数の異種Ｉｇ鎖の発
現を許容する。
【０１６５】抗体の適切な抗体供給源としては、以下の
ものが含まれる： （１）特異的にマウスμ，γ，κ又は入鎖に結合するも
のの本発明のヒトＩｇトランスジーンによりコードされ
るヒト免疫グロブリン鎖と反応しない、モノクローナル
抗体といったようなモノクローナル抗体、 （２）混合物が、内因性Ｉｇ鎖の単一種上の多重エピト
ープと、多重内因性Ｉｇ鎖（例えばマウスμ及びマウス
γ）と、又は多重エピトープ及び多重の鎖又は内因性免
疫グロブリンと結合するような、かかるモノクローナル
抗体の混合物； （３）ポリクローナル抗血清又はその混合物。標準的に
は、かかる抗血清（単鎖）は、内因性Ｉｇ鎖の単一種
（例えばマウスμ，マウスγ，マウスκ，マウスλ）又
は内因性Ｉｇ鎖の多重種）に結合するため単一特異性の
ものであり、最も好ましくは、かかる抗血清は、本発明
のトランスジーンによりコードされたヒト免疫グロブリ
ン鎖に対して無視できる結合力しか有していない：及び
／又は
【０１６６】（４）内因性Ｉｇ鎖の単一又は多重種に対
し結合し、最も好ましくは本発明のトランスジーンによ
りコードされるヒト免疫グロブリン鎖に対して無視でき
るほどの結合力しかもたないポリクローナル抗血清とモ
ノクローナル抗体の混合物。一般にポリクローナル抗体
が好まれ、かかる実質的に単一特異性のポリクローナル
抗体は、有利には、ヒト以外の動物種（例えばマウス）
から誘導される抗体での予備吸着及び／又は例えば不動
化されたヒトＩｇを含む親和性樹脂上での抗血清又はそ
の精製分画のアフィニティクロマトグラフィ（ここで結
合された分画は抗血清中の望ましい抗ヒトＩｇについて
富化されており、この結合分画は標準的には低pH又はカ
オトロピック塩溶液という条件で溶離される）によりヒ
ト免疫グロブリンに対して生成された抗血清から産生で
きる。
【０１６７】内因性の（例えばマウスの）免疫グロブリ
ン鎖を発現するリンパ球の抗体により誘導された細胞の
枯渇を増強させるため、細胞分裂及び／又は補体固定を
利用することができる。例えば、一実施態様において
は、マウスＩｇを発現する外植された造血細胞及び／又
はヒトＩｇトランスジーンを宿すトランスジェニックマ
ウスから得たＢ−系列のリンパ球の半ビボ枯渇のために
抗体が利用される。かくして、造血細胞及び／又はＢ系
列リンパ球が、ヒトＩｇトランスジーンを宿す（好まし
くはヒト重鎖トランスジーン及びヒト軽鎖トランスジー
ンの両方を宿す）ヒト以外のトランスジェニック動物か
ら外植され、外植された細胞は、（１）内因性免疫グロ
ブリン（例えばマウスμ及び／又はκ）に結合し、
（２）トランスジーンによりコードされるヒト免疫グロ
ブリン鎖に対する実質的な結合力に欠ける抗体（単数又
は複数）と共にインキュベートされる。
【０１６８】このような抗体は、明確化を期して「抑制
抗体」と呼ばれる。外植された細胞集団は、抑制抗体
（単複）に結合する細胞を選択的に枯渇させられる；こ
のような枯渇は、（１）未結合細胞から抑制抗体結合細
胞を除去するための物理的分離（例えば、抑制抗体に結
合している細胞を不動化し除去するため固体支持体又は
磁気ビードに抑制抗体を結合させることができる）、
（２）抑制抗体により結合された細胞の抗体依存型細胞
死滅（例えば、ADCC、補体固定、又は抑制抗体に連関さ
れた毒素による）、及び（３）抑制抗体により誘発され
たクローンアネルギー、などのさまざまな方法により達
成できる。
【０１６９】往々にして、内因性Ｉｇ鎖産生の抗体抑制
のために用いられる抗体は、補体を固定することができ
る。ウサギ又はモルモットといったように半ビボ／イン
ビトロ枯渇のための便利な補体源と充分反応するように
かかる抗体を選択できることが往々にして好ましい。イ
ンビボ枯渇については、一般に抑制抗体がヒト以外のト
ランスジェニック動物種においてエフェクター機能を有
することが好ましい。かくして、トランスジェニックマ
ウスでの使用のためには、一般に、マウスエフェクター
機能（例えば、ADCC及び補体固定）を含む抑制抗体が好
ましい。
【０１７０】１変形実施態様においては、内因性免疫グ
ロブリンを発現するリンパ球の半ビボ／インビトロ枯渇
のために、予め定められた内因性免疫グロブリン鎖に特
異的に結合する抑制抗体が用いられる。ヒト免疫グロブ
リントランスジーンを宿すヒト以外のトランスジェニッ
ク動物からの細胞外植体（例えばリンパ球試料）は抑制
抗体と接触させられ、抑制抗体に特異的に結合する細胞
は枯渇させられ（例えば、不動化、補体固定などによ
り）、かくして内因性（非ヒト）免疫グロブリンを発現
する細胞（例えばマウスＩｇを発現するリンパ球）内で
枯渇された細胞副次集団を生成する。
【０１７１】結果として得られた枯渇したリンパ球集団
（Ｔ細胞、ヒトＩｇ−陽性Ｂ細胞など）は、内因性抗体
を産生する能力が実質的に無い同じ種の免疫適合性ある
（すなわちMHC 適合性ある）ヒト以外の動物（例えばSC
IDマウス、RAG-１又はRAG-２ノックアウトマウス）の体
内へとトランスファさせることができる。再構成された
動物（マウス）を次に抗原で免疫化させ（又は外植体を
提供したドナー動物を免疫化するのに使用した抗原を用
いて再免疫化させる）、高親和性（親和性成熟した）抗
体及びかかる抗体を産生するＢ細胞を得ることができ
る。かかるＢ細胞は、従来の細胞融合によりハイブリド
ーマを生成するのに使用でき、スクリーニングできる。
抗体抑制はその他の内因性Ｉｇの失活／抑制方法（例え
ばＪH ノックアウト、ＣH ノックアウト、Ｄ−領域切
除、アンチセンス抑制、補償されたフレームシフト失
活）と組合わせて使用することもできる。
【０１７２】完全な内因性Ｉｇ遺伝子座失活 或る種の実施態様では、ヒト可変領域及び非ヒト（例え
ばマウス）恒常領域を含むハイブリッド免疫グロブリン
鎖が形成され得ないような形で（例えばトランスジーン
及び内因性Ｉｇ配列の間のトランス切換えにより）、内
因性Ｉｇ遺伝子座の完全な失活を行なうことが望まし
い。ＪH 領域においてのみ機能的に分断されている（原
文with→which の誤り）内因性重鎖対立遺伝子を支持す
るノックアウトマウスは、標準的にはトランスジーンに
よりコードされた再配置されたヒト可変領域（ＶＤＪ）
が内因性マウス恒常領域に連鎖された融合タンパク質と
して発現されるトランススイッチを頻繁に示すが、その
他のトランススイッチされた連結も可能である。
【０１７３】この潜在的問題を克服するためには、一般
に、制限的な意味なく以下のものを含むさまざまな方法
のうちのいずれかにより内因性重鎖遺伝子座を完全に失
活することが望ましい：（１）少なくとも１つ、好まし
くは全ての内因性重鎖恒常領域遺伝子を、相同組換えに
よって機能的に分断及び／又は欠失させること、（２）
少なくとも１つ好ましくは全ての内因性重鎖恒常領域遺
伝子を突然変異させて、終止コドン（又はフレームシフ
ト）をコードし、切形又はフレームシフトされた産物
（トランススイッチされた場合）を産生すること、及び
当業者にとっては明白なその他の方法及び戦略。重鎖恒
常領域遺伝子及び／又はＤ−領域遺伝子の実質的部分又
は全ての欠失は、特に「ヒット・エンド・ラン」タイプ
などの相同組換えターゲティングベクターによる逐次欠
失を含むさまざまな方法によって達成できる。同様にし
て、内因性軽鎖恒常領域遺伝子を切除するための少なく
とも１つの内因性軽鎖遺伝子（例えばκ）の機能的分断
及び／又は欠失が往々にして好ましい。
【０１７４】頻繁に、非相同トランスジーンがＪセグメ
ント（単複）内のフレームシフト及びトランスジーン恒
常領域遺伝子のうちの単数又は複数のもの（好ましくは
全て）の初期領域（すなわちアミノ末端コーディング部
分）内の補償フレームシフト（例えば原読取り枠を再生
させるため）を含んでいるようなフレームシフトされた
トランスジーンを利用することが好ましい。内因性IgＨ
遺伝子座恒常遺伝子（補償フレームシフトを含まないも
の）に対するトランススイッチは、切形又はミスセンス
産物を結果としてもたらすことになり、その結果、トラ
ンススイッチされたＢ細胞は欠失されるか又は選択され
なくなり、かくしてトランススイッチされた表現型は抑
制されることになる。
【０１７５】内因性Ｉｇ遺伝子産物発現（例えば、マウ
ス重鎖及び軽鎖配列）及び／又はトランススイッチされ
た抗体（例えばヒト可変／マウス恒常キメラ抗体）の実
質的に完全な機能的失活を実施するためにはアンチセン
ス抑制及び抗体抑制も同様に使用することができる。内
因性（例えばマウスの）Ｉｇ鎖発現の基本的に完全な抑
制を行なうためには、失活及び抑制戦略のさまざまな組
合せを使用することが可能である。
【０１７６】（トランス−スイッチ）いくつかの変形態
様においては、トランススイッチされた免疫グロブリン
を産生することが望ましい場合がある。例えば、このよ
うなトランススイッチされた重鎖は、キメラのものであ
りうる（すなわち非マウス（ヒト）可変領域及びマウス
恒常領域）。このようなトランススイッチされたキメラ
免疫グロブリンを含む抗体は、非ヒト（例えばマウス）
恒常領域を有することが望まれるさまざまな利用分野
（例えば、ヒト恒常領域を結合しない二次抗体の結合の
ためといったようなマウス免疫学的決定因子の存在につ
いて宿主内のエフェクター機能の保持のため）のために
使用することができる。１例を挙げると、或る種の抗原
に関して、マウス可変領域能力範囲（レパートリー）に
比べて、ヒト可変領域能力範囲が有利である可能性があ
る。
【０１７７】おそらくは、ヒトＶH ，Ｄ，ＪH ，ＶL 及
びＪL 遺伝子は、進化の間に、或る種の進化上重要な抗
原を結合する免疫グロブリンをコードするその能力のた
めに選択されてきたのであろう：マウスの能力範囲のた
めの進化上選択的な圧力を提供した抗原は、ヒトの能力
範囲を形作るのに進化的圧力を提供した抗原と全く異な
るものである可能性がある。マウス恒常領域（例えばト
ランススイッチされたマウスの）アイソタイプと組合わ
されたときヒト可変領域能力範囲を有利なものにするそ
の他の能力範囲の利点も存在しうる。マウス恒常領域の
存在は、ヒト恒常領域に比べ利点を提供する可能性があ
る。
【０１７８】例えば、トランススイッチによりヒト可変
領域に連鎖されたマウスγ恒常領域は、予め定められた
抗原（例えばヒトIL−２レセプター）と反応性あるキメ
ラ抗体（好ましくはモノクローナル）を、マウス内のＴ
リンパ球が機能的ヒトIL−２レセプターを発現する移植
細胞対宿主病のマウスモデルといったマウス疾病モデル
の中でテストできるように、マウスエフェクター機能
（例えばADCC、マウス補体固定）を有する抗体を提供し
うる。これに続いて、ヒト可変領域コーディング配列を
（例えば供給源（ハイブリドーマクローン）からのｃＤ
ＮＡクローニング又はPCR 増幅により）分離させ、望ま
しいヒト恒常領域をコードする配列にスプライシングし
て、免疫原性が好ましくは最小限にされているヒトの治
療用途により適したものであるヒト配列抗体をコードす
ることが可能である。
【０１７９】結果として得られる完全にヒトのコーディ
ング配列（単複）を有するポリヌクレオチド（単複）を
宿主内で発現させ（例えば哺乳動物細胞中の発現ベクタ
ーから）、医薬品のため精製することが可能である。い
くつかの利用分野では、マウス恒常領域をヒト恒常領域
と置換することなく直接キメラ抗体を使用することがで
きる。トランススイッチされたキメラ抗体のその他の変
形態様及び用途は、当事者にとって明白であろう。
【０１８０】本発明は、一般にヒト重鎖トランスジーン
と内因性マウス重鎖恒常領域遺伝子の間のトランススイ
ッチの結果として得られるキメラ抗体を発現するＢリン
パ球を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供
する。このようなキメラ抗体は、一般にマウスのスイッ
チされた（すなわち非μ、非δ）アイソタイプであるマ
ウス恒常領域とヒト配列可変領域を含む。予め定められ
た抗原に対するキメラ抗体を作ることのできるヒト以外
のトランスジェニック動物は、通常、ヒト可変及びヒト
恒常領域遺伝子をコードするヒト重鎖及びヒト軽鎖トラ
ンスジーンの両方が組込まれた場合、完全にヒトの配列
の抗体を作る能力もある。
【０１８１】最も標準的には、機能的に分断された重鎖
遺伝子座及び／又は軽鎖遺伝子座について同型接合であ
るが、トランススイッチできる単数又は複数の内因性重
鎖恒常領域遺伝子（例えばγ，α，ε）を保持し、頻繁
にシス連鎖したエンハンサーを保持する。このようなマ
ウスは、通常アシュバントと組合わせた形で予め定めら
れた抗原を用いて免疫化され、マウス恒常領域配列に連
鎖されたヒト配列可変領域から成る重鎖を含む検出可能
な量のキメラ抗体を含む免疫応答が生み出される。標準
的には、かかる免疫化された動物の血清は少なくとも約
１μｇ／ml往々にして約10μｇ/ ml以上、頻繁には30μ
ｇ／ml以上、そして最高50〜100 μｇ／ml以上の濃度で
このようなキメラ抗体を含みうる。
【０１８２】キメラヒト可変／マウス恒常領域重鎖を含
む抗体を含む抗血清は標準的に、ヒト可変／ヒト恒常領
域（完全ヒト配列）重鎖を含む抗体をも含んでいる。ト
ランススイッチされたキメラ抗体は通常、（１）ヒト可
変領域とマウス恒常領域（標準的にはマウスガンマ）か
ら成るキメラ重鎖及び（２）ヒトのトランスジーンコー
ディングを受けた軽鎖（標準的にはけカッパ）又はマウ
ス軽鎖（標準的にはカッパノックアウトパックグラウン
ド内のラムダ）を含んでいる。
【０１８３】かかるトランススイッチされたキメラ抗体
は、一般に、約１×107 Ｍ-1以上、好ましくは５×107
Ｍ-1以上、より好ましくは１×108 Ｍ-1〜１×109 Ｍ-1
以上の親和力で予め定められた抗原（例えば免疫原）に
結合する。頻繁には、予め定められた抗原は、ヒトタン
パク質、例えばヒト細胞表面抗原（例えばCD４，CD８，
IL−２レセプター、EGF レセプター、PDGFレセプタ
ー）、その他のヒト生物学的巨大分子（例えばトロンボ
モジュリン、プロテインＣ、炭水化物抗原、シアリル−
ルイス抗原、Ｌ−セレクチン）又は非ヒト疾病関連巨大
分子（例えば細菌性LPS 、ビリオン・カプシドタンパク
質又は外被糖タンパク質）などである。
【０１８４】本発明は、次のものを含むゲノムを含むヒ
ト以外のトランスジェニック動物を提供する：すなわ
ち、（１）（例えば、機能的スイッチ組換え配列、標準
的には機能的エンハンサーに対するシス連鎖における）
トランススイッチすることのできる少なくとも１つのマ
ウス恒常領域遺伝子を含む同型接合で機能的に分断され
た内因性重鎖遺伝子、（２）機能的ヒト重鎖可変領域を
コードし発現するよう再配置することができかつトラン
ススイッチすることのできる（例えばシス連鎖されたＲ
ＳＳを有する）ヒト重鎖トランスジーン；さらに任意に
は（３）機能的ヒト軽鎖可変領域をコードするべく再配
置しかつヒト配列軽鎖を発現することのできるヒト軽鎖
（例えばカッパ）トランスジーン；さらに任意には、
（４）同型接合で機能的に分断された内因性軽鎖遺伝子
座（κ、好ましくはκ及びλ）；そしてさらに任意に
（５）ヒトトランスジーンによりコードされたヒト配列
可変領域及び内因性マウス重鎖恒常領域遺伝子（例えば
γ１，γ２ａ，γ２ｂ，γ３）によりコードされたマウ
ス恒常領域配列から成るキメラ重鎖を含む抗体を含む血
清。
【０１８５】かかるトランスジェニックマウスはさら
に、約１×104 Ｍ-1以上、好ましくは約５×104 Ｍ-1以
上、より好ましくは１×107 Ｍ-1〜１×109 Ｍ-1以上の
親和力で、予め定められたヒト抗原（例えば、CD４，CD
８，CEA ）に結合するキメラ抗体を含む血清を含みう
る。頻繁には、こうして産生されたモノクローナル抗体
が少なくとも８×107 Ｍ-1の親和力をもつハイブリドー
マを作ることができる。往々にして非ヒト抗原に結合す
ることができる、マウス恒常領域とヒト可変領域から成
る重鎖を含むキメラ抗体が同様に血清中に、又はハイブ
リドーマから分泌された抗体として、存在しうる。
【０１８６】いくつかの変形態様においては、無傷の重
鎖恒常領域遺伝子を保持する失活した内因性マウス重鎖
遺伝子座を有し、トランススイッチできるヒト重鎖トラ
ンスジーンを有し、任意には単数又は複数の失活した内
因性マウス軽鎖遺伝子座を伴い、ヒト軽鎖トランスジー
ンをも有するトランスジェニックマウスを生成すること
が望ましい。かかるマウスは有利にも、トランススイッ
チにより、完全にヒトの重鎖を含む抗体及びキメラ（ヒ
ト可変／マウス恒常）重鎖を含む抗体を交互に発現する
ことのできるＢ細胞を産生することができる。このマウ
スの血清には、完全にヒトの重鎖を含む抗体及び、好ま
しくは完全にヒトの軽鎖と組合わせた状態でキメラ（ヒ
ト可変／マウス恒常）重鎖を含む抗体を含む抗体が含ま
れる。ハイブリドーマは、このマウスのＢ細胞から生成
されうる。
【０１８７】一般にこのようなキメラ抗体はトランスス
イッチにより生成でき、ここで、インビボで産生能ある
Ｖ−Ｄ−Ｊ再配置によりコードされるヒト可変領域及び
ヒト恒常領域、標準的にはヒトμをコードするヒトトラ
ンスジーンは、非トランスジーン免疫グロブリン恒常遺
伝子スイッチ配列（ＲＳＳ）でのスイッチ組換えを受
け、かくして、標準的に内因性マウス免疫グロブリン重
鎖恒常領域又は第２のトランスジーン上でコードされた
非相同（例えばヒト）重鎖恒常領域である、前記トラン
スジーンによりコードされていないヒト重鎖恒常領域と
トランスジーンコーディングを受けたヒト可変領域を作
動的に連鎖させる。シス−スイッチというのは、トラン
スジーン内のＲＳＳ要素の組換えによるアイソタイプス
イッチのことであるが、トランススイッチには、往々に
してトランスジーンを宿す染色体とは異なる染色体上
で、トランスジーンＲＳＳとこのトランスジーンの外側
のＲＳＳ要素の間での組換えが関与する。
【０１８８】トランススイッチは、一般に、発現された
トランスジーン重鎖恒常領域遺伝子と、（非μアイソタ
イプ、標準的にはγの）内因性マウス恒常領域遺伝子の
ＲＳＳ又は往々にして別々の染色体上に組込まれている
第２のトランスジーン上に含まれたヒト恒常領域遺伝子
のＲＳＳのいずれか一方の間で起こる。トランススイッ
チが第１の、発現されたトランスジーン重鎖恒常領域遺
伝子（例えばμ）のＲＳＳと、第２のトランスジーン上
に含まれたヒト重鎖恒常領域遺伝子のＲＳＳの間で起こ
る場合、実質的に完全にヒトの配列をもつ非キメラ抗体
が産生される。制限的な意味のない例として、ヒト重鎖
恒常領域（例えば、γ１）及び作動的に連鎖されたＲＳ
Ｓ（例えばγ１ＲＳＳ）をコードするポリヌクレオチド
を、トランスジーンコーディングと受けたヒトμ鎖を含
む抗体を発現するトランスジェニックマウスのＢ細胞
（又はＢ細胞集団）から生成されたハイブリドーマ細胞
の集団内に導入（例えばトランスフェクション）するこ
とができる。
【０１８９】結果として得られたハイブリドーマ細胞
を、導入されたポリヌクレオチドの存在について、及び
／又は、ヒトμ鎖の可変領域（イディオタイプ／抗原反
応性）を有しかつ導入されたポリヌクレオチド配列（例
えば、ヒトγ１）によりコードされる恒常領域をもつ重
鎖を含むトランススイッチされた抗体の発現について、
選択することができる。トランスジーンにコードされた
ヒトμ鎖のＲＳＳと下流のアイソタイプ（例えばγ１）
をコードする導入されたポリヌクレオチドのＲＳＳの間
のトランススイッチ組換えは、かくしてトランススイッ
チされた抗体を生成することができる。
【０１９０】本発明はと同様に、（１）トランススイッ
チすることのできる少なくとも１つのマウス恒常領域遺
伝子（例えばγ２ａ，γ２ｂ，γ１，γ３）を含む、同
型接合で機能的に分断された内因性重鎖遺伝子座、
（２）機能的ヒト重鎖可変領域をコードするべく再配置
しヒト配列重鎖を発現することができ、かつアイソタイ
プスイッチ（及び／又はトランススイッチ）を受けるこ
とのできるヒト重鎖トランスジーン；さらに任意には
（３）機能的ヒト軽（例えばカッパ）鎖可変領域をコー
ドするべく再配置しヒト配列軽鎖を発現することができ
るヒト軽鎖（例えばカッパ）トランスジーン、そしてさ
らに任意には（４）同型接合で機能的に分断された内因
性軽鎖遺伝子座（標準的にはκ、好ましくはκとλの両
方）、そしてさらに任意には（５）ヒトトランスジーン
によりコードされたヒト配列可変領域及び内因性マウス
重鎖恒常領域遺伝子（例えば、γ１，γ２ａ，γ２ｂ，
γ３）によりコードされるマウス恒常領域配列から成る
キメラ重鎖を含む抗体を含む血清、を含むゲノムを含む
トランスジェニックマウスを予め定められた抗原で免疫
化する段階を含む、このようなトランススイッチされた
キメラ抗体を産生するための方法も提供している。
【０１９１】親和性標識：スイッチされたアイソタイプ
についての選択 有利なことに、体細胞突然変異のプロセスは、トランス
スイッチ（及びシススイッチ）と結びつけられる。体細
胞突然変異は、Ｂ細胞のクローン後代によりコードされ
る抗体親和力の範囲を拡張する。例えば、スイッチ（ト
ランス−又はシス−）を受けたハイブリドーマ細胞によ
り産生された抗体は、スイッチを受けなかったハイブリ
ドーマ細胞内に存在するよりも広い抗原結合親和力範囲
を示す。従って、第１のヒト重鎖恒常領域（例えばμ）
に対するポリペプチド結合において第１のヒト重鎖可変
領域を含む重鎖を含む第１の抗体を発現するハイブリド
ーマ細胞集団（標準的にはクローンの）を、第２の重鎖
恒常領域（例えばヒトγ、α又はε恒常領域）に対する
ポリペプチド結合において前記第１のヒト重鎖可変領域
を含む重鎖を含む抗体を発現するハイブリドーマ細胞ク
ローン変異株についてスクリーニングすることができ
る。
【０１９２】かかるクローン変異株は、インビトロでシ
ススイッチを生成する天然クローン変異によって、又は
Ｔ細胞誘導されたリンホカイン（例えばIL−４及びＩＦ
Ｎγ）といったアイソタイプスイッチを促進する作用物
質の投与を通してといったようなクラススイッチ（トラ
ンス−又はシス−）の誘発によって、又はトランススイ
ッチのための基質として役立つべき非相同（例えばヒ
ト）重鎖恒常領域遺伝子及び機能的ＲＳＳを含むポリヌ
クレオチドの導入によって、又は上述のものの組合せな
どによって、産生させることができる。往々にして、作
動的に連鎖されたＲＳＳを伴うヒト下流アイソタイプ恒
常領域（例えばγ１，γ３など）を含むポリヌクレオチ
ドが同様に、ハイブリドーマ細胞内に導入され、トラン
ス・スイッチメカニズムを介してアイソタイプスイッチ
を促進する。
【０１９３】クラススイッチ及び親和性成熟は、本発明
のトランスジェニック動物から誘導されたＢ細胞の同じ
集団内で発生する。従って、クラススイッチされたＢ細
胞（又はそれから誘導されたハイブリドーマ）の同定
を、高親和力のモノクローナル抗体を得るための１つの
スクリーニング段階として使用することができる。シス
−スイッチ（トランスジーン内スイッチ）、トランスス
イッチ又はその両方といったクラススイッチ事象を容易
にするため、さまざまなアプローチを利用することがで
きる。例えば、付随するＲＳＳ要素及びスイッチ調節要
素（例えば不稔写しプロモーター）を伴うμ及びγの両
方の恒常領域遺伝子を含む単一の連続ヒトゲノミックフ
ラグメントを、トランスジーンとして使用することがで
きる。
【０１９４】しかしながら、望まれる単一の隣接するヒ
トゲノミックフラグメントの一部分は、例えばクローニ
ング宿主などの中で複製されるときの不安定さの問題な
どにより、効果的にクローニングすることが困難であり
うる：特にδとγ３の間の領域は、特にμ遺伝子、γ３
遺伝子、Ｖ遺伝子、Ｄ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セ
グメントを含む隣接するフラグメントのように効率良く
クローニングしにくいことが判明する可能性がある。
【０１９５】同様に例として、ヒトμ遺伝子、ヒトγ３
遺伝子、ヒトＶ遺伝子（単複）、ヒトＤ遺伝子セグメン
ト及びヒトＪ遺伝子セグメントから成り、介入する（イ
ントロンの）又はその他の形で可欠な配列（例えば単数
又は複数のＶ，Ｄ、及び／又はＪセグメント及び／又は
単数又は複数の非μ恒常領域遺伝子）の単数又は複数の
欠失を伴う、不連続のヒトトランスジーン（ミニ遺伝
子）、がある。このようなミニ遺伝子は、効率良い免疫
グロブリンの発現及びスイッチのための必須要素の全て
にまたがるゲノミックＤＮＡの単一の隣接セグメントを
分離することに比べて、いくつかの利点を有する。
【０１９６】例えば、このようなミニ遺伝子は、クロー
ニングし難い配列（例えば、不安定配列、毒物配列な
ど）を内含しうるＤＮＡの大きい断片を分離する必要性
を無くする。さらに、シス−又はトランス−スイッチの
ためのアイソタイプスイッチのために必要な要素（例え
ば、ヒトγ不稔写しプロモータ）を含むミニ遺伝子座
は、有利にもインビボで体細胞突然変異及びクラススイ
ッチを受けることができる。多くの真核性ＤＮＡ配列が
クローニングし難いものであることが立証されているた
め、可欠配列を削除することが有利であることが判明す
る。
【０１９７】一変形態様においては、高い結合親和力
（例えば１×107 Ｍ-1以上、好ましくは１×108 Ｍ-1以
上、より好ましくは１×109 Ｍ-1以上）をもつ抗体を産
生するハイブリドーマクローンは、産生力ある（枠内）
Ｖ−Ｄ−Ｊ再配置を受けることができる内因性マウス重
鎖遺伝子座が実質的に欠如しアイソタイプスイッチを行
なうことのできる（以上参照）ヒト重鎖トランスジーン
を宿すトランスジェニックマウスのＢ細胞から誘導され
たハイブリドーマ細胞のプールから、ヒト（又はマウ
ス）非μ重鎖恒常領域に対するポリペプチド結合におい
てヒト配列重鎖可変領域を含む重鎖を含む抗体を発現す
るハイブリドーマを選択することによって得られる。こ
れらの抗体は、インビボ又は細胞培養中でのシス−スイ
ッチ及び／又はトランス−スイッチの結果として産生さ
れる「スイッチされた重鎖」を含むことから、「スイッ
チされた抗体」と呼ばれる。
【０１９８】スイッチされた抗体を産生するハイブリド
ーマは、一般に、体細胞突然変異プロセスを受けてお
り、このハイブリドーマのプールは一般により広い抗原
結合親和力範囲を有することになり、この中から高親和
力の抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択する
ことができる。標準的には、予め決定された抗原につい
て実質的な結合親和力（１×107 Ｍ-1〜１×108 Ｍ-1以
上）をもつヒト配列抗体を分泌し、このヒト配列抗体が
ヒト免疫グロブリン可変領域（単複）を含んでいるよう
なハイブリドーマを、２段階プロセスを含む方法により
選択することができる。１つの段階は、（例えば、スイ
ッチされた重鎖に特異的に結合しスイッチされていない
アイソタイプ、例えばμ、に対して実質的に結合しない
不動化された免疫グロブリンに対しハイブリドーマ細胞
を結合することにより）、スイッチされた重鎖を含む免
疫グロブリンを分泌するハイブリドーマ細胞を同定し分
離することにある。
【０１９９】もう１つの段階は、（例えばハイブリドー
マクローン上清のELISA 、標識づけされた抗原を用いた
FACS分析などにより) 実質的な結合親和力で予め定めら
れた抗原に結合するハイブリドーマ細胞を同定すること
にある。標準的には、スイッチされた抗体を分泌するハ
イブリドーマの選択は，予め定められた抗原を結合する
ハイブリドーマ細胞を同定する前に行なわれる。予め定
められた抗原に対する実質的な結合親和力をもつスイッ
チされた抗体を発現するハイブリドーマ細胞が分離さ
れ、標準的には個々の選択されたクローンとして当該技
術分野において既知の適切な成長条件下で培養される。
任意には、この方法には、モノクローナル抗体の発現に
適した条件下で前記選択されたクローンを培養する段階
が含まれる。このモノクローナル抗体を収集し、これを
治療、予防及び／又は診断の目的で投与することができ
る。
【０２００】往々にして、選択されたハイブリドーマク
ローンは、予め定められた抗原に結合する（又はこれに
対する結合力を付与する）免疫グロブリン（例えば可変
領域）をコードする免疫グロブリン配列を分離するため
のＤＮＡ又はＲＮＡ源として役立ちうる。これに続い
て、ヒト可変領域コーディング配列を分離し（例えばPC
R 増幅又は供給源（ハイブリドーマクローン）からのｃ
ＤＮＡクローニングによる）、好ましくは免疫原性が最
小限にされるヒトの治療用途により適したヒト配列抗体
をコードするべく望ましいヒト恒常領域をコードする配
列に対しスプライシングする。結果として得られた完全
にヒトのコーディング配列（単複）をもつポリヌクレオ
チド（単複）を宿主細胞（例えば哺乳細胞内の発現ベク
ターから）の中で発現させ、医薬品のために精製するこ
とが可能である。
【０２０１】キセノ（異種）エンハンサー ヒト免疫グロブリン（例えば重鎖）をコードすることの
できる非相同トランスジーンは、有利にも、マウスゲノ
ムから誘導されていない、及び／又は非相同トランスジ
ーンのエキソンとシスで自然に結びつけられていないシ
ス−連鎖されたエンハンサーを含んでいる。例えば、ヒ
トκトランスジーン（例えばκミニ遺伝子座）は有利に
も、ヒトＶK 遺伝子、ヒトＪK 遺伝子、ヒトＣK 遺伝子
及びキセノエンハンサーを含んでいる可能性があり、標
準的には、このキセノエンハンサーは、標準的にＪK 遺
伝子とＣK 遺伝子の間にあるか又はＣK 遺伝子の下流に
位置づけされた、ヒト重鎖イントロンエンハンサー及び
／又はマウス重鎖イントロンエンハンサーを含む。例え
ば、マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー(Banerji
etal. (1983) Cell 33： 729）は、プラスミドpKVe２
の 0.9kbのXba Ｉフラグメント上で分離されうる（下記
参照）。
【０２０２】ヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー
（Hayday etal. (1984) Nature 307： 334）は、 1.4k
bのMlu Ｉ／Hind IIIフラグメントとして分離されうる
（下記参照）。基本的にマウスＪ−μイントロンエンハ
ンサーに対しシスで連鎖されたヒトＪ−μイントロンエ
ンハンサーで構成されている組合されたキセノエンハン
サーといった、トランスジーンに対する転写的に活性な
キセノエンハンサーの付加は、特にこのトランスジーン
がヒトκといった軽鎖をコードする場合、トランスジー
ンの高い発現レベルを付与することができる。同様に、
ラット３′エンハンサーを、ヒト重鎖とコードできるミ
ニ遺伝子座構成体内に有利にも含み入れることができ
る。
【０２０３】核酸 「実質的相同性」なる用語は、２つの核酸またはデザイ
ンしたその配列を最適に整列しそして比較した時に、少
なくとも約80％のヌクレオチド、通常は少なくとも約90
％〜95％、より好ましくは少なくとも約98％〜99.5％の
ヌクレオチドが同一であることを指摘する。あるいは、
セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下でそ
の鎖の相補体にハイブリダイズする時、実質的相同性が
存在する。核酸は完全細胞中に、細胞溶解物中に、また
は部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形で、存
在することができる。
【０２０４】核酸は、標準技術により、例えばアルカリ
／SDS 処理、CsClバンド沈降、カラムクロマトグラフィ
ー、アガロースゲル電気泳動および当業界で公知の他の
方法により、他の細胞成分または他の汚染物、例えば他
の細胞性核酸もしくはタンパク質から分離精製された
時、「単離され」または「実質的に純粋にされ」る。F.
Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biolog
y, Greene Publishingand Wiley-Interscience, New Yo
rk (1987) を参照のこと。
【０２０５】本発明の核酸組成物は、遺伝子配列を提供
するための標準技術に従って、しばしばｃＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡまたは混合物のいずれかからの生来の配列（修
飾された制限部位等を除く）を変異せしめることができ
る。コード配列については、それらの変異は、所望であ
ればアミノ酸配列に影響してもよい。特に生来のＶ，
Ｄ，Ｊ，定常，スイッチおよび他の本明細書中に記載の
そのような配列に実質的に相同であるかまたはそれから
誘導されるＤＮＡ配列が考えられる（ここで、「誘導さ
れる」とは、ある配列が別の配列と同一であるかまたは
変更されていることを指摘する）。
【０２０６】核酸はそれが別の核酸配列と機能的関係に
置かれる時、「作用可能に連結される」という。例え
ば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転
写に作用するならば、それらはコード配列に作用可能に
連結されている。転写調節配列については、作用可能に
連結されるとは、連結されるＤＮＡ配列が連続であっ
て、そして２種のタンパク質コード領域を連結すること
が必要な場合には、連続であって且つ読み枠内であるこ
とを意味する。スイッチ配列については、作用可能に連
結されるとは、該配列がスイッチ組換えを行うことがで
きることを意味する。
【０２０７】特定の好ましい態様 本発明の好ましい態様は、実施例５，６，８または14に
記載の軽鎖トランスジーンの単一コピーを含有する動物
と交配させた実施例12に記載のトランスジーン（例えば
pHC1またはpHC2）の少なくとも１回のコピー、典型的に
は２〜10回のコピー、時には25〜50回以上のコピーを含
有する動物、並びに実施例10に記載のＪ H 欠失動物から
繁殖させた子孫である。動物はそれらの３つの特性につ
いて同型接合に交配される。
【０２０８】そのような動物は次の遺伝子型を有する：
再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座（実施例12に記
載）の単一コピー（染色体の一倍体１組あたり）、再配
列されたヒトκ軽鎖構成物（実施例14に記載）の単一コ
ピー（染色体の一倍体１組あたり）、および機能的ＪH
セグメントの全部を除去する各内因性マウス重鎖遺伝子
座のところの欠失（実施例10に記載）。そのような動物
は、ＪH セグメントの欠失について同型接合であるマウ
スと交配させる（実施例10）と、ＪH 欠失について同型
接合でありそしてヒト重鎖および軽鎖構成物については
半接合である子孫を生産する。生じた動物に抗原を注入
し、それらの抗原に対するヒトモノクローナル抗体の産
生に使う。
【０２０９】そのような動物から単離されたＢ細胞は、
それらが各遺伝子の単一コピーのみを含むため、ヒト重
鎖および軽鎖に関して単一特異性である。更に、それら
はヒトまたはマウス重鎖に関して単一特異性であろう。
というのは、実施例９および12に記載のようにして導入
されたＪH 領域に広がる欠失によって、両方の内因性マ
ウス重鎖遺伝子コピーが非機能的であるためである。更
に、Ｂ細胞の実質的部分はヒトまたはマウス軽鎖に関し
て単一特異性であろう。何故なら、再配列されたヒトκ
軽鎖遺伝子の単一コピーの発現が、Ｂ細胞の実質的部分
における内因性マウスκおよびλ鎖遺伝子の再配列を対
立的におよび同位的に排除するだろうからである。
【０２１０】好ましい態様のトランスジェニックマウス
は、理想的には生来のマウスのものと実質的に同じであ
る、有意なレパートリーを有する免疫グロブリン産生を
示すだろう。例えば、内因性Ig遺伝子が不活性化されて
いる態様では、総免疫グロブリンレベルは約0.1 〜10mg
／ml血清、好ましくは0.5 〜5 mg／ml、理想的には少な
くとも約1.0 mg／mlの範囲であろう。IgM からIgG にス
イッチすることができるトランスジーンをトランスジェ
ニックマウスに導入した時、血清IgＧ対IgＭの成熟マウ
ス比は好ましくは約10：1 である。もちろん、IgＧ対Ig
Ｍ比は、未成熟マウスではずっと低いだろう。一般に、
脾臓およびリンパ節Ｂ細胞の約10％より多く、好ましく
は40〜80％が、もっぱらヒトIgＧタンパク質のみを発現
する。
【０２１１】レパートリーは理想的には非トランスジェ
ニックマウス中にしめされるものとほぼ等しく、通常は
少なくとも約10％ほど高く、好ましくは25〜50％または
それ以上高いだろう。マウスゲノム中に導入される異な
るＶ，ＪおよびＤ領域の数に主として依存して、通常少
なくとも約1000種の異なる免疫グロブリン（理想的には
IgＧ）、好ましくは104 〜106 またはそれ以上の免疫グ
ロブリンが産生されるだろう。それらの免疫グロブリン
は、典型的には、高抗原性タンパク質の約半分またはそ
れ以上を認識するだろう。
【０２１２】抗原性タンパク質としては、ハトチトクロ
ームＣ、ニワトリリゾチーム、アメリカヤマゴボウのマ
イトジェン(PWM) 、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモ
シアニン、インフルエンザ赤血球凝集素、スタフィロコ
ッカスプロテインＡ、マッコウクジラミオグロビン、イ
ンフルエンザノイラミニダーゼおよびλリプレッサータ
ンパク質が挙げられるがそれに限定されない。上記免疫
グロブリンの幾つかは、予め選択された抗原に対して、
少なくとも約10 7 Ｍ -1、好ましくは10 8 Ｍ -1〜10 9 Ｍ -1
またはそれ以上の親和性を示すだろう。
【０２１３】いくつかの実施態様においては、予め定め
られた抗原タイプに対する抗体応答において表わされる
Ｖ遺伝子の選択を制限する目的で、予め定められた能力
範囲をもつマウスを生成することが好まれる可能性があ
る。予め定められた能力範囲をもつ重鎖トランスジーン
は例えば、人間における予め定められた抗原タイプに対
する抗体応答で好んで用いられるヒトＶH 遺伝子を含み
うる。代替的には、さまざまな範囲により（例えば、予
め定められた抗原に対する高い親和力のＶ領域をコード
する確率が低い；体細胞突然変異及び親和力激化を受け
る傾向が弱い；又は一定の人間に対する免疫原性をも
つ）、規定された能力範囲からいくつかのＶH 遺伝子を
除外することができる。
【０２１４】様々な重鎖または軽鎖遺伝子セグメントを
含むトランスジーンの再配列の前に、それらの遺伝子セ
グメントは、例えばハイブリダイゼーションまたはＤＮ
Ａ配列決定により、トランスジェニック動物以外の生物
種に由来するものであると容易に同定することができ
る。上記に本発明のトランスジェニック動物の好ましい
態様を記載したけれども、他の態様は本明細書の開示に
より、そしてより特定的には実施例に記載のトランスジ
ーンにより定義される。トランスジェニック動物の４つ
のカテゴリーが定義され得る：
【０２１５】Ｉ．再配列されていない重鎖免疫グロブリ
ントランスジーンと再配列された軽鎖免疫グロブリント
ランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。 II．再配列されていない重鎖免疫グロブリントランスジ
ーンと再配列されていない軽鎖免疫グロブリントランス
ジーンとを含有するトランスジェニック動物。 III ．再配列された重鎖免疫グロブリントランスジーン
と再配列されていない軽鎖免疫グロブリントランスジー
ンとを含有するトランスジェニック動物。
【０２１６】IV．再配列された重鎖免疫グロブリントラ
ンスジーンと再配列された軽鎖免疫グロブリントランス
ジーンとを含有するトランスジェニック動物。 トランスジェニック動物の上記カテゴリーの好ましい優
先順序は、内因性軽鎖遺伝子（または少なくともκ遺伝
子）が相同組換え（または他の方法）により破壊されて
いる場合にはII＞Ｉ＞III ＞IVであり、そして内因性軽
鎖遺伝子が破壊されておらず且つ対立遺伝子排除により
優性になるに違いない場合にはＩ＞II＞III ＞IVであ
る。
【０２１７】
【実施例】方法および材料 トランスジェニックマススは、Hogan ら、"Manipulatin
g the Mouse Embryo :A Laboratory Manual", Cold Spr
ing Harbor Laboratory（これは参考として本明細書中
に組み込まれる）に従って誘導される。
【０２１８】胎児性幹細胞は、発表された方法に従って
操作される〔Terato- carcinomas and embryonic stem
cells : a practical approach, E.J. Robertson編, IR
L Press, Washington, D.C., 1987 ; Zjilstraら、Natu
re 342:435-438 (1989)およびSchwartzberg, P.ら、Sc
ience 246:799-803 (1989)；この各々は参考として本
明細書中に組み込まれる〕。
【０２１９】ＤＮＡクローニング方法は、J. Sambrook
ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第２
版，1989, Cold Spring Harbor Labo-ratory Press, Co
ld Spring Harbor, N.Y.（これは参考として本明細書中
に組み込まれる）に従って実施される。オリゴヌクレオ
チドは、製造業者により与えられた規格書に従ってAppl
ied Biosystemsのオリゴヌクレオチド合成装置上で合成
される。
【０２２０】ハイブリドーマ細胞および抗体は、"Antib
odies: A Laboratory Manual", Harlow およびDavid La
ne編, Cold Spring Harbor Labo-ratory (1988) （これ
は参考として本明細書中に組み込まれる）に従って操作
される。
【０２２１】実施例１ ゲノム重鎖ヒトIgトランスジーン この実施例は、マウスの接合子中にマイクロインジェク
トされるヒトゲノム重鎖免疫グロブリントランスジーン
のクローニングとマイクロインジェクションを記載す
る。
【０２２２】Marzluff, W.F.ら、 "Transcription and
Translation : A Pra-ctical Approach", B.D. Hammes
およびS.J. Higgins編, 89-129頁, IRL Press, Oxford
(1985)により記載されたようにして、新鮮なヒト胎盤組
織から核を単離する。単離された核（またはＰＢＳで洗
浄したヒト精母細胞）を低融点アガロース母材中に埋め
込み、EDTAとプロテイナーゼＫで溶解せしめて高分子量
ＤＮＡを暴露させ、このＤＮＡを次いでM. Finney によ
り Current Protocols in Molecular Biology（F. Ausu
belら編, John Wiley & Sons,増補４版, 1988, 第2.5.1
章）中に記載された通りにアガロース中で制限酵素Not
Ｉで消化する。
【０２２３】次いでNot Ｉ消化されたＤＮＡを、Anand,
R. ら、Nucl. Acids Res., 17:3425-3433 (1989) によ
り記載されたようにパルスフィールドゲル電気泳動によ
り分画する。Not Ｉ断片に富む画分をサザンブロットハ
イブリダイゼーションによりアッセイし、この断片によ
りコードされる１または複数の配列を検出する。そのよ
うな配列は、重鎖Ｄセグメント、Ｊセグメント、μおよ
びγ１定常領域と一緒に６種のＶH ファミリーの全部の
代表物を含む〔この断片は、Bermanら (1988)前掲によ
りHeLa細胞から670 kb断片として同定されているが、本
発明者らはヒト胎盤および精子ＤＮＡからは830 kb断片
としてであることを発見した〕。
【０２２４】この NotＩ断片を含む画分（図４参照）を
プールし、そして酵母細胞中のベクターpYACNNの NotＩ
部位にクローニングする。プラスミドpYACNNは、pYAC-4
Neo〔Cook, H.ら、Nucl. Acids Res. 16:11817 (198
8) 〕をEcoRI で消化しそしてオリゴヌクレオチド 5′
−AAT TGC GGC CGC −3 ′の存在下で連結せしめること
により調製する。
【０２２５】Brownsteinら(1989), Science, 244, 134
8-1351およびGreen, E. ら、Proc.Natl. Acad. Sci. US
A 87:1213-1217 (1990) （これらは参考として本明細
書中に組み込まれる）により記載されたようにして、重
鎖 NotＩ断片を含む YACクローンを単離する。M. Finne
y （前掲）により記載されたパルスフィールドゲル電気
泳動により、高分子量酵母ＤＮＡからクローン化 NotＩ
挿入断片を単離する。１mMのスペルミンの添加によりこ
のＤＮＡを凝縮させ、上述の単細胞胚の核に直接マイク
ロインジェクトする。
【０２２６】実施例２ 生体内相同組換えにより形成されるゲノムκ軽鎖ヒトIg
トランスジーン ヒトκ軽鎖の地図はLorenz. W.ら、Nucl. Acids Res.
15:9667-9677 (1987)に記載されており、これは参考と
して本明細書中に組み込まれる。全てのＣκ、３′エン
ハンサー、全てのＪセグメントおよび少なくとも５つの
異なるＶセグメントを含む450 kbの XhoＩ−Not Ｉ断片
を実施例１に記載の如く単離し、そして単一の細胞胚の
核の中にマイクロインジェクトする。
【０２２７】実施例３ 生体内相同組換えにより形成されるゲノムκ軽鎖ヒトIg
トランスジーン 前記成分の全部と少なくとも20個多いＶセグメントとを
含む750 kp MluＩ−Not Ｉ断片を実施例１に記載の如く
単離し、そしてBssHIIで消化して約400 kbの断片を生成
せしめる。
【０２２８】450 kb XhoＩ−Not Ｉ断片と約400 kb Mlu
Ｉ−BssHII断片は、Bss H II制限部位とXho Ｉ制限部位
とにより限定される配列重複を有する。マウス接合子の
マイクロインジェクションによるそれらの２断片の相同
組換えは、450 kb XhoＩ／Not Ｉ断片（実施例２）中に
見つかるものよりも少なくとも15〜20個追加のＶセグメ
ントを含むトランスジーンをもたらす。
【０２２９】実施例４ 重鎖小遺伝子座の作製 Ａ．pGP1およびpGP2の作製 pBR322をEcoRI とStyIで消化し、下記のオリゴヌクレオ
チドと連結せしめることにより、図８に記載の制限部位
を有する147 塩基対の挿入断片を含むpGP1を作製する。
それらのオリゴの概括的重複は図９にも示される。
【０２３０】オリゴヌクレオチドは下記のものである： オリゴ−１ ５′−CTT GAG CCC GCC TAA TGA GCG GGC
TTT TTT TTG CAT ACTGCG GCC −３′ オリゴ−２ ５′−GCA ATG GCC TGG ATC CAT GGC GCG
CTA GCA TCG ATA TCTAGA GCT CGA GCA −３′
【０２３１】オリゴ−３ ５′−TGC AGA TCT GAA TTC
CCG GGT ACC AAG CTT ACG CGT ACTAGT GCG GCC GCT −
３′ オリゴ−４ ５′−AAT TAG CGG CCG CAC TAG TAC GCG
TAA GCT TGG TAC CCGGGA ATT −３′ オリゴ−５ ５′−CAG ATC TGC ATG CTC GAG CTC TAG
ATA TCG ATG CTA GCGCGC CAT GGA TCC −３′ オリゴ−６ ５′−AGG CCA TTG CGG CCG CAG TAT GCA
AAA AAA AGC CCG CTCATT AGG CGG GCT −３′
【０２３２】このプラスミドは、マイクロインジェクシ
ョン用のベクター配列から単離することができる大挿入
断片を構築するための、稀少な切断性Not Ｉ部位により
隣接された大きなポリリンカーを含む。このプラスミド
は、pUC 系プラスミドに比べて比較的低コピー数である
pBR322に由来する（pGP1は複製開始点の近くにpBR322コ
ピー数調節領域を保持している）。低コピー数は挿入配
列の潜在的毒性を減少させる。加えて、pGP1は、アンピ
シリン耐性遺伝子と前記ポリリンカーとの間に挿入され
た、trpA由来の強力な転写ターミネーター配列〔Christ
ie, G.E.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4180 (1
981)〕も含む。これは、アンピシリンプロモーターから
起こる読み通し転写を防ぐことにより、或る種の挿入断
片に関係する毒性を減少させる。
【０２３３】プラスミドpPG2は、ポリリンカー中に追加
の制限部位（Sfi Ｉ）を導入するようにpGP1から誘導さ
れる。pGP1を MluＩと SpeＩで消化し、該プラスミドの
ポリリンカー部分の中の認識配列を切除する。このよう
に消化されたpGP1に次のアダプターオリゴヌクレオチド
を連結せしめてpGP2を作製する。
【０２３４】 5′CGC GTG GCC GCA ATG GCC A 3′ 5′CTA GTG GCC ATT GCG GCC A 3′ pGP2は MluＩ部位と SpeＩ部位の間に置かれた追加の S
fiＩ部位を含むこと以外はpGP1と同じである。これは挿
入断片を SfiＩで並びに NotＩで完全に切除することを
可能にする。 Ｂ．pRE3（ラットエンハンサー３′）の作製 ラット定常領域の下流に置かれたエンハンサー配列を重
鎖構成物中に導入する。
【０２３５】Petterssonら、Nature 344:165-168 (199
0)により記載された重鎖領域３′エンハンサーを単離
し、クローニングする。次のオリゴヌクレオチド： 5′CAG GAT CCA GAT ATC AGT ACC TGA AAC AGG GCT TGC
3′ 5′GAG CAT GCA CAG GAC CTG GAG CAC ACA CAG CCT TCC
3′ を使って、ラットIGH ３′エンハンサー配列をＰＣＲ増
幅せしめる。
【０２３６】こうして形成された３′エンハンサーをコ
ードする二本鎖ＤＮＡをBamHI とSphIで切断し、BamHI/
SphIで切断されたpGP2中にクローニングしてpRE3（ラッ
トエンハンサー３′）を得る。 Ｃ．ヒトＪ−μ領域のクローニング この領域の実質的部分を、λファージ挿入断片から単離
された２以上の断片を組み合わせることによりクローニ
ングする。図９を参照のこと。
【０２３７】オリゴヌクレオチド GGA CTG TGT CCC TGT
GTG ATG CTT TTG ATGTCT GGG GCCAAG を使って、全部
のヒトＪセグメントを含む6.3 kbBamHI ／HindIII 断片
〔Matsuda ら、EMBO J. 7: 1047-1051 (1988) ; Ravete
chら、Cell 27:583-591 (1981) 、これらは参考として
本明細書中に組み込まれる〕をヒトゲノムＤＮＡライブ
ラリーから単離する。
【０２３８】オリゴヌクレオチド CAC CAA GTT GAC CTG
CCT GGT CAC AGA CCTGAC CAC CTATGA を使って、エン
ハンサー、スイッチおよび定常領域コードエクソンを含
む隣接の10 kb HindIII ／BamHI 断片〔Yasui ら、Eur.
J. Immunol. 19:1399-1403(1989) 〕を同様にして単
離する。プローブとしてクローンpMUM挿入断片（pMUM
は、μ膜エクソン１オリゴヌクレオチド：CCT GTG GAC
CAC CGC CTC CAC CTT CAT CGT CCT CTT CCT CCT を使っ
てヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離された4 kb E
coRI／HindIII 断片である）を使って隣接の３′1.5 kb
BamHI 断片を同様に単離し、そしてpUC19 中にクローニ
ングする。
【０２３９】pGP1をBamHI とBgl IIで消化した後、子ウ
シ腸アルカリホスファターゼで処理する。図９からの断
片（ａ）および（ｂ）を前記消化pGP1中にクローニング
する。次いで５′BamHI 部位が BamHI／Bgl II融合によ
り破壊されるように置かれたクローンを単離する。それ
をpMU と命名する（図10参照）。pMU をBamHI で消化
し、図９からの断片（ｃ）を挿入する。HindIII 消化に
より方向性を確認する。生じたプラスミドpHIG1 （図1
0）は、ＪおよびＣμセグメントをコードする18 kb 挿
入断片を含有する。 Ｄ．Ｃμ領域のクローニング pGP1をBamHI とHindIII で消化し、次いで子ウシ腸アル
カリホスファターゼで処理する（図14）。このように処
理された図14の断片（ｂ）および図14の（ｃ）を、 Bam
HI／HindIII で切断したpGP1中にクローニングする。Hi
ndIII 消化により断片（ｃ）の正しい方向を確認し、Ｃ
μ領域をコードする12 kb 挿入断片を含むpCON1 を得
る。
【０２４０】pHIG1 は、Not Ｉ部位により隣接されたポ
リリンカー中に SfiＩ３′部位と SpeＩ５′部位を有す
る18 kb 挿入断片内にＪセグメント、スイッチおよびμ
配列を含む故に、再配列されたＶＤＪセグメントに使わ
れるだろう。pCON1 はＪ領域を欠き12 kb 挿入断片のみ
を含むこと以外はpHIG1 と同じである。再配列されたＶ
ＤＪセグメントを含む断片の作製におけるpCON1 の使用
については後で記載する。 Ｅ．γ−１定常領域のクローニング（pREG2 ） ヒトγ−１領域のクローニングは図16に描写される。
【０２４１】Yamamuraら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:2152-2156 (1986) は、組込み時に部分的に削除さ
れたトランスジーン構成物からの膜結合ヒトγ−１の発
現を報告している。彼らの結果は、３′BamHI 部位が、
5 kb未満のＶ−Ｃイントロンを有する経膜再配列されそ
してスイッチされたγ遺伝子コピーを含む配列の輪郭と
なることを指摘している。従って、再配列されていない
スイッチされていない遺伝子では、最初のγ−１定常エ
クソンの５′末端から5 kb未満のところで始まる配列中
にスイッチ領域全体が含まれる。
【０２４２】従ってそれは５′5.3 kb Hind III 断片中
に含まれる〔Ellison, J.W. ら、Nucleic.Acids Res.
10:4071-4079 (1982) ；これは参考として本明細書中に
組み込まれる〕。Takahashi ら、Cell 29:671-679 (19
82) （これは参考として本明細書中に組み込まれる）も
また、この断片がスイッチ配列を含むことを報告してお
り、この断片と7.7 kb Hind III −BamHI 断片とを合わ
せると我々がトランスジーン構成物に必要とする配列の
全部を含むに違いない。イントロン配列は、特定遺伝子
のイントロン中に存在する少なくとも15の連続ヌクレオ
チドのヌクレオチド配列である。
【０２４３】γ−１の第三エクソン（ＣH ３）に特異的
である次のオリゴヌクレオチドを使って、γ−１領域を
含むファージクローンを同定し単離する。 5′ TGA GCC ACG AAG ACC CTG AGG TCA AGT TCA ACT GG
T ACG TGG 3 ′ 7.7 kb Hind III −Bgl II断片（図11中の断片（ａ））
をHindIII ／Bgl IIで切断されたpRE3中にクローニング
してpREG1 を作製する。上流の5.3 kb Hind III 断片
（図11中の断片（ｂ））をHindIII 消化されたpREG1 中
にクローニングしてpREG2 を作製する。 BamHI／Spe Ｉ
消化により正しい方向を確かめる。 Ｆ．ＣγとＣμの結合 上述したプラスミドpHIG1 はヒトＪセグメントとＣμ定
常領域エクソンを含む。Ｃμ定常領域遺伝子セグメント
を含むトランスジーンを提供するために、pHIG1 をSfi
Ｉで消化した（図10）。プラスミドpREG2 も SfiＩで消
化し、ヒトＣγエクソンとラット３′エンハンサー配列
を含む13.5 kb 挿入断片を得た。それらの配列を連結
し、31.5 kb 挿入断片上にヒトＪセグメント、ヒトＣμ
定常領域、ヒトＣγ１定常領域およびラット３′エンハ
ンサー配列を含むプラスミド pHIG3′を作製した（図1
2）。
【０２４４】pCON1 を SfiＩで消化し、そしてpREG2 を
Sfi Ｉで消化して得られたヒトＣγ領域とラット３′エ
ンハンサーとを含むSfi Ｉ断片と連結せしめることによ
り、ヒトＣμおよびヒトＣγ１をコードするがＪセグメ
ントを含まない第二のプラスミドを作製する。得られた
プラスミドpCON（図12）は、ヒトＣμ、ヒトγ１および
ラット３′エンハンサー配列を有する 26 kbの NotＩ／
Spe Ｉ挿入断片を含有する。 Ｇ．Ｄセグメントのクローニング ヒトＤセグメントをクローニングするための方策は図13
に描写される。Ｄセグメントを含むヒトゲノムライブラ
リーからのファージクローンを、多様性領域配列〔Y. I
chihara ら、EMBO J. 7: 4141-4150 (1988) 〕に特異的
なプローブを使って同定しそして単離する。次のオリゴ
ヌクレオチドを使用する。
【０２４５】DXP1： ５′−TGG TAT TAC TAT GGT TCG
GGG AGT TAT TAT AAC CAC AGT GTC−３′ DXP4： ５′−GCC TGA AAT GGA GCC TCA GGG CAC AGT
GGG CAC GGA CAC TGT−３′ DN４： ５′−GCA GGG AGG ACA TGT TTA GGA TCT GAG
GCC GCA CCT GAC ACC−３′ オリゴ DXP1 を使って同定されたファージクローンか
ら、DLR1, DXP1, DXP'1およびDA1 を含む5.2 kb XhoＩ
断片（図13中の断片（ｂ））を単離する。
【０２４６】オリゴ DXP4 を使って同定されたファージ
クローンから、DXR4, DA4 およびDK4 を含む3.2 kb Xba
Ｉ断片（図13中の断片（ｃ））を単離する。図13中の断
片（ｂ），（ｃ）および（ｄ）を結合し、pGP1のXba Ｉ
／ XhoＩ部位中にクローニングして、10.6 kb 挿入断片
を含むpHIG2 を形成せしめる。このクローニングは連続
的に行われる。まず、図13の5.2 kb断片（ｂ）と図13の
2.2 kb断片（ｄ）を子ウシ腸アルカリホスファターゼで
処理し、そして XhoＩとXba Ｉで消化されたpGP1中にク
ローニングする。生じたクローンを該 5.2 kbおよび2.2
kb挿入断片を用いてスクリーニングする。5.2 kbおよ
び2.2 kb挿入断片での試験に陽性であるそれらのクロー
ンの半分が、BamHI 消化により確かめると正しい方向で
5.2 kb挿入断片を有する。次いで図13の3.2 kb XbaＩ断
片を、断片（ｂ）と（ｄ）を含むこの中間プラスミド中
にクローニングし、pHIG2 を形成せしめる。このプラス
ミドは、ユニーク５′Sfi Ｉ部位とユニーク３′Spe Ｉ
部位を有するポリリンカー中にクローニングされた多様
性セグメントを含む。完全なポリリンカーは NotＩ部位
により隣接される。 Ｈ．重鎖小遺伝子座の作製 下記は、１または複数のＶセグメンントを含むヒト重鎖
小遺伝子座の作製を説明する。
【０２４７】Newkirk ら、J. Clin. Invest. 81:1511-
1518 (1988) （これは参考として本明細書中に組み込ま
れる）のハイブリドーマ中に含まれるＶセグメントとし
て同定されたものに相当する再配列されていないＶセグ
メントを、次のオリゴヌクレオチド： 5′−GAT CCT GGT TTA GTT AAA GAG GAT TTT ATT CAC C
CC TGT GTC −3 ′ を使って単離する。
【０２４８】再配列されていないＶセグメントの制限地
図を調べて、消化すると３′および５′隣接配列と一緒
に再配列されていないＶセグメントを含む約2 kbの長さ
を有するＤＮＡ断片を提供するユニーク制限部位を同定
する。５′開始配列はプロモーターおよび他の調節配列
を含み、一方３′隣接配列はＶ−ＤＪ結合に必要な組換
え配列を提供するだろう。この約3.0 kbＶセグメント挿
入断片をpGB2のポリリンカー中にクローニングし、pVH1
を形成せしめる。
【０２４９】pVH1を SfiＩで消化し、得られた断片をpH
IG2 の SfiＩ部位にクローニングして pHIG5′を作製す
る。pHIG2 はＤセグメントのみを含むので、生成した p
HIG5′プラスミドはＤセグメントと一緒に単一のＶセグ
メントを含む。pHIG5 中に含まれる挿入断片のサイズ
は、10.6 kb ＋Ｖセグメント挿入断片のサイズである。
Not Ｉと SpeＩでの消化によりpHIG5 から挿入断片を切
り出す。Ｊ，ＣμおよびＣγ１セグメントを含む pHIG
3′を SpeＩと NotＩで消化し、そして上記配列とラッ
ト３′エンハンサーとを含む３kb断片を単離する。それ
らの２断片を一緒にして、 NotＩで消化されたpGP1中に
連結せしめ、Ｖセグメント、９つのＤセグメント、６つ
の機能的なＪセグメント、Ｃμ、Ｃγおよびラット３′
エンハンサーを含むpHIGを作製する。この挿入断片のサ
イズは約43 kb ＋Ｖセグメント挿入断片のサイズであ
る。 Ｉ．相同組換えによる重鎖小遺伝子座の作製 前の章で指摘したように、pHIGの挿入断片は単一のＶセ
グメントを使用すると約43〜45 kb である。この挿入断
片サイズは、プラスミドベクター中に容易にクローニン
グすることができる限界かまたはそれに近い。より多数
のＶセグメントの使用に備えるために、接合子またはＥ
Ｓ細胞内での相同組換えによってラット３′エンハンサ
ー配列、ヒトＣμ、ヒトＣγ１、ヒトＪセグメント、ヒ
トＤセグメントおよび多数のヒトＶセグメントを含むト
ランスジーンを形成する、重複ＤＮＡ断片の生体内相同
組換えを下記に記載する。
【０２５０】ヒトＪセグメントを含む6.3 kb BamHI／Hi
ndIII 断片（図９中の断片（ａ）を参照のこと）を、次
のアダプター： 5′GAT CCA AGC AGT 3′ 5′CTA GAC TGC TTG 3′ 5′CGC GTC GAA CTA 3′ 5′AGC TTA GTT CGA 3′ を使って、Mlu Ｉ／Spe Ｉで消化された pHIG5′中にク
ローニングする。
【０２５１】生成したプラスミドを pHIG5'O（重複）と
命名する。このプラスミド中に含まれる挿入断片はヒト
Ｖ，ＤおよびＪセグメントを含む。pVH1からの単一Ｖセ
グメントが使われる時、この挿入断片のサイズは約17 k
b ＋2 kbである。この挿入断片を単離し、そしてヒト
Ｊ，Ｃμ，γ１およびラット３′エンハンサー配列を含
む pHIG3′からの挿入断片と組み合わせる。両挿入断片
は、２つのＤＮＡ断片の間の約6.3 kbの重複部分に備え
るヒトＪ配列を含む。これらをマウス接合子中に同時注
入すると、生体内相同組換えが起こり、pHIG中に含まれ
る挿入断片と同等のトランスジーンを生成する。
【０２５２】このアプローチは生体内で形成されるトラ
ンスジーン中への多数のＶセグメントの付加に備える。
例えば、単一のＶセグメントを pHIG5′中に組み込む代
わりに、（１）単離されたゲノムＤＮＡ、（２）ゲノム
ＤＮＡから誘導された連結ＤＮＡ、または（３）合成Ｖ
セグメントレパートリーをコードするＤＮＡ、上に含ま
れる多数のＶセグメントを pHIG2の SfiＩ部位にクロー
ニングして pHIG5′VN を作製する。次いで図９のＪセ
グメント断片（ａ）を pHIG5′V N 中にクローニング
し、そして挿入断片を単離する。この挿入断片は、pHIG
3 ′から単離した挿入断片上に含まれるＪセグメントと
重複するＪセグメントと多数のＶセグメントを含むよう
になる。これをマウス接合子の核中に同時注入すると、
相同組換えが起こり、多数のＶセグメントおよび多数の
Ｊセグメント、多数のＤセグメント、Ｃμ領域、Ｃγ１
領域（全てヒト由来）並びにラット３′エンハンサー配
列をコードするトランスジーンを生成する。
【０２５３】実施例５ 軽鎖小遺伝子座の作製 Ａ．pEμ1 の作製 pEμ1 の作製は図16に描写される。オリゴ： 5′GAA TGG GAG TGA GGC TCT CTC ATA CCC TAT TCA GAA
CTG ACT 3 ′ を使ってファージクローンから678 bpの XbaＩ−EcoRI
断片〔J.Banerji ら、Cell 33:729-740 (1983) 〕にお
いてマウス重鎖エンハンサーを単離する。
【０２５４】このＥμ断片を、EcoRI 部位の平滑末端フ
ィルインにより、EcoRV ／Xba Ｉ消化されたpGP1中にク
ローニングする。生じたプラスミドをpEμ1 と命名す
る。 Ｂ．κ軽鎖小遺伝子座の作製 κ構成物は、少なくとも１つのヒトＶκセグメント、５
つのヒトＪκセグメント全部、ヒトＪ−Ｃκエンハンサ
ー、ヒトκ定常領域エクソン、および理想的にはヒト
３′κエンハンサーを含む〔K. Meyerら、EMBO J. 8:19
59-1964 (1989)〕。マウスのκエンハンサーはＣκから
9 kb下流である。しかしながら、ヒトではまだ同定され
ていない。加えて、該構成物はマウス重鎖Ｊ−Ｃμエン
ハンサーの１コピーも含む。
【０２５５】この小遺伝子座は次の４つの成分断片から
作製される： （ａ）マウス遺伝子座との類推によりヒトＣκエクソン
と３′ヒトエンハンサーとを含む16 kb Sma Ｉ断片； （ｂ）５つのＪセグメント全部を含む５′隣接5 kb Sma
Ｉ断片； （ｃ）pEμ1 から単離されたマウス重鎖イントロンエン
ハンサー（この配列は、Ｂ細胞発達のできるだけ初期に
軽鎖構成物の発現を誘導するために含まれる。重鎖遺伝
子は軽鎖遺伝子よりも初期に転写されるため、この重鎖
エンハンサーはおそらくイントロンκエンハンサーより
も早い段階で活性であろう。）；および （ｄ）１または複数のＶセグメントを含む断片。
【０２５６】この構成物の調製は次の通りである。ヒト
胎盤ＤＮＡをSmaIで消化し、電気泳動によりアガロース
上で分画する。同様に、ヒト胎盤ＤＮＡを BamHIで消化
し、電気泳動により分画する。SmaIで消化したゲルから
16 kb 画分を単離し、同様にBamHIで消化したＤＮＡを
含むゲルから11 kb 領域を単離する。16 kb Sma Ｉ画分
を、 XhoＩで消化されXho Ｉ制限消化生成物をフィルイ
ンするためにクレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼで処理さ
れているラムダFIX II (Stratagene, La Jolla, Califo
rnia) 中にクローニングする。16 kb Sma Ｉ画分の連結
はSma Ｉ部位を破壊するがXho Ｉ部位はそのまま残す。
【０２５７】11 kb BamHI 画分を、クローニング前に B
amHIで消化したラムダFIX II（Stratagene, La Jolla,
California）中にクローニングする。各ライブラリーか
らのクローンを、Ｃκ特異的オリゴ： 5′GAA CTG TGG CTG CAC CAT CTG TCT TCA TCT TCC CGC
CAT CTG 3 ′ を用いて探査する。
【０２５８】Ｃκが SmaＩに隣接するように、16 kb Xh
o Ｉ挿入断片をXho Ｉで切断されたpEμ1 中にサブクロ
ーニングする。生じたプラスミドをpKap1 と命名する。
上記Ｃκ特異的オリゴヌクレオチドを用いてλ EMBL3/B
amHIライブラリーを探査し、11 kb クローンを同定す
る。5 kb SmaＩ断片（図25の断片（ｂ））をサブクロー
ニングし、次いで SmaＩで消化されたpKap1 中に挿入す
る。正しい方向のＪセグメント、ＣκおよびＥμエンハ
ンサーを含むそれらのプラスミドをpKap2と命名する。
【０２５９】その後、１または複数のＶκセグメントを
pKap2 の MluＩ中にサブクローニングし、ヒトＶκセグ
メント、ヒトＪκセグメント、ヒトＣκセグメントおよ
びヒトＥμエンハンサーをコードするプラスミドpKapH
を生ぜしめる。pKapH を NotＩで消化することによりこ
の挿入断片を切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動
により精製する。こうして精製された挿入断片を上述の
如くマウス接合子の前核中にマイクロインジェクトす
る。 Ｃ．生体内相同組換えによるκ軽鎖小遺伝子座の作製 11 kb BamHI 断片を、その３′末端が SfiＩ部位の方に
向くように、BamHI で消化されたpGP1中にクローニング
する。生じたプラスミドをpKAPint と命名する。pKAPin
t 中のBamHI 部位とSpe Ｉ部位との間のポリリンカー中
に１または複数のＶκセグメントを挿入してpKapHVを作
製する。pKapHVの挿入断片を NotＩでの消化により切り
出し、そして精製する。pKap2 からの挿入断片を NotＩ
での消化により切り出し、精製する。それらの２断片の
各々は、pKapHVからの断片が、pKap2 から得られる挿入
断片中に含まれる5 kb SmaＩ断片と実質的に相同である
Ｊκセグメントを含む５kbのＤＮＡ配列を含むという点
で、相同性領域を含有する。それ故に、それらの挿入断
片は、マウス接合子中にマイクロインジェクトされると
相同組換えして、Ｖκ，ＪκおよびＣκをコードするト
ランスジーンを形成することができる。
【０２６０】実施例６ 免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子の再配列され発現されるコ
ピーに相当するゲノムクローンの単離 この実施例は、着目の免疫グロブリンを発現する培養細
胞からの免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子のクローニングを
記載する。そのような細胞は、与えられた免疫グロブリ
ン遺伝子の多数の対立遺伝子を含み得る。例えば、ハイ
ブリドーマは４コピーのκ軽鎖遺伝子を含み、その２コ
ピーは融合相手の細胞系からのものであり、２コピーは
着目の免疫グロブリンを発現するもとのＢ細胞からのも
のである。それらの４コピーのうち、数個が再配列する
ことができるという事実にもかかわらず、ただ１つだけ
が着目の免疫グロブリンをコードする。この実施例に記
載の手順は、κ軽鎖の発現コピーの選択的クローニング
を考慮したものである。 Ａ．二本鎖cDNA ヒトハイブリドーマもしくはリンパ腫からの細胞、また
は細胞表面形態もしくは分泌形態またはその両形態のκ
軽鎖含有IgM を合成する他の細胞系を、ポリＡ+ RNA の
単離に使用する。次いで該RNA を、逆転写酵素を使った
オリゴdT開始cDNAの合成に使用する。次いで一本鎖cDNA
を単離し、ポリヌクレオチドターミナルトランスフェラ
ーゼ酵素を使って３′末端にＧ残基を付加する。次いで
Ｇ末端が付けられた一本鎖cDNAを精製し、そしてプライ
マーとして次のオリゴヌクレオチド： 5′−GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG CCC CCC CCC C
CC − 3′ を使った第二鎖合成（ＤＮＡポリメラーゼ酵素により触
媒される）のための鋳型として用いる。
【０２６１】二本鎖cDNAを単離し、発現される免疫グロ
ブリン分子の重鎖および軽鎖をコードするmRNAの５′末
端のヌクレオチド配列を決定するために使用する。次い
で、それらの発現される遺伝子のゲノムクローンを単離
する。発現される軽鎖遺伝子のクローニング方法は、下
記のＢ部に要約される。 Ｂ．軽鎖 Ａ部に記載された二本鎖cDNAを変性せしめ、次のオリゴ
ヌクレオチドプライマー： 5′−GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG TCA TCA GAT G
GC GGG AAG ATG AAG ACA GAT GGT GCA − 3′ を使った第３巡目のＤＮＡ合成のための鋳型として使用
する。
【０２６２】このプライマーは、κ軽鎖情報の定常部分
に特異的な配列（TCA TCA GAT GGCGGG AAG ATG AAG ACA
GAT GGT GCA ）並びに新たに合成されるＤＮＡ鎖のＰ
ＣＲ増幅のためのプライマーとして使うことができるユ
ニーク配列（GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG ）を含
む。この配列を、次の２つのオリゴヌクレオチドプライ
マー： 5′−GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG −3 ′ 5′−GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG −3 ′ を使ってＰＣＲにより増幅せしめる。
【０２６３】ＰＣＲ増幅された配列をゲル電気泳動によ
り精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオ
チド： 5′−GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG −3 ′ を使うジデオキシ配列決定反応のための鋳型として使用
する。次いで、該配列の最初の42ヌクレオチドを使っ
て、免疫グロブリン情報が転写された遺伝子を単離する
ためのユニークプローブを合成する。このＤＮＡの合成
42ヌクレオチドセグメントを、以後ｏ−カッパと称する
ことにする。
【０２６４】Ig発現細胞系から単離しそして個別におよ
びSmaIを含む幾つかの異なる制限エンドヌクレアーゼと
対に組み合わせて消化したＤＮＡのサザンブロットを、
32Ｐ標識したユニークオリゴヌクレオチドｏ−カッパを
用いて探査する。ユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位
は、再配列されたＶセグメントの上流に同定される。次
いでIg発現細胞系からのＤＮＡを SmaＩおよび第二の酵
素（Ｖセグメントの内側に SmaＩ部位がある場合にはBa
mHI またはKpnI）で切断する。いずれかの生成した非平
滑末端をT4 DNAポリメラーゼ酵素で処理し、平滑末端化
ＤＮＡ分子を与える。次いで制限部位をコードするリン
カー（断片中にどの部位が存在しないかに応じてBamHI,
EcoRIまたは XhoＩ）を付加し、そして対応するリンカ
ー酵素で切断してBamHI, EcoRIまたは XhoＩ末端を有す
るＤＮＡ断片を与える。次いで該ＤＮＡをアガロースゲ
ル電気泳動によりサイズ分画し、発現されるＶセグメン
トを包含するＤＮＡ断片を含む画分をラムダEMBL3 また
はラムダFIX (Stratagene, La Jolla, California)中に
クローニングする。ユニークプローブｏ−カッパを使っ
て、Ｖセグメント含有クローンを単離する。陽性クロー
ンからＤＮＡを単離し、そしてpKap1 のポリリンカー中
にサブクローニングする。生じたクローンをpRKLと命名
する。
【０２６５】実施例７ 免疫グロブリン重鎖μ遺伝子の再配列され発現されるコ
ピーに相当するゲノムクローンの単離 この実施例は、着目の免疫グロブリンを発現する培養細
胞からの免疫グロブリン重鎖μ遺伝子のクローニングを
記載する。この実施例に記載の手順は、μ重鎖遺伝子の
発現コピーの選択的クローニングを考慮したものであ
る。
【０２６６】上述した如く、二本鎖cDNAを調製し単離す
る。この二本鎖cDNAを変性せしめ、次のオリゴヌクレオ
チドプライマー： 5′−GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG ACA GGA GAC G
AG GGG GAA AAG GGT TGG GGC GGA TGC − 3′ を使った３巡目のＤＮＡ合成のための鋳型として使用す
る。
【０２６７】このプライマーは、μ重鎖情報の定常部分
に特異的な配列（ACA GGA GAC GAGGGG GAA AAG GGT TGG
GGC GGA TGC ）並びに新たに合成されるＤＮＡ鎖のＰ
ＣＲ増幅のためのプライマーとして使うことができるユ
ニーク配列（GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG ）を含
む。この配列を、次の２つのオリゴヌクレオチドプライ
マー： 5′−GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG −3 ′ 5′−GTA CTC CAT ATC AGC TGG ATG AAG −3 ′ を使ってＰＣＲにより増幅せしめる。
【０２６８】ＰＣＲ増幅された配列をゲル電気泳動によ
り精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオ
チド： 5′−GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG −3 ′ を使ったジデオキシ配列決定反応のための鋳型として使
用する。次いで、該配列の最初の42ヌクレオチドを使っ
て、免疫グロブリン情報が転写された遺伝子を単離する
ためのユニークプローブを合成する。このＤＮＡの合成
42ヌクレオチドセグメントを、以後ｏ−ミューと称する
ことにする。
【０２６９】Ig発現細胞系から単離しそして個別におよ
びMluI（MluIは、ＪセグメントとμCH1 との間を開裂す
る稀少切断性酵素である）を含む幾つかの異なる制限エ
ンドヌクレアーゼと対に組み合わせて消化したＤＮＡの
サザンブロットを、32Ｐ標識したユニークオリゴヌクレ
オチドｏ−ミューを用いて探査する。ユニーク制限エン
ドヌクレアーゼ部位は、再配列されたＶセグメントの上
流に同定される。
【０２７０】次いでIg発現細胞系からのＤＮＡを MluＩ
と第二の酵素で切断する。次いで MluＩまたは SpeＩア
ダプターリンカーを末端に連結せしめ、切断して上流部
位をMluＩまたは SpeＩに変換する。次いで該ＤＮＡを
アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、発現され
るＶセグメントを包含するＤＮＡ断片を含む画分をプラ
スミドpGP1中に直接クローニングする。ユニークプロー
ブｏ−ミューを使ってＶセグメント含有クローンを単離
し、その挿入断片を MluＩでまたはMlu Ｉ／Spe Ｉで切
断されたプラスミドpCON2 中にサブクローニングする。
生じたクローンをpRMGH と命名する。
【０２７１】実施例８ ヒトκ小遺伝子座トランスジーンの作製 軽鎖小遺伝子座 κ軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒト
ゲノムＤＮＡファージライブラリーをスクリーニング
し、Ｊκ−Ｃ領域に及ぶクローンを単離した。Ｊκ1 を
含む5,7 kb ClaＩ／Xho Ｉ断片をＪκ2-5 とＣκを含む
13 kb XhoＩ断片と一緒にpGP1d 中にクローニングし、
そしてプラスミドpKcor を作製するのに使った。このプ
ラスミドは、4.5 kbの５′隣接配列と9 kbの３′隣接配
列と共に、Ｊκ1-5 、κインロトンエンハンサーおよび
Ｃκを含有する。それはＶセグメントのクローニング用
のユニークな５′Xho Ｉ部位と追加のシス作用性調節配
列の挿入用のユニークな３′Sal Ｉ部位も有する。Ｖκ遺伝子 Ｖκ軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒ
トゲノムＤＮＡファージライブラリーをスクリーニング
し、ヒトＶκセグメントを含むクローンを単離した。Ｄ
ＮＡ配列分析により機能的Ｖセグメントを同定した。そ
れらのクローンは、TATAボックス、リーダーと可変性ペ
プチド（２つのシステイン残基を含む）をコードする転
写解読枠、スプライス配列、および組換えヘプタマー−
12 bスペーサー−ノナマー配列を含有する。該クローン
のうちの３つをマッピングし、配列決定した。該クロー
ンのうちの２つ、65.5と65.8が機能的であり、それらが
TATAボックス、リーダーと可変性ペプチド（２つのシス
テイン残基を含む）をコードする転写解読枠、スプライ
ス配列、および組換えヘプタマー−12 bスペーサー−ノ
ナマー配列を含有すると思われる。３つめのクローン6
5.4は、非規準的組換えヘプタマーを含むことからＶκ
Ｉ偽遺伝子をコードすると思われる。
【０２７２】VkIII ファミリー遺伝子をコードする機能
的クローンのうちの１つＶκ 65-8を使って軽鎖小遺伝
子座構成物を作製した。pKC1 Ｖκ 65-8 を含む7.5 kb XhoＩ／Sal Ｉ断片を pKcorの
５′Xho Ｉ部位に挿入することにより、κ軽鎖小遺伝子
座pKC1（図38）を作製した。注入前に NotＩでの消化に
より該トランスジーン挿入断片を単離した。
【０２７３】精製した挿入断片を、受精した(C57BL/6×
CBA)Ｆ2 マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、
次いでHogan ら（Methods of Manipulating the Mouse
Embryo, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, New Y
ork)に記載の通りに、生存している胚を偽妊娠雌に移し
た。注入された胚から発育したマウスを、尾部ＤＮＡの
サザンブロット分析によりトランスジーン配列の存在に
ついて分析した。既知量のクローン化ＤＮＡを含有する
対照標準に比較したバンド強度により、トランスジーン
コピー数を評価した。それらの動物から血清を単離し、
そしてHarlowおよびLane (Antibodies: A Laboratory M
anual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yo
rk) により記載された通りに、トランスジーンによりコ
ードされるヒトIgκタンパク質の存在についてELISA に
より分析した。
【０２７４】マイクロタイタープレートウエルをヒトIg
κ（クローン 6E1, #0173, AMAC Inc., Westbrook, ME
）、ヒトIgＭ（クローン AF6, #0285, AMAC Inc., Wes
tbrook, ME ）およびヒトIgG1（クローンJL512, #0280,
AMAC Inc., Westbrook, ME ）に特異的なマウスモノク
ローナル抗体でコーティングした。血清試料を該ウエル
中に系列希釈し、そしてマウス免疫グロブリンとの交差
反応性を最少にするために予備吸着されているアフィニ
ティー精製済アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトIg
（多価）を使って特定の免疫グロブリンの存在を検出し
た。
【０２７５】図41は、８匹のマウス（I.D. #676, 674,
673, 670, 666, 665, 664 および496 ）からの血清のEL
ISA アッセイの結果を示す。それらのマウスの最初の７
匹はpKC1トランスジーン挿入断片が注入された胚から発
育し、そして８番目のマウスはpHC1トランスジーン（前
記）のマイクロインジェクションにより生まれたマウス
に由来する。pKC1注入胚からの７匹のマウスのうちの２
匹（I.D. #666 と664）は、ＤＮＡサザンブロット分析
により分析するとトランスジーン挿入断片を含んでおら
ず、５匹（I.D. #676, 674, 673, 670および665 ）は該
トランスジーンを含んでいた。
【０２７６】pKC1トランスジーン陽性動物の一匹を除く
全てが検出可能なレベルのヒトIgκタンパク質を発現
し、残りの一匹の非発現性動物はＤＮＡサザンブロット
分析に基づくと遺伝的モザイクであるらしい。pHC1陽性
トランスジェニックマウスはヒトIgＭとIgＧ1 を発現す
るがIgκを発現せず、これは該アッセイに使用する試薬
の特異性を証明する。pKC2 Ｖκ 65.5 を含む8 kb XhoＩ／Sal Ｉ断片をpKC1の５′
Xho Ｉ部位に挿入することにより、κ軽鎖小遺伝子座pK
C2を作製した。２つのＶκセグメントを含む生成トラン
スジーン挿入断片をマイクロインジェクション前に Not
Ｉでの消化により単離した。pKVe2 この構成物は、Ｊκの５′に1.2 kbの追加配列を含みそ
してＶκ65.8の３′の4.5 kbの配列を欠いていること以
外は、pKC1と同じである。該構成物は更に、マウス重鎖
Ｊ−ｍイントロンエンハンサー〔Banerji ら、Cell 3
3:729-740 (1982) 〕を含む0.9 kb XbaＩ断片と、下流
に挿入されたヒト重鎖Ｊ−ｍイントロンエンハンサー
〔Haydayら、Nature 307:334-340 (1984)〕を含む1.4
kb MluＩ−HindIII 断片を含有する。この構成物を、対
立遺伝子排除とイソタイプ排除を果たす軽鎖小遺伝子座
の初期再配列を開始する可能性について試験する。異な
るエンハンサー、即ちマウスまたはラットの３′κまた
は重鎖エンハンサー〔Meyer およびNeuberger, EMBO J.
8:1959-1964 (1989) ; Pettersonら、Nature 344:16
5-168 (1990)；これらは参考として本明細書中に組み込
まれる〕を有する類似構成物を作製することができる。再配列された軽鎖トランスジーン ヒトＢ細胞ＤＮＡからＰＣＲにより増幅され機能的に再
配列された軽鎖遺伝子を再構成するためにκ軽鎖発現カ
セットをデザインした。方策を図39に示す。ＰＣＲ増幅
させた軽鎖遺伝子を、κ軽鎖遺伝子65.5から単離した3.
7 kbの５′隣接配列を含むベクターpK5nx 中にクローニ
ングする。次いで、Ｊκ2-4 、Ｊκイントロンエンハン
サー、Ｃκおよび9 kbの下流配列を含むベクターpK31s
のユニーク XhoＩ部位中に、５′転写調節配列に融合さ
せたＶＪセグメントをクローニングする。生じたプラス
ミドは、再構成された機能的に再配列されたκ軽鎖トラ
ンスジーンを含有し、このトランスジーンは胚へのマイ
クロインジェクションのために NotＩで切り出すことが
できる。該プラスミドは追加のシス作用性調節配列の挿
入のために３′末端にユニーク SalＩ部位も含有する。
【０２７７】ヒト脾臓ゲノムＤＮＡ由来の再配列された
κ軽鎖遺伝子を増幅せしめるのに２つの合成オリゴヌク
レオチド（o-130, o-131）を使った。オリゴヌクレオチ
ドo-130 （gga ccc aga (g,c)gg aac cat gga a(g,a)
(g,a,t,c) ）は、ＶκIII ファミリー軽鎖遺伝子の５′
領域に相補的でありそしてリーダー配列の最初のＡＴＣ
と重複している。オリゴヌクレオチド o-131（gtg caa
tca att ctc gag ttt gac tac aga c ）は、Ｊκ１の約
150 bp ３′よりの配列に相補的であり、Xho Ｉ部位を
含む。それらの２つのオリゴヌクレオチドは、Ｊκ１セ
グメントに連結された再配列されたＶκIII 遺伝子に相
当するヒト脾臓ＤＮＡからの0.7 kbのＤＮＡ断片を増幅
する。
【０２７８】ＰＣＲ増幅されたＤＮＡを NcoＩと XhoＩ
で消化し、個々のＰＣＲ生成物をプラスミドpNN03 中に
クローニングした。５つのクローンのＤＮＡ配列を決定
すると、機能的ＶＪ連結（転写解読枠）を有する２つの
クローンが同定された。追加の機能的に再配列された軽
鎖クローンも収集される。機能的に再配列されたクロー
ンは上記軽鎖発現カセット（図39）中に個別にクローニ
ングすることができる。再配列された軽鎖構成物を用い
て生産されたトランスジェニックマウスを重鎖小遺伝子
座トランスジェニックマウスと交配せしめることによ
り、一次レパートリーの多様性の全てが重鎖により与え
られる完全にヒトの抗体のスペクトルを発現するマウス
株を生産することができる。
【０２７９】軽鎖多様性の１つの起源は体細胞突然変異
からであることができる。全ての軽鎖が様々な異なる重
鎖と結合する能力に関して同等であるわけではないの
で、各々が異なる軽鎖構成物を含有する異なるマウス株
を生成せしめ試験することができる。この方策の利点
は、再配列されていない軽鎖小遺伝子座の使用とは反対
に、容易に重鎖と対を作りすぐに重鎖ＶＤＪ連結が起こ
るような軽鎖を有することから生まれる軽鎖対立遺伝子
およびイソタイプ排除の増加である。この組み合わせ
は、完全にヒトの抗体を発現するＢ細胞の頻度の増加を
もたらし、かくしてヒトIg発現性ハイブリドーマの単離
を容易にすることができる。
【０２８０】プラスミドpIGM1, pHC1, pIGH1, pKC1およ
びpKC2の NotＩ挿入断片をアガロースゲル電気泳動によ
りベクター配列から単離した。精製されたそれらの挿入
断片を、受精した(C57BL/6×CBA) F2 マウスの前核中に
マイクロインジェクトし、そしてHogan らにより記載さ
れた通りに〔Hogan ら、Methods of Manipulating the
Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, New Y
ork (1986)〕、生存している胚を偽妊娠雌中に移した。
【０２８１】実施例９ 相同組換えによるマウスκ軽鎖遺伝子の不活性化 この実施例は、胎児性幹(ES)細胞中での相同組換えによ
るマウス内因性κ遺伝子座の不活性化に次いで、不活性
化されたκ対立遺伝子を有する標的ES細胞を初期マウス
胚（胚盤胞）中に注入することによるマウス生殖細胞系
中への変異遺伝子の導入を記載する。
【０２８２】方策は、Ｊκ遺伝子とＣκセグメントに及
ぶ遺伝子座の4.5 kbセグメントが削除されそして選択マ
ーカーneo により置き換えられているマウスκ遺伝子座
に相同なＤＮＡ配列を含むベクターを用いた相同組換え
によりＪκ遺伝子とＣκ遺伝子を欠失せしめることであ
る。κ標的ベクターの作製 プラスミドpGEM7(KJ1) (M.A. Rudnicki, Whitehead Ins
titute) は、クローニングベクター 7Zf(+) 中のマウス
ホスホグリセレートキナーゼ(pgk) プロモーター〔Xba
Ｉ／ TaqＩ断片；Adra，C.N.ら、Gene 60:65-74 (198
7) 〕の転写調節下に、トランスフェクトされたES細胞
の薬剤選択に使うネオマイシン耐性遺伝子(neo) を含
む。このプラスミドは、マウスpgk 遺伝子の３′領域に
由来する、neo 遺伝子にとって異種のポリアデニル化部
位〔Pvu II／HindIII 断片；Boer, P.H.ら、Biochemica
l Genetics 28:299-308 (1990) 〕も含む。このプラス
ミドをκ標的ベクターの作製のための出発点として使っ
た。第一段階はneo 発現カセットの３′のκ遺伝子座に
相同な配列を挿入することであった。
【０２８３】Ｃκ遺伝子座に特異的なオリゴヌクレオチ
ドプローブ： 5 ′−GGC TGA TGC TGC ACC AAC TGT ATC CAT CTT CCC
ACC ATC CAG − 3′ とＪκ遺伝子セグメントに特異的なオリゴヌクレオチド
プローブ： 5 ′−CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG
AAA CGT AAG − 3′ を使って、肝臓ＤＮＡから誘導されたゲノムファージラ
イブラリーから、マウスκ鎖配列（図25ａ）を単離し
た。
【０２８４】陽性ファージクローンから２断片におい
て、即ち1.2 kb BglII／Sac Ｉ断片と6.8 kb SacＩ断片
として、マウスＣκセグメントの３′に及ぶ8 kb BglII
／SacＩ断片を単離し、それを BglII／Sac Ｉで消化さ
れたpGEM(KJ1) 中にサブクローニングし、プラスミド p
NEO-K3′を作製した（図25ｂ）。Ｊκ領域の５′に及ぶ
1.2 kb EcoRI／Sph Ｉ断片も陽性ファージクローンから
単離した。この断片の SphＩ部位に SphＩ／Xba Ｉ／Bg
l II／EcoRI アダプターを連結せしめ、生じたEcoRI 断
片をneo 遺伝子および下流の３′κ配列と同じ５′→
３′方向で、 EcoRIで消化された pNEO-K3' に連結せし
め、pNEO-K5'3'（図25ｃ）を作製した。
【０２８５】次いで、Mansour ら、Nature 336: 348-3
52 (1988) （これは参考として本明細書中に組み込まれ
る）により記載されたようにして、相同組換え体を有す
るESクローンの富化に備えるために、該構成物中に単純
ヘルペスウイルス(HSV) チミジンキナーゼ(TK)遺伝子を
含めた。プラスミドpGEM7(TK) からHSV TKカセットを得
た。このカセットは、pGEM7(KJ1)について上述したのと
同様に、マウスpgk プロモーターとポリアデニル化配列
とにより隣接されたHSV TK遺伝子の構造配列を含む。pG
EM7(TK) の EcoRI部位を BamHI部位に変更し、そしてTK
カセットを BamHI／HindIII 断片として切り出し、pGP1
b 中にサブクローニングしてpGP1b-TKを作製した。この
プラスミドをXho Ｉ部位のところで線状化し、Ｊκの
５′からのゲノム配列とＣκの３′からのゲノム配列と
により隣接された neo遺伝子を含む、pNEO-K5'3'由来の
XhoＩ断片をpGP1b-TK中に挿入し、標的ベクターJ/C KI
（図25ｄ）を作製した。J/C K1を用いた相同組換え後の
ゲノムκ遺伝子座の推定構造を図25ｅに示す。κ対立遺伝子の標的不活性化によるES細胞の作製および
分析 使用したES細胞は、本質的には記載された通りに〔Robe
rtson, E. J., Teratocarcinomas and Embryonic Stem
Cells: A Practical Approach, E.J.Robertson編 (Oxfo
rd: IRL Press) 71-112 頁(1987)〕、分裂上不活性なSN
L76/7 支持細胞層〔McMahon およびBradley, A. Cell
62:1073-1085 (1990) 〕上で増殖させたAB-1系であっ
た。他の適当なES系としては、E14 系〔Hooperら、Natu
re 326:292-295 (1987)〕、D3系〔Doetschmanら、J. E
mbryol. Exp. Morph. 87:27-45(1985) 〕、およびCCE
系〔Robertson ら、Nature 323:445-448 (1986)〕が
挙げられるが、それらに限定されない。特異的な標的変
異を有するES細胞からマウス系統をうまく作製できるの
は、ES細胞の多分化能性（即ち、宿主胚盤胞中に注入さ
れれば、胚形成に参加することができ且つ生じた動物の
生殖細胞に貢献することができるそれらの能力）に依存
している。
【０２８６】任意の与えられたES細胞系の多分化能性
は、培養時間およびそれに取り払った注意によって異な
り得る。多分化能性についての唯一の決定的アッセイ
は、使用することになっているES細胞の特定集団がESゲ
ノムの生殖細胞伝達を行うことができるキメラ体を生成
することができるかどうかを決定することである。この
理由により、遺伝子標的の前に、AB-1細胞の親集団の一
部をC57B1/6J胚盤胞中に注入し、該細胞がキメラマウス
を生成できるかどうか、およびそれらのキメラ体の大部
分がESゲノムを子孫に伝達できるかどうかを確かめる。
【０２８７】κ鎖不活性化ベクターJ/C K1を NotＩで消
化し、そして記載された方法〔Hasty, P.R. ら、Nature
350:243-246 (1991)〕によりAB-1細胞中にエレクトロ
ポレートせしめた。エレクトロポレートされた細胞を10
0 mm皿上に2 〜5 ×106 細胞／皿の密度で塗抹した。24
時間後、G418（200 μg/mlの活性成分）およびFIAU（0.
5 μＭ）を培地に添加し、10〜11日に渡り薬剤耐性クロ
ーンを発達させた。クローンを採取し、トリプシン処理
し、２部分に分け、更に増殖させた。次いで、各クロー
ンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと
標的配列との間の相同組換えについて分析した。
【０２８８】サザンブロットハイブリダイゼーションに
よりＤＮＡ分析を行った。記載の如く〔Laird, P.W.
ら、Nucl. Acids Res. 19:4293 (1991)〕クローンから
ＤＮＡを単離し、 XbaＩで消化し、そして標特的プロー
ブとして図25ｅに指摘の800 bpEcoRI／Xba Ｉ断片を用
いて探査した。このプローブは野生型遺伝子座中の3.7k
b XbaＩ断片、および標的ベクターと相同組換えされた
遺伝子座中の標徴的な1.8 kbバンドを検出した（図25ａ
およびｅを参照のこと）。サザンブロット分析によりス
クリーニングした 901個のG418およびFIAU耐性クローン
のうち、７つのクローンがκ遺伝子のうちの１つへの相
同組換えを示す1.8 kb XbaＩバンドを表した。それらの
４つのクローンを更に BglII, Sac Ｉおよび PstＩ酵素
で消化し、κ遺伝子のうちの１つに該ベクターが相同的
に組み込まれたことを確認した。標徴的800 bp EcoRI／
Xba Ｉ断片（プローブＡ）を用いて探査すると、野生型
ＤＮＡの BglII, Sac ＩおよびPst Ｉ消化物がそれぞれ
4.1, 5.4, および7 kbの断片を生成し、一方標的された
κ対立遺伝子の存在はそれぞれ2.4, 7.5および5.7 kbの
断片により指摘された（図25ａおよびｅを参照のこ
と）。 XbaＩ消化物により検出された７つの陽性クロー
ンの全てが、κ軽鎖のところでの相同組換えに標徴的で
ある期待の BglII, Sac Ｉおよび PstＩ制限断片を示し
た。不活性化されたκ鎖を有するマウスの作製 前の章で記載した標的されたESクローンのうちの５つ
を、記載の如く〔Bradley, A. , Teratocarcinomas and
Embryonic Stem Cells: A Practical Approach,E.J. R
obertson 編 (Oxford: IRL Press), 113-151 頁(198
7)〕C57B1/6J胚盤胞中に注入し、そして偽妊娠雌の子宮
に移し、注入ES細胞から誘導された細胞と宿主の胚盤胞
との混合物に由来するキメラマウスを作製する。黒いC5
7B1/6J背景上において、ES細胞系由来のアグーチ皮膜着
色の量により、キメラ体へのES細胞の貢献の程度を外観
的に同定する。標的クローンの胚盤胞注入から得られた
子孫のほぼ半分がキメラであり（即ち、アグーチ並びに
黒い着色を示した）、それらの大部分が皮膜着色への過
剰のES細胞の貢献（70％以上）を示した。AB1 ES細胞は
XY細胞系であり、それらの高率キメラ体の大部分が、コ
ロニー形成された雄ES細胞による雌胚の性転換のために
雄であった。
【０２８９】雄のキメラをC57BL/6Jと交配させ、ESゲノ
ムの生殖細胞伝達の指標である優性のアグーチ皮膜色の
存在について子孫を観察する。それらのクローンのうち
の２つからのキメラ体が一貫してアグーチ子孫を生産し
た。κ遺伝子座の唯一のコピーが注入ESクローンに標的
されたので、各アグーチ子孫は変異遺伝子座を受け継ぐ
見込みを50％有した。尾部生検試料からの BglII消化Ｄ
ＮＡのサザンブロット分析により、標的ESクローンの同
定に用いたプローブ（プローブＡ、図25ｅ）を使って、
標的遺伝子のスクリーニングを行った。予想通り、アグ
ーチ子孫の約50％が4.1 kbの野生型バンドに加えて2.4
kbのハイブリダイズする BglIIバンドを示した。この結
果は、標的されたκ遺伝子座の生殖細胞伝達を証明す
る。
【０２９０】該変異に対して同型接合性のマウスを生成
せしめるために、異型接合体同士を交配し、そして上述
のようにして子孫のκ遺伝子型を決定した。予想通り、
異型接合体交配から３つの遺伝子型が誘導された：２コ
ピーの正常κ遺伝子座を有する野生型マウス、１コピー
の標的κ遺伝子と１つのＮＴκ遺伝子を有する異型接合
体、およびκ変異に対して同型接合性であるマウス。そ
れらの後者のマウスからのκ配列の欠失は、Ｊκに特異
的なプローブ（プローブＣ、図25ａ）を使ったサザンブ
ロットハイブリダイゼーションにより確認した。該Ｊκ
プローブのハイブリダイゼーションは異型接合性子孫と
野生型子孫からのＤＮＡ試料に観察されたが、一方で同
型接合体には全くハイブリダイゼーションシグナルが検
出されなかった。これは、標的変異の結果としての欠失
によりκ遺伝子座の両方のコピーが不活性化されている
新規マウス株の発生を証明する。
【０２９１】実施例10 相同組換えによるマウス重鎖遺伝子の不活性化 この実施例は、胎児性幹(ES)細胞中での相同組換えによ
る内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子の活性化を記
載する。方策は、ＪH 領域が削除されそして選択マーカ
ー遺伝子neo により置き換えられている重鎖配列を含む
ベクターとの相同組換えにより内因性重鎖Ｊセグメント
を欠失せしめることである。重鎖標的ベクターの作製 ＪH 4 特異的オリゴヌクレオチドプローブ： 5′−ACT ATG CTA TGG ACT ACT GGG GTC AAG GAA CCT C
AG TCA CCG − 3′ を使って、D3 ES 細胞系〔Gossler ら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A. 83:9065-9069 (1986) 〕から誘導され
たゲノムファージライブラリーから、ＪH 領域を含むマ
ウス重鎖配列（図26ａ）を単離した。
【０２９２】ＪH 領域に及ぶ3.5 kbのゲノムSac Ｉ／St
u Ｉ断片を陽性ファージクローンから単離し、それをSa
c Ｉ／Sma Ｉで消化されたpUC18 中にサブクローニング
した。生じたプラスミドをpuc18 J H と命名した。トラ
ンスフェクトされたES細胞の薬剤選別に用いるネオマイ
シン耐性遺伝子(neo) は、プラスミド pGEM7 (KJ1)の修
復変形から誘導された。文献中の報告〔Yenofskiら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 87: 3435-3439 (1990)〕
は、pGEM7 (KJ1) 中に使用されるneo 遺伝子の源として
働いた pMC1neo〔ThomasおよびCappechi，Cell 51: 50
3-512 (1987)〕を含む幾つかの常用の発現ベクターの n
eoコード配列の点変異を証明している。
【０２９３】この変異は neo遺伝子産物の活性を減少さ
せるが、該変異を含む制限断片を野生型 neoクローンか
らの対応配列と置き換えることにより修復された。pGEM
7 (KJ1) 中のHindIII 部位を合成アダプターの付加によ
って SalＩ部位に変更し、そして XbaＩ／Sal Ｉでの消
化によりneo 発現カセットを切り出した。次いで neo断
片の両端をＤＮＡ polＩのクレノウ形での処理により平
滑末端化し、pUC18 ＪH の NaeＩ部位中にサブクローニ
ングし、プラスミドpUC18 ＪH -neo（図26ｂ）を作製し
た。
【０２９４】標的ベクターの更なる作製は、プラスミド
pGP1b の誘導体において行った。pGP1b を制限酵素 Not
Ｉで消化し、アダプターとして次のオリゴヌクレオチ
ド： 5′−GGC CGC TCG ACG ATA GCC TCG AGG CTA TAA ATC T
AG AAG AAT TCC AGC AAA GCT TTG GC− 3′ と連結せしめた。
【０２９５】生じたプラスミド（pGETと命名）を使って
マウス免疫グロブリン重鎖標的構成物を構築した。Mans
our ら、Nature 336: 348-352 (1988) により記載され
たようにして、相同組換え体を有するESクローンの富化
に備えるために、該構成物中に単純ヘルペスウイルス(H
SV) チミジンキナーゼ(TK)遺伝子を含めた。プラスミド
pGEM(TK)からEcoRI とHindIII での消化によりHSV TK遺
伝子を得た。このTK DNA断片をpGMTのEcoRI 部位とHind
III 部位との間にサブクローニングし、プラスミドpGMT
-TK（図26ｃ）を作製した。
【０２９６】標的配列に対する広範な相同性領域を提供
するために、陽性ゲノムファージクローンから XhoＩで
のＤＮＡの限定消化および XbaＩでの部分消化により、
ＪH領域の５′に位置する5.9 kbのゲノムXba Ｉ／Xho
Ｉ断片を誘導した。図26ａに示されるように、このXba
Ｉ部位はゲノムＤＮＡ中には存在せず、むしろ陽性ファ
ージクローン中のクローン化ゲノム重鎖挿入断片にすぐ
に隣接するファージ配列から誘導される。この断片をXb
a Ｉ／Xho Ｉで消化されたpGMT-TK 中にサブクローニン
グし、プラスミド pGMT-TK-JH 5'（図27ｄ）を作製し
た。
【０２９７】作製の最終段階は、neo 遺伝子および隣接
するゲノム配列を含むpUC18 ＪH -neoからの2.8 kb Eco
RI断片の切除を含んだ。この断片をクレノウポリメラー
ゼにより平滑末端にし、同様に平滑末端化されたpGMT-T
K-ＪH 5'の XhoＩ部位中にサブクローニングした。生じ
た構成物ＪH KO1 （図27ｅ）は、ＪH 遺伝子座を隣接す
る6.9 kbのゲノム配列を含み、neo 遺伝子が中に挿入さ
れているＪH 領域に及ぶ2.3 kbの欠失を有する。図27ｆ
は、標的用構成物との相同組換え後の内因性重鎖遺伝子
の構造を示す。
【０２９８】実施例11 標的されたES細胞の生産および分析 本質的には記載された通りに〔Robertson, E.J.(1987)
Terato- carcinomas and Embryonic Stem Cells: A Pra
ctical Approach, E.J. Robertson編 (Oxford: IRL Pr
ess), 71-112頁〕、分裂上不活性なSNL76/7 支持細胞層
〔McMahon および Bradley, Cell 62: 1073-1085 (199
0)〕上でAB-1 ES 細胞を増殖させた。前の実施例に記載
した通り、標的指向性構成物ＪH KO1 によるES細胞のエ
レクトロポレーションの前に、ESゲノムの生殖細胞伝達
能力を有することが証明されたAB-1由来のキメラの作製
により、ES細胞の多分化能性を決定した。
【０２９９】重鎖不活性化ベクターＪH KO1 をNot Ｉで
消化し、そして記載された方法〔Hasty ら、Nature 35
0: 243-246 (1991) 〕によりAB-1細胞中にエレクトロポ
レートせしめた。エレクトロポレートされた細胞を100
mm皿上に1 〜2 ×106 細胞／皿の密度で塗抹した。24時
間後、G418（200 mg／mlの活性成分）およびFIAU（0.5m
M ）を培地に添加し、８〜10日間に渡り薬剤耐性クロー
ンを発達させた。クローンを採取し、トリプシン処理
し、２部分に分け、更に増殖させた。次いで、各クロー
ンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと
標的配列との間の相同組換えについて分析した。
【０３００】サザンブロットハイブリダイゼーションに
よりＤＮＡ分析を行った。記載の如く〔Laird ら、Nuc
l. Acids Res. 19:4293 (1991)〕クローンからＤＮＡ
を単離し、 StuＩで消化し、そしてプローブＡとして図
27ｆに示される500 bp EcoRI／Stu Ｉ断片を用いて探査
した。このプローブは野生型遺伝子座中の 4.7 kb Stu
Ｉ断片を検出し、一方で3 kbバンドは標的指向ベクター
と内因性配列の相同組換えに標徴的である（図26ａおよ
び27ｆを参照のこと）。サザンブロットハイブリダイゼ
ーションによりスクリーニングした525 個のG418および
FITU二重耐性クローンのうち、12個が標的指向ベクター
との組換えに標徴的な3 kb断片を含むことがわかった。
それらのクローンがＪH 遺伝子座のところに期待の標的
現象（図27ｆに示されるような）を示すことは、HindII
I 、Spe ＩおよびHpa Ｉでの更なる消化により確認され
た。
【０３０１】HindIII 、Spe ＩおよびHpa Ｉで消化され
たＤＮＡのサザンブロットへのプローブＡ（図27ｆ参
照）のハイブリダイゼーションは、野生型遺伝子座につ
いてはそれぞれ2.3 kb、＞10 kb および＞10 kb のバン
ドをもたらし、一方標的された重鎖遺伝子座については
それぞれ5.3 kb、3.8 kbおよび1.9 kbのバンドが予想さ
れる（図27ｆ参照）。 StuＩ消化物により検出された12
個の陽性クローンの全てが、標的ＪH 遺伝子に標徴的な
推定HindIII 、Spe ＩおよびHpa Ｉバンドを示した。加
えて、neo-特異的プローブ（プローブＢ、図27ｆ）を使
った12個のクローン全ての StuＩ消化物のサザンブロッ
ト分析は3 kbの推定断片のみを生じ、それらのクローン
が各々標的指向ベクターの単一コピーを含有することを
証明した。 ＪH 欠失を有するマウスの作製 前の章で記載した標的されたESクローンのうちの３つを
解凍し、記載の如く〔Bradley, A. (1987)Teratocarcin
omas and EmbryonicStem Cells: A PracticalApproach,
E.J. Robertson編 (Oxford: IRL Press), 113-151 頁
(1987)〕C57B1/6J胚盤胞中に注入し、そして偽妊娠雌の
子宮に移した。黒色C57B1/6J背景上において、ES細胞系
由来のアグーチ皮膜着色の量から、キメラ体へのES細胞
の貢献の程度を外観的に同定する。２つの標的クローン
の胚盤胞注入から得られた子孫のほぼ半分がキメラであ
り（即ち、アグーチ並びに黒い着色を示した）、３つ目
の標的クローンはキメラ動物を生じなかった。それらの
キメラ体の大部分が皮膜着色へのES細胞のかなりの貢献
度（70％以上）を示した。AB1 ES細胞はXY細胞系であ
り、キメラ体の大部分は、コロニー形成された雌胚が雄
ES細胞により性転換されたために雄であった。雄キメラ
をC57BL/6J雌と交配させ、ESゲノムの生殖細胞伝達の標
徴である優性のアグーチ皮膜色の存在について子孫を観
察する。
【０３０２】それらのクローンのうちの両方からのキメ
ラ体が一貫してアグーチ子孫を生産した。重鎖遺伝子座
の唯一のコピーが注入ESクローン中に標的されたので、
各アグーチ子孫は変異遺伝子座を受け継ぐ見込みを50％
有した。尾部生検試料からのStuＩ消化ＤＮＡのサザン
ブロット分析により、標的ESクローンの同定に用いたプ
ローブ（プローブＡ、図27f ）を使って、標的遺伝子の
スクリーニングを行った。予想通り、アグーチ子孫の約
50％が4.7 kbの野生型バンドに加えて約3 kbのハイブリ
ダイズする StuＩバンドを示した。この結果は、標的さ
れたＪH 遺伝子座の生殖細胞伝達を証明する。
【０３０３】該変異に対して同型接合のマウスを作製す
るために、異型接合体同士を交配し、そして上述のよう
にして子孫の重鎖遺伝子型を決定した。予想通り、異型
接合体交配から３つの遺伝子型が誘導された：２コピー
の正常ＪH 遺伝子座を有する野生型マウス、該遺伝子の
１つの標的コピーと１つの正常コピーを有する異型接合
体、およびＪH 変異に対して同型接合であるマウス。そ
れらの後者のマウスからのＪH 配列の欠失は、ＪH に特
異的なプローブ（プローブＣ、図26）を使ったサザンブ
ロットハイブリダイゼーションにより確認した。異型接
合性子孫と野生型子孫からのＤＮＡ試料において4.7 kb
断片へのＪH プローブのハイブリダイゼーションが観察
されたが、一方でＪH 変異体同型接合体からの試料には
全くシグナルが検出されなかった。これは、ＪH 配列の
欠失により重鎖遺伝子の両方のコピーが変異されている
新規マウス株の生成を証明する。
【０３０４】実施例12 重鎖小遺伝子座トランスジーン Ａ．大型ＤＮＡ配列をクローニングするためのプラスミ
ドベクターの作製 1. pGP1a プラスミドpBR322を EcoRIと StyＩで消化し、そして次
のオリゴヌクレオチド： オリゴ−42 5′−caa gag ccc gcc taa tga gcg ggc
ttt ttt ttg cat act gcg gcc gct − 3′ オリゴ−43 5′−aat tag cgg ccg cag tat gca aaa
aaa agc ccg ctc att agg cgg gct − 3′ と連結せしめた。
【０３０５】生じたプラスミド pGP1aを、稀少切断性制
限酵素 NotＩにより切除することができる非常に大型Ｄ
ＮＡ構成物をクローニングするために改変する。それ
は、trpA遺伝子に由来する強力な転写終結シグナル〔Ch
ristieら、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 78:4180 (198
1)〕の下流に（アンピシリン耐性遺伝子AmpRに関して）
NotＩ制限部位を含む。この終結シグナルは、AmpR遺伝
子からの読み通し転写を排除することにより、 NotＩ部
位中に挿入されるコード配列の潜在的毒性を低下させ
る。加えて、このプラスミドは、pBR322コピー数調節領
域を保持しているために pUCプラスミドに比較して低コ
ピー数である。この低コピー数も挿入配列の潜在的毒性
を更に低下させ、そしてＤＮＡ複製による大型挿入断片
に対する選択を減少させる。ベクター pGP1b, pGP1c, p
GP1dおよびpGP1f はpGP1a から誘導され、そして異なる
ポリリンカークローニング部位を含む。そのポリリンカ
ー配列を下記に与える。
【０３０６】
【化１】
【０３０７】それらの各プラスミドは大型トランスジー
ン挿入断片の作製に利用することができ、該挿入断片は
NotＩで切り出すことができ、その結果トランスジーン
ＤＮＡをマイクロインジェクション前にベクター配列か
ら精製することができる。 2. pGP1b pGP1a を NotＩで消化し、そして次のオリゴヌクレオチ
ド： オリゴ−47 5′−ggc cgc aag ctt act gct gga tcc
tta att aat cga tag tga tct cga ggc − 3′ オリゴ−43 5′−ggc cgc ctc gag atc act atc gat
taa tta agg atc cag cag taa gct tgc − 3′ と連結せしめた。
【０３０８】生じたプラスミド pGP1bは、 NotＩにより
隣接された短いポリリンカー領域を含む。これは、 Not
Ｉにより切除することができる大型挿入断片の作製を容
易にする。 3. pGPe 次のオリゴヌクレオチド： オリゴ−44 5′−ctc cag gat cca gat atc agt acc
tga aac agg gct tgc −3′ オリゴ−45 5′−ctc gag cat gca cag gac ctg gag
cac aca cag cct tcc −3′ を使って、ポリメラーゼ連鎖反応技術によりラット肝臓
ＤＮＡ由来の免疫グロブリン重鎖３′エンハンサー〔S.
Pettersonら、Nature344:165-168 (1990)〕を増幅せし
めた。
【０３０９】増幅生成物を BamHIとSph Ｉで消化し、そ
して BamHI／Sph Ｉで消化されたpNNO3 （pNNO3 は、記
載順に次の制限部位： NotＩ, BamHI, NcoＩ, Cla Ｉ，
EcoRV, XbaＩ, Sac Ｉ, Xho Ｉ, Sph Ｉ, Pst Ｉ, Bgl
II, EcoRI, SmaＩ, Kpn Ｉ,HindIII および NotＩを有
するポリリンカーを含む pUC由来のプラスミドである）
中にクローニングした。生じたプラスミドpRE3を BamHI
とHindIII で消化し、そしてラットIg重鎖３′エンハン
サーを含む挿入断片を、 BamHI／HindIII で消化された
pGP1b 中にクローニングした。生じたプラスミドpGPe
（図28および（化２）及び（化３））は、配列をクロー
ニングすることができそして次いで NotＩ消化によって
３′エンハンサーと一緒に切り出すことができる幾つか
のユニーク制限部位を含有する。
【０３１０】
【化２】
【０３１１】
【化３】
【０３１２】Ｂ．IgM を発現する小遺伝子座トランスジ
ーン pIGM1の作製 1. Ｊ−μ定常領域クローンの単離およびpJM1の作製 ファージベクターλEMBL3/SP6/T7 (Clonetech Laborato
ries, Inc., Palo Alto, CA)中にクローニングしたヒト
胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒト重鎖Ｊ領域特異
的オリゴヌクレオチド： オリゴ−１ 5′−gga ctg tgt ccc tgt gtg atg ctt
ttg atg tct ggg gcc aag − 3′ を用いてスクリーニングし、そしてファージクローンλ
1.3 を単離した。６つのＪセグメント全部並びにＤセグ
メントDHQ52 および重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー
を含む、6 kbのHindIII ／Kpn Ｉ断片をこのクローンか
ら単離した。同じライブラリーをヒトμ特異的オリゴヌ
クレオチド： オリゴ−２ 5′−cac caa gtt gac ctg cct ggt cac
aga cct gac cac cta tga − 3′ を用いてスクリーニングし、ファージクローンλ2.1 を
単離した。μスイッチ領域およびμ定常領域エクソンの
全部を含む、10.5 kb のHindIII ／Xho Ｉ断片をこのク
ローンから単離した。それらの２断片を、Kpn Ｉ／Xho
Ｉで消化されたpNNO3 と一緒に連結せしめ、プラスミド
pJM1を得た。 2. pJM2 ファージクローンλ2.1 から4 kbのXho Ｉ断片を単離し
た。該断片は、ある種のIgD 発現Ｂ細胞中でのμ遺伝子
のδ関連欠失に関与するいわゆるΣμ要素〔H.Yasui
ら、Eur. J. Immunol. 19:1399 (1989)；これは参考と
して本明細書中に組み込まれる〕を含む、pJM1の配列の
すぐ下流の配列を含有する。この断片をＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノウ断片で処理し、そして XhoＩで切断さ
れクレノウで処理されたpJM1と連結せしめる。生じたプ
ラスミドpJM2（図29）は、内部の XhoＩ部位を失ってい
るが、クレノウ酵素による不完全な反応の結果として
３′Xho Ｉを保持している。pJM2は完全なヒトＪ領域、
重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー、μスイッチ領域お
よびμ定常領域エクソン全部、並びにμ遺伝子のδ関連
欠失に関与する２つの0.4 kbの直接反復σμおよびΣμ
を含有する。 3. Ｄ領域クローンの単離およびpDH1の作製 次のヒトＤ領域特異的オリゴヌクレオチド： オリゴ−４ 5′−tgg tat tac tat ggt tcg ggg agt
tat tat aac cac agt gtc − 3′ を用いて、ヒト胎盤ゲノムライブラリーをＤ領域クロー
ンについてスクリーニングした。ファージクローンλ4.
1 とλ4.3 を単離した。Ｄ要素ＤK1，ＤN1およびＤ
M2〔Y. Ichihara ら、EMBO J. 7: 4141 (1988)〕を含む
5.5 kbの XhoＩ断片をファージクローンλ4.1 から単離
した。Ｄ要素ＤLR1 ，ＤXP1 ，ＤXP'1およびＤA1を含む
上流の隣接5.2 kb XhoＩ断片をファージクローンλ4.3
から単離した。それらのＤ領域 XhoＩ断片の各々をプラ
スミドベクターpSP72 (Promega, Madison, WI)の SalＩ
部位中にクローニングし、２配列を結合する XhoＩ部位
を破壊した。次いで上流断片を XhoＩと SmaＩで切り出
し、下流断片を EcoRVと XhoＩで切り出した。得られた
単離断片を SalＩで消化されたpSP2と一緒に連結せし
め、プラスミドpDH1を与えた。pDH1は、少なくとも７つ
のＤセグメントを含みXho Ｉ（５′）およびEcoRV
（３′）で切り出すことができる10.6kbの挿入断片を含
有する。 4. pCOR1 プラスミドpJM2をAsp718（Kpn Ｉのアイソシゾマー）で
消化し、そしてDNA ポリメラーゼＩのクレノウ断片を用
いて突出末端をフィルインした。次いで生じたDNA を C
laＩで消化し、挿入断片を単離した。この挿入断片をpD
H1の XhoＩ／EcoRV 挿入断片および XhoＩ／Cla Ｉ消化
pGPeと連結せしめ、pCOR1 を作製した（図30）。 5. pVH251 ２つのヒト重鎖可変領域セグメントＶH 251 とＶH 105
〔Humphries ら、Nature 331:446 (1988)〕を含む10.3
kb のゲノムHindIII 断片をpSP72 中にサブクローニン
グし、プラスミドpVH251を与えた。６． ｐＩＧＭ１ プラスミドpCOR1 を XhoＩで部分消化し、そしてpVH251
の単離Xho Ｉ／Sal Ｉ挿入断片を上流の XhoＩ部位にク
ローニングし、プラスミド pIGM1（図31）を作製した。
pIGM1 は、下記の配列要素の全部が NotＩでの消化によ
りベクター配列を含まない単一断片において単離するこ
とができそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェク
トすることができるように、２つの機能的ヒト可変領域
セグメント、少なくとも８つのヒトＤセグメント、６つ
のヒトＪH セグメント全部、ヒトμエンハンサー、ヒト
σμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン
全部およびヒトΣμ要素を、ラット重鎖３′エンハンサ
ーと共に含有する。 Ｃ．IgM とIgG を発現する小遺伝子座トランスジーンpH
C1の作製 1. γ定常領域クローンの単離 次のヒトIgG 定常領域遺伝子に特異的なオリゴヌクレオ
チド： オリゴ−29 5′−cag cag gtg cac acc caa tgc cca
tga gcc cag aca ctg gac − 3′ を用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングし
た。ファージクローンλ29.4とλ29.5を単離した。γス
イッチ領域を含むファージクローンλ29.4の 4 kbHindI
II 断片を使って、ファージベクターラムダ FIXTM II
(Stratagene, La Jolla, CA)中にクローニングされたヒ
ト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを探査した。ファージ
クローンλSg1.13を単離した。異なるγクローンのサブ
クラスを決定するために、鋳型として上記３つのファー
ジクローンの各々のサブクローンを使ってそしてプライ
マーとして次のオリゴヌクレオチド： オリゴ−67 5′−tga gcc cag aca ctg gac − 3′ を使って、ジデオキシ配列決定反応を実施した。
【０３１３】ファージクローンλ29.5とλS γ1.13は両
方ともγ１サブクラスであると決定された。 2. pγe1 γ１コード領域を含むファージクローンλ29.5の7.8 kb
Hind III 断片をpUC18 中にクローニングした。生じた
プラスミドpLT1を XhoＩで消化し、クレノウ断片で処理
し、そして再連結せしめて内部Xho Ｉ部位を破壊した。
生じたクローンpLT1xkをHindIII で消化し、挿入断片を
単離し、pSP72 中にクローニングしてプラスミドクロー
ンpLT1xks を作製した。ポリリンカー XhoＩ部位とヒト
配列由来のBamHI 部位のところでのpLT1xks の消化は、
γ１定常領域コードエクソンを含む7.6 kb断片を与え
た。この7.6 kb XhoＩ／BamHI 断片を、ファージクロー
ンλ29.5からの隣接の下流4.5 kb BamHI断片と一緒に、
XhoＩ／BamHI で消化されたpGPe中にクローニングし、
プラスミド pγe1を作製した。 pγe1は、ラット重鎖
３′エンハンサーに連結された、5 kbの下流配列と共に
γ１定常領域コードエクソンの全部を含有する。 3. pγe2 γ１スイッチ領域とスイッチ前繁殖不能転写物 (steril
e trans-cript)〔P. Siderasら、International Immuno
l. 1:631 (1989)〕の第一エクソンとを含む5.3 kbのHi
ndIII 断片をファージクローンλS γ1.13から単離し、
そして挿入断片の５′末端の近隣にポリリンカー XhoＩ
部位を有するpSP71 中にクローニングし、プラスミドク
ローンpSγ1sを作製した。pSγ1sの XhoＩ／Sal Ｉ挿入
断片をXho Ｉで消化された pγe1中にクローニングし、
プラスミドクローン pγe2を作製した（図32）。 pγe2
は、ラット重鎖３′エンハンサーに連結された、下流の
5kb配列と共に、γ１定常領域コードエクソン全部並び
に上流のスイッチ領域および繁殖不能転写物エクソンを
含有する。 4. pHC1 プラスミドpIGM1 を XhoＩで消化し、43 kb 挿入断片を
単離し、そして XhoＩで消化された pγe2中にクローニ
ングし、プラスミドpHC1を作製した（図31）。pHC1は、
下記の配列要素の全部が NotＩでの消化によりベクター
配列を含まない単一断片において単離しそしてマウス胚
の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニッ
ク動物を作製することができるように、ラット重鎖３′
エンハンサーと共に、２つの機能的ヒト可変領域セグメ
ント、少なくとも８つのヒトＤセグメント、６つのヒト
ＪH セグメント全部、ヒトＪ−μエンハンサー、ヒトσ
μ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全
部、ヒトΣμ要素、およびヒトγ１定常領域（関連のス
イッチ領域および繁殖不能転写物関連エクソンを含む）
を含有する。 Ｄ．IgM とIgG を発現する小遺伝子鎖トランスジーンpH
C2の作製 1. ヒト重鎖Ｖ領域遺伝子 VH49.8 の単離 ヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーラムダ FIXTM II (S
tratagene, La Jolla,CA)を、次のヒトVH1 ファミリー
特異的オリゴヌクレオチド： オリゴ−49 5′−gtt aaa gag gat ttt att cac ccc
tgt gtc ctc tcc aca ggt gtc − 3′ を用いてスクリーニングした。
【０３１４】ファージクローンλ49.8を単離し、そして
可変セグメントVH49.8を含む6.1 kbXbaＩ断片をpNNO3
中にサブクローニングし（ポリリンカー ClaＩ部位がVH
49.8の下流にそしてポリリンカー XhoＩ部位が上流にく
るように）、プラスミドpVH49.8 を作製した。この挿入
断片の800 bp領域を配列決定すると、VH49.8は転写解読
枠並びに完全なスプライシングシグナルおよび組換えシ
グナルを有することがわかり、よって該遺伝子が機能的
であることを指摘する（表２）（化４）（化５）。
【０３１５】
【化４】
【０３１６】
【化５】
【０３１７】2. pV2 プラスミドpUC12 中にサブクローニングされたヒトＶH
IVファミリー遺伝子ＶH 4-21〔I. Sanz ら、EMBO J. 8:
3741 (1989)〕を含む4 kb XbaＩゲノム断片をSmaＩとH
indIII で切り出し、ポリメラーゼＩのクレノウ断片で
処理した。平滑末端化された断片を、 ClaＩで消化され
クレノウで処理されたpVH49.8 中にクローニングした。
生じたプラスミド pV2は、挿入断片の３′末端のユニー
ク SalＩ部位および５′末端のユニーク XhoＩ部位を使
って、同じ方向でVH4-21の上流に連結された、ヒト重鎖
遺伝子VH49.8を含む。 3. pSγ1-5' 近隣の上流3.1 kb XbaＩ断片と一緒に0.7 kb XbaＩ／Hi
ndIII 断片（プラスミド pγe2中の 5.3 kb γ1 スイッ
チ領域含有断片のすぐ上流で且つそれに隣接した配列を
表す）をファージクローンλSg1.13から単離し、そして
HindIII ／XbaＩで消化された pUC18ベクター中にクロ
ーニングした。生じたプラスミドpSγ1-5'は、γ１イソ
タイプにスイッチする前のＢ細胞中に見つかる繁殖不能
転写物(sterile transcript)〔P. Siderasら、Internat
ional Immunol., 1: 631 (1989)〕の開始部位の上流の
配列を表す3.8 kb挿入断片を含む。該転写物はイソタイ
プスイッチの開始に関係があり、そして上流のシス作用
性配列はしばしば転写調節に重要であるので、繁殖不能
転写物の正しい発現および関連するスイッチ組換えを促
進するためにそれらの配列がトランスジーン構成物中に
含まれる。 4. pVGE1 pSγ1-5'挿入断片を SmaＩとHindIII で切り出し、クレ
ノウ酵素で処理し、そして次のオリゴヌクレオチドリン
カー： 5′−ccg gtc gac cgg − 3′ と連結せしめた。この連結生成物を SalＩで消化し、 S
alＩで消化されたpV2 に連結せしめた。
【０３１８】生じたプラスミドpVP は、２つの機能的ヒ
ト可変遺伝子セグメントVH49.8とVH4-21（表２（化４）
及び（化５）参照）の下流に連結された3.8 kbのγ１ス
イッチ５′隣接配列を含む。 SalＩでの部分消化および
XhoＩでの完全消化の後、アガロースゲル上での15kb断
片の精製により、pVP 挿入断片を単離する。次いで該挿
入断片を pγe2の XhoＩ部位中にクローニングし、プラ
スミドクローンpVGE1（図33）を作製する。pVGE1 は、
ヒトγ１定常遺伝子および関連のスイッチ領域の上流に
２つのヒト重鎖可変遺伝子セグメントを含有する。可変
領域と定常領域との間のユニーク SalＩ部位を用いて、
Ｄ，Ｊおよびμ遺伝子セグメントをクローニングするこ
とができる。γ１遺伝子の３′末端にラット重鎖３′エ
ンハンサーが連結され、そして挿入断片全体は NotＩ部
位により隣接される。 5. pHC2 プラスミドクローン pVGE1をSal Ｉで消化し、pIGM1 の
Xho Ｉ挿入断片をその中にクローニングした。生じたク
ローンpHC2（図31）は、４つの機能的ヒト可変領域セグ
メント、少なくとも８つのＤセグメント、６つのヒトＪ
H セグメント全部、ヒトＪ−μエンハンサー、ヒトσμ
要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全
部、ヒトΣμ要素、およびヒトγ１定常領域（繁殖不能
転写物開始部位の上流の4 kb隣接配列と共に、関連のス
イッチ領域と繁殖不能転写物関連エクソンを含む）を含
有する。
【０３１９】それらのヒト配列は、前記配列要素全部を
NotＩでの消化によりベクター配列を含まない単一鎖上
に単離しそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェク
トしてトランスジェニック動物を生ぜしめることができ
るように、ラット重鎖３′エンハンサーに連結される。
該挿入断片の５′末端のユニーク XhoＩ部位を使って、
追加のヒト可変遺伝子セグメントをその中にクローニン
グし、この重鎖小遺伝子座の組換え多様性を更に増大さ
せることができる。 Ｅ．トランスジェニックマウス プラスミドpIGM1 およびpHC1の NotＩ挿入断片をアガロ
ースゲル電気泳動によりベクター配列から単離した。精
製された挿入断片を、受精した（C57BL/6 × CBA）F2マ
ウスの胚の前核中にマイクロインジェクトし、そして生
存している胚を、Hogan らにより記載された通りに（B.
Hogan, F. Costantini およびE. Lacy,Methods of Man
ipulating the Mouse Embryo, 1986, Cold Spring Harb
or Laboratory, New York）偽妊娠した雌に移した。注
入された胚から発育したマウスを、尾部ＤＮＡのサザン
ブロット分析によりトランスジーン配列の存在について
分析した。既知量のクローン化ＤＮＡを含有する対照標
準物に比較したバンド強度により、トランスジーンコピ
ー数を評価した。
【０３２０】３〜８週齢において、それらの動物から血
清を単離し、そしてHarlowおよびLane (E. Harlow およ
びD. Lane,Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, C
oldSpring Harbor Laboratory, New York) により記載
されたように、トランスジーンによりコードされるヒト
IgＭおよびIgＧ1 の存在について ELISAによりアッセイ
した。マイクロタイタープレートのウエルを、ヒトIgＭ
に特異的なマウスモノクローナル抗体（クローンAF6, #
0285, AMAC, Inc. Westbrook, ME）およびヒトIgＧに特
異的なマウスモノクローナル抗体（クローンJL512, #02
80, AMAC, Inc.Westbrook, ME）によりコーティングし
た。該ウエル中に血清試料を連続的に希釈し、予備吸着
させることによってマスウ免疫グロブリンとの交差反応
性を最小限にしたアフィニティー単離されたアルカリホ
スファターゼ接合ヤギ抗ヒトIg（多価）を用いて、特異
的免疫グロブリンの存在を検出した。
【０３２１】表１と図34は、プラスミドpHC1のトランス
ジーン挿入断片を注入した胚から発育した２匹の動物の
血清中のヒトIgＭおよびIgＧ1 の存在についてのELISA
アッセイの結果を示す。このアッセイにより試験した対
照の非トランスジェニックマウスは全て、ヒトIgＭおよ
びIgＧの発現について陰性であった。 pIGM1 NotＩ挿入
断片を含有する２系統のマウス（系統 #6 と15）はヒト
IgＭを発現するがヒトIgＧ1 を発現しない。我々はpHC1
挿入断片を含む６つの系のマウスを試験した。その結
果、４系統（系 #26, 38, 57および122 ）がヒトIgＭと
ヒトIgＧ1 の両方を発現し、２系統のマウス（系統 #19
および21）は検出可能なレベルのヒト免疫グロブリンを
発現しなかった。
【０３２２】ヒト免疫グロブリンを発現しなかったpHC1
トランスジェニックマウスは、マイクロインジェクトし
た胚から直接発育したものであり、該トランスジーンの
存在についてモザイクであり得る、いわゆるＧO マウス
であった。サザンブロット分析は、それらのマウスの多
くが細胞あたり該トランスジーンの１つまたは少数のコ
ピーを含むことを示した。pIGM1 トランスジェニック動
物の血清中のヒトIgＭ、並びにpHC1トランスジェニック
動物の血清中のヒトIgＭとIgＧ1 の検出は、トランスジ
ーン配列がＶＤＪ連結、転写およびイソタイプスイッチ
を指令することにおいて正しく機能しているという証拠
を提供する。１匹の動物 (#18)は、サザンブロット分析
によりトランスジーンについて陰性であり、検出可能レ
ベルのヒトIgＭまたはIgＧ1 を全く示さなかった。２番
目の動物(#38) は、サザンブロッティングによりアッセ
イすると該トランスジーンの約５コピーを含んでおり、
そして検出可能レベルのヒトIgＭとIgＧ1 の両方を示し
た。トランスジーンを注入した胚から発育した11匹の動
物についてのELISA アッセイの結果を下表（表１）に要
約する。
【０３２３】
【表１】
【０３２４】表１は、組み込まれたトランスジーンＤＮ
Ａの存在と血清中のトランスジーンによりコードされる
免疫グロブリンとの間の相関関係を示す。pHC1トランス
ジーンを含むことがわかった動物のうちの２匹は、検出
可能なレベルのヒト免疫グロブリンを発現しなかった。
それらは共に低コピー動物であり、該トランスジーンの
完全なコピーが含まれていないか、または該動物が遺伝
的モザイクを有している（動物#21 について評価された
細胞あたり＜１コピーにより指摘される）ことがあり、
そしてトランスジーン含有細胞が造血系統に移っていな
い場合がある。あるいは、トランスジーンがそれらの発
現に至らないゲノム領域中に組み込まれている場合があ
る。pIGM1 トランスジェニック動物の血清中のヒトIgＭ
の検出、並びにpHC1トランスジェニック動物の血清中の
ヒトIgＭとIgＧ1 の検出は、トランスジーン配列がＶＤ
Ｊ結合、転写およびイソタイプスイッチを指令する上で
正しく機能することを指摘する。 Ｆ．cDNAクローン ＶＤＪ連結およびクラススイッチ、並びにＢ細胞発達お
よび対立遺伝子排除におけるトランスジーンがコードす
るヒトＢ細胞レセプターの関与に関するpHC1トランスジ
ーンの機能性を評価するために、トランスジェニックマ
ウス脾臓mRNAから誘導した免疫グロブリンcDNAクローン
の構造を調べた。ＤおよびＪセグメント用法、Ｎ領域の
付加、CDR3の長さ分布、並びに機能的mRNA分子をもたら
す接合部の頻度に焦点を合わせて、該トランスジーンに
よりコードされる重鎖の総合的多様性を調べた。VH105
とVH251 を組み込んだIgM およびIgＧをコードする転写
物を調べた。
【０３２５】第11週の雄第二世代57系列pHC1トランスジ
ェニックマウスからポリアデニル化ＲＮＡを単離した。
このＲＮＡを使ってオリゴｄＴ開始一本鎖cDNAを合成し
た。次いで得られたcDNAを、次の４つの合成オリゴヌク
レオチドをプライマーとして使った４つの各ＰＣＲ増幅
反応のための鋳型として使用した： VH251特異的オリゴ
−149 ctagct cga gtc caa gga gtc tgt gcc gag gtg
cag ctg (g,a,t,c) ;VH105 特異的オリゴ−150 gtt gct
cga gtg aaa ggt gtc cag tgt gag gtg cagctg (g,a,
t,c) ; ヒトγ１特異的オリゴ−151 ggc gct cga gtt c
ca cga cac cgt cac cgg ttc ; およびヒトμ特異的オ
リゴ−152 cct gct cga ggc agc caa cgg cca cgc tgc
tcg 。反応１はプライマー o-149とo-151 を使って VH2
51−γ１転写物を増幅せしめ、反応２はプライマー o-1
49とo-152 を使って VH251−μ転写物を増幅せしめ、反
応３はプライマー o-150とo-151 を使ってVH105 −γ１
転写物を増幅せしめ、そして反応３はプライマーo-150
とo-152 を使って VH105−μ転写物を増幅せしめた。
【０３２６】得られた0.5 kbのＰＣＲ産物をアガロース
ゲルから単離した。対応するELISAデータ（図40）と一
致して、μ転写物産物はγ転写物産物よりも豊富であっ
た。ＰＣＲ産物を XhoＩで消化し、プラスミドpNN03 中
にクローニングした。４つのＰＣＲ増幅の各々からの９
個のクローンのミニプレプから二本鎖プラスミドＤＮＡ
を単離し、そしてジデオキシ配列決定反応を実施した。
該クローンのうちの２つがＤまたはＪセグメントを含ま
ない欠失体であることがわかった。それらは正常のＲＮ
Ａスプライシング生成物からは誘導することができなか
ったので、おそらくＰＣＲ増幅中に導入された欠失から
生じたのであろう。該ＤＮＡ試料のうちの１つは、２つ
の個々のクローンの混合物であることがわかり、そして
他の３つのクローンは読み取り可能なＤＮＡ配列を生成
しなかった（おそらくＤＮＡ試料が十分に純粋でなかっ
たためであろう）。
【０３２７】残りの30個のクローンからのＶＤＪ接合部
のＤＮＡ配列を（化６）（及び化７）にまとめた。各配
列はユニークであり、遺伝子再配列の単一経路が優性で
ないこと、またはトランスジーン発現性Ｂ細胞の単一ク
ローンが優性でないことを示す。どの２配列も類似して
いないという事実は、免疫グロブリンの莫大な多様性が
２個のＶセグメント、10個のＤセグメントおよび６個の
Ｊセグメントのみを含む小型の小遺伝子座から発現され
得るという暗示でもある。該トランスジーン中に含まれ
るＶセグメントの両方、６個のＪセグメントの全部およ
び10個のＤセグメントの７個がＶＤＪ接合部に使われ
る。
【０３２８】加えて、両定常領域遺伝子（μとγ１）が
転写物中に含まれる。VH105 プライマーは実施した反応
においてVH105 に特異的であることがわかった。従っ
て、反応３および４からのクローンの多くがVH251 転写
物を含んでいた。更に、連結反応３のＰＣＲ産物から単
離されたクローンはIgＧよりもむしろIgＭをコードする
ことがわかった；しかしながら、これは、ＤＮＡを同一
ゲル上で単離したため、反応４からのＰＣＲ産物による
汚染を表すかもしれない。成人末梢血リンパ球（ＰＢ
Ｌ）から免疫グロブリン重鎖配列を増幅せしめそしてＶ
ＤＪ接合部のＤＮＡ配列を決定した同様な実験が、細菌
Yamadaらにより報告された〔J. Exp. Med.173:395-407
(1991)；これは参考として本明細書中に組み込まれ
る〕。このヒトＰＢＬからのデータをpHC1トランスジェ
ニックマウスからの我々のデータと比較した。
【０３２９】
【化６】
【０３３０】
【化７】
【０３３１】Ｇ．Ｊセグメント選択 表２は、成人ＰＢＬ免疫グロブリン転写物中に見つかる
Ｊセグメントに対して、pHC1トランスジーンによりコー
ドされる転写物中に取り込まれるＪセグメントの分布を
比較した。それらの分布プロフィールは非常に類似して
おり、両系ともＪ４セグメントが優性セグメントであ
り、次いでＪ６セグメントが優性である。Ｊ２はヒトＰ
ＢＬ中およびトランスジェニック動物中で最も稀なセグ
メントである。
【０３３２】
【表２】
【０３３３】Ｈ．Ｄセグメント選択 Yamadaらにより分析されたクローンの49％（82のうち4
0）が、pHC1トランスジーン中に含まれるＤセグメント
を含んでいた。他の11クローンは、該著者らにより既知
Ｄセグメントのいずれにも指定されなかった配列を含ん
だ。それらの指定されなかった11個のクローンのうちの
２つは、pHC1構成物中に含まれるDIR2セグメントの逆位
から誘導されるようだ。Ichiharaら〔EMBO J. 7: 4141
(1988)〕により予想されそしてSanz〔J. Immunol. 147:
1720-1729 (1991)〕により観察されたこの機構を、Yama
daら〔J. Exp. Med. 171:395-407 (1991)〕は考慮に入
れなかった。表２は、pHC1トランスジェニックマウスに
ついてのＤセグメント分布とYamadaらによりヒトＰＢＬ
転写物について観察されたものとの比較である。Yamada
らのデータを、DIR2使用を包含しそしてpHC1トランスジ
ーン中にないＤセグメントを除外するように再編集し
た。
【０３３４】表３は、Ｄセグメント組み込みの分布がト
ランスジェニックマウスとヒトＰＢＬとにおいて非常に
類似していることを証明する。２つの優性なヒトＤセグ
メントDXP'1 とDN1 は、トランスジェニックマウス中に
も高頻度で見つかる。２つの分布間の最も大きな相違点
は、ヒトに比べてトランスジェニックマウス中でのDHQ5
2 の高頻度である。DHQ52 の高頻度はヒト胎児肝臓中の
Ｄセグメント分布を思い出させる。Sanzは重鎖転写物の
14％がDHQ52 配列を含んだことを報告している。pHC1中
に見つからないＤセグメントを分析から除外すれば、Sa
nzにより分析された胎児転写物の31％がDHQ52 を含んで
いる。これは、本発明者らがpHC1トランスジェニックマ
ウス中に観察した27％と同等である。
【０３３５】
【表３】
【０３３６】Ｉ．ＶＤＪ接合部の機能性 表４は、pHC1トランスジェニック動物から分析された30
個のクローンからのＶＤＪ領域の推定アミノ酸配列を示
す。翻訳配列は、30個のＶＤＪ接合部のうちの23個（77
％）が可変セグメントとＪセグメントに関して枠内（in
-frame）であることを示す。
【０３３７】
【化８】
【０３３８】
【化９】
【０３３９】Ｊ．CDR3の長さ分布 表４は、pHC1トランスジェニックマウス中の枠内ＶＤＪ
接合部を有する転写物からのCDR3ペプチドの長さをヒト
ＰＢＬ中のそれと比較したものである。ヒトＰＢＬデー
タは同じくYamadaらから得られたものである。両分布は
類似しているが、トランスジェニックマウスの分布はヒ
トＰＢＬから観察されたものよりもわずかに小さいCDR3
ペプチドの方に偏っていた。トランスジェニックマウス
におけるCDR3の平均長さは10.3アミノ酸である。これは
Sanz〔J. Immunol. 147:1720-1729 (1991)〕によりヒト
CDR3ペプチドについて報告された平均サイズと実質的に
同じである。
【０３４０】
【表４】
【０３４１】実施例13 再配列された重鎖トランスジーン Ａ．再配列されたヒト重鎖ＶＤＪセグメントの単離 ファージベクターλEMBL3/SP6/T7 (Clonetech Laborato
ries, Inc., Palo Alto, CA)中にクローニングされた２
種のヒト白血球ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒト重鎖
Ｊ−μイントロンエンハンサーを含むλ1.3 の1 kb Pac
Ｉ／HindIII 断片を用いてスクリーニングする。陽性ク
ローンを、次のＶH 特異的オリゴヌクレオチド： オリゴ−７ 5′−tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca
tct gga tac acc ttc acc − 3′ オリゴ−８ 5′−tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc
tct gga ttc acc ttc agt − 3′ の混合物とのハイブリダイゼーションについて試験す
る。
【０３４２】ＶプローブとＪ−μプローブの両方とハイ
ブリダイズするクローンを単離し、そして再配列された
ＶＤＪセグメントのＤＮＡ配列を決定する。 Ｂ．再配列されたヒト重鎖トランスジーンの作製 機能的ＶＪセグメントを含む断片（転写解読枠およびス
プライスシグナル）を、プラスミド由来の XhoＩ部位が
挿入断片配列の５′末端に隣接するように、プラスミド
ベクターpSP72 中にサブクローニングする。機能的ＶＤ
Ｊセグメントを含むサブクローンを XhoＩとPac Ｉ（Pa
c ＩはＪ−μイントロンエンハンサー近くの部位を認識
する稀少な切断酵素である）で消化し、そして挿入断片
を XhoＩ／Pac Ｉで消化されたpHC2中にクローニング
し、機能的ＶＤＪセグメント、Ｊ−μイントロンエンハ
ンサー、μスイッチ要素、μ定常領域コードエクソンお
よびγ１定常領域（これは繁殖不能転写物関連配列、γ
１スイッチおよびコードエクソンを含む）を有するトラ
ンスジーン構成物を作製する。上述したように、このト
ランスジーン構成物を NotＩで切り出し、そしてマウス
胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニ
ック動物を作製する。
【０３４３】実施例14 軽鎖トランスジーン Ａ．プラスミドベクターの作製 1. プラスミドベクターpGP1c プラスミドベクターpGP1a を NotＩで消化し、そして次
のオリゴヌクレオチド： オリゴ−81 5′−ggc cgc atc ccg ggt ctc gag gtc
gac aag ctt tcg agg atc cgc − 3′ オリゴ−82 5′−ggc cgc gga tcc tcg aaa gct tgt
cga cct cga gac ccg gga tgc − 3′ をその中に連結せしめる。生じたプラスミドpGP1c は、
NotＩ部位により隣接された XmaＩ,XhoＩ,SalＩ,Hind
III およびBamHI 制限部位を有するポリリンンカーを含
む。 2. プラスミドベクターpGP1d プラスミドベクターpGP1a を NotＩで消化し、そして次
のオリゴヌクレオチド： オリゴ−87 5′−ggc cgc tgt cga caa gct tat cga
tgg atc ctc gag tgc −3′ オリゴ−88 5′−ggc cgc act cga gga tcc atc gat
aag ctt gtc gac agc −3′ をその中に連結せしめる。生じたプラスミドpGP1d は、
NotＩ部位により隣接された SalＩ, HindIII,Cla Ｉ,B
amHIおよび XhoＩ制限部位を有するポリリンンカーを含
む。 Ｂ．ＪκおよびＣκクローンの単離 ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laborato
ries, Inc., Palo Alto, CA ）中にクローニングされた
ヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒトκ軽鎖Ｊ領
域特異的オリゴヌクレオチド： オリゴ−36 5′−cac ctt cgg cca agg gac acg act
gga gat taa acg taa gca − 3′ を用いてスクリーニングし、そしてファージクローン13
6.2 と136.5 を単離する。136.2 からＪκ1 セグメント
を含む7.4 kb XhoＩ断片を単離し、プラスミドpNNO3 中
にサブクローニングしてプラスミドクローンp36.2 を作
製する。Ｃκ遺伝子セグメントと共にＪκセグメント２
〜５を含む近隣の13 kb Xho Ｉ断片をファージクローン
136.5 から単離し、そしてプラスミドpNNO3 中にサブク
ローニングしてプラスミドクローンp36.5 を作製する。
それら２つのクローンを一緒にすると、Ｊκ1 の7.2 kb
上流で始まりＣκの9 kb下流で終わる領域に及ぶ。 Ｃ．再配列された軽鎖トランスジーンの作製 1. 再配列された可変セグメントを発現させるためのＣ
κベクターpCK1 Ｃκ遺伝子を含むプラスミドクローン p36.5の13 kb Xh
o Ｉ断片を、9 kbの下流配列と一緒に、該挿入断片の
５′末端がプラスミドXho Ｉ部位に隣接した状態で、プ
ラスミドベクターpGP1c のSal Ｉ部位中にクローニング
する。生じたクローンpCK1は、再配列されたＶＪκセグ
メントを含むクローン化断片をユニーク５′Xho Ｉ部位
に収容することができる。次いで該トランスジーンを N
otＩで切り出し、ゲル電気泳動によってベクター配列か
ら精製する。得られたトランスジーン構成物は、ヒトＪ
−Ｃκイントロンエンハンサーを含むであろうし、ヒト
３′κエンハンサーを含むことができる。 2. 再配列された可変セグメントを発現させるための重
鎖エンハンサー含有ＣκベクターpCK2 マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー〔J. Banerji
ら、Cell33: 729-740(1983)〕を含むマウスゲノムＤＮ
Ａの0.9 kb XbaＩ断片をpUC18 中にサブクローニング
し、プラスミドpJH22.1 を作製した。このプラスミドを
SphＩにより線状化し、クレノウ酵素を用いて末端をフ
ィルインした。クレノウ処理されたＤＮＡを次いでHind
III で消化し、そしてヒト重鎖μイントロンエンハンサ
ー〔Haydayら、Nature 307:334-340 (1984)〕を含むフ
ァージクローンλ1.3 （前の実施例）の MluＩ（クレノ
ウ）／HindIII 断片をそれと連結した。
【０３４４】生じたプラスミド pMHE1は、両者が単一の
BamHI／HindIII 断片上に切除されるように、pUC18 中
に一緒に連結されたマウスとヒトの重鎖μイントロンエ
ンハンサーから成る。この2.3 kb断片を単離し、pGP1c
中にクローニングして pMHE2を作製する。pMHE2 を Sal
Ｉで消化し、p36.5 の13 kb Xho Ｉ挿入断片をその中に
クローニングする。生じたプラスミドpCK2は、マウスと
ヒトの重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーがトランスジ
ーン挿入断片の３′末端に融合していること以外は、pC
K1と同一である。最終トランスジーンの発現を調節する
ために、異なるエンハンサー、即ちマウスまたはラット
の３′κまたは重鎖エンハンサー〔Meyer およびNeuber
ger, EMBO J. 8:1959-1964 (1989) ; Pettersonら、Na
ture 344:165-168 (1990)〕を使って類似構成物を作製
することができる。 3. 再配列されたκ軽鎖可変セグメントの単離 ファージベクターλEMBL3/SP6/T7 (Clonetech Laborato
ries, Inc., Palo Alto, CA)中にクローニングされた２
つのヒト白血球ゲノムＤＮＡライブラリーを、p36.5 の
3.5 kb XhoＩ／Sma Ｉ断片を含むヒトκ軽鎖Ｊ領域を用
いてスクリーニングした。陽性クローンを、次のＶκ特
異的オリゴヌクレオチド： オリゴ−65 5′−agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg
aca gac ttc act ctc acc atc agc − 3′ とのハイブリダイゼーションについて試験した。Ｖプロ
ーブとＪプローブの両方とハイブリダイズしたクローン
を単離し、そして再配列されたＶＪκセグメントのＤＮ
Ａ配列を決定する。 4. 再配列されたヒト軽鎖構成物を含有するトランスジ
ェニックマウスの作製 機能的ＶＪセグメントを含む断片（転写解読枠およびス
プライススグナル）をベクターpCK1およびpCK2の XhoＩ
部位中にサブクローニングし、再配列されたκ軽鎖トラ
ンスジーンを作製する。 NotＩでの消化により該トラン
スジーン構成物をベクター配列から単離する。アガロー
スゲル上で精製した挿入断片をマウス胚の前核中にマイ
クロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製
する。ヒトκ鎖を発現している動物を、重鎖小遺伝子を
含有するトランスジェニック動物（実施例14）と交配
し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを作る。
【０３４５】ＶＪκ組合せの全部が、広域スペクトルの
種々の重鎖ＶＤＪ組合せと安定な重鎖−軽鎖複合体を形
成できるわけではないので、それぞれ異なる再配列され
たＶＪκクローンを使って幾つかの異なる軽鎖トランス
ジーン構成物を作製し、そして重鎖小遺伝子座トランス
ジーンを発現するマウスと交配させる。二重トランスジ
ェニック（重鎖構成物と軽鎖構成物の両方）動物から、
末梢血、脾臓およびリンパ節リンパ球を単離し、ヒトお
よびマウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリンに特異的な
蛍光抗体（Pharmingen, San Diego, CA ）で染色し、そ
してFACScan 分析装置（Becton Dickinson, San Jose,
CA）を使ってフローサイトメトリーにより分析する。最
大数のＢ細胞の表面上に最高レベルのヒト重鎖／軽鎖複
合体を生じ且つ免疫細胞区分に悪影響を与えない（Ｂお
よびＴ細胞サブセット特異的抗体を用いたフローサイト
メトリー分析によりアッセイした時）再配列された軽鎖
トランスジーン構成物を、ヒトモノクローナル抗体の産
生のために選択する。 Ｄ．再配列されていない軽鎖小遺伝子座トランスジーン
の作製 1. 小遺伝子座トランスジーンを作製するためのＪκ，
Ｃκ含有ベクターpJCK1p36.5 の13 kb のＣκ含有 Xho
Ｉ挿入断片をクレノウ酵素で処理し、HindIIIで消化さ
れクレノウ処理されたプラスミドpGP1d 中にクローニン
グする。挿入断片の５′末端がベクター由来の ClaＩ部
位に隣接するようなプラスミドクローンを選択する。生
じたプラスミドp36.5-1dをCla Ｉで消化し、クレノウで
処理する。p36.2 のＪκ1 含有7.4 kb XhoＩ挿入断片を
クレノウで処理し、そして ClaＩで消化されクレノウ処
理されたp36.5-1d中にクローニングする。p36.2 挿入断
片がp36.5 挿入断片と同じ方向にあるクローンを選択す
る。このクローンpJCK1 （図35）は、7.2 kbの上流配列
および9 kbの下流配列と一緒に、完全なヒトＪκ領域お
よびＣκ領域を含む。
【０３４６】該挿入断片はヒトＪ−Ｃκイントロンエン
ハンサーも含み、ヒト３′κエンハンサーを含むことも
ある。該挿入断片は、追加の３′隣接配列、例えば重鎖
または軽鎖エンハンサーをクローニングする目的でユニ
ーク３′ SalＩ部位により隣接される。ユニーク XhoＩ
部位は、再配列されていないＶκ遺伝子セグメント中で
クローニングする目的で該挿入断片の５′末端に置かれ
る。ユニーク SalＩおよびXho Ｉ部位は、最終のトラン
スジーン構成物をベクター配列から単離するために使わ
れる NotＩ部位により隣接される。 2. 再配列されていないＶκ遺伝子セグメントの単離お
よびヒトIg軽鎖タンパク質を発現するトランスジェニッ
ク動物の作製 Ｖκ特異的オリゴヌクレオチドであるオリゴ−65（上
述）を使って、ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clon
etech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA ）中にクロ
ーニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡを探査する。生じ
たクローンからの可変遺伝子セグメントを配列決定し、
機能的と思われるクローンを選択する。機能性を判断す
るための基準は、転写解読枠、完全なスプライス受容体
および供与体配列、並びに完全な組換え配列を含むこと
である。
【０３４７】選択された可変遺伝子セグメントを含むＤ
ＮＡ断片をプラスミドpJCK1 のユニーク XhoＩ部位にク
ローニングし、小遺伝子座構成物を作製する。得られた
クローンを NotＩで消化し、挿入断片を単離し、そして
マウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランス
ジェニック動物を作製する。それらの動物のトランスジ
ーンは、Ｂ細胞発達の際にＶ−Ｊ結合を受けるであろ
う。ヒトκ鎖を発現する動物を、重鎖小遺伝子座を含有
するトランスジェニック動物と交配し、ヒト抗体を完全
に発現するマウスを得る。
【０３４８】実施例15 ゲノム重鎖ヒトIgトランスジーン この実施例は、接合子中へのマイクロインジェクション
またはES細胞中への組み込みによりマウス生殖細胞中に
導入される、ヒトゲノム重鎖免疫グロブリントランスジ
ーンのクローニングを記載する。
【０３４９】Marzluff, W.F.ら,(1985) Transcription
and Translation : A Practical Approach, B.D. Hamme
s およびS.J. Higgins編, 89-129頁, IRL Press, Oxfor
d により記載されたようにして、新鮮なヒト胎盤組織か
ら核を単離する。単離された核（またはPBS で洗浄した
ヒト精母細胞）を 0.5％低融点アガロースブロック中に
埋め込み、そして核については500mM EDTA, 1% SDS中の
１mg／mlのプロテイナーゼＫにより、精母細胞について
は500mM EDTA, 1% SDS, 10mM DTT中の１mg／mlのプロテ
イナーゼＫにより、50℃にて18時間溶解せしめる。該ブ
ロックを40μg/mlのPMSF／TE中で50℃にて30分間インキ
ュベートすることにより、プロテイナーゼＫを不活性化
する。次いでM. Finney によりCurrent Protocols in M
olecularBiology（F.Ausubel ら編, John Wiley & Son
s, 増補４, 1988, 例えば第2.5.1 章）中に記載された
ように、アガロース中で該ＤＮＡを制限酵素 NotＩで消
化する。
【０３５０】Not Ｉで消化したＤＮＡを、次いでAnand
ら, Nuc. Acids Res. 17:3425-3433(1989) により記載
されたようにパルスフィールドゲル電気泳動により分画
する。 NotＩ断片に富む画分をサザンハイブリダイゼー
ションによりアッセイし、この断片によってコードされ
る１または複数の配列を検出する。そのような配列は、
重鎖Ｄセグメント、Ｊセグメントおよびγ１定常領域と
共に６つのＶH ファミリー全部の代表物を含む〔この断
片は、Bermanら(1988), 前掲によればHeLa細胞から670
kb断片として同定されているけれども、本発明者らはそ
れがヒト胎盤および精子ＤＮＡからのは830 kb断片であ
ることを発見した〕。この NotＩ断片を含む画分（図４
参照）を記載の如く〔McCormick ら、Technique 2:65
-71 (1990)〕ベクターpYACNNの NotＩ部位中に連結せし
める。プラスミドpYACNNは、pYACneo (Clontech)を Eco
RIで消化しそしてオリゴヌクレオチド5 ′−AAT TGC GG
CCGC − 3′の存在下で連結せしめることにより、調製
される。
【０３５１】Traverら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:5898-5902 (1989) により記載された通りに、重鎖 N
otＩ断片を含むYAC ベクターを単離する。クローン化さ
れたNotＩ挿入断片を、 M. Finney（前掲）により記載
されたようなパルスフィールドゲル電気泳動により高分
子量酵母ＤＮＡから単離する。１mMスペルミンの添加に
よりＤＮＡを濃縮し、上述した通り単細胞胚の核に直接
マイクロインジェクトする。あるいは、ＤＮＡをパルス
フィールドゲル電気泳動により単離し、そしてリポフェ
クション〔Gnirkeら、EMBO J. 10:1629-1634(1991)〕に
よりES細胞中に導入するか、またはYAC をスフェロプラ
スト融合によりES細胞中に導入する。
【０３５２】実施例16 不連続ゲノム重鎖Igトランスジーン ＶH 6 、Ｄセグメント、Ｊセグメント、μ定常領域およ
び一部のγ定常領域を含むヒトゲノムＤＮＡの 85 kb S
peＩ断片は、本質的には実施例１に記載した通りのYAC
クローニングによって単離された。生殖細胞型可変領域
由来の断片、例えば多コピーのＶ1 〜Ｖ5 を含む上記の
670-830 kb NotＩ断片の上流の570 kb NotＩ断片、を含
有するYAC を上述の如く単離する。〔Bermanら(1988),
前掲は、各々が多数のＶセグメントを含有する２つの57
0 kb NotＩ断片を検出した。〕この２断片を実施例１に
記載の如くマウス単細胞胚の核中に同時注入する。
【０３５３】典型的には、２つの異なるＤＮＡ断片の同
時注入は、染色体内の同一部位のところへの両断片の組
込みをもたらす。従って、該２断片各々の少なくとも１
コピーを含む生じたトランスジェニック動物の約50％
が、定常領域含有断片の上流に挿入されたＶセグメント
断片を有する。それらの動物のうち、85 kb Spe Ｉ断片
の位置に関する570 kb NotＩ断片の方向性に依存して、
約50％がＤＮＡ逆位によりＶ−ＤＪ結合を行い、そして
約50％が欠失によりＶ−ＤＪ結合を行うだろう。生じた
トランスジェニック動物からＤＮＡを単離し、そしてサ
ザンブロットハイブリダイゼーションにより両方のトラ
ンスジーンを含んでいることが示された動物（詳しく
は、多数のヒトＶセグメントとヒト定常領域遺伝子の両
方を含む動物）を、標準技術に従って、ヒト免疫グロブ
リンを発現する能力について試験する。
【０３５４】実施例17 トランスジェニックＢ細胞中の機能的に再配列された可
変領域配列の同定 着目の抗原を使って、次の遺伝的特性：ＪH の欠失（実
施例10）については内因性所有鎖遺伝子座中の同型接合
性；再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座トランスジ
ーン（実施例５および14）の単一コピーについては半接
合性；および再配列されたヒトκ軽鎖トランスジーン
（実施例６および14）の単一コピーについては半接合
性、を有するマウスを免疫化する〔HarlowおよびLane,
Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r, New York (1988)を参照のこと〕。
【０３５５】免疫化スケジュールの後、脾臓を取り出
し、脾細胞を使ってハイブリドーマを調製する。着目の
抗原と反応性である抗体を分泌する個々のハイブリドー
マクローンからの細胞を使ってゲノムＤＮＡを調製す
る。ゲノムＤＮＡの試料を、ユニークな６塩基対配列を
認識する幾つかの異なる制限酵素で消化し、そしてアガ
ロースゲル上で分画する。サザンブロットハイブリダイ
ゼーションを使って２〜10kb範囲内の２つのＤＮＡ断片
を同定する。該断片の一方は、再配列されたヒト重鎖Ｖ
ＤＪ配列の単一コピーを含み、もう一方は再配列された
ヒト軽鎖ＶＪ配列の単一コピーを含む。それらの２断片
をアガロースゲル上でサイズ分画し、pUC18中に直接ク
ローニングする。クローン化された挿入断片を、定常領
域配列を含む重鎖および軽鎖発現カセット中にそれぞれ
サブクローニングする。
【０３５６】プラスミドクローン pγe1（実施例12）を
重鎖発現カセットとして使用し、再配列されたＶＤＪ配
列を XhoＩ部位中にクローニングする。プラスミドクロ
ーンpCK1を軽鎖発現カセットとして使用し、再配列され
たＶＪ配列を XhoＩ部位中にクローニングする。生じた
クローンを一緒に使ってSP0 細胞をトランスフェクトせ
しめ、着目の抗原と反応する抗体を産生せしめる〔M.S.
Co ら、Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88:2869 (199
1)〕。
【０３５７】あるいは、上述のクローン化ハイブリドー
マ細胞からmRNAを単離し、cDNAを合成するのに使う。発
現されるヒト重鎖および軽鎖ＶＤＪおよびＶＪ配列を、
次いでＰＣＲにより増幅し、クローニングする〔J. W.
Larrich ら (1989) Biol. Technology, 7:934-938 〕。
それらのクローンのヌクレオチド配列を決定した後、同
じポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを合成
し、そしてC. Queenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:5454-5458 (1989) により記載されたようにして合成
発現ベクターを作製する。複合抗原によるトランスジェニック動物の免疫化 次の実験は、トランスジェニック動物がヒト赤血球上の
抗原のような複合抗原により好結果に免疫化することが
でき、そして正常マウスにおいて観察される応答速度論
に類似した速度論で応答することができることを証明す
る。
【０３５８】血液細胞は一般に適当な免疫原であり、赤
血球と白血球の表面上には多数の異なる型の抗原を含ん
で成る。ヒト血液による免疫化 一人の提供者からのヒト血液のチューブを収集し、機能
的に破壊された内因性重鎖遺伝子座（ＪH Ｄ）を有し且
つヒト重鎖小遺伝子構成物(HC1) を含有するトランスジ
ェニックマウスを免疫化するのに使った。それらのマウ
スを系112 と命名する。血液を洗浄し、50mlのハンクス
溶液中に再懸濁し、 1×108 細胞／mlに希釈した。次い
で28ゲージの針と１ccの注射器を使って 0.2ml（2 ×10
7 細胞）を腹腔内注射した。この免疫化プロトコールを
６週間に渡りほぼ毎週繰り返した。眼窩後方出血から採
血し、血清を収集し、それを特異抗体について試験する
ことにより、血清抗体価をモニタリングした。免疫前出
血を対照として取った。まさしく最後の免疫化の時、血
清またはハイブリドーマを得るためにそれらの動物を犠
牲にする３日前に、ハイブリドーマの生産を増大させる
ために尾部静脈内への１×108 細胞による免疫化を１回
行った。
【０３５９】
【表５】
【０３６０】マウス# 2343と2348は所望の表現型を有す
る：重鎖破壊背景上のヒト重鎖小遺伝子トランスジェニ
ック。ハイブリドーマの作製 上述の通り免疫化された約16週齢のトランスジェニック
マウス（表５）のマウス脾細胞を非分泌性ＨＡＴ感受性
ミエローマ細胞系X63 Ag8.653 から成る融合相手と融合
せしめることにより、ハイブリドーマを作製した。ハイ
ブリドーマクローンを培養し、血液細胞抗原に対して特
異的な結合親和性を有する免疫グロブリンを含有するハ
イブリドーマ上清を、例えばフローサイトメトリーによ
り、同定した。フローサイトメトリー フローサイトメトリーを使って血清とハイブリドーマ上
清を試験した。提供者からの赤血球をハンクス溶液中で
４回洗浄し、50,000個の細胞を1.1 mlのポリプロピレン
微小管中に入れた。細胞をハイブリドーマからの上清ま
たは抗血清と共に染色媒質〔フェノールレッドまたはビ
オチン(Irvine Scientific) 、３％新生ウシ血清、0.1
％ナトリウムアジドを含まない１×RPMI培地〕中で氷上
で30分間インキュベートした。対照は他の遺伝子型を有
する同腹マウスから成った。次いで細胞をSorvall RT60
0B中で1000 rpmで５〜10分間４℃にて遠心することによ
り洗浄した。細胞を２回洗浄した後、蛍光生成試薬を使
って細胞表面上の抗体を検出した。２種類のモノクロー
ナル試薬を使って試験した。１つはFITCで標識されたマ
ウス抗ヒトμ重鎖抗体（Pharmagen, San Diego, CA）で
あり、もう１つはPEで標識されたラット抗マウスκ軽鎖
抗体（Becton-Dickenson, San Jose, CA）であった。そ
れらの試薬は両方とも同様な結果を与えた。全血（赤血
球と白血球）および白血球のみを標的細胞として使用し
た。両方の組が陽性結果を与えた。
【０３６１】トランスジェニックマウスおよび同腹対照
の血清を提供者からの赤血球または他の個体からの白血
球のいずれかと共にインキュベートし、洗浄し、次いで
抗ヒトIgＭ FITC 標識抗体により発色させ、フローサイ
トメーター中で分析した。結果は、ヒト小遺伝子座につ
いてトランスジェニックであるマウス（マウス 2343お
よび2348）からの血清がヒトIgＭ反応性を示し、一方全
ての同腹動物（2344,2345, 2346, 2347）からの血清は
該反応性を示さなかった。正常マウス血清（ＮＳ）とリ
ン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）を負の対照として使用し
た。赤血球は未濾過であり、白血球はリンパ球のみを含
むように濾過された。比較を与えるためにｘ軸とｙ軸上
に線が引かれている。融合体2348からの 100の上清に関
してフローサイトメトリーを実施した。４つの上清が血
球細胞抗原に対する陽性反応性を示した。
【０３６２】実施例18 アンチセンスＲＮＡによる内因性マウス免疫グロブリン
発現の減少 Ａ．アンチセンスＩｇ配列の発現用のベクター 1. クローニングベクターpGP1h の作製 ベクター pGP1b（前の実施例に記載）をXho ＩとBamHI
で消化し、そして次のオリゴヌクレオチド： 5′- gat cct cga gac cag gta cca gat ctt gtg aat t
cg -3′ 5′- tcg acg aat tca caa gat ctg gta cct ggt ctc g
ag -3′ と連結せしめてプラスミドpGP1h を作製した。このプラ
スミドは、次の制限部位： NotＩ, EcoRI, BglII, Asp7
18, Xho Ｉ, BamHI, Hind III, NotＩを含むポリリンカ
ーを含有する。
【０３６３】2. pBCE1 の作製 プロモーター−リーダー配列エクソン、第一イントロン
およびヒトＶH −Ｖファミリー免疫グロブリン可変遺伝
子セグメントの第二エクソンの一部を含む、pVH251（前
の実施例に記載）の0.8 kb XbaＩ／Bgl II断片を、Xba
Ｉ／Bgl IIで消化したベクターpNN03 中に挿入してプラ
スミドpVH251N を作製した。
【０３６４】ヒト成長ホルモン遺伝子〔hGH ; Seeburg
(1982)DNA 1:239-249 〕のコードエクソンを含む2.2
kb BamHI／EcoRI ＤＮＡ断片を、BamHI ／EcoRI で消化
したpGH1h中にクローニングした。生じたプラスミドを
BamHIで消化し、そしてpVH251N の BamHI／EcoRI 断片
をhGH 遺伝子と同じ方向において挿入し、プラスミドpV
hgh を作製した。
【０３６５】マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー
〔Banerji ら (1983) Cell 33:729-740〕を含むマウス
ゲノムＤＮＡの0.9 kb XbaＩ断片をpUC18 中にサブクロ
ーニングしてプラスミドpJH22.1 を作製した。このプラ
スミドを SphＩで直鎖状にし、末端をクレノウ酵素でフ
ィルインした。次いでクレノウ処理したＤＮＡをHindII
I で消化し、そしてヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハン
サー〔Haydayら (1984) Nature 307:334-340 〕を含む
ファージクローンλ1.3 （上記実施例）の1.4kb MluＩ
（クレノウ）／HindIII 断片をそれと連結せしめた。得
られたプラスミド pMHE1は、単一の BamHI／HindIII 断
片において切り出すことができるようにpUC18中に一緒
に連結されたマウスおよびヒトの重鎖Ｊ−μイントロン
エンハンサーから成る。
【０３６６】pMHE1 の BamHI／HindIII 断片を BamHI／
HindIII で切断されたpVhgh 中にクローニングし、Ｂ細
胞発現ベクター pBCE1を作製した。このベクター（図42
に描写）はユニーク XhoＩおよびAsp718クローニング部
位を含有し、その中にアンチセンスＤＮＡ断片をクロー
ニングすることができる。それらのアンチセンス配列の
発現は、上流の重鎖プロモーター−エンハンサー組み合
わせにより指令され、下流のhGH 遺伝子配列はイントロ
ン配列に加えてトランスジーン構成物の発現を促進する
ポリアデニル化配列を提供する。pBCE1 から作製された
アンチセンストランスジーン構成物は NotＩでの消化に
よりベクター配列から分離することができる。 Ｂ．IgM アンチセンストランスジーン構成物 下記オリゴヌクレオチド： 5′- cgc ggt acc gag agt cag tcc ttc cca aat gtc -
3′ 5′- cgc ctc gag aca gct gga atg ggc aca tgc aga -
3′ を、基質としてマウス脾臓cDNAを使ったポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）によるマウス IgM定常領域配列の増幅
のためのプライマーとして使用した。得られた0.3 kbの
ＰＣＲ産物をAsp718と XhoＩで消化し、そしてAsp718／
Xho Ｉで消化したpBCE1 中にクローニングしてアンチセ
ンストランスジーン構成物pMAS1 を作製した。pMAS1 の
精製済 NotＩ挿入断片を、単独でまたは１もしくは複数
の別のトランスジーン構成物と組み合わせて、半日マウ
ス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェ
ニックマウスを作製した。この構成物はマウスIgＭのmR
NAとハイブリダイズするＢ細胞中のＲＮＡ転写物を発現
し、よってマウスIgＭタンパク質の発現をダウンレギュ
レーションする。
【０３６７】pMAS1 とpHC1のようなヒト重鎖トランスジ
ーン小遺伝子座とを含有する二重トランスジェニックマ
ウス（両構成物の同時注入によるかまたは一重トランス
ジェニックマウスの交配により作製される）は、ヒト重
鎖小遺伝子座のみについてトランスジェニックであるマ
ウスよりも高い比率のＢ細胞上に、ヒトトランスジーン
によってコードされるIgレセプターを発現するだろう。
ヒト対マウスIgレセプター発現細胞の比は、一部はＢ細
胞の分化と発展を促進する因子および細胞に対する２集
団間の競争のためである。IgレセプターはＢ細胞発達に
おいて重要な役割を果たすので、表面上に減少したレベ
ルのIgＭを発現する（マウスIg特異的アンチセンスダウ
ンレギュレーションのため）マウスIgレセプター発現Ｂ
細胞も、ヒトレセプターを発現する細胞も競争しないだ
ろう。 Ｃ．Igκアンチセンストランスジーン構成物 次の２つのオリゴヌクレオチド： 5′- cgc ggt acc gct gat gct gca cca act gta tcc -
3′ 5′- cgc ctc gag cta aca ctc att cct gtt gaa gct -
3′ を、基質としてマウス脾臓cDNAを使ったポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）によるマウスIgκ定常領域配列の増幅
のためのプライマーとして使用した。得られた0.3 kbの
ＰＣＲ産物をAsp718とXho Ｉで消化し、そしてAsp718／
Xho Ｉで消化したpBCE1 中にクローニングしてアンチセ
ンストランスジーン構成物 pKAS1を作製した。pMAS1 の
精製済 NotＩ挿入断片を、単独でまたは１もしくは複数
の別のトランスジーン構成物と組み合わせて、半日マウ
ス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェ
ニックマウスを作製した。この構成物はマウスIgκ mRN
A とハイブリダイズするＢ細胞中のＲＮＡ転写物を発現
し、よってpMAS1 について上述したのと同様にマウスIg
κタンパク質の発現をダウンレギュレーションする。
【０３６８】実施例19 この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにお
ける好結果の免疫化と免疫応答を証明する。マウスの免疫化 １分子あたり 400以上のジニトロフェニル基と結合させ
たアオガイヘモシアニン（Calbiochem, La Jolla, Cali
fornia）（KLH-DNP)を以前発表された方法（Practical
Immunology, L. Hudson およびF.C. Hay, Blackwell Sc
ientific出版,第９頁，1980年）に従ってミョウバン沈
澱させた。ミョウバン沈澱させたKLH-DNP 400 μg を10
0 μｌのリン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中の臭化ジメ
チルジオクタデシルアンモニウム 100μg と一緒に各マ
ウスに腹腔内注射した。６日後に眼窩後洞出血により血
清試料を収集した。血清中のヒト抗体反応性の分析 間接エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ(ELI
SA) を使って抗体の反応性および特異性を評価した。免
疫原による抗体誘導を分析するために幾つかの標的抗原
を試験した。タンパク質成分に対する反応性の同定には
アオガイヘモシアニン（Calbiochem）、ハプテンおよび
／または修飾アミノ基に対する反応性の同定にはウシ血
清アルブミン、そして全免疫原に対する反応性の同定に
はKLH-DNP を使用した。抗原へのヒト抗体結合は、マウ
ス免疫グロブリンとの交差反応性を全く持たないIgＭお
よびIgＧサブクラスに特異的な酵素接合体により検出し
た。
【０３６９】簡単に言えば、ＰＢＳ中５μg/mlのタンパ
ク質を37℃にて一晩乾燥することによりマイクロタイタ
ープレートを抗原コーティングした。ＰＢＳ、５％ニワ
トリ血清、0.5 ％ Tween-20中に希釈した血清試料をウ
エル中で室温にて１時間インキュベートし、次いで同希
釈剤中の抗ヒトIgG FcおよびIgG F(ab')−西洋ワサビペ
ルオキシダーゼまたは抗ヒトIgM Fc−西洋ワサビペルオ
キシダーゼと共にインキュベートした。室温で１時間
後、ABTS基質（Sigma, St. Louis, Missouri）の添加に
より酵素活性を評価し、30分後に415-490 nmで読み取っ
た。トランスジェニックマウス中の免疫応答におけるヒト重
鎖の関与 図43は、KLH-DNP による免疫化に対する３匹の同腹子マ
ウスの応答を表す。第1296号のマウスは再配列されてい
ないヒトIgＭおよびIgＧトランスジーンを有し、マウス
Ig重鎖破壊について同型接合性であった。第1299号のマ
ウスは無破壊の背景上にトランスジーンを有し、1301号
のマウスはそれらの遺伝子組のいずれも遺伝しなかっ
た。別の同腹子である第1297号のマウスはヒトトランス
ジーンを有し、マウス重鎖破壊に関して半接合性であっ
た。それを非免疫化対照として実験に組み入れた。
【０３７０】結果は、ヒトIgＧとIgＭ応答は両方ともタ
ンパク質への接合という状況においてハプテンに対して
発生したことを証明する。ヒトIgＭはKLH に対しても発
生したが、この時点では有意なレベルのヒトIgＧは存在
しなかった。同じマウスからの免疫前血清試料では、同
じ標的抗原に対するヒト抗体の力価は有意でなかった。
【０３７１】実施例20 この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにお
けるヒト抗原による好結果の免疫化および免疫応答を証
明し、そしてヒトトランスジーンの可変領域配列中に無
作為でない体細胞変異が起こることを証明する。ヒト糖タンパク質抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖
を含んで成る抗体応答の証明 この実験に使用するトランスジェニックマウスは、機能
的内因性（マウス）重鎖生産の欠失をもたらすＪ領域の
ところへのトランスジーンの導入（前掲）により作製さ
れた機能的に破壊されたマウス免疫グロブリン重鎖遺伝
子座について同型接合性であった。該トランスジェニッ
クマウスは、少なくとも１つの完全な再配列されていな
いヒト重鎖小遺伝子座トランスジーン（HC1 、前掲）も
含み、該トランスジーンは単一の機能的ＶH 遺伝子（Ｖ
H 251 ）、ヒトμ定常領域遺伝子、およびヒトγ１定常
領域遺伝子を含んで成る。ヒト免疫グロブリントランス
ジーン産物を発現することが示されたトランスジェニッ
クマウス（前掲）をヒト抗原による免疫化のため選択
し、トランスジェニックマウスがヒト抗原免疫化に対し
て免疫応答を生じる能力を有することを証明した。HC1-
26系統のマウス３匹とHC1-57系統のマウス３匹（前掲）
にヒト抗原を注射した。
【０３７２】ミョウバン上に不溶化された精製済ヒト癌
胎児性抗原（ＣＥＡ）100 μg を不完全フロイントアジ
ュバント中で０日目に注射し、次いで更に７，14，21お
よび28日目に不完全フロイントアジュバント中のミョウ
バン沈澱ＣＥＡを毎週注射した。ＣＥＡの注射前の各日
に眼窩後方出血により血清試料を収集した。各グループ
中の３匹のマウスの各々から同容量の血清を分析用にプ
ールした。
【０３７３】マイクロタイタープレート上に固定化した
ヒトＣＥＡに結合したヒトμ鎖含有免疫グロブリンおよ
びヒトγ鎖含有免疫グロブリンをELISA アッセイにより
測定した。ヒトμ鎖含有免疫グロブリンおよびヒトγ鎖
含有免疫グロブリンについての ELISAアッセイの結果を
それぞれ図44および45に示す。７日目までは両系統につ
いて有意なヒトμ鎖Ig抗体価が検出され、約21日目まで
上昇が観察された。ヒトγ鎖Igについては、有意な抗体
価は遅れ、前者がHC1-57系統で14日目そして後者はHC1-
26系統で21日目に明らかになった。ヒトγ鎖Igの抗体価
は、実験の間じゅう時間と共に増加を示し続けた。観察
されたヒトμ鎖Ig応答は、平坦域に達した後、遅れて発
生する上昇し続けるγ鎖応答と組み合わせると、親和性
の成熟に伴って観察されるパターンに特徴的である。21
日目の試料の分析は、無関係の抗原であるアオガイヘモ
シアニン(KLH) に対する反応性の欠失を示した。これ
は、抗体応答が特異的な形でＣＥＡに対して向けられた
ことを指摘する。
【０３７４】それらのデータは、再配列されていないヒ
ト免疫グロブリン遺伝子座に関してトランスジェニック
である動物が、（１）ヒト抗原（例えばヒト糖タンパク
質、ＣＥＡ）に対して応答でき、（２）観察されたμか
らγへのクラススイッチにより例示されるようなイソタ
イプスイッチ（クラススイッチ）を受けることができ、
そして（３）それらの体液性免疫応答における親和性の
成熟の特徴を表すことを示す。一般に、それらのデータ
は、（１）ヒトIgトランスジェニックマウスが異種抗体
を誘導する能力を有すること、（２）単一のトランスジ
ーン重鎖可変領域が限定抗原に対して応答する能力を有
すること、（３）一次および二次応答形成に典型的な時
期に渡る応答速度論、（４）IgM からIgG への、トラン
スジーンによってコードされる体液性免疫応答のクラス
スイッチ、および（５）トランスジェニック動物がヒト
抗原に対してヒト配列抗体を産生する能力を有すること
を指摘する。ヒト重鎖トランスジーン小遺伝子座における体細胞変異
の証明 HC1 トランスジーンの多重コピーを含有するHC1-57系統
のトランスジェニックマウスを免疫グロブリン重鎖欠失
マウスと交配させ、HC1 トランスジーンを含み且つ内因
性マウス重鎖の両対立遺伝子に破壊を含むマウスを得た
（前掲）。それらのマウスは、マウスκおよびλ軽鎖と
共にヒトμおよびγ１重鎖を発現する（前掲）。それら
のマウスのうちの１匹を、1.5 カ月の期間に渡る反復腹
腔内注射により、ヒト癌胎児性抗原に対して高度免疫化
した。このマウスを犠牲にし、脾臓、鼠径部および腸間
膜のリンパ節、並びにパイヤー斑からリンパ系細胞を単
離した。該細胞を合わせ、全ＲＮＡを単離した。該ＲＮ
Ａから第一鎖cDNAを合成し、次の２つのオリゴヌクレオ
チドプライマー： 149 5'- cta gtc cga gtc caa gga gtc tgt gcc gag g
tg cag ctg(g/a/t/c) -3' 151 5'- ggc gct cga gtt cca cga cac cgt cac cgg t
tc -3' を用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。
【０３７５】それらのプライマーはVH251/γ1 cDNA配列
を特異的に増幅する。増幅された配列を XhoＩで消化
し、ベクターpNN03 中にクローニングした。23個のラン
ダムクローンの挿入断片のＤＮＡ配列を図46〜51に示
す；生殖細胞配列からの配列変異が指摘され、ドットは
配列が生殖細胞と同じであることを示す。VH251 トラン
スジーンの生殖細胞配列と該cDNA配列との比較は、クロ
ーンのうちの３個が完全に未変異であり、他の23個は体
細胞変異を含むことを明らかにした。
【０３７６】３個の未変異配列のうちの１つは枠外（ou
t-of-frame）ＶＤＪ連結に由来する。特定の位置におい
て観察された体細胞変異は、ヒトリンパ球において観察
されたものと同様な頻度で且つ同様な分布パターンで起
こる〔Cai ら (1992) J. Exp. Med. 176:1073；これは
参考として本明細書中に組み込まれる〕。体細胞変異の
総体的頻度は約１％である；しかしながら、CDR1内の頻
度は約５％にまで及び、抗原結合に影響を及ぼすアミノ
酸変化への選択を指摘する。これは、ヒト重鎖配列の抗
原指令型親和性成熟を証明する。
【０３７７】実施例21 この実施例は、組み換わると完全なヒト軽鎖小遺伝子座
トランスジーンを形成する２つの別々のポリヌクレオチ
ドを同時導入することによる、好結果のトランスジーン
の形成を証明する。２つの重複ＤＮＡ断片の同時注入による再配列されてい
ない軽鎖小遺伝子座トラ ンスジーンの作製 1. 再配列されていない機能的Ｖκ遺伝子セグメントvk
65.3, vk65.5, vk65.8およびvk65.15 の単離 Ｖκ特異的オリゴヌクレオチドであるオリゴ−65（5'-
agg ttc agt ggc agtggg tct ggg aca gac ttc act ctc
acc atc agc -3')を使って、ファージベクターλEMBL3
/SP6/T7 (Clonetech Laborat-ories, Inc., Palo Alto,
CA) 中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡラ
イブラリーを探査した。陽性ファージクローンからのＶ
κセグメントを含有するＤＮＡ断片をプラスミドベクタ
ー中にサブクローニングした。
【０３７８】得られたクローンからの可変遺伝子断片を
配列決定し、機能的であると思われるクローンを選択し
た。機能性を判断する基準は次のものを含む：転写解読
枠、完全なスプライス受容体および供与体配列、並びに
完全な組換え配列。この方法により単離された４つの異
なるプラスミドクローンからの４つの機能的 Ｖκ遺伝子セグメント（vk65.3, vk65.5, vk65.8および
vk65.15 ）のＤＮＡ配列を図52〜55に示す。４つのプラ
スミドクローン p65.3f, p65.5g1, p65.8 およびp65.15
f）を下記に説明する。 (1 a) p65.3f ファージクローンλ65.3の3 kb XbaＩ断片を、ベクター
由来のSal Ｉ部位が該挿入断片の３′末端に近位になり
且つベクター由来のBamHI 部位が該挿入断片の５′末端
に近位になるように pUC19中にサブクローニングした。
このクローンの3 kb BamHI／Sal Ｉ挿入断片を pGP1f中
にサブクローニングしてp65.3fを得た。 (1 b) p65.5g1 ファージクローンλ65.5の6.8 kb EcoRI断片を、ベクタ
ー由来のXho Ｉ部位が該挿入断片の５′末端に近位にな
り且つベクター由来の SalＩ部位が該挿入断片の３′末
端に近位になるようにpGP1f 中にサブクローニングし
た。得られたプラスミドをp65.5g1 と命名した。 (1 c) p65.8 ファージクローンλ65.8の 6.5 kb HindIII 断片をpSP7
2 中にクローニングしてp65.8 を得た。 (1 d) p65.15f ファージクローンλ65.16 の10 kb EcoRI 断片をpUC18
中にサブクローニングしてプラスミドp65.15.3を作製し
た。該プラスミド挿入断片中のＶκ遺伝子セグメントを
4.6 kb EcoRI／HindIII 小断片にマッピングし、これを
pGP1f 中にサブクローニングした。得られたクローン p
65.15fは、挿入断片の５′および３′末端にそれぞれユ
ニークXho Ｉ部位およびSal Ｉ部位が置かれている。 2. pKV4 p65.8 のXho Ｉ／Sal Ｉ挿入断片を p65.15fの XhoＩ部
位中にクローニングしてプラスミドpKV2を作製した。p6
5.5g1 のXho Ｉ／Sal Ｉ挿入断片をpKV2の XhoＩ部位中
にクローニングしてpKV3を作製した。pKV3のXho Ｉ／Sa
l Ｉ挿入断片をp65.3fの XhoＩ部位中にクローニングし
てプラスミドpKV4を作製した。このプラスミドは、４つ
の機能的Ｖκ遺伝子セグメントを含む単一の21 kb Xho
Ｉ／SalＩ挿入断片を含有する。Not Ｉを使って挿入断
片全体を切り出すことができる。 3. pKC1B (3 a) pKcor ヒトゲノムＤＮＡファージλクローンに由来する２つの
XhoＩ断片をプラスミドベクター中にサブクローニング
した。第一の断片である13 kb のＪκ２−Ｊκ５／Ｃκ
含有断片をクレノウ酵素で処理し、そしてHindIII で消
化されクレノウ処理されたプラスミドpGP1d 中にクロー
ニングした。挿入断片の５′末端がベクター由来のCla
Ｉ部位に近いプラスミドクローン（pK-31 ）を選択し
た。第二のXho Ｉ断片である、Ｊκ１を含有する7.4 kb
のＤＮＡ断片を、３′挿入断片XhoＩ部位がベクターSal
Ｉ部位への連結により破壊されるように、Xho Ｉ／Sal
Ｉで消化された pSP72中にクローニングした。
【０３７９】得られたクローンp36.2sは、Ｊκ１の4.5
kb上流に挿入断片由来のCla Ｉ部位、およびＪκ１とＪ
κ２の間に天然に存在するXho Ｉ部位の少し下流にポリ
リンカー由来の ClaＩ部位を含有する。このクローンを
Cla Ｉで消化して4.7 kb断片を遊離せしめ、該断片を正
しい５′→３′方向において、Cla Ｉで消化されたpK-3
1 中にクローニングし、全部で５個のヒトＪκセグメン
ト、ヒトイントロンエンハンサー、Ｃκ、4.5 kbの５′
隣接配列を含有するプラスミドを作製した。このプラス
ミドpKcor は、挿入断片のそれぞれ５′および３′側に
ユニークな隣接XhoＩ部位およびSal Ｉ部位を含有す
る。 (3 b) pKcorB ヒト３′κエンハンサーを含有する4 kb BamHI断片〔Ju
dde, J.G. およびMax,E.E., Mol. Cell Biol. 12:5206
(1992)；これは参考として本明細書中に組み込まれ
る〕を、５′末端がベクターのXho Ｉ部位に近位になる
ようにpGP1f 中にクローニングした。得られたプラスミ
ド p24BfをXho Ｉで切断し、pKcor の17.7kb Xho Ｉ／S
al Ｉ断片を該エンハンサー断片と同じ方向でその中に
クローニングした。得られたプラスミドpKcorBは、該挿
入断片の５′および３′末端にそれぞれユニークXho Ｉ
およびSal Ｉ部位を含有する。 (3 c) pKC1B pKcorBの XhoＩ／Sal Ｉ挿入断片をp65.3fのSal Ｉ部位
の中にクローニングして軽鎖小遺伝子座トランスジーン
プラスミド pKC1Bを作製した。このプラスミドは、５個
のＪκセグメント、ヒトイントロンエンハンサー、ヒト
Ｃκ、およびヒト３′κエンハンサーを含有する。この
25 kb 挿入断片全体を NotＩ消化により単離することが
できる。 4. Co4 プラスミドpKV4とpKC1B からの２つの NotＩ挿入断片を
各々2.5 μg/mlの濃度でマイクロインジェクション緩衝
液中に混合し、そして上記実施例に記載のようにして半
日マウス胚の前核中に同時注入した。生成したトランス
ジーン動物は、２断片が一緒に組み込まれたトランスジ
ーン挿入断片（Co4 と命名、図56に示した組換えの生成
物）を含有する。pKV4挿入断片の３′の3 kbとpKC1B 挿
入断片の５′の3 kbは全く同じである。幾つかの組み込
み現象は3 kbの共通配列に渡って２断片の間で相同組換
えが起こったことを表す。Co4 は遺伝子座はトランスジ
ェニックマウス中のヒト配列軽鎖のレパートリーの発現
を指令するだろう。
【０３８０】本発明の好ましい態様の今までの記載は、
例示および説明のために与えられる。それらは排他的で
あるつもりはなく、また本発明を正確な開示形態に制限
するつもりはない。上記教示に照らして多数の改良およ
び変更が可能である。本明細書中の全ての刊行物および
特許出願は、あたかも各々の刊行物または特許出願が明
確に且つ個別に参考として本明細書中に組み込まれると
指摘されたかのように、参考として本明細書中に組み込
まれる。
【０３８１】実施例２２ この例は、ヒトＩｇトランスジーンによりコードされる
ヒト免疫グロブリン鎖を含みかつ特異的免疫原と反応性
をもつモノクローナル抗体を分泌するマウスのハイブリ
ドーマクローンの産生の成功を実証している。
【０３８２】ヒト重鎖トランスジーン産物を取込むモノ
クローナル抗体の生成 １．ヒト重鎖トランスジーンを宿すマウスの免疫化 内因性重鎖遺伝子（上記実施例２０を参照）のノックア
ウト（すなわち機能的分断）について同型接合でトラン
スジーンをコードするヒト重鎖を含むマウスを、精製さ
れたヒトＣＥＡで免疫化し、その後適切な免疫応答期間
の後に脾細胞を収穫した。従来の技術を用いて（Kohler
及びMilstein, Eur.J.Immunol., ６：511-519 (1976)；
Harlow及びLane、「抗体：その研究所マニュアル、Cold
SpringHarbor, New York (1988) 参照）ハイブリドー
マを生成するべく、マウスの脾細胞をマウス骨髄腫細胞
と融合させた。免疫化のために用いられたマウスは、単
一の機能的ＶH 遺伝子（ＶH251）、ヒトＤ及びＪセグメ
ント、ヒトμ恒常領域、及びヒトγ１恒常領域遺伝子を
含むヒトの再配置されていない重鎖ミニ遺伝子座トラン
スジーンを内含していた。それが由来したトランスジェ
ニック系統はＨＣ１−５７（上記）と呼称された。
【０３８３】ミョウバン上で不溶化させた精製ヒトガン
胎児性抗原（ＣＥＡ）（Cyrstal Chem、シカゴ, IL又は
Scripps Labs. サンディエゴ, CA）を１００μｇ、完全
フロイントアジュバントの中で、０日目に注入し、その
後さらに７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に不
完全フロイントアジュバント中のミョウバン沈降したＣ
ＥＡを週に一度注入した。さらに２０μｇの可溶性ＣＥ
Ａを８３日目に静脈内で投与し、その後９２日目に、不
完全フロイントアジュバント中の５０μｇのミョウバン
沈降させたＣＥＡを注入した。骨髄腫細胞と脾細胞の融
合に先立って血清試料中に、ＣＥＡに対するヒト重鎖応
答を確認した。
【０３８４】９５日目に動物を安楽死させ、脾臓を除去
し、ポリエチレングリコールを用いてＰ３Ｘ６３−Ａｇ
８．６５３マウス骨髄腫細胞（ATCC CRL 1580, America
n Type Culture Collection, Rockville, MD）と融合さ
せた。２週間後、ＥＬＩＳＡによりヒト重鎖μ又はγ恒
常領域エピトープを含む、ＣＥＡと特異的に反応する抗
体の存在について、融合ウエルからの上清をスクリーニ
ングした。簡単に言うと、２．５μｇ／mlでＰＶＣマイ
クロタイタープレート上に精製されたヒトＣＥＡをコー
ティングさせ、これを、ＰＢＳ、０．５％のＴｗｅｅ
ｎ、５％のニワトリ血清内で１：４又は１：５に希釈さ
れた培養上清と共にインキュベートした。
【０３８５】プレートを洗浄し、その後ひきつづき、ヒ
トＩｇＧ Ｆｃに対し特異的なホースラディッシュペル
オキシダーゼで接合されたヤギ抗血清又はヒトＩｇＭ
Ｆｃ５Ｍｕに特異的なウサギ抗血清（Jackson Immuno R
esearch, West Grove, PA ）を付加した。さらに洗浄し
た後、ＡＢＴＳ基質の付加により、捕獲された抗体に結
合された接合体の存在を確認した。独立した２つの融合
ウエルがＣＥＡに対する実質的な結合力をもつ抗体を含
んでいることがわかった。クローニングの後、ＥＬＩＳ
Ａにより、ヒトμ鎖及びマウスκ鎖の存在について、両
方のハイブリドーマが陽性であることがわかった。類似
の検定を用いて、いかなるマウスＩｇＧもＩｇＭも検出
されなかった。
【０３８６】２つの独立した親ハイブリドーマのサブク
ローニングの結果、９２−０９Ａ−４Ｆ７−Ａ５−２及
び９２−０９Ａ−１Ｄ７−１−７−１と呼称される２つ
のクローンが得られた。両方の系統共、ブタペスト条約
に基づきＡＴＣＣ特許培養寄託所に寄託され、それぞれ
ＡＴＣＣ呼称ＨＢ１１３０７及びＨＢ１１３０８を受け
た。これらの細胞系統からの培養上清に関し、ＥＬＩＳ
Ａを用いていくつかの精製された標的タンパク質に対す
る反応性についてテストすることによって、特異性を評
価した。図５７に示されているように、さまざまな抗原
に対するモノクローナル抗体の反応性を決定するための
ＥＬＩＳＡ検定は、ＣＥＡ及びＣＥＡ関連抗原ＮＣＡ−
２のみが有意の反応性を示すことを立証したが、これ
は、ヘテロハイブリッド免疫グロブリン分子の可変領域
について制限された反応性の発達を表わしている。
【０３８７】実施例２３ この例は、ヒトＩｇミニ遺伝子座トランスジーンにより
コードされる再配置されたヒトＶＤＪ遺伝子を、キメラ
ヒト／マウスＩｇ鎖をコードするべく例えばトランスス
イッチメカニズムによって、内因性Ｉｇ恒常領域遺伝子
を含む写しとして転写させることができるということを
立証している。キメラヒト−マウス重鎖をコードするトランス−スイッ
チ写しの同定 内因性重鎖Ｊセグメント欠失について同型接合の高度免
疫されたＨＣ１系統５７のトランスジェニックマウスか
らＲＮＡを分離させた（上記）。本書に参考として内含
されているTaylor et al.(1993) Nucleic Acids Res. 2
0 ：6287に従ってｃＤＮＡを合成し、以下の２つのプラ
イマを用いてＰＣＲにより増幅した： ｏ−１４９（ヒトＶH251）： ５′−CTA GCT CGA GTC CAA GGA GTC TGT GCC GAG GTG
CAG CTG(G,A,T,C)−３′ ｏ−２４９（マウスガンマ）： ５′−GGC GCT CGA GCT GGA CAG GG(A／C) TCC A(G／T)
A GTT CCA −３′ オリゴヌクレオチドｏ−１４９は、ＨＣ１でコードされ
た可変遺伝子セグメントＶH251に特異的であり、一方ｏ
−２４９は、次のような特異性順序でマウス及びヒトの
両方のガンマ配列に対しハイブリッド形成する： マウスγ１＝マウスγ２ｂ＝マウスγ３＞マウスγ２ａ
≫ヒトγ１ ＰＣＲ産物から生成された無作為に選択した１０個のク
ローンからのＤＮＡ配列を決定し、これらを図５８に示
す。２つのクローンが、ヒトＶＤＪ及びマウスγ１を含
んでいた；４つのクローンがヒトＶＤＪ及びマウスγ２
ｂを含んでいた。又４つのクローンがヒトＶＤＪとマウ
スγ３を含んでいた。これらの結果は、トランスジェニ
ックＢ細胞の一分画の中で、トランスジーンでコードさ
れたヒトＶＤＪが、クラススイッチ又は類似の組換えに
より内因性マウス重鎖遺伝子座内に組換わったというこ
とを表わしている。
【０３８８】実施例２４ この例は、ヒトＩｇ鎖をコードし発現するクローンか
ら、キメラヒト／マウスＩｇ鎖をコードするクローンを
弁別するためのハイブリドーマプールのスクリーニング
方法について記述する。例えば、Ｊ領域で分断された内
因性重鎖遺伝子座について同型接合でありヒトＩｇ重鎖
トランスジーンを含むトランスジェニックマウスから作
られたハイブリドーマクローンのプールの中で、トラン
ススイッチされたヒトＶＤＪ−マウス恒常領域重鎖をコ
ードするハイブリドーマクローンを、ヒトＶＤＪ−ヒト
恒常領域重鎖を発現するハイブリドーマクローンから同
定し分離することが可能である。キメラＩｇ鎖を除去するためのハイブリドーマのスクリ
ーニング スクリーニングプロセスには、単独で又は任意には組合
わせた形で実施できる次の２つの段階が関与している：
（１）予備的なＥＬＩＳＡに基づくスクリーン及び
（２）ハイブリドーマ候補の二次的分子特徴づけ。好ま
しくは、ヒトＶＤＪ領域及びヒト恒常領域を発現するハ
イブリドーマ候補の初期同定のためには、予備的なＥＬ
ＩＳＡに基づくスクリーンが用いられる。
【０３８９】（例えば、トランスジェニックマウス内で
の抗体応答を惹起するのに用いられる免疫原などの）抗
原との陽性の反応性を示すハイブリドーマを、マウス
μ，γ，κ及びλ及びヒトμ，γ及びκと特異的に反応
するモノクローナル抗体のパネルを用いてテストした。
ヒト重鎖及び軽鎖に対して陽性でありかつマウス鎖につ
いて陰性であるハイブリドーマだけが、ヒト免疫グロブ
リン鎖を発現するハイブリドーマ候補として同定され
る。かくして、ハイブリドーマ候補は、特定の抗原との
反応性を有し、ヒト恒常領域の特徴であるエピトープを
有することがわかる。
【０３９０】ＲＮＡをハイブリドーマ候補から分離し、
最初のストランドのｃＤＮＡを合成するのに使用する。
この最初のストランドのｃＤＮＡを次に、（１本鎖ＤＮ
Ａを連結する）ＲＮＡリガーゼを用いて、予め定められ
た配列の唯一の１本鎖オリゴヌクレオチドに連結する。
連結されたｃＤＮＡを次に、２組のオリゴヌクレオチド
プライマーを用いてＰＣＲにより２つの反応において増
幅させる。セットＨ（重鎖）は、（ＥＬＩＳＡの結果に
応じて）ヒトμ又はヒトγ１のいずれかへと特異的にア
ニールするオリゴ、及び、オリゴ−Ｘ配列へとアニール
するオリゴを含む。こうして、ヒトミニ遺伝子座内へト
ランス再配置している可能性のあるマウスＶセグメント
を含め、特別なＶセグメントの検出に対抗する偏りが防
止される。第２の組のプライマ、つまりセットＬ（軽
鎖）は、ヒトκへと特異的にアニールするオリゴと、オ
リゴ−Ｘへと特異的にアニールするオリゴを含む。ＰＣ
Ｒ産物を分子クローニングし、ヒト及びマウスＩｇ配列
に対する配列比較に基づいてハイブリドーマが唯一のヒ
ト抗体を産生しているか否かを確かめるため、そのいく
つかのＤＮＡ配列を決定する。
【０３９１】実施例２５ この例は、ヒト軽鎖（κ）ミニ遺伝子座を宿すトランス
ジェニックマウスの産生を実証する。ヒトκミニ遺伝子座トランスジェニックマウス ＫＣ１ （上記のようなκ特異的オリゴヌクレオチドに対するハ
イブリダイゼーションによるヒトゲノミックＤＮＡファ
ージライブラリから分離された）ファージクローンから
の１３kbのＸｈｏＩ Ｊκ２−Ｋκを含むフラグメント
をクレノウ酵素で処理し、ｐＫ−３１を産生するべくｐ
ＧＰ１ｄのクレノウ処理されたＨｉｎｄIII 部位にクロ
ーニングさせた。これにより、インサートＸｈｏＩ部位
が破壊され、唯一のポリリンカー誘導されたＸｈｏＩ部
位はＪκ２の隣りの５′末端に位置づけされた。唯一の
ポリリンカー誘導されたＣｌａＩ部位をこのＸｈｏＩ部
位とインセット配列の間に位置設定し、一方唯一のポリ
リンカー誘導されたＳａｌＩ部位をインサートの３′末
端に位置設定する。
【０３９２】Ｊκ１及び上流配列を含む７．５kbのＸｈ
ｏＩフラグメントも同様に、（上述のようにκ特異的オ
リゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによ
りヒトゲノミックＤＮＡファージライブラリーから分離
された）ヒトゲノミックＤＮＡファージクローンから分
離した。この７．５kbのＸｈｏＩフラグメントをｐＳＰ
７２（Promega, Madison, Wisconsin ）のＳａｌＩ部位
内にクローニングさせ、かくして両方のＸｈｏＩ部位を
破壊し、Ｊκ１の３′にポリリンカーＣｌａＩ部位を位
置づけた。結果として得られたクローンをＣｌａＩで消
化させると、上流配列を４．５kbとＪκ１を含む４．７
kbのフラグメントが放出された。
【０３９３】この４．７kbのフラグメントをｐＫ−３１
のＣｌａＩ部位内にクローニングさせ、ｐＫｃｏｒを作
り出した。残りの唯一の５′ＸｈｏＩ部位をポリリンカ
ー配列から誘導する。再配置されていないヒトＶκIII
遺伝子セグメント６５．８（プラスミドｐ６５．８、実
施例２１）を含む６．５kbのＸｈｏＩ／ＳａｌＩ ＤＮ
ＡフラグメントをｐＫｃｏｒのＸｈｏＩ部位内にクロー
ニングしてプラスミドｐＫＣ１を生成させた。ｐＫＣ１
のＮｏｔＩインサートを１／２日目のマウス胎児内に微
量注射してトランスジェニックマウスを生成した。２つ
の独立したｐＫＣ１誘導されたトランスジェニック系統
を樹立し、重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子座を両方共含むマウ
スを繁殖させるのに用いた。これらの系統ＫＣ１−６７
３及びＫＣ１−６７４は、サザンブロットハイブリダイ
ゼーションにより、それぞれトランスジーンのおよそ１
及び１０〜２０のコピーの組込みを含むものとして見積
られた。ＫＣ１ｅ マウス及びヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーを両
方共含む２．３kbのインサートを切除するため、Ｂａｍ
ＨＩ及びＨｉｎｄIII を用いてプラスミドｐＭＨＥ１
（実施例１３及び１８）を消化した。このフラグメント
をクレノウ処理し、ＳａｌＩリンカー（New England Bi
olabs, Beverly, Massachusetts ）に連結させ、ｐＫＣ
１の唯一の３′ＳａｌＩ部位の中にクローニングさせて
プラスミドｐＫＣ１ｅを生成した。ｐＫＣ１ｅのＮｏｔ
Ｉインサートを１／２日目のマウス胎児に微量注射して
トランスジェニックマウスを生成した。４つの独立した
ｐＫＣ１ｅ誘導されたトランスジェニック系統を樹立
し、重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子座を両方共含むマウスを繁
殖させるのに使用した。これらの系統ＫＣ１ｅ−１３９
９，ＫＣ１ｅ−１４０３，ＫＣ１ｅ−１５２７及びＫＣ
１ｅ−１５３６は、サザンブロットハイブリダイゼーシ
ョンにより、それぞれトランスジーンの約２０〜５０，
５〜１０，１〜５及び３〜５のコピーの組込みを含むも
のであると見積られた。ｐＫＣ２ 再配置されていないヒトＶκIII 遺伝子セグメント６
５．５（プラスミドｐ６５．５ｇｌ、実施例２１）を含
む６．８kbのＸｈｏＩ／ＳａｌＩ ＤＮＡフラグメント
をｐＫＣ１の唯一の５′ＸｈｏＩ部位内にクローニング
してプラスミドｐＫＣ２を生成した。このミニ遺伝子座
トランスジーンは、２つの異なる機能的ＶκIII 遺伝子
セグメントを含む。１／２日目のマウス胎児の中にｐＫ
Ｃ２のＮｏｔＩインサートを微量注射してトランスジェ
ニックマウスを生成した。５つの独立したｐＫＣ２誘導
されたトランスジェニック系統を樹立し、重鎖及び軽鎖
ミニ遺伝子座の両方を含むマウスを繁殖させるのに用い
た。これらの系統ＫＣ２−１５７３，ＫＣ２−１５７
９，ＫＣ２−１５８８，ＫＣ２−１６０８及びＫＣ２−
１６１０は、サザンブロットハイブリダイゼーションに
より、それぞれトランスジーンの約１〜５，１０〜５
０，１〜５，５０〜１００及び５〜２０のコピーの組込
みを含むものと見積られた。
【０３９４】実施例２６ この例は、ヒトκトランスジーンを支持するトランスジ
ェニックマウスが、機能的ヒトκ鎖を含む抗体を形成す
る抗原誘発された抗体応答を発生させることができると
いうことを示している。ヒトＩｇκ軽鎖と結びつけられた抗体応答 ＨＣ１−５７ヒト重鎖及びＫＣ１ｅヒトκトランスジー
ンを含むトランスジェニックマウスを精製されたヒト可
溶性ＣＤ４（ヒト糖タンパク質抗原で免疫化した。ポリ
スチレンラテックス粒子（Polysciences, Warrington,
PA）に対する接合（コンジュゲーション）により不溶化
された精製ヒトＣＤ４（NEN Researchの製品、Westwoo
d, MA）を２０μｇ、０日目にジメチルジオクタデシル
臭化アンモニウム（Cal bio chem, San Diego, CA ）を
伴う食塩水中で腹腔内注射し、その後２０日目及び３４
日目にさらに注射を行なった。
【０３９５】２５日目と４０日目に眼窩後方出血をと
り、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＩｇＭ又はヒトＩｇＧ重鎖
を含むＣＤ４に対する抗体の存在についてスクリーニン
グした。簡単に言うと、ＰＶＣのマイクロタイタープレ
ート上に２．５μｇ／mlで精製されたヒトＣＤ４をコー
ティングし、ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％
のニワトリ血清中で１：４／１：５に希釈された培養上
清と共にインキュベートさせた。プレートを洗浄し、そ
の後、ヒトＩｇＧ Ｆｃに特異的なホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ接合されたヤギ抗血清又はヒトＩｇＭ
Ｆｃ５Ｍｕに特異的なウサギ抗血清（Jackson Immuno
Research, Westr Grove, PA）を付与した。
【０３９６】ＡＢＴＳ基質の付加によるさらなる洗浄後
に、捕獲された抗体に結合された接合体の存在を見極め
た。両方の出血において、抗原との反応性をもつヒトμ
を検出したが、γ反応性は基本的に検出不能であった。
４０日目に、ヤギ抗ヒトκペルオキシダーゼ接合体（Si
gma, St.Louis, MO ）での同じ検定を用いて抗原反応性
ヒトκ鎖についても試料をテストした。この時点でＣＤ
４を結合するκ反応性が検出された。検定の結果は、図
５９に示されている。
【０３９７】実施例２７ この例は、機能的に分断されたマウス重鎖及び軽鎖遺伝
子座（重鎖及びκ鎖遺伝子座）について同型接合であ
り、しかも、機能的ヒト重鎖及び機能的ヒト軽鎖をコー
ドするべく産生的に再配置することのできるヒト軽鎖ト
ランスジーンとヒト重鎖トランスジーンを並行して宿す
マウスの生成の成功を示している。このようなマウスは
「００１１」マウスと呼ばれ、ここで最初の２ケタの２
つのゼロはこのマウスに機能的な重鎖及び軽鎖遺伝子座
が欠如していることを表わし、次の２ケタの１は、この
マウスがヒト重鎖トランスジーン及びヒト軽鎖トランス
ジーンについて半接合であることを表わしている。この
例は、かかる００１１マウスに予め定められた抗原に対
する特異的抗体応答を発生させる能力があること、又か
かる抗体応答にアイソタイプスイッチが関与しうること
を示している。００１１／００１２マウス：内因性Ｉｇノックアウト＋
ヒトＩｇトランスジーン 上述のＨＣ１−２６トランスジェニックマウス系統とい
ったヒトＨＣ１トランスジーンも宿し、機能的ＪH 領域
が欠如した機能的に分断された内因性重鎖遺伝子座（Ｊ
ＨＤ＋＋又はＪＨΔ＋＋と呼ばれる）について同型接合
であったマウスを、機能的ＪH 領域の欠如した機能的に
分断された内因性カッパ鎖遺伝子座（ここではＪＫＤ＋
＋又はＪＫΔ＋＋と呼ばれる、図９参照）について同型
接合のマウスと同系交配させて、ＪＨＤ＋＋／ＪＫＤ＋
＋と呼ばれるＨＣ１トランスジーンを含む機能的に分断
された重鎖及びカッパ鎖遺伝子座（重鎖／カッパ鎖ノッ
クアウト）について同型接合のマウスを産生した。
【０３９８】かかるマウスを、同系交配により産生さ
せ、ゲノミックＤＮＡのサザンブロットにより評価され
るとおりの遺伝子型に基づいて選択した。ＨＣ１−２６
＋／ＪＫＤ＋＋／ＪＨＤ＋＋マウスと呼ばれるこれらの
マウスを、ヒトカッパ鎖トランスジーンを宿すマウス
（系統ＫＣ２−１６１０，ＫＣ１ｅ−１３９９及びＫＣ
１ｅ−１５２７；実施例２５参照）と同系交配させ、機
能的に分断された重鎖及び軽鎖遺伝子座について同型接
合でしかもＨＣ１トランスジーン及びＫＣ２又はＫＣ１
ｅトランスジーンについて半接合である子孫マウスを同
定するのに、ゲノミックＤＮＡのサザンブロット分析を
用いた。
【０３９９】このようなマウスは番号で呼称され、以下
の略号を用いてその遺伝子型に関して同定された：すな
わち、ＨＣ１−２６＋はＨＣ１−２６系統のヒト重鎖ミ
ニ遺伝子座トランスジーン組込みに対する半接合を表わ
し；ＪＨＤ＋＋はＪH ノックアウトに対する同型接合を
表わし；ＪＫＤ＋＋はＪκノックアウトに対する同型接
合を表わし；ＫＣ２−１６１０＋は、系統ＫＣ２−１６
１０の場合と同じように組込まれたＫＣ２ヒトκトラン
スジーンについての半接合を表わし；ＫＣ１ｅ−１５２
７＋は、系統ＫＣ１ｅ−１５２７の場合と同じように組
込まれたＫＣ１ｅヒトκトランスジーンについての半接
合を表わし；ＫＣ１ｅ−１３９９＋は、系統ＫＣ１ｅ−
１３９９の場合と同じように組込まれたＫＣ１ｅヒトκ
トランスジーンについての半接合を表わす。
【０４００】結果として得られた個々の子孫には各々数
字で表わした呼称（例えば６２９５，６９０７など。）
が与えられ、各々ＪH ノックアウト対立遺伝子、Ｊκノ
ックアウト対立遺伝子、ＨＣ１−２６トランスジーン及
びκトランスジーン（ＫＣ２又はＫＣ１ｅ）の存在につ
いて評価され、各遺伝子座において半接合（＋）又は同
型接合（＋＋）のいずれかであることが決定された。表
１０は、子孫マウスのいくつかの番号呼称、性別及び遺
伝子型を示している。
【０４０１】 表 ６ ID番号 性別 Igコード 遺伝子型 6295 Ｍ 0011 HC1−26＋；JHD++ ；JKD++ ；KC2 −1610＋ 6907 Ｍ 0011 HC1−26＋；JHD++ ；JKD++ ；KC1e−1527＋ 7086 Ｆ 0011 HC1−26＋；JHD++ ；JKD++ ；KC1e−1399＋ 7088 Ｆ 0011 HC1−26＋；JHD++ ；JKD++ ；KC1e−1399＋ 7397 Ｆ 0011 HC1−26＋；JHD++ ；JKD++ ；KC1e−1527＋ 7494 Ｆ 0012 HC1−26＋；JHD++ ；JKD++ ；KC2 −1610++ 7497 Ｍ 0011 HC1−26＋；JHD++ ；JKD++ ；KC1e−1399＋ 7648 Ｆ 0011 HC1−26＋；JHD++ ；JKD++ ；KC2 −1610＋ 7649 Ｆ 0012 HC1−26＋；JHD++ ；JKD++ ；KC2 −1610++ 7654 Ｆ 0011 HC1−26＋；JHD++ ；JKD++ ；KC2 −1610＋ 7655 Ｆ 0011 HC1−26＋；JHD++ ；JKD++ ；KC2 −1610＋ 7839 Ｆ 0011 HC1−26＋；JHD++ ；JKD++ ；KC1e−1399＋ 7656 Ｆ 0001 HC1−26−；JHD++ ；JKD++ ；KC2 −1610＋ 7777 Ｆ 1100 Co1−2141−；JHD ＋；JKD ＋
【０４０２】我々は、生後６週間の雌マウスから脾臓を
とり出した。サザンブロットハイブリダイゼーションに
より、マウス＃７６５５は、ＨＣ１（系統２６）及びＫ
Ｃ２（系統１６１０）トランスジーン取込みについて半
接合であり、マウスμ及びκＪ領域のＪＨΔ及びＪκΔ
ターゲティングされ欠失について同型接合であることが
見極められた。マウス＃７６５６は、サザンブロットハ
イブリダイゼーションにより、ＫＣ２（系統１６１０）
トランスジーン組込みについて半接合でありマウスμ及
びκＪ領域のＪＨΔ及びＪκΔターゲッティングされた
欠失について同型接合であることが見極められた。マウ
ス＃７７７７は、サザンブロットハイブリダイゼーショ
ンにより、マウスμ及びκＪ領域のＪＨΔ及びＪκΔタ
ーゲティングされた欠失について半接合であると見極め
られた。これらの欠失が劣性であることから、このマウ
スは表現型上野生型であるはずである。
【０４０３】００１１マウスにおける内因性Ｉｇ鎖の発
現 （１）野生型マウス（７７７７）、（２）重鎖及びカッ
パノックアウト対立遺伝子について同型接合でヒト軽鎖
トランスジーン（７６５６）を宿す０００１マウス及び
（３）重鎖及びカッパノックアウト対立遺伝子について
同型接合でヒト軽鎖トランスジーン及びヒト重鎖トラン
スジーン（７６５５）を宿す００１１マウスから外植さ
れたリンパ球を選別するため、ヒトμ、マウスμ、ヒト
κ、マウスκ、又はマウスλのいずれかと反応性ある抗
体のパネルを用いたＦＡＣＳ分析を使用した。
【０４０４】我々は、Mishell 及びShiigi (Mishell,
B.B. & Shiigi.S.M. (eds) 細胞免疫学における選択さ
れた方法。W.H.Freeman & Co., New York, 1980 ）によ
り記述されているように、脾臓から単細胞懸濁液を調製
し、ＮＨ4 Ｃｌで赤血球を溶解させた。リンパ球を以下
の試薬で染色する：ヨウ化プロピジウム（分子プロー
ブ、Eugene, OR）、ＦＩＴＣ接合された抗ヒトＩｇＭ
（クローンＧ２０−１２７；Pharmingen, サンディエ
ゴ, CA）、ＦＩＴＣ接合された抗マウスＩｇＭ（クロー
ンＲ６−６０．２；Pharmingen, サンディエゴ, CA）、
フィコエリトリン接合された抗ヒトＩｇκ（クローンＨ
Ｐ６０６２；Cal Tag, サウスサンフランシスコ, C
A）、ＦＩＴＣ接合された抗マウスＩｇλ（クローンＲ
２６−４６；Pharmingen, サンディエゴ, CA）、ＦＩＴ
Ｃ接合された抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ
２；Pharmingen, サンディエゴ, CA）、及びＣｙ−クロ
ム接合された抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ
２：Pharmingen, サンディエゴ, CA）。我々は、ＦＡＣ
Ｓｃａｎフロー血球計算器及びＬＹＳＩＳIIソフトウェ
ア（Becton Dickinson, サンホゼ, CA）を用いて染色さ
れた細胞を分析した。
【０４０５】マクロファージ及び残留赤血球を、前方及
び側方散乱をゲート・オンすることにより排除する。死
濁細胞は、ヨウ化プロピジウム陽性細胞をゲート・アウ
トすることにより排除する。図６０及び図６１のフロー
サイトメトリーデータは、サザンブロットハイブリダイ
ゼーションデータを確認し、マウス＃７６５５がヒトμ
及びヒトκの両方を発現し、あったとしても比較的わず
かなマウスμ又はマウスκを発現することを実証してい
る。それでも、Ｂ細胞の有意な分画（約７０〜８０％）
がヒト重鎖及びマウスλ軽鎖から成るハイブリッドＩｇ
レセプターを発現すると思われる。
【０４０６】図６０は、細胞表面上でヒトμ又はマウス
μを発現するＢ細胞の相対的分布を示す；００１１マウ
ス（７６５５）リンパ球はヒトμに対し陽性であるが、
相対的にマウスμが欠如している；０００１マウス（７
６５６）リンパ球は、多くのヒトμ又はマウスμを発現
しない；野生型マウス（７７７７）リンパ球はマウスμ
を発現するが、ヒトμが欠如している。
【０４０７】図６１は、細胞表面上でヒトκ又はマウス
κを発現するＢ細胞の相対的分布を示す；００１１マウ
ス（７６５５）リンパ球はヒトκについて陽性である
が、相対的マウスκが欠如している；０００１マウス
（７６５６）リンパ球は多くのヒトκ又はマウスκを発
現しない；野生型マウス（７７７７）リンパ球はマウス
κを発現するが、ヒトκが欠如している。
【０４０８】図６２は、細胞表面上でマウスλを発現す
るＢ細胞の相対的分布を示す；００１１マウス（７６５
５）リンパ球はマウスλについて陽性である；０００１
マウス（７６５６）リンパ球は、有意なマウスλを発現
しない；野生型マウス（７７７７）リンパ球はマウスλ
を発現するが、００１１マウス（７６５５）に比べ相対
的に低いレベルにある。
【０４０９】図６３は、ヒトκ（トランスジーンでコー
ドされたもの）に比べての内因性マウスλについて陽性
のＢ細胞の相対的分布を示す。左上の図版は、機能的内
因性重鎖及び軽鎖対立遺伝子を有しヒトトランスジーン
（単複）が欠如している野生型マウスからの細胞の結果
を示す；細胞はマウスラムダについて陽性である。右上
の図版は、κノックアウトバックグラウンド（ＪＫＤ＋
＋）を有しＫＣ１ｅ−１３９９系統のヒトκトランスジ
ーンの組込みを宿すマウス（＃５８２２）からの細胞を
示す；細胞は、おおまかに比例する量でヒトκ又はマウ
スλについて陽性である。
【０４１０】左下図版は、κノックアウトバックグラウ
ンド（ＪＫＤ＋＋）を有しＫＣ２−１６１０系統のヒト
κトランスジーン組込みを宿すマウス（＃７１３２）か
らの細胞を示す：ヒトκに対してよりマウスλに対して
より多くの細胞が陽性であり、ＫＣ２−１６１０トラン
スジーン組込みがＫＣ１ｅ−１３９９トランスジーン組
込みほど効率が良くないということを表わしている可能
性がある。右下図版は、ヒトκミニ遺伝子座トランスジ
ーン（ＫＣｏ４）を宿し機能的内因性マウスκ対立遺伝
子が欠如しているマウスからの細胞を示す。
【０４１１】図６３に示されているデータは同様に、ト
ランスジーン間の表現型の可変性をも実証している。か
かる可変性は、組込まれたトランスジーンの結果もたら
される単数又は複数の表現型上の特徴（例えばアイソタ
イプスイッチ、高レベル発現、低マウスＩｇバックグラ
ウンド）を発現する個々のトランスジーン及び／又はト
ランスジェニック系統について選択するのが望ましいこ
とであるということを表わしている。一般に、（１）ト
ランスジーン、（２）トランスジーン組込みの部位、及
び／又は（３）遺伝的背景により異なっている多数の個
別のトランスジェニック系統を形成するため、別々に単
一又は多数のトランスジーン種（例えばｐＫＣ１ｅ，ｐ
ＫＣ２，ＫＣｏ４）が利用される。
【０４１２】次のような望ましいパラメータについて個
々のトランスジェニック系統を検査する：（１）予め定
められた抗原に対する免疫応答を高める能力、（２）ト
ランスジーンでコードされた恒常領域内のアイソタイプ
スイッチの頻度及び／又は内因性（例えばマウス）Ｉｇ
恒常領域遺伝子に対するトランススイッチの頻度、
（３）トランスジーンでコードされた免疫グロブリン鎖
及び抗体の発現レベル、（４）内因性（例えばマウス）
免疫グロブリン、免疫グロブリン配列の発現レベル、及
び（５）産生的ＶＤＪ及びＶＪ再配置の頻度。標準的に
は、トランスジーンでコードされる（例えばヒト）免疫
グロブリン鎖を最大濃度で産生するトランスジェニック
系統が選択される：好ましくは、選択された系統は、ト
ランスジェニック動物の血清中で少なくとも約４０μｇ
／mlのトランスジーンコードされた重鎖（例えばヒトμ
又はヒトγ）及び／又は少なくとも約１００μｇ／mlの
トランスジーンコードされた軽鎖（例えばヒトκ）を産
生する。
【０４１３】マウスの免疫化を受けていない血清及び特
異的抗原つまりヒトＣＤ４での免疫化の後の血清の中の
ヒト及びマウス免疫グロブリン鎖の発現について、マウ
スを検査した。図６４はさまざまな遺伝子型の別々の４
匹の免疫化を受けていない００１１マウスの血清の中に
存在するヒトμ、ヒトγ、マウスμ、マウスγ、ヒト
κ、マウスκ及びマウスλ鎖の相対的発現を示している
（ｎｔ＝テストせず）；ヒトκが最も豊富な軽鎖として
優勢であり、ヒトμ及びマウスγ（推定上はトランスス
イッチの産物）が最も豊富な重鎖であるが、系統間で可
変性が存在しており、このことは、ヒト鎖の発現を可能
にしながらマウス鎖の発現を最小限にする有利な遺伝子
型組合せを同定するための選択段階の有用性を表わして
いる。マウス＃６９０７及び７０８８は、ヒトμからヒ
トγへのアイソタイプスイッチ（トランスジーン内のシ
ス・スイッチ）を示している。
【０４１４】図６５は、さまざまな００１１遺伝子型の
マウス内のヒトμ（ｈｕμ）、ヒトγ（ｈｕγ）、ヒト
κ（ｈｕκ）、マウスμ（ｍｓμ）、マウスγ（ｍｓ
γ）、マウスκ（ｍｓκ）、及びマウスλ（ｍｓλ）に
ついての血清免疫グロブリン鎖レベルを示している。００１１マウス内の特異的抗体応答 ００１１マウス（＃６２９５）を、次の免疫化計画に従
って免疫原性用量のヒトＣＤ４を用いて免疫化した：０
日目、ＣＤ４マウス免疫血清１００μｌの腹腔内注入；
１日目、１００μｌ中ＤＤＡを伴いラテックス溶球上で
２０μｇのヒトＣＤ４（American Bio-Tech ）を注入す
る；１５日目、１００μｌ中ＤＤＡを伴いラテックス溶
球上で２０μｇのヒトＣＤ４（American Bio-Tech ）を
注入する；２９日目、１００μｌ中ＤＤＡを伴いラテッ
クス溶球上で２０μｇのヒトＣＤＡ（American Bio-Tec
h ）を注入する；４３日目、１００μｌ中ＤＤＡを伴い
ラテックス溶球上で２０μｇのヒトＣＤ４（American B
io-Tech ）を注入する。
【０４１５】図６７は、抗ＣＤ４応答におけるヒトμ、
ヒトκ及びヒトγ鎖の存在を立証する３週間目及び７週
間目のＣＤ４免疫化に対する相対的抗体応答を示す。ヒ
トγ鎖は、７週間目の血清中で著しく増大した発生量で
存在し、野生型動物におけるアイソタイプスイッチのも
のと似た時間的関係で重鎖トランスジーン内でのシス−
スイッチ（アイソタイプスイッチ）が発生していること
を表わしている。
【０４１６】図６８は、さまざまなヒト重鎖及び軽鎖ト
ランスジーンの概略的寄せ集めを示す。
【０４１７】実施例２８ この例は、マウスλ軽鎖遺伝子座のターゲティングされ
たノックアウトを提供する。マウスラムダ軽鎖遺伝子座のターゲティングされた失活 Ｉｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座とは異なり、マウスＶ
λＪλ及びＣλ遺伝子セグメントは、５′→３′アレイ
の形に配置された３つのグループにまとめられておら
ず、その代りに散在させられている。最も５′の部分は
２つのＶセグメント（Ｖλ２及びＶλＸ）で構成されて
おり、これら２つのセグメントの後には、３′方向に続
行して各々独自のＪセグメント（Ｊλ２Ｃλ２及び偽遺
伝子Ｊλ４Ｃλ４）と結びつけられた２つの恒常領域エ
キソンが続いている。次にくるのは最も広く用いられる
Ｖセグメント（Ｖλ１）であり、このセグメントの後に
は恒常領域エキソンの第２のクラスター（Ｊλ３Ｃλ３
及びＪλ１Ｃλ１）が続いている。全体として、遺伝子
座は約２００kbにまたがり、２つのクラスター間の間隔
は〜２０〜９０kbである。
【０４１８】ラムダ遺伝子座の発現には、優越してＪλ
２までのＶλ２又はＶλＸの再配置そして稀にのみＪλ
３又はＪλ１に対してさらに３′の再配置が関与する。
Ｖλ１はＪλ３及びＪλ１の両方と組換え可能である。
かくして、遺伝子座の組換え及び発現を充分に削除する
ため、ラムダ遺伝子座を突然変異させることが可能であ
る。
【０４１９】２つのラムダ遺伝子クラスターの間の距離
は、マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座を失活させ
る上で用いられたとおりに、単一のち密なターゲッティ
ングされた欠失の生成を介して遺伝子座の発現を失活す
ることを困難にする。その代り、発現ラムダ軽鎖を削除
することになる小さい単一の欠失は、Ｊλ２Ｃλ２から
Ｊλ１Ｃλ１までに広がる約１２０kbにまたがっている
（図６９）。こうしてラムダ恒常領域エキソンの全てな
らびにＶλ１遺伝子セグメントが除去され、遺伝子座の
失活が確保される。
【０４２０】欠失された１２０kbがＰＧＫ発現カセット
内で選択可能な標識遺伝子ｎｅｏと置換されている、置
換型ターゲティングベクター（Thomas及びCapecehi (19
87)前掲書中）が構築される。このマーカーは、ラムダ
遺伝子座に対する相同性を提供するため欠失にフランキ
ングするゲノミックラムダ配列内に埋め込まれており、
同様に、ベクターを相同的に組込んだ細胞についての富
化を可能にするため、相同性領域の１つの端部にＨＳＶ
−ｔｋ遺伝子を含むこともできる。ターゲティングされ
ている染色体ＤＮＡに対し同質遺伝子型のターゲティン
グベクターの使用が相同組換えの効率を増強することが
報告されていることから、ラムダ遺伝子座ゲノミックク
ローン配列は、ターゲティングされているＥＳ系統と同
質遺伝子型の系１２９／Ｓｖゲノミックファージライブ
ラリのスクリーニングによって得られる。
【０４２１】ラムダ遺伝子座に対する相同性の長さで相
異のあるターゲティングベクターが構築される。第１の
ベクター（図７０中のベクター１）は、合計約８〜１２
kbのラムダ遺伝子座配列によりフランキングされた標識
遺伝子を含む。置換ベクターが数kbのＤＮＡの付加又は
検出を媒介するターゲティング事象については、これ
は、充分以上の相同性範囲であることが実証されてきた
（Hasty et al. (1991)、前掲書中；Thomas et al.(199
2) 前掲書中）。フランキングラムダ配列をさらに約４
０〜６０kb伴うベクターも又構築される（図７０中のベ
クター２）。少なくとも８０kbのヒトＩｇミニ遺伝子座
が日常的にクローニングされ、プラスミドベクターｐＧ
Ｐ１の中で増殖される（Taylor et al.(1993) 前掲書
中） ラムダ遺伝子座の失活のための代替的なアプローチで
は、同じＥＳ細胞内において、例えば２つの恒常領域ク
ラスター又は２つのＶ領域遺伝子座の突然変異といった
２つの独立した突然変異が利用される。
【０４２２】恒常領域が両方共各々ＤＮＡの〜６kb内に
内含されているのに対しＶ遺伝子座の１つは〜１９kbに
またがっていることから、ターゲティングベクターはＪ
λ２Ｃλ２／Ｊλ４Ｃλ４及びＪλ３Ｃλ３／Ｊλ１Ｃ
λ１遺伝子座を独立して欠失するように構築される。図
７０に示されているように、各々のベクターは、各欠失
にフランキングする合計〜８〜１２kbのラムダ遺伝子座
ゲノミックＤＮＡによりとり囲まれた、ＰＧＫ発現カセ
ット内の選択可能なマーカー（例えばｎｅｏ又はｐａ
ｃ）から成る。陽性−陰性選択による相同組換え事象の
ため富化するべく、ターゲティングベクターに対し、Ｈ
ＳＶ−ｔｋ遺伝子を付加することが可能である。
【０４２３】恒常領域遺伝子のうちの１つの欠失を支持
するクローンが生成されるように、ＥＳ細胞を２つのベ
クターで逐次的にターゲッティングさせる。次にこれら
のクローンを２つのベクターで逐次的にターゲティング
させて、恒常領域遺伝子座の１つの欠失を支持するクロ
ーンが生成されるようにし、その後これらのクローンを
残りの機能的恒常領域クラスターの欠失を生成するべく
ターゲティングさせる。両方のターゲティング事象がか
くして同じ細胞に対し向けられていることから、２つの
ターゲティングのために異なる選択可能なマーカーを使
用することが好ましい。図７０に示されている概略的な
例においては、ベクターのうち一方はｎｅｏ遺伝子を含
み、もう一方はｐａｃ（ピュロマイシンＮ−アセチルト
ランスフェラーゼ）遺伝子を含んでいる。
【０４２４】第３の潜在的に優性な選択可能マーカー
は、ｈｙｇ（ハイグロマイシンホスフォトランスフェラ
ーゼ）遺伝子である。ｐａｃ及びｈｙｇ遺伝子は両方
共、Ｉｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座の中にｎｅｏ遺伝
子座をターゲティングするためにうまく使用されるＰＧ
Ｋ発現構成体の中に挿入され得る。２つのラムダ恒常領
域クラスターは密に連鎖されるされていることから、２
つの突然変異が同じ染色体上にあることが重要である。
好ましくは独立した２つのターゲティング事象により同
じ対立遺伝子を突然変異させる確率は５０％あり、突然
変異の連鎖は、２重にターゲティングされたＥＳ細胞か
ら誘導されたキメラの繁殖（交配）中のその同時分離に
より確立される。
【０４２５】実施例２８ この例は、マウス重鎖遺伝子座のターゲティングされた
ノックアウトを提供する。マウス重鎖遺伝子座のターゲティングされた失活 ＥＳ細胞内での遺伝子ターゲティングによりマウス重鎖
遺伝子座恒常領域遺伝子のうちの少なくとも１つ好まし
くは実質的に全てを欠失するために、図７０に示された
構造をもつ相同組換え遺伝子ターゲティングトランスジ
ーンを使用する。図７０は、ターゲティングトランスジ
ーンの全体的概要図を示す。セグメント（ａ）は、欠失
されるべき恒常領域遺伝子（単複）の上流にある（すな
わちＪH遺伝子に近接する）クローニングされたゲノミ
ックＤＮＡ配列である；セグメント（ｂ）は、ｐｇｋ−
ｎｅｏといった正の選択マーカーを含み；セグメント
（ｃ）は欠失すべき恒常領域遺伝子（単複）の下流にあ
る（すなわち恒常領域遺伝子（単複）及びＪH 遺伝子に
対し遠位にある）クローニングされたゲノミックＤＮＡ
配列である；又任意のものであるセグメント（ｄ）は、
負の選択マーカー遺伝子（例えばＨＳＶ−ｔｋ）を含
む。図７１は、「免疫グロブリン遺伝子」、Honjo T. A
lt, FW及びRabbits TH (eds) Academic Press, NY (198
9) p129 からとったマウス重鎖遺伝子座の地図を示す。
【０４２６】ターゲティングトランスジーンは、図７０
に従った構造を有し、ここで（１）（ａ）セグメント
は、クローンＪＨ８．１の１１．５kbのインサート（Ch
en etal.(1993) Int.Immunol. ５：647 ）又は、マウ
スＣμ遺伝子の上流にある少なくとも約１〜４kbの配列
を含む同等の部分であり、（２）（ｂ）セグメントは上
述のとおりのｐｇｋ−ｎｅｏであり、（３）（ｃ）セグ
メントは、５′−gtg ttg cgt gta tca gct gaa acc ta
g aaa cag ggt gac cag −３′という配列をもつ末端標
識づけされたオリゴヌクレオチドでマウスゲノミックク
ローンライブラリをスクリーニングすることにより分離
されたマウスＣα遺伝子のファージクローンから分離さ
れた４〜６kbのインサート又は図７２に示された１６７
４bpの配列を含んでおり、（４）（ｄ）セグメントは上
述のＨＳＶ−ｔｋ発現カセットを含んでいる。
【０４２７】代替的には、第１のターゲティングが相同
性領域すなわち恒常領域遺伝子（単複）、第１種の正の
選択マーカー遺伝子（ｐｇｋ−ｎｅｏ）及びＨＳＶ−ｔ
ｋ負の選択マーカーにフランキングする配列に相同なセ
グメント（ａ）及び（ｃ）を含んでいる、単数又は複数
の重鎖恒常領域遺伝子の段階的欠失を実施する。かくし
て、（ａ）セグメントは、Ｃγ３の上流にある領域に相
同な少なくとも約１〜４kbの配列を含むことができ、
（ｃ）セグメントはＣγ２ａの上流にある領域に対して
相同な少なくとも約１〜４kbの配列を含むことができ
る。
【０４２８】このターゲティングトランスジーンはＣγ
３，Ｃγ１，Ｃγ２ｂ及びＣγ２ａ遺伝子を欠失させ
る。この第１のターゲティングトランスジーンはＥＳ細
胞内に導入され、適正にターゲティングされた組換え体
が選択され（例えばＧ４１８で）、適正にターゲティン
グされたＣ領域欠失を生み出す。次にＨＳＶ−ｔｋカセ
ットの喪失についての負の選択が行なわれる（例えばｇ
ａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ又はＦＩＡＵで）。結果として得
られる適正にターゲティングされた第１図のＣ欠失組換
え体は、Ｃγ３，Ｃγ１，Ｃγ２ｂ及びＣγ２ａ遺伝子
が欠如した重鎖遺伝子座を有する。
【０４２９】第２のターゲティングトランスジーンは、
相同性領域すなわち、恒常領域遺伝子（単複）、第１の
種とは異なる第２種の正の選択マーカー遺伝子（例ｇｐ
ｔ又はｐａｅ）及びＨＳＶ−ｔｋ負の選択マーカーにフ
ランキングする配列と相同なセグメント（ａ）及び
（ｃ）を含んでいる。かくして、（ａ）セグメントは、
Ｃεの上流にある領域に対し相同な少なくとも約１〜４
kbの配列を含むことができ、（ｃ）セグメントは、Ｃα
の上流にある領域に相同で少なくとも約１〜４kbの配列
を含むことができる。このターゲティングトランスジー
ンはＣε及びＣα遺伝子を欠失させる。
【０４３０】この第２のターゲティングトランスジーン
は、第１のターゲティング事象から得られた適正にター
ゲティングされたＣ−領域組換え型ＥＳ細胞の中へ導入
される。第２のノックアウト事象のために適正にターゲ
ティングされている（すなわち第２のターゲティングト
ランスジーンでの相同組換えによる）細胞は、第２種の
正の選択マーカー遺伝子に特異的な選択薬剤（例えば、
ｇｐｔについて選択するためのミコフェノール酸；ｐａ
ｃについて選択するためのピュロマイシン）を用いて選
択される。その後、ＨＳＶ−ｔｋカセットの喪失につい
ての負の選択が行なわれる（例えばｇａｎｃｉｃｌｏｖ
ｉｒ又はＦＩＡＵを用いて）。結果として得られるこれ
らの適正にターゲティングされた第２回目のＣ領域組換
え体は、Ｃγ３，Ｃγ１，Ｃγ２ｂ，Ｃγ２ａ，Ｃε及
びＣα遺伝子が欠如した重鎖遺伝子座を有する。
【０４３１】単数又は複数のＣ領域遺伝子が欠如した適
正にターゲティングされた第１回又は第２回目の組換え
型ＥＳ細胞を、上述のとおり、胚盤胞注入のために使用
し、キメラマウスを産生する。ターゲティングされた重
鎖対立遺伝子の生殖細胞系伝播が樹立され、結果として
得られた創立者マウスの繁殖（交配）を行なってＣ領域
ノックアウトに対して同型接合のマウスを生成する。こ
のようなＣ領域ノックアウトマウスは、ＪH ノックアウ
トマウスに比べていくつかの利点を有する：一例を挙げ
ると、Ｃ領域ノックアウトマウスは、ヒト重鎖トランス
ジーンと内因性重鎖遺伝子座恒常領域の間のトランスス
イッチを受ける能力が低下しており（又はこの能力が完
全に欠如している）、かくしてトランスジェニックマウ
ス内のキメラヒト／マウス重鎖の頻度を減少している。
μ及びデルタも同様に頻繁に相同ターゲティングによっ
て欠失させられているものの、マウスガンマ遺伝子のノ
ックアウトが好まれる。
【０４３２】内因性マウス重鎖遺伝子座内のその他のタ
ーゲティングされた病巣と合わせて、Ｃ領域ノックアウ
トを行なうことが可能である：中でも、マウス重鎖遺伝
子座の産生的ＶＤＪ再配置を排除するため及びヒト重鎖
トランスジーンとマウス重鎖遺伝子座の間のトランスス
イッチを排除又は削減するために、ＪH ノックアウトと
Ｃ領域欠失を組合わせることが可能である。いくつかの
実施態様については、内因性重鎖遺伝子座の単数又は複
数のＣ領域遺伝子が特定的に欠如しているもののその他
のいくつかのＣ領域遺伝子を保持しているマウスを産生
することが望ましい可能性がある。例えば、キメラヒト
／マウスＩｇＡが有利な表現型を付与し実質的にマウス
の望ましい有用性と干渉しない場合、このＩｇＡのトラ
ンススイッチによる産生を可能にするべくマウスＣα遺
伝子を保持することが好ましい可能性がある。
【０４３３】実施例２９ この例は、ヒトトランスジーンを宿すトランスジェニッ
クマウスから得られるリンパ球試料からの内因性（マウ
ス）免疫グロブリンを発現するリンパ球の半ビボ枯渇を
実証する。マウスＩｇを発現するリンパ球は、トランス
ジーン（単複）によりコードされるヒト免疫グロブリン
に対する実質的結合力が欠如している抗マウス免疫グロ
ブリン抗体に対する特異的結合により選択的に枯渇され
る。マウスＩｇ−発現Ｂ細胞の半ビボ枯渇 ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン（ＨＣ２）及びヒ
ト軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーン（ＫＣｏ４）に対し
て同型接合のマウスをＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）同系繁殖
マウスと繁殖（交配）させ、２２１１マウス（すなわ
ち、機能的内因性マウス重鎖遺伝子座に対し同型接合
で、機能的内因性マウス軽鎖遺伝子座に対し同型接合
で、かつヒト重鎖トランスジーンの１つのコピーとヒト
軽鎖トランスジーンの１つのコピーを有するマウス）を
得る。かかる２２１１マウスは同様にＢ６主要及び非主
要組織適合抗原をも発現する。これらのマウスを、免疫
原性用量の抗原でプライミングさせ、約１週間後に脾細
胞を分離させる。
【０４３４】標準的方法（Wyso ckiet al.(1978). Pro
c.Natl.Acad.Sci. (U.S.A.) 75 ；2844；MACS磁気細胞
選別、Miltenyi Biotec Inc, Sunnyvale, CA）に従った
固相連結された抗体依存型細胞分離及び、それに続く、
マウスＩｇに関し陽性の残留細胞を実質的に除去するた
めの抗体依存型補体媒介の細胞溶解（「細胞免疫学にお
ける選択された方法」、Mishell BB及びShiigi SM (ed
s), W.H.Freeman and Company, New York, 1980, p211
〜212 ）によって、マウスＩｇに関して陽性のＢ細胞を
除去する。枯渇された試料中の残りの細胞（例えば、ヒ
トＩｇについて陽性なＢ細胞、Ｔ細胞）を、好ましくは
発生するＢ細胞に対する付加的な抗マウスＩｇ抗体と合
わせて、ＳＣＩＤ／Ｂ６又はＲＡＧ／Ｂ６マウスに静脈
内注射する。再構成されたマウスを次に、さらに抗原に
対し免疫化させ、ハイブリドーマクローンを産生するた
めの抗体及び親和力の成熟した細胞を得る。
【０４３５】実施例３０ 体細胞キメラ内の完全にヒトの抗体の産生 体細胞キメラマウス内で完全にヒトの抗体を産生するた
めの方法が記述される。これらのマウスは、ヒト免疫グ
ロブリン（Ｉｇ）重鎖及び軽鎖トランスジーンを有し、
機能的マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子が欠如した
胚幹（ＥＳ）細胞を、ＲＡＧ−１又はＲＡＧ−２欠損マ
ウスからの胚盤胞の中に導入することによって生成され
る。
【０４３６】ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２欠損マウス（Mo
mbaerts et al. (1992) Cell 68：869 ；Shinkai et a
l. (1992) Cell 68：855 ）には、ＶＤＪ再配置を開始
しＩｇｓをコードする遺伝子セグメント及びＴ細胞レセ
プタ（ＴＣＲ）を組立てることができないため、マウス
Ｂ及びＴ細胞が欠如している。Ｂ及びＴ細胞の産生にお
けるこの欠陥は、ＲＡＧ−２欠損動物から誘導された胚
盤胞内への野生型ＥＳ細胞の注入によって補完できる。
結果として得られたキメラマウスは、注入されたＥＳ細
胞から完全に誘導された成熟したＢ及びＴ細胞を産生す
る（Chen et al.(1993) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90：
4528）。
【０４３７】キメラのＢ及び／又はＴ細胞全ての中に、
規定の突然変異及び／又は外因性ＤＮＡ構成体を導入す
るために、注入されたＥＳ細胞の遺伝子操作を使用す
る。Chen et al. (1993), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 9
0：4528−4532） ＲＡＧ胚盤胞内に注入された時点で、Ｂ細胞が無い状態
でＴ細胞を作るキメラを産生した、Ｉｇ重鎖遺伝子座の
同型接合失活を有する生成されたＥＳ細胞（原文不明
瞭）。突然変異体ＥＳ細胞内への再配置されたマウス重
鎖のトランスフェクションの結果、Ｂ細胞の発達が救わ
れ、キメラ内でＢ細胞及びＴ細胞の両方が再生されるこ
とになる。
【０４３８】マウスＩｇ重鎖又はカッパ軽鎖の合成が無
い状態で完全にヒトの抗体を発現するキメラマウスを生
成することが可能である。マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽
鎖遺伝子の両方の失活について同型接合であるＥＳ細胞
の中に、ヒトＩｇ重鎖及び軽鎖構成体を導入する。この
ときＥＳ細胞を、ＲＡＧ２欠損マウスから誘導された胚
盤胞の中に注入する。結果として得られるキメラは、マ
ウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子を発現することはで
きないもののヒトＩｇ遺伝子は発現する注入されたＥＳ
細胞から排他的に誘導されたＢ細胞を含んでいる。免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子の失活につい
て同型接合のＥＳ細胞の生成 それぞれ既知の手順に従った（Chen et al.(1993) EMBO
J. 12：821 ；及びChen et al.(1993) Int.Immunol.
前掲書中）、ＥＳ細胞内でのＩｇＪH 及びＪκ／Ｃκ配
列のターゲティングされた欠失により、失活されたＩｇ
重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座を支持するマウスを生成し
た。２つの突然変異体系のマウスを合わせて繁殖させ
て、両方のＩｇ遺伝子座の失活について同型接合の系を
生成した。この２重突然変異体の系を、ＥＳ細胞の誘導
のために使用した。使用されたプロトコルは、基本的
に、Robertson により記述されたものであった（１９８
７、「奇形ガン腫及び胚幹細胞；１つの実践的アプロー
チ」中。
【０４３９】p71 〜112 。E.J.Robertson 編、ＩＲＬプ
レス）。簡単に言うと、同系接合の２重突然変異体マウ
スの自然交配により、胚盤胞が生成された。受胎した雌
を妊娠２．５日目に卵巣摘出し、妊娠７日目に子宮から
「遅延した」胚盤胞を洗い流し、支持細胞上で培養し
て、それらの未分化状態の維持を助けた。その形態で同
定できる胚盤胞の内部細胞質量からの幹細胞をとり出
し、解離させ、支持細胞上で継代させた。正常な核型を
もつ細胞を同定し、雄細胞系統は、キメラを生成しマウ
スの生殖細胞に寄与するその能力についてテストされる
ことになる。雄キメラははるかに多くの子孫を産生でき
ることから、雌系統よりも雄ＥＳ細胞の方が好ましい。マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖欠損ＥＳ細胞内へのヒト
Ｉｇ遺伝子の導入 ＨＣＳ及びＫＣ−ＣＯ４といったミニ遺伝子座構成体又
はＪ１．３ＰといったＹＡＣクローンのいずれかとし
て、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を突然変異
体ＥＳ細胞内に導入する。ヒトＩｇ ＤＮＡでのＥＳ細
胞のトランスフェクションを、電気穿孔又は陽イオン脂
質でのリポフェクションといった技術によって行なう。
ヒトＤＮＡを取込んだＥＳ細胞の選択を可能にするた
め、選択可能マーカーを構成体に連結させるか又はＥＳ
細胞へと構成体と同時トランスフェクションさせる。突
然変異体ＥＳ細胞は、Ｉｇ遺伝子失活を生成した遺伝子
ターゲティング事象の結果としてネオマイシンホスフォ
トランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子を含んでいること
から、ヒトＩｇ遺伝子をＥＳ細胞内に導入するため、ハ
イグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）
又はピュロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ
（ｐａｃ）といったさまざまな選択可能なマーカーが使
用される。
【０４４０】ヒトＩｇ重鎖及び軽鎖遺伝子は、異なる選
択可能マーカーを用いて、突然変異体ＥＳ細胞内に同時
に又は逐次的に導入することができる。トランスフェク
ションの後、適切な選択可能マーカーで細胞を選択し、
ヒト遺伝子配列の組込みを確認し分析するべく凍結しＤ
ＮＡ分析する目的で薬剤耐性コロニーを拡張させる。 キメラの生成 記述されているとおり（Bradley, A. (1987), 「奇形ガ
ン腫及び胚幹細胞：１つの実践的アプローチ」中、p113
〜151, E.J.Robertson編、ＩＲＬプレス）ＲＡＧ−２胚
盤胞内にヒトＩｇ重鎖及び軽鎖遺伝子を含むＥＳクロー
ンを注入し、偽妊娠の雌の子宮内にトランスファさせ
る、血清試料のＥＬＩＳＡ検定により、ヒト抗体の存在
について子孫をスクリーニングする。ヒトモノクローナ
ル抗体の免疫化及び産生のために陽性動物を使用する。
【０４４１】実施例３１ この例は、スイッチ組換えを受けるＢ細胞の欠失へと導
くマウス重鎖遺伝子座内へのターゲティングされたフレ
ームシフト突然変異の、ＥＳ細胞内の相同組換えを介し
ての導入について記述する。フレームシフトされたマウ
スは、ヒト配列免疫グロブリンをコードするマウス以外
の（例えばヒトの）トランスジーンを宿すための適切な
宿主である。
【０４４２】新しいフレームシフトされたマウスは、な
かでも、重鎖トランスジーン（単複）及び／又は軽鎖ト
ランスジーンによりコードされる非マウス（例えばヒ
ト）配列免疫グロブリンを発現させるため、及び導入さ
れたトランスジーンからのクラススイッチされた親和力
が成熟したヒト配列抗体を発現するハイブリドーマの分
離のために使用可能である。４つのマウスＪＨ遺伝子セ
グメントのうちの１つの中、そしてマウスμ遺伝子の第
１のエキソンの中に、フレームシフトを導入する。導入
された２つのフレームシフト突然変異は、互いに補償し
合い、かくして、機能的ＶＤＪ連結のためにＢ細胞がフ
レームシフトされたＪＨを使用するときの完全に機能的
なマウスμ重鎖の発現を可能にする。残りのＪＨ遺伝子
内で補償されないμ内のフレームシフトのため、その他
の３つのＪＨセグメントのいずれも機能的ＶＤＪジョイ
ニングに使用することができない。代替的には、多数の
マウスＪＨ遺伝子の中に、補償するフレームシフトを工
作することもできる。
【０４４３】補償されフレームシフトされた免疫グロブ
リン重鎖対立遺伝子に対し同型接合のマウスは、ほぼ生
理学的レベルの末梢Ｂ細胞及び、マウスとヒトのμを両
方共含むほぼ生理学的レベルの血清ＩｇＭを有する。し
かしながら胚中心内に動員されたＢ細胞は、頻繁に、非
μアイソタイプへのクラススイッチを受ける。内因性マ
ウスμ鎖を発現するＢ細胞内のこのようなクラススイッ
チは、残りの非μＣH遺伝子が補償するフレームシフト
を有していないことから、補償されていないフレームシ
フトｍＲＮＡの発現を導く。結果として得られるＢ細胞
は、Ｂ細胞レセプタを発現せず、欠失される。従って、
マウス重鎖を発現するＢ細胞はそれらがアイソタイプス
イッチの起こる分化段階にひとたび達した時点で欠失さ
れる。しかしながら、アイソタイプスイッチの能力をも
ちかかるアイソタイプ制限フレームシフトを含まない、
非マウス（例えばヒト）トランスジーンによりコードさ
れる重鎖を発現するＢ細胞は、アイソタイプスイッチ及
び／又は親和力成熟などを含むさらなる発達の能力をも
つ。
【０４４４】従って、フレームシフトを受けたマウスは
マウス重鎖（μ）に関して二次応答が損なわれている
が、トランスジーンコードされた重鎖に関しては有意な
二次応答を有する。クラススイッチを受けることのでき
る重鎖トランスジーンがこの突然変異体バックグラウン
ド内に導入された場合、非−ＩｇＭ二次応答は、Ｂ細胞
を発現するトランスジーンにより支配される。かくして
これらのフレームシフトされたマウスからハイブリドー
マを発現する親和力成熟したヒト配列免疫グロブリンを
分離することが可能である。さらに、フレームシフトさ
れたマウスは一般に、ヒト重鎖トランスジーンが可変領
域の制限された能力範囲しかコードできない場合に有利
でありうるマウスＩｇＭの免疫防御レベルを有する。
【０４４５】ヒト配列モノクローナル抗体を分泌するハ
イブリドーマを作るために、トランスジェニック突然変
異体マウスを免疫化し、その脾臓を骨髄腫細胞系統と融
合させ、結果として得られたハイブリドーマを、トラン
スジーンでコードされたヒト非μアイソタイプの発現に
ついてスクリーニングする。さらに、フレームシフトし
たマウスは、シススイッチのための活性基質として役立
つ転写されたＶＤＪに隣接した機能的μスイッチ配列を
含むことになり（Gu et al,(1993) Cell 73；1155）、
かくしてキメラヒト／マウス抗体を発現するトランスス
イッチされたＢ細胞レベルを低下させるため、ＪＨ欠失
したマウスに比べ有利でありうる。フレームシフトベクターの構築 ２つの別々のフレームシフトベクターを構築する。これ
らのベクターのうちの１つは、マウスＪ４遺伝子セグメ
ントの３′末端で２つのヌクレオチドを導入するのに用
いられ、もう１つのベクターは、マウスμ遺伝子のエキ
ソン１の５′末端からこれらの同じ２つのヌクレオチド
を欠失させるために用いられる。 １．ＪＨベクター ホスホグリセリン酸キナーゼプロモータの制御下でヘル
ペスチミジンキナーゼ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝
子を含むプラスミドベクター内に、マウス重鎖Ｊ領域及
びμイントロンエンハンサーを網羅する３．４kbのＸｈ
ｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをサブクローニングする
（ｔｋ／ｎｅｏカセット、 Hasty et al., (1991) Natu
re 350 ：243 ）。次に以下のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いて２つの異なるＰＣＲフラグメントを生成
するための基質として、このクローンを使用する： ｏ−Ａ１ ５′−cca cac tct gca tgc tgc aga agc tt
t tct gta −３′ ｏ−Ａ２ ５′−ggt gac tga ggt acc ttg acc cca gt
a gtc cag −３′ ｏ−Ａ３ ５′−ggt tac ctc agt cac cgt ctc ctc ag
a ggt aag aat ggc ctc−３′ ｏ−Ａ４ ５′−agg ctc cac cag acc tct cta gac ag
c aac tac −３′ ＳｐｈＩ及びＫｐｎＩで消化される１．２kbのフラグメ
ントを増幅するため、オリゴヌクレオチドｏ−Ａ１及び
ｏ−Ａ２を使用する。ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化され
る０．６kbのフラグメントを増幅するため、オリゴヌク
レオチドｏ−Ａ３及びｏ−Ａ４を使用する。次にこれら
２つの消化されたフラグメントを、ＳｐｈＩ／ＸｂａＩ
で消化されたプラスミドＡの中にクローニングし、プラ
スミドＢを生成する。
【０４４６】プラスミドＢは、Ｊ４の末端に２ヌクレオ
チド挿入を含み、さらに挿入の上流に新しいＫｐｎＩ部
位を含む。挿入のための診断マーカーとして、ＫｐｎＩ
部位を使用する。相同組換え効率を増大させるため、プ
ラスミドの５′ＸｈｏＩ部位及び３′ＥｃｏＲＩ部位の
中に、付加的フランキング配列をクローニングすること
ができる。その後、ＳｐｈＩ又はインサート内に単一の
部位をもつもう１つの制限酵素で、結果として得られた
プラスミドを消化し、胚幹細胞へと電気穿孔させ、これ
らの細胞を次に、Hasty et al (1991)、前掲書中、によ
り記述されているとおりに、Ｇ４１８で選択させる。サ
ザンブロットハイブリダイゼーションにより相同組換え
体を同定し、次にHasty et al により記述されていると
おりにＦＩＡＵにより選択させて、２塩基対挿入とＪＨ
４内の新たなＫｐｎＩ部位のみを含む欠失されたサブク
ローンを得る。これらを、ＫｐｎＩ消化されたＤＮＡの
サザンブロットハイブリダイゼーションにより同定し、
ＰＣＲ増幅されたＪＨ４ ＤＮＡのＤＮＡ配列分析によ
り確認する。
【０４４７】結果として得られたマウスは、突然変異さ
れていない配列：すなわち ...TGGGGTCAAGGA ACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG gtaagaatggcctctcc... TrpGlyGlnGlyThrSerValThrValSerSerGlu から突然変異体配列すなわち、 ...TGGGGTCAAGGT ACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGAGgtaagaatggcctctcc... TrpGlyGlnGlyThrSerValThrValSerSerGlu へと変換されたＪＨ４セグメントを含む。μエキソン１ベクター ＪＨ４遺伝子セグメント内への２塩基対挿入を工作する
べく上述したものと類似のインビトロ突然変異誘発を用
いて、第１のμエキソンの５′末端で２塩基対欠失を含
むベクターを作り出すため、ＰＣＲ産物及びゲノミック
サブクローンを組立てる。さらに突然変異をマーキング
するため、ＡをＧに変更することにより新しいＸｍｎＩ
部位も下流に導入する。
【０４４８】突然変異を受けていないμ遺伝子の配列は
以下のとおりである： ...ctggtcctcagAGAGTCAGTCCTTCCCA AATGTCTTCCCCCTCGTC... GluSerGlnSerPheProAsnValPheProLeuVal 突然変異を受けたμ遺伝子の配列は以下のとおりであ
る。 XmnI ...ctggtcctcag AGTCAGTCCTTCCCG AATGTCTTCCCCCTCGTC... SerGlnSerPheProAsnValPheProLeuVal 突然変異体配列を含む相同組換えベクターを、ＪＨ４挿
入を含むＥＳ細胞系統へと線形化させ電気穿孔させる。
ネオマイシン耐性クローンから相同組換え体を同定す
る。ＪＨ挿入と同じ染色体上のフレームシフト挿入を含
むこれらの相同組換え体を、ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩで消
化されたＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーショ
ンにより同定する。野生型１１．３kbから突然変異体９
kbまでのＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩを含むＪ−μイントロン
のサイズを減少させる新しいＫｐｎＩ部位とＪＨ４挿入
を結びつける。次に、ＦＩＡＵを用いて、挿入されたｔ
ｋ／ｎｅｏカセットの欠失のために、結果として得られ
たクローンを選択する。突然変異体μエキソンを含むク
ローンを、ＸｍｎＩで消化されたＤＮＡのサザンブロッ
トハイブリダイゼーションにより同定する。突然変異
は、ＰＣＲ増幅されたμエキソン１ＤＮＡのＤＮＡ配列
分析により確認される。フレームシフトされたマウスの生成 次に、ＪＨ４内の２塩基対挿入及びμエキソン１内の２
塩基対欠失の両方を含むＥＳ細胞系統を、キメラを生成
するべく偽妊娠の雌の体内に挿入される胚盤胞段階の胚
の中に導入する。キメラ動物を繁殖させて生殖細胞系列
の伝播を得、結果として得られた動物を同型接合まで繁
殖させて、補償されたフレームシフトされた重鎖遺伝子
座に対し同型接合でかつマウス重鎖を発現するＢ細胞内
の二次体液性免疫応答が損なわれている突然変異体動物
を得る。
【０４４９】例えばｐＨＣ１又はｐＨＣ２といったヒト
重鎖トランスジーンを、フレームシフトされたマウスＩ
ｇＨ遺伝子座をもつマウスの中にかかるヒトトランスジ
ーンを宿すマウスを交雑育種することによってマウス重
鎖フレームシフトバックグラウンドへと繁殖させること
ができる。同系交配及び戻し交配を介して、μ補償され
フレームシフトされたマウスＩｇＨ対立遺伝子に対して
マウスＩｇＨ遺伝子座で同型接合で（すなわちマウスの
非μ鎖ではなくμ鎖のみの補償された枠内発現をするこ
とのできる）しかも機能的ヒト重鎖トランスジーン（例
えばｐＨＣ１又はｐＨＣ２）の少なくとも１つの組込み
コピーを宿すマウスを産生させる。かかるマウスは任意
には、上述のとおりの内因性マウスκ及び／又はλ遺伝
子のノックアウトを内含していてよく、又任意には、ヒ
ト又はその他の非マウス軽鎖トランスジーン（例、ｐＫ
Ｃ１ｅ，ｐＫＣ２など）を含む可能性がある。
【０４５０】代替的には、トランスジーン恒常領域遺伝
子（単複）内のフレームシフトにより補償されるフレー
ムシフトがトランスジーンＪ遺伝子（単複）に含まれる
ように、ヒトトランスジーン（単複）（重鎖及び／又は
軽鎖）には補償フレームシャフトが含まれていてもよ
い、内因性恒常領域遺伝子に対するトランススイッチ
は、補償されず、切形の又はナンセンス産生を産生す
る；かかる補償されていないトランススイッチされた免
疫グロブリンを発現するＢ細胞に対し選択を行ない、こ
れを枯渇させる。
【０４５１】実施例３２ Ｄ領域切除による内因性重鎖の失活 この例は、マウス生殖細胞系統免疫グロブリン重鎖Ｄ領
域を非機能的な再配置されたＶＤＪセグメントで置換す
るための正−負選択相同組換えベクターについて記述す
る。結果として得られる対立遺伝子は、対立遺伝子内重
鎖クラススイッチを受けかくしてトランススイッチレベ
ルを活性トランスジーン遺伝子座まで減少させている状
態で、正常な非産生的対立遺伝子としてＢ細胞内で機能
する。Ｄ領域ターゲティング構成体 マウスＤ領域の上流にある８〜１５kbのＤＮＡフラグメ
ントを、Gen BankにリストアップされたＤＦＬ１６．１
セグメントに対する公表済み配列の約５０の連続したヌ
クレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブを用い
て、マウス系１２９ファージライブラリから分離し、サ
ブクローニングする。ＤＦＬ１６．１は、上流Ｄセグメ
ント（すなわち、Ｖ領域遺伝子クラスターに近位で、恒
常領域遺伝子クラスタに遠位のもの）である。
【０４５２】同様に、ＪＨ３，ＪＨ４，Ｅμ，Ｓμ及び
μ恒常領域の最初の２つのコーティングエキソンを含む
９．５kbのＢａｍＨＩフラグメントを、マウス系１２９
ゲノミックファージライブラリーから分離しサブクロー
ニングする。次にマウスハイブリドーマ（あらゆる系）
から５〜１０kbの再配置されたＶＤＪを分離し、停止コ
ドンを含む合成リンカーをＪセグメント内に挿入する。
Ｖ置換再配置が可能であるため、枠外ＶＤＪ連結よりも
Ｊの内部の停止リンカーが好まれる。
【０４５３】これら３つのフラグメントをＰＧＫｎｅｏ
正の選択カセット及びＰＧＫＨＳＶｔｋ負の選択カセッ
トと合わせて組立てて、相同組換えにより１２９−誘導
ＥＳ細胞（例えばＡＢ１）内のマウスＤ領域を削除する
ための正−負選択ベクターを形成する。ターゲティング
ベクターは、それ自体９．５kbのＢａｍＨＩフラグメン
トに連結される再配置された５〜１０kbの再配置済みＶ
ＤＪにそれ自体連結されている正の選択カセット（例え
ばＰＧＫｎｅｏ）に８〜１５kbのＤＮＡフラグメントを
連結させることによって形成される。次に、ターゲティ
ング構成体のいずれかの端部で負の選択カセット（例え
ばＰＧＫＨＳＶｔｋ）を連結させる。かかるＤ領域ター
ゲティングベクターの構成は、図７３に概略的に示され
ている。
【０４５４】Ｄ領域ターゲティング構成体を、ＡＢ１
ＥＳ細胞内にトランスファし、正及び負の選択を上述の
とおりに行ない、適正にターゲティングされたＥＳ細胞
をクローニングする。胚盤胞注入のために、適正にター
ゲティングされたＥＳ細胞クローンを使用し、キメラマ
ウスを産生する。Ｄ領域失活された重鎖対立遺伝子を宿
す創立者マウスを産生するため、キメラマウスを繁殖さ
せる。機能的内因性重鎖遺伝子座が欠如した同型接合体
を産生するため、子孫の同系交配を行なう。
【０４５５】このような同型接合体を用いて、ヒトＩｇ
トランスジーン（例えばｐＨＣ１，ｐＨＣ２，ｐＫＣ
２，ｐＫＣ１ｅ，ＫＣｏ４）を宿すマウスまで交雑育種
し、（さらに、機能的Ｄ領域が欠如した同型接合体まで
もどし交配することにより）、機能的内因性重鎖遺伝子
座が欠如しかつヒト重（鎖）トランスジーン（そして好
ましくはヒト軽鎖トランスジーンも）を宿すマウスを生
み出す。
【０４５６】いくつかの機能的内因性軽鎖遺伝子座（例
えばλ遺伝子座）が残る実施態様においては、一般に、
トランスジーンがヒト軽鎖（例えばκ）ポリペプチドの
高レベル発現を誘導する転写制御配列を含み、かくして
トランスジーンの遺伝子座が残りの内因性軽鎖（例えば
λ）遺伝子座と有効に競合できるようにすることが好ま
しい。例えば、Ｃｏ４カッパ軽鎖トランスジーンは、ト
ランスジェニック動物内の内因性λ遺伝子座と有効に競
合する能力に関してｐＫＣ１に比べ一般に好まれてい
る。
【０４５７】実施例３３ この例は、ヒトＶκ遺伝子座の一部分を含む酵母人工染
色体とヒトκ軽鎖ミニ遺伝子座の同時注入によるヒト軽
鎖トランスジーンＶ遺伝子の能力範囲の拡張について記
述する。Ｖκ含有ＹＡＣ ＤＮＡとκミニ遺伝子座の同時注入に
よる機能的ヒト軽鎖Ｖセグメントの導入 一般に入手可能なＩＣＲＦ ＹＡＣライブラリーのクロ
ーン４×１７Ｅ１から、増幅されていないＹＡＣ ＤＮ
Ａとして、ヒトＶκ遺伝子座の一部を含む約４５０kbの
ＹＡＣクローンを得た（Larin et al. (1991) Proc.Nat
l.Acad.Sci(U.S.A.) 88：4123；Imperial Cancer Rese
arch Fund 、ゲノム分析研究所、ロンドン, UK）。メー
カーの仕様に従って標準的なパルフフィールドゲル電気
泳動法により、予め増幅することなく、４５０kbのＹＡ
Ｃクローンを分離した（ＣＨＥＦＤＲ−II、電気泳動セ
ル、Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA）。臭化エチ
ジウムを用いて６つの個別のパルスフィールドゲルを染
色し、ＹＡＣクローンＤＮＡを含むゲル材料をゲルから
切除し、次に三角形のゲルトレイ内に流し込まれた新し
い（標準ゲル緩衝液中の低融点アガロース）ゲル内にこ
れを埋込む。標準電気泳動緩衝液に加えて２ＭのＮａＯ
Ａｃを伴う狭いアガロースゲルを用いて頂点において、
結果として得られた三角形のゲル（６つの切除されたＹ
ＡＣ含有ゲルブロックを内含する）を伸展させた。次に
ゲルを、標準ゲル緩衝液中に浸漬された電気泳動チャン
バ内に入れた。
【０４５８】Ｙ形状のゲルフォーマは、電流（流動？）
が狭く高いソルトゲル部分までだけ流れるように、緩衝
液の表面より上に立上っている。緩衝液内へのＮａＯＡ
ｃの拡散を防ぐため、高ソルトゲル切片全体にわたり、
アクリルのブロックを置いた。次に、ＹＡＣ ＤＮＡを
切片化された（埋込まれた）もとの切除ゲルから狭い高
ソルトゲル部分内へと電気泳動させた。低ソルトゲルか
ら高ソルトゲルへの遷移の時点で、三角形のゲルの頂点
でＤＮＡの移動を有効に停止させる抵抗の低下が存在す
る。
【０４５９】電気泳動及び臭化エチジウムでの染色の
後、濃縮したＹＡＣ ＤＮＡを残りのゲルから切り離
し、アガロースをＧＥＬａｓｅ（Epi Centre Technolog
ies, Madison, Wisconsin ）で消化した。次に、結果と
して得られたＹＡＣ含有液体に塩化セシウムを付加し、
１．６８ｇ／mlの密度を得た。この溶液を３６時間３７
０００rpm で遠心分離し、あらゆる汚染物質からＹＡＣ
ＤＮＡを分離した。結果として得られた密度勾配の
０．５ml分画を分離し、５mMのＴｒｉｓ（pH７．４）、
５mMのＮａＣｌ、０．１ＭのＥＤＴＡに対してピークＤ
ＮＡ分画を透析した。
【０４６０】透析の後、結果として得られたＹＡＣ Ｄ
ＮＡの０．６５ml溶液の濃縮は、２μｇ／mlのＤＮＡを
含んでいることがわかった。このＹＡＣ ＤＮＡを、２
０：１：１（マイクログラムＹＡＣ４×１７Ｅ１：ＫＣ
１Ｂ：ＫＶ４）の比率で、プラスミドｐＫＣ１Ｂ及びｐ
ＫＶ４からの精製されたＤＮＡインサートと混合した。
半日のＢ６ＣＢＦ２の胚の前核の中に、結果として得ら
れた２μｇ／mlの溶液を注入し、９５の存続する微量注
入された胚を偽妊娠の雌の卵管内に移送した。微量注入
された胚から発達した１２匹のマウスが生まれた。
【０４６１】実施例３４ この例は、失活した内因性免疫グロブリン遺伝子座に対
して同型接合でありかつＨＣ１又はＨＣ２重鎖トランス
ジーンを含む免疫化したトランスジェニックマウスの中
でのクラススイッチ、体細胞突然変異及びＢ細胞発達に
ついて記述する。
【０４６２】ヒト配列生殖細胞系統配置ミニ遺伝子座が
真正遺伝子座と置換できることを実証するために、我々
は、ヒト生殖細胞系統−配置ＩｇＨトランスジーンを含
む系を用いて、内因性ＩｇＨが欠如したマウス系を繁殖
させた。２つのトランスジーンミニ遺伝子座ＨＣ１及び
ＨＣ２は、それぞれ１つ及び４つの機能可変（Ｖ）セグ
メント、１０及び１６の多様性（Ｄ）セグメント、６つ
のジョイニング（ＪＨ）セグメント全て、及び両方のμ
及びγ１恒常領域セグメントを含む。ミニ遺伝子座は、
コーディングセグメントに密に連鎖されている--ＪＨ−
μイントロンエンハンサー及びμ及びγ１スイッチ配列
といった--ヒトシス作用性調節配列を含む。
【０４６３】これらは同様に、ラットＩｇＨ遺伝子座の
３′末端から誘導された付加的なエンハンサー要素も含
んでいる。我々は、ＨＣ１及びＨＣ２トランスジェニッ
クマウスを、記述のとおり（前出）ＪＨセグメント（Ｊ
ＨＤマウス）が欠如し従って機能的重鎖再配置を受ける
ことのできない幹細胞由来の突然変異マウスと交配させ
た。結果として得られたトランスジェニック−ＪＨＤマ
ウスは、導入された重鎖配列に依存するＢ細胞を含んで
いる。免疫化及びハイブリドーマ 我々は、５０〜１００μｇの抗原の腹腔内注入によりマ
ウスを免疫化した。抗原には、ヒトのガン胎児性抗原
（ＣＥＡ；Crystal Chem, Chicago, IL ）、ニワトリ卵
白リゾチーム（ＨＥＬ；Pierce, Rockford, IL）及びキ
ーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；Pierce, Ro
ckford, IL）が含まれていた。一次注入のために、我々
は抗原を完全フロイントアジュバントと混合し、その後
の注入については不完全フロイントアジュバント（Gibc
o BRL, Gaithersburg, MD ）を用いた。脾細胞を、非分
泌性マウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ATCC,
CRL1580 ）と融合させた。
【０４６４】我々は、ＥＬＩＳＡにより、ヒト重鎖配列
を含む特異的及び非特異的抗体の存在について血清試料
及びハイブリドーマ上清を検定した。非特異的抗体の検
出のために、我々は、ヒト重鎖アイソタイプ特異的抗体
（マウスＭＡｂαヒトＩｇＧ１、クローンＨＰ６０６
９、Cal bio chem, La Jolla, CA；マウスＭＡｂαヒト
ＩｇＭ、クローンＣＨ６、The Binding Site, Birmingh
am, UK）でマイクロタイターウエルをコーティングし、
ペルオキシダーゼ接合抗血清（ポリクローナルヤギαヒ
トＩｇＧ（ｆｃ）からのホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ接合の親和性精製されたｆａｂフラグメント、ｃ
ａｔ ＃１０９−０３６−０９８；親和性精製されたホ
ースラディッシュペルオキシダーゼ接合されたポリクロ
ーナルウサギαヒトＩｇＭ（ｆｃ），ｃａｔ ＃３０９
−０３５−０９５。
【０４６５】Jackson Immuno Research, West Grove, P
A ）を用いて発達させた。抗原特異的抗体の検出のた
め、我々はマイクロタイターウエルを抗原でコーティン
グし、ペルオキシダーゼ接合されたヒト重鎖アイソタイ
プ特異血清を用いて発達させた。我々は、過酸化水素及
び２，２′−アジノ−ビス−（３−エチルベンズチアゾ
リン−ｂ−スルフォン酸、Sigma Chem.Co., St.Louis,
Mo）でのインキュベーションにより、結合ペルオキシダ
ーゼを検出した。反応産物を４１５nmで吸収により測定
し、４９０nmでの吸収について補正する。フローサイトメトリー 我々は、脾臓、骨髄及び腹腔から単細胞懸濁液を調製
し、 Mishell及びShiigiにより記述されているとおりに
ＮＨ4 Ｃｌで赤血球を溶解した。次の試薬でリンパ球を
染色した：すなわち、フィコエリトリン接合された抗マ
ウスＩｇκ（クローンＸ３６；Becton Dickinson, San
Joss. CA），ＦＩＴＣ接合された抗マウスＩｇＤ（クロ
ーンＳＢＡ１，Southern Biotech, AL），ＦＩＴＣ接合
された抗マウスＣＤ５（クローン５３−７．３；Becton
Dickinson, San Jose. CA），ＦＩＴＣ接合された抗マ
ウスＩｇλ（クローンＲ２６−４６）；Pharmingen, Sa
n Diego, CA ）及びＣｙ−クロム接合された抗マウスＢ
２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２；Pharmingen, San Di
ego, CA ）、我々はＦＡＣＳｃａｎクローン血球計算器
及びＬＹＳＩＳIIソフトウェア（Becton Dickinson, Sa
n Jose. CA）を用いて染色した細胞を分析した。前方及
び側方散乱器上でのゲーティングにより、大部分のマク
ロファージ、好中球及び残留赤血球を排除する。Ｂ細胞区画の救助 ＨＣ１トランスジェニック−ＪＨＤ動物の腹腔内では、
ＣＤ5+Ｂ細胞の正常レベル及び従来のＣＤ5-Ｂ細胞の正
常レベルの約４分の１が見られる。トランスジェニック
腹腔ＣＤ５+ Ｂ細胞は、正常な動物内での記述されたい
わゆるＢ−１細胞に類似している：すなわち、これらは
従来のＢ及びＴリンパ球よりも大きく、脾臓内で見られ
る従来のＢ細胞よりも低いレベルのＢ２２０を発現し、
より高い割合のλ軽鎖発現細胞を含んでいる。脾臓Ｂ細
胞の９０％以上がκを発現し、一方最高５０％の腹腔Ｂ
細胞がλを発現する。かくして、従来のＢ細胞のレベル
は全ての組織内で均等に減少している一方で、自己更新
の能力がはるかに大きいものとして報告されているＢ−
１のレベルは、ＨＣ１トランスジェニック−ＪＨＤ動物
において正常であると思われる。クラススイッチ トランスジェニック−ＪＨＤマウスにおいては、抗原に
対して反復的に露呈することにより、ヒトγ１抗体なら
びにμ抗体が結果として産生される。我々は、一週間の
間隔でトランスジェニック−ＪＨＤマウス内にヒトＣＥ
Ａを注入し、４週間にわたり抗原特異的ＩｇＭ及びＩｇ
Ｇ１の血清レベルを監視した（図７４）。１週間目に、
検出可能なＩｇＭ応答があるがＩｇＧ１応答は全く無
い。しかしながらＩｇＧ１応答は２週間後ＩｇＭ応答よ
りも大きく、ＩｇＭ応答が比較的恒常な状態にとどまっ
ているのに対して増大し続けている。このパターン、す
なわち初期のＩｇＭ応答とそれに続くＩｇＧ反応は、二
次免疫応答に典型的なものであり、これは、トランスジ
ーン内に内含されているシス作用性配列が、クラススイ
ッチを導くサイトカインに対し応答しているかもしれな
いということを示唆している。我々は、各々文献中で論
述されてきた非μアイソタイプの発現について考えられ
る３つのメカニズムを考慮した。これらのメカニズムと
はすなわち、μ遺伝子の欠失が関与しない交互のスプラ
イシング；フランキング反復配列間の相同組換えを介し
てのμ遺伝子の欠失が関与した「δ−型」スイッチ；そ
してスイッチ領域間の非相同組換えである。以下で記述
する我々の実験の結果はスイッチ領域組換えモデルを表
わしている。
【０４６６】アイソタイプシフトを説明するのに２つの
タイプの非欠失性交互スプライシングメカニズムを喚起
することができる。第１に、μ及びγ１の両方をカバー
する単一の写しをトランスジーンから発現させることが
可能である；この写しは抗原に対する露出により誘発さ
れたサイトカインに応答して交互にスプライシングさせ
ることができた。代替的には、サイトカイン誘発された
γ１の上流で開始する不稔写しを、μ写しにトランスス
プライシングさせることができた。これらのメカニズム
のうちのいずれかがヒトγ１配列の発現の原因であった
ならば、μ及びγ１の両方を発現するハイブリドーマを
分離できるということを期待したであろう。しかしなが
ら、ヒトμ又はヒトγ１のいずれかを発現する数百のハ
イブリドーマをスクリーニングしてきたものの、かかる
二重産生者（μ+ ，γ１+ ）ハイブリドーマは全く発見
されなかった。このことは、γ１の発現にμ遺伝子の欠
失が伴っていることを表わしている。
【０４６７】μ遺伝子の欠失は、μとγ１スイッチ領域
の間の非相同組換えによって、又はＨＣ１及びＨＣ２ト
ランスジーン内に含まれている２つのフランキングする
４００bpの直接反復（σμ及びΣμ）の間の相同組換え
によって媒介されうる。σμ及びΣμの間の欠失組換え
は、いくつかのヒトＢ細胞のＩｇＤ+ ，ＩｇＭ- 表現型
の原因であることが報告されてきた。第１のメカニズム
すなわち非相同スイッチ組換えは可変的な長さのスイッ
チ産物を産生するはずであるが、一方第２のメカニズム
すなわちσμ／Σμ組換えはつねに同じ産物を生成する
はずである。我々は、μを発現するもの１つとγ１を発
現するもの２つの計３つのハイブリドーマ（図７５）か
ら分離したゲノミックＤＮＡのサザンブロット分析を行
なった。γ１スイッチ領域のうち２つの中にのみトラン
スジーンγ１の上流にゲノミック再配置が発見される
（図７６）。さらに、観察した構造のうちいずれもσμ
とΣμの間の相同組換えと両立性がない。従って、我々
の結果は、トランスジーンでコードされたμ及びγ１の
スイッチ領域の間での欠失性非相同組換えによって媒介
されるγ１アイソタイプ発現のためのモデルと一貫性を
有する。トランススイッチ ヒトγ１に加えて、ＨＣ１及びＨＣ２トランスジェニッ
ク−ＪＨＤマウスの血清中にマウスγが見い出される。
これらの動物から、マウスγ発現ハイブリドーマも得ら
れた。非トランスジェニック同型接合ＪＨＤ動物は、検
出可能なレベルのマウス免疫グロブリンを発現しないこ
とから、ＨＣ１及びＨＣ２トランスジェニック−ＪＨＤ
動物内のマウスγの発現は、トランススイッチ現象のせ
いであると思われる。我々が分析したトランスジェニッ
ク・ハイブリドーマの全ては、マウス又はヒトのいずれ
かの恒常領域配列を発現するものの両方を発現すること
はない。従ってトランススプライシングメカニズムが関
与する可能性は低い。トランススイッチ産物のｃＤＮＡ
クローンを分離するためのＰＣＲ増幅を用い、結果とし
て得られるクローンのうちの１０個のヌクレオチド配列
を決定した（図７７）。ＰＣＲ増幅中の５′オリゴヌク
レオチドはトランスジーンコードされたＶＨ２５１に特
異的であり、３′オリゴヌクレオチドはマウスγ１，γ
２ｂ及びγ３配列に特異的である。これら３つのマウス
恒常領域の全てを取込んだトランススイッチ産物の例が
見られる。体細胞突然変異 図７に示されているトランススイッチ産物の可変領域内
のヌクレオチドの約１％が、生殖細胞系統コーディング
を受けていない。これはおそらく、体細胞突然変異のせ
いであると思われる。突然変異を受けた配列は内因性遺
伝子座にトランスロケートされていたため、これらの突
然変異を導くシス作用性配列は、マウスγスイッチから
３′のどこにでも位置設定することができた。しかしな
がら以下で論述するとおり、かかるトランスロケーショ
ンを受けなかったＶＤＪセグメント内の体細胞突然変異
も観察される。そしてこの結果は、重鎖体細胞突然変異
が必要とする配列がトランスジーン内に内含されている
ということを表わしている。
【０４６８】ＨＣ１及びＨＣ２構成体が、トランスジェ
ニック−ＪＨＤマウス内で体細胞突然変異が起こるのに
充分なシス作用性配列を含んでいるか否かを決定するた
め、我々は、２つの独立したＨＣ１トランスジェニック
系統そして１つのＨＣ２系統から誘導されたｃＤＮＡク
ローンを分離し部分的に配列決定した。トランスジェニ
ック−ＪＨＤマウスからのγ１写しのいくつかが、広範
な体細胞突然変異を伴うＶ領域を含んでいることがわか
る。これらの突然変異を受けた写しの頻度は、免疫化の
反復に伴って増大するように思われる。図７８及び７９
は、２組のｃＤＮＡ配列を示す：すなわち１組は、ＲＮ
Ａを分離する５日前に抗原の一回の注入で免疫化したＨ
Ｃ１（系統２６）トランスジェニック−ＪＨＤマウスか
ら誘導体されている；
【０４６９】第２の組は、ＲＮＡを分離する５カ月前か
ら始めて異なる日に３回抗原を注入することによって高
度免疫させたＨＣ１（系統２６）トランスジェニック−
ＪＨＤマウスから誘導されている；第２の組は、ＲＮＡ
を分離する５カ月前から始めて異なる日に３回抗原を注
入することによって高度免疫させたＨＣ１（系統２６）
トランスジェニック−ＪＨＤマウスから誘導されている
（原文重複）。露呈後５日目から１３のＶ領域のうちわ
ずか２つだけがいずれかの生殖細胞系統コーディングを
受けていないヌクレオチドを含んでいる。これらのＶの
各々は単一のヌクレオチド変更しか含まず、この試料に
ついて０．１％未満の全体的体細胞突然変異頻度を与え
ている。これとは対照的に、高度免疫された動物からの
１３のＶ配列のいずれも完全に生殖細胞系統ではなく、
全体的体細胞突然変異頻度は１．６％である。
【０４７０】単一の組織試料から分離されたμ及びγ１
写しの比較は、体細胞突然変異の頻度がクラススイッチ
を受けたトランスジーンコピーの場合よりも高いという
ことを示している。我々は高度免疫したＣＨ１系統５７
トランスジェニック−ＪＨＤマウスからの４７の独立し
たμ及びγ１ｃＤＮＡクローンを分離し、部分的に配列
決定した（図８０及び８１）。μｃＤＮＡクローンのほ
とんどは、生殖細胞系統配列との関係において修正され
ておらず、一方γ１クローンの半数以上は、多数の生殖
細胞系統コーディングを受けていないヌクレオチドを含
んでいる。γ１発現細胞は、μ発現細胞とは全く異な
り、２つのプロセスは必ずしも連関されていないもの
の、クラススイッチと体細胞突然変異は、Ｂ細胞の同じ
副次集団内で起こっている。
【０４７１】高度免疫を受けていないＣＨ１トランスジ
ェニックマウス内にＶＨ２５１遺伝子の広範な体細胞突
然変異は見られないが、特定の実験を受けていないＨＣ
２トランスジェニックマウスにおいてはＶＨ５６ｐ１及
びＶＨ５１ｐ１遺伝子の中で著しい体細胞突然変異が発
見された。生後９週間の免疫化を受けていない雌のＨＣ
２トランスジェニック動物から脾臓及びリンパ節ＲＮＡ
を分離した。我々は、Ｖ及びγ１特異的プライマを用い
てＨＣ２トランスジーン内の４つのＶ領域の各々を取込
むγ１写しを個別に増幅した。特異的ＰＣＲ産物の各々
の相対的収量はＶＨ５６ｐ１≫ＶＨ５１ｐ１＞ＶＨ４．
２１＞ＶＨ２５１であった。この技術は厳密に定量的で
はないものの、ＨＣ２マウス内でのＶセグメントの使用
における偏りを表わす可能性がある。
【０４７２】図８２は、４つのＶ特異的プライマ全ての
等モル混合物を用いたＰＣＲ増幅から誘導された、無作
為にとり上げた２３個のγ１ｃＤＮＡ配列を示してい
る。ここでも又、ＶＨ５６ｐ１（１９／２３クローン）
に向かっての偏りが見られる。さらに、ＶＨ５６ｐ１配
列は、Ｖ遺伝子セグメント内で２．１％の全体的頻度
で、著しい体細胞突然変異を示している。ＣＤＲ３配列
を検査すると、１９のうち１７の個別のＶＨ５６ｐ１ク
ローンが固有のものであるけれども、それらがわずか７
つの異なるＶＤＪ組換え事象のみから誘導されている、
ということがわかる。従って、特定の実験を受けていな
い動物において、恐らくは内因性病原体又は自己抗原に
よりＶＨ５６ｐ１発現Ｂ細胞が選択されるように思われ
る。この同じ遺伝子がヒトの胎児能力範囲内で過剰表示
されることが適切である可能性がある。
【０４７３】要約 上流シス作用性配列は、個々のスイッチ領域の機能性を
規定し、クラススイッチには必要なものである。ＨＣ１
トランスジーン内のクラススイッチが二次応答に関与す
る細胞に大幅に制限されており、全Ｂ細胞集団を横切っ
て無作為に発生しないという我々の観察は、トランスジ
ーンと共に内含される最低限の配列が充分なものである
ということを示唆している。この構成体の中に内含され
るγ配列は、γ１不稔写しの開始部位の上流わずか１１
６個のヌクレオチドのところで始まっていることから、
スイッチ調節領域はち密なものである。
【０４７４】我々の結果から、これらの重要なシス作用
性調節要素が個々のγ遺伝子に密に連鎖されているか又
はＨＣ１及びＨＣ２トランスジーン内に含まれている
３′重鎖エンハンサーと結びつけられているかであると
いうことが立証される。ＨＣ１及びＨＣ２インサート
は、体細胞突然変異を受けている可能性の高い配列に対
するマーカーとして役立ちうるトランスジーン自律性ク
ラススイッチを受けていることから、我々は内因性遺伝
子座へのトランスロケーションに由来したものでない高
度に突然変異を受けた写しを容易に見い出すことができ
た。我々は、３つの独立したトランスジェニック系統
（２つのＨＣ１系統及び１つのＨＣ２系統）の中に体細
胞突然変異を受けたγ写しを見い出した。従って、トラ
ンスジーンの組込み部位にフランキングする配列がこの
プロセスに影響を及ぼすという可能性は低い：その代
り、トランスジーン配列は、体細胞突然変異を導くのに
充分なものである。
【０４７５】実施例３５ この実施例は、失活した内因性免疫グロブリン遺伝子座
について同型接合であり、ヒト配列重鎖及びヒト配列軽
鎖をコードするトランスジーン配列を含むマウスからの
ハイブリドーマの生成について記述する。ここで記述さ
れるハイブリドーマは、ヒト配列重鎖及びヒト配列軽鎖
を含むモノクローナル抗体を分泌し、Ｔ細胞上で発現さ
れる予め定められた抗原に結合する。この実施例は同様
に、ヒト由来の免疫原ヒトＣＤ４に応えてヒト配列抗体
を作るマウスの能力、及びヒト抗原と反応性あるヒト配
列モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作る
ための供給源としてのかかるマウスの適性をも立証す
る。 Ａ．ヒトＣＤ４抗原で免疫化されたＨＣ１トランスジェ
ニックマウスから誘導されたヒトＩｇモノクローナル抗
体の生成 機能的に分断されたＪH 遺伝子座について同型接合でし
かも、ヒト配列重鎖をコードするべく再配置可能なトラ
ンスジーン及びヒト配列軽鎖をコードするべく再配列可
能なトランスジーンを宿すトランスジェニックマウスを
免疫化した。マウスの遺伝子型はＨＣ１−２６+ ＫＣｌ
ｅ−１５３６+ ＪH Ｄ+/+ ＪK Ｄ- であり、これはマウ
ス重鎖失活に対する同型接合、及びＨＣ１ヒト配列重鎖
トランスジーン及びＫＣｌｅヒト配列軽鎖トランスジー
ン生殖細胞系統コピーの存在を表わしていた。
【０４７６】マウスを、安定した形でトランスフェクシ
ョンされたポリヌクレオチドによりコードされたマウス
−ヒトハイブリッドＣＤ４分子を発現するＥＬ４細胞系
統（ＡＴＣＣ）の変異体で免疫化した。発現されたＣＤ
４分子は、実質的にヒト様のＣＤ４配列を含む。１００
μｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を伴う１
００μｌのＰＢＳの中の約５×１０6 の細胞を、０日目
に腹腔内注入を介してマウス体内に導入した。７日目、
１４日目、２１日目、２８日目、６０日目及び７７日目
に接種をくり返し行ない、１８日目、３５日目及び６７
日目にテスト出血を行なった。８１日目に脾臓を除去
し、標準的な方法（ＰＥＧ融合）により約１．２×１０
7 の融合パートナー細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３細
胞系統：ＡＴＣＣ）に対して約７．２×１０7 の脾細胞
を融合させ、ＲＰＭＩ１６４０ １５％ＦＣＳ，４mMグ
ルタミン、１mMのピルビン酸ナトリウムにＨＡＴ及びＰ
ＳＮ培地を加えたものの中で培養させた。多数の融合を
実施した。
【０４７７】ハイブリドーマを成長させ、ＣＨＯ細胞内
で発現された精製組換え型可溶性ヒト配列ＣＤ４（Amer
ican Bio-Technologies, Inc.(ABT), Cambridge, MA ）
及び／又はNEN-DuPontから得られるＣＤ４といった市販
の供給源に対する結合力について、ＥＬＩＳＡを用いて
上清をテストした。ＡＢＴ試料は、ヒトＣＤ４のＶ1〜
Ｖ3 ドメインから成る精製された５５kDのヒトＣＤ４分
子を含んでいた。検定プレートに対して、組換え型ヒト
配列ＣＤ４（ＣＨＯ−Ｋ１細胞内で産生されたもの）を
吸着させ、ハイブリドーマ上清からの抗体を捕獲するの
に用い、次に捕獲した抗体を、ヒトμ、ヒトκ、ヒト
γ、マウスμ又はマウスκのいずれかを結合する抗体の
パネルに対する結合力について評価した。
【０４７８】１つのハイブリドーマを、１Ｆ２と呼ばれ
るその培養プレートウエルからサブクローニングした。
ＡＢＴ ＣＤ４調製物に対して結合された１Ｆ２抗体
は、ヒトμ及びヒトκについて陽性であり、ヒトγ、マ
ウスγ及びマウスκについて陰性であった。 Ｂ．ヒトＣＤ４及びヒトＩｇＥで免疫化されたＨＣ２ト
ランスジェニックマウスから誘導されたヒトＩｇモノク
ローナル抗体の生成 重鎖トランスジーンＨＣ２は図７８，７９に示され、上
で記述したきた（実施例３４参照）。
【０４７９】図６８に記されているヒト軽鎖トランスジ
ーンＫＣｏ４は、マウスゲノム内の単一部位での２つの
個別にクローニングされたＤＮＡフラグメントの同時組
込みにより生成される。フラグメントは４つの機能的Ｖ
K セグメント、５Ｊセグメント、ＣK エキソンそしてイ
ントロン及び下流の両方のエンハンサー要素を含んでい
る（実施例２１参照）(Meyer及びNeuberger (1989), EM
BO J. ８：1959-1964； Judde及びMax (1992), Mol.Cel
l Biol. 12：5206-5216 ）。２つのフラグメントは共
通の３kb配列を共有していることから（図６７参照）、
これらは、重複する配列の間の相同組換えの後、隣接す
る４３kbのトランスジーンとしてゲノミックＤＮＡの中
に潜在的に組込まれうる。
【０４８０】かかる組換え事象は、重複するＤＮＡフラ
グメントの微量注入の時点で頻繁に発生することが立証
されてきた（Pieper et al.(1992), Nucleic Acids Re
s.20：1259-1264 ）。同時注入されたＤＮＡは同様に接
合体内に同時組込みされる傾向をもち、個々にクローニ
ングされたフラグメント内に含まれた配列は、その後Ｂ
細胞の発達中ＤＮＡ再配置により連結されることにな
る。表１１は、トランスジェニック系統のうち少なくと
も２つからのトランスジーンインサートが機能的である
ことを示す。４つのトランスジーンコーディングを受け
たＶセグメントの各々及び５Ｊセグメントの各々を取込
んだＶＪ連結の例が、この３６クローンの組の中に表わ
されている。
【０４８１】
【表６】
【０４８２】上記の表はＫＣｏ４トランスジェニックマ
ウスにおけるヒト軽鎖Ｖ及びＪセグメントの使用を示
す。この表は、示されたヒトカッパー配列を含有する、
２つのトランスジェニック系に由来するｃＤＮＡから増
幅されたＰＣＲクローンの数を示す。ｗ個々のＫＣｏ４
トランスジェニックマウス（マウス＃８４９０、３ｍ
ｏ．、雄性ＫＣｏ４系４４３７；マウス＃８８６７、
２．５ｍｏ．、雌性、ＫＣｏ４系４４３６）から単離さ
れた脾臓ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した。Ｃｋ特異
的オリゴヌクレオチド５′TAG AAG GAA TTC AGC AGG CA
C ACA ACA GAG GCA GTT CCA ３′、並びに２つのＶｋ特
異的オリゴヌクレオチド５′AGC TTC TCG AGCTCC TGC T
GC TCT GTT TCC CAG GTG CC３′及び５′CAG CTT CTC G
AG CTC CTG CTA CTC TGG CTC (C,A)CA GAT ACC ３′の
１：３混合物を用いてＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅し
た。このＰＣＲ生成物をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩにより
消化し、そしてプラスミドベクター中にクローニングし
た。各動物からの無作為にとり上げた１８個のクローン
につき、ジデオキシチェンターミネージョン法により部
分ヌクレオチド配列を決定した。各クローンの配列を未
組換え（unrearranged）トランスジーンのジャームライ
ン配列と比較した。
【０４８３】２３の軽鎖ミニ遺伝子座陽性及び１８の重
鎖陽性マウスが、注射した胚から発達した。機能的マウ
ス重鎖及びκ軽鎖遺伝子座が無い状態でヒト重鎖及びκ
軽鎖を含むマウスを得るため、内因性マウス重鎖（系Ｊ
ＨＤ）及びκ軽鎖遺伝子座（系ＪＣＫＤ）の中にターゲ
ティングされた突然変異を含むマウスを用いて、これら
のマウス及びその後代を繁殖させた。これらのマウスは
λＢ細胞のみを含んでいる。
【０４８４】表７は、体細胞突然変異がトランスジェニ
ックマウスのトランスジーンコーディングを受けたヒト
重鎖写しの可変領域の中で発生することを示している。
ＨＣ２トランスジェニックマウスからの２３のｃＤＮＡ
クローンを部分的に配列決定して可変領域内の生殖細胞
系統コーディングされていないヌクレオチドの頻度を決
定した。データには各クローンからのＶセグメントコド
ン１７〜９４の配列のみが含まれており、Ｎ領域は含ま
れていない。ＲＮＡは、マウス５２５０の脾臓及びリン
パ節から分離した（ＨＣ２系統２５５０半接合、ＪＨＤ
同型接合）、記述されているとおり（参考）一本鎖ｃＤ
ＮＡを合成し、γ写しをＰＣＲで増幅した。増幅したｃ
ＤＮＡをプラスミドベクターにクローニングし、ジデオ
キシ読み終り方法により２３の無作為にとり上げたクロ
ーンを部分的に配列決定した。ＰＣＲ導入されたヌクレ
オチド変更の頻度は、恒常領域配列から＜０．２％とし
て見積られる。
【０４８５】
【表７】
【０４８６】フローサイトメトリー 我々は、ＦＡＣＳｃａｎフロー血球計算器及びＬＹＳＩ
ＳIIソフトウェア（Becton Dickinson, San Jose. CA）
を用いて染色した細胞を分析した。以下の試薬を用いて
脾細胞を染色した；ヨウ化プロビシウム（分子プロー
ブ、Eugene, OR）、フィコエリトリン接合されたα−ヒ
トＩｇκ（クローンＨＰ６０６２；Caltag, S.San Fran
cisco, CA ）、フィコエリトリン接合されたα−マウス
Ｉｇκ（クローンＸ３６；Becton Dickinson, San Jos
e. CA）、ＦＩＴＣ接合されたα−マウスＩｇλ（クロ
ーンＲ２６−４６；Pharmingen, San diego, CA ）、Ｆ
ＩＴＣ接合されたα−マウスＩｇμ（クローンＲ６−６
０．２；Pharmingen, San diego, CA ）、ＦＩＴＣ接合
されたα−ヒトＩｇμ（クローンＧ２０−１２７；Phar
mingen, San Diego, CA ）、及びＣｙ−クロム接合され
た抗−マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２；Phar
mingen, San Diego, CA ）。ヒトＩｇトランスジーンの発現 図８３は、ＪＨＤ及びＪＣＫＤの両方の突然変異につい
て同型接合であるＫＣｏ４及びＨＣ２マウスからの脾細
胞のフロー血球計算法による分析を示す。ヒト配列ＨＣ
２トランスジーンは、ＪＨＤ突然変異バックグラウンド
内でのＢ細胞の発達を救助し、脾臓内のＢ２２０+ 細胞
の相対的数を野生型動物の約半分まで回復させた。これ
らのＢ細胞はトランスジーンコーディングを受けた重鎖
を用いた細胞表面免疫グロブリンレセプタを発現した。
ヒトＫＣｏ４トランスジーンは同様に機能的であり、無
傷の内因性λ軽鎖遺伝子座をうまく競合した。重鎖及び
軽鎖ヒトトランスジーンを両方共含む（２重トランスジ
ェニック）ＪＨＤ／ＪＣＫＤ同型接合突然変異体マウス
の中のＢ脾細胞のほぼ９５％が、完全にヒト細胞表面Ｉ
ｇＭκを発現した。
【０４８７】血清Ｉｇレベルを以下のとおりＥＬＩＳＡ
によって決定した：ヒトμ：マウスＭａｂαヒトＩｇＭ
（クローンＣＨ６、結合部位、Birmingham, UK）でコー
ティングされペルオキシダーゼ接合されたウサギαヒト
ＩｇＭ（ｆｃ）（ｃａｔ＃３０９−０３５−０９５，Ja
ckson Immuno Research, West Grove, PA ）で発達させ
られたマイクロタイターウエル。ヒトγ：マウスＭＡｂ
αヒトＩｇＧ１（クローンＨＰ６０６９，Calbiochem,
La Jolla, CA）でコーティングされ、ペルオキシダーゼ
接合されたヤギαヒトＩｇＧ（ｆｃ）（ｃａｔ＃１０９
−０３６−０９８，Jackson Immuno Research, West Gr
ove, PA ）で発達させられたマイクロタイターウエル。
【０４８８】ヒトκ：マウスＭａｂαヒトＩｇκ（ｃａ
ｔ＃０１７３，AMAC, Inc, Ｉｇκ（ｃａｔ＃Ａ７１６
４，Sigma Chem. Co., St.Louis, MO ）でコーティング
されたマイクロタイターウエル。マウスγ：ヤギαマウ
スＩｇＧ（ｃａｔ＃１１５−００６−０７１，Jackson
Immuno Research, West Grove, PA ）でコーティングさ
れたマイクロタイターウエル。マウスλ：ラットＭＡｂ
αマウスＩｇλ（ｃａｔ＃０２１７１Ｄ，Pharmingen,
San Diego, CA ）でコーティングされ、ペルオキシダー
ゼ接合されたウサギαマウスＩｇＭ（ｆｃ）（ｃａｔ＃
３０９−０３５−０９５，Jackson Immuno Research, W
est Grove, PA ）で発達させられたマイクロタイターウ
エル。結合したペルオキシダーゼを、過酸化水素及び
２，２′−アジノ−ビス−１３−エチルベンズチアゾリ
ン−６−スルフォン酸、Sigma Chem. Co., St.Louis, M
O ）を用いたインキュベーションにより検出する。反応
産物を、４１５nmでの吸収により測定する。
【０４８９】２重トランスジェニックマウスは、血清中
で完全にヒトの抗体をも発現する。図８４は、いくつか
の異なるトランスジェニック創立者動物から誘導された
重及びカッパ軽鎖失活について同型接合である１８の個
々の２重トランスジェニックマウスに関する免疫グロブ
リンタンパク質の測定された血清レベルを示す。我々
は、検出可能なレベルのヒトμ，γ１及びκを発見し
た。我々は以上で、発現されたヒトγ１がトランスジー
ンμ及びγ１スイッチ領域の間のゲノミック組換えによ
る真正なクラススイッチの結果として得られるというこ
とを示した。その上、我々は、トランスジーン内部のク
ラススイッチが重鎖可変領域の体細胞突然変異により達
成されることを発見した。
【０４９０】ヒト免疫グロブリンに加えて、我々は血清
内のマウスγ及びλをも発見した。内因性遺伝子座が完
全に無傷であることからマウスλタンパク質の存在が予
想される。我々は他の箇所で、マウスγ発現が、内因性
重鎖遺伝子座内へのトランスジーンＶＤＪセグメントの
トランススイッチ組換えの結果であるということを示し
た。当初野生型重鎖対立遺伝子及び再配置されたＶＤＪ
トランスジーンについて立証されていたこのトランスス
イッチ現象（Durdik et al.(1989), Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 86：2346-2350 ； Gerstein et al.(1990), 細
胞63：537-548）は、下流重鎖恒常領域及びそのそれぞ
れのスイッチ要素がなおも無傷であることから、突然変
異体ＪＨＤバックグラウンド内で起こる。
【０４９１】２重トランスジェニックマウス内のヒトＩ
ｇＭκの血清濃度は約０．１mg／mlであり、動物間又は
系統間での偏差はほとんど無い。しかしながら、ヒトγ
１、マウスγ及びマウスλレベルは０．１〜１０マイク
ログラム／mlの範囲に及んでいる。個々の動物間で見ら
れたγレベルの変動は、γが誘発可能な恒常領域である
という事実の結果である可能性がある。発現はおそら
く、動物の健康、抗原に対する露呈そして場合によって
はＭＨＣタイプといった要因により左右されると思われ
る。マウスλ血清レベルは、個々のトランスジェニック
系統と相関すると思われる唯一のパラメータである。
【０４９２】１回の組込みあたりのトランスジーンのコ
ピー数が最も少ない（約１〜２コピー）ＫＣｏ４系統４
４３６マウスは、最高の内因性λレベルを有し、一方Ｋ
Ｃｏ４系統の４４３７マウス（組込み一回あたり〜１０
コピー）は最低のλレベルを有する。これは、κトラン
スジーンに続いて内因性λが再配置し、血清λレベルが
選択されずその代りに前駆体Ｂ細胞プールの相対的サイ
ズを反映しているような１つのモデルと一貫性をもつ。
多数の軽鎖インサートを含むトランスジーン遺伝子座
は、１つ以上のＶ〜Ｊへの組換え事象を受ける機会を有
する可能性があり、そのうちの１つが機能的なものとな
る確率は増大する。かくして、高いコピー系統は、より
小さい潜在的λ細胞プールを有することになる。ヒトＣＤ４及びＩｇＥでの免疫化 免疫応答に参加するトランスジェニックＢ細胞の能力を
テストするために、我々はヒトタンパク質抗原で２重ト
ランスジェニックマウスを免疫化し、ＥＬＩＳＡにより
抗原特異的免疫グロブリンの血清レベルを測定した。腹
腔内注入により完全フロイントアジュバント内のポリス
チレン溶球（ｃａｔ＃０８２２６，Polysciences Inc.,
Warrington, PA ）に共役結合された５０μｇの組換え
型ｓＣＤ４（ｃａｔ，＃０１３１０１，American Bio-T
echnologies Inc., Cambridge, MA ）でマウスを免疫化
した。マウスの各々は、内因性μ及びκ遺伝子座の分断
について同型接合であり、ヒト重鎖トランスジーンＨＣ
２系統２５００及びヒトκ軽鎖トランスジーンＫＣｏ４
系統４４３７について半接合である。
【０４９３】方法 血清試料を、組換え型ｓＣＤ４でコーティングされたマ
イクロタイターウエルへと希釈させた。ペルオキシダー
ゼ接合されたウサギαヒトＩｇＭ（ｆｃ）（Jackson Im
muno Research, West Grove, PA ）又はペルオキシダー
ゼ接合されたヤギの抗ヒトＩｇκ（Sigma, St.Louis, M
O ）を用いて、ヒト抗体を検出した。
【０４９４】図８５は、組換えヒト可溶性ＣＤ４で免疫
化されたトランスジェニックマウスの一次応答を示す。
免疫化された４匹の動物は全て、抗原特異的ヒトＩｇＭ
応答を１週間目に示す。ＣＤ４特異的血清抗体は、ヒト
μ重鎖及びヒトκ軽鎖の両方を含んでいる。ＨＣ２トラ
ンスジーンの二次応答に参加する能力を評価するため、
我々は、抗原を反復的に注入することによりトランスジ
ェニックマウスを高度免疫し、誘発された抗体の重鎖ア
イソタイプを監視した。ヒト重鎖トランスジーンＨＣ２
及びヒトκ軽鎖トランスジーンＫＣｏ４について同型接
合であるマウスを、０日目に完全フロイントアジュバン
ト内の２５μｇのヒトＩｇＥκ（The Binding Site,Bir
mingham, UK）で免疫化した。その後、約一週間おきで
不完全フロイントアジュバント中でＩｇＥκをマウスに
注入した。血清試料を１対１０の割合で希釈させ、ヒト
ＩｇＥ，λでコーティングされたプレート上で抗原特異
的ＥＬＩＳＡを行なった。
【０４９５】図８６は、これらの動物からの免疫応答の
標準的時間的経過を示している。我々は、完全フロイン
トアジュバント中のヒトＩｇＥを２重トランスジェニッ
クマウスに注入し、その後週一回、不完全フロイントア
ジュバント内のＩｇＥで追加免疫した。初期ヒト抗体応
答はＩｇＭκであり、その後抗原特異的ヒトＩｇＧκが
現われた。これらのマウス内の誘発された血清抗体は、
ヒトＩｇＭ又はＢＳＡに対していかなる反応反応性も示
さなかった。ヒトＩｇＧの経時的発達、（原文抜け）。
【０４９６】我々は、重鎖トランスジーンのインビトロ
でのクラススイッチを受ける能力もテストした；同じ重
鎖構成体（ＨＣ２、系統２５５０）について半接合であ
る脾臓Ｂ細胞が精製された形の動物は、ＬＰＳ及び組換
え型マウスＩＬ−４の存在下で、ヒトＩｇＭからヒトＩ
ｇＧ１へとスイッチする。しかしながら、インビトロス
イッチは、ＬＰＳ及び組換え型マウスＩＬ−２又はＬＰ
Ｓ独自の存在下で起こらなかった。
【０４９７】２重トランスジェニック／２重ノックアウ
ト（００１１）マウスの脾臓、リンパ節、腹膜及び骨髄
内にヒトＩｇＭ発現細胞が見られる。腹腔には正常な数
のＢ細胞が含まれているものの、骨髄及び脾臓中のトラ
ンスジェニックＢ細胞の絶対数は、正常値の約１０〜５
０％である。トランスジーン依存性のＢ細胞の発達にお
ける遅延の結果として、減少がもたらされる可能性があ
る。２重トランスジェニック／２重ノックアウト（００
１１）マウスは同様に、これらのマウスにおけるヒト
μ、γ１及びκのレベルが有意なものである状態で、血
清中で完全にヒトの抗体を発現する。発現されたヒトγ
１は、トランスジーンμとγ１のスイッチ領域の間での
ゲノミック組換えによる真正のクラススイッチの結果と
して得られる。
【０４９８】さらに、トランスジーン内のクラススイッ
チには、トランスジーンによりコードされた重鎖可変領
域の体細胞突然変異が伴う。ヒト免疫グロブリンに加え
て、これらのマウス内にはマウスμ及びマウスλが見ら
れる。マウスμ発現は、トランスジーンＶＤＪ遺伝子が
内因性マウス重鎖遺伝子座内に組込まれるトランススイ
ッチ組換えの結果であると思われる。もともと野生型重
鎖対立遺伝子及び再配置されたＶＤＪトランスジーンに
ついて文献内に見られたトランススイッチは、マウス下
流重鎖恒常領域及びそのそれぞれのスイッチ要素がなお
も無傷であることから、我々のＪH -/- バックグラウン
ド内で起こる。
【０４９９】トランスジェニックＢ細胞の免疫応答に参
加する能力を実証するため、我々は、ヒトタンパク質抗
原で００１１マウスを免疫化し、抗原特異的免疫グロブ
リンの血清レベルを監視した。初期ヒト抗体応答はＩｇ
Ｍであり、その後抗原特異的ヒトＩｇＧの発現が続く
（図８６及び図８８）。ヒトＩｇＧ抗体が現われる前の
遅延は、抗原に対する二次応答とクラススイッチの間の
結びつきと一貫性をもつ。
【０５００】ヒトＣＤ４で免疫化されたトランスジェニ
ックマウスにおいては、ＣＤ４抗原に対するヒトＩｇＧ
の反応性は、２×１０-2〜１．６×１０-4の範囲の血清
濃度で検出可能であった。抗ヒトＣＤ４ハイブリドーマの同定 ヒト重鎖トランスジーンＨＣ２及びヒトκ軽鎖トランス
ジーンＫＣｏ４について同型接合のトランスジェニック
マウスを、０日目に完全フロイントアジュバント内の組
換え体ヒトＣＤ４ ２０μｇで免疫化した。その後、約
一週間の間隔をおいて不完全フロイントアジュバント中
のＣＤ４をマウスに注入した。図８８は、トランスジェ
ニックマウスの血清中のヒトＣＤ４に対するヒト抗体応
答を示す。血清試料を１：５０で希釈し、ヒトＣＤ４で
コーティングされたプレート上で抗原特異性ＥＬＩＳＡ
を行なった。各々のラインは、個々の試料の測定値を表
わす。黒丸はＩｇＭを、白丸はＩｇＧを表わす。
【０５０１】ライン＃７４９４（００１２；ＨＣｌ−２
６＋；ＪＨＤ＋＋；ＪＫＤ＋＋；ＫＣ２−１６１０＋
＋）のマウスを０日目、１３日目、２０日目、２８日
目、３３日目及び４７日目にヒトＣＤ４で免疫化する
と、ヒトκ及びヒトμ又はγから成る抗ヒトＣＤ４抗体
を産生した。２８日目に、血清中にヒトμ及びヒトκが
見られた。４７日目までに、ヒトＣＤ４に対する血清応
答には、ヒトμ及びヒトγならびにヒトκが含まれてい
た。５０日目に、Ｐ３×６３−Ａｇ８．６５３マウス骨
髄腫細胞で脾細胞を融合させ、培養した。７００のウエ
ルのうち４４（６．３％）がヒトγ及び／又はκ抗ヒト
ＣＤ４モノクローナル抗体を含んでいた。これらのウエ
ルのうち３つは、ヒトγ抗ＣＤ４モノクローナル抗体を
含んでいることが確認されたが、ヒトκ鎖（おそらくは
マウスλを発現する）が欠如していた。９つの１次ウエ
ルは、完全にヒトのＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル
抗体を含んでおり、さらなる特徴づけのため選択され
た。完全にヒトのＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗
体を発現する１つのこのようなハイブリドーマを２Ｃ１
１−８と呼称した。
【０５０２】限界希釈法により一次ハイブリドーマをク
ローニングし、ＣＤ４に対して反応性あるヒトμ及びκ
モノクローナル抗体の分泌について評価した。９つのハ
イブリドーマのうち５つがＣＤ４ＥＬＩＳＡにおいて陽
性にとどまった。ヒトＣＤ４についてのこれらのヒトＩ
ｇＭκモノクローナル抗体の特異性は、オバルブミン、
ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、キーホール
リンペットヘマシアニン及びガン胎児性抗原を含むその
他の抗原との反応性が欠如していることによって実証さ
れた。
【０５０３】これらのモノクローナル抗体が細胞表面上
のＣＤ４（例えば未変性ＣＤ４）を認識できるか否かを
見極めるため、ＣＤ４＋Ｔ細胞系統、ＳｕｐＴ１との反
応性について、これら５つのクローンの上清もテストし
た。５つのヒトＩｇＭκモノクローナル抗体のうち４つ
がこれらのＣＤ４＋細胞と反応した。これらのＩｇＭκ
モノクローナル抗体の特異性をさらに確実にするため、
これらの抗体で、分離されたばかりのヒト末梢血リンパ
球（ＰＢＬ）を染色した。５つの一次ハイブリッドのう
ちの４つから誘導されたクローンからの上清はＣＤ４＋
リンパ球のみに結合し、ＣＤ８＋リンパ球には結合しな
かった（図８７）。
【０５０４】図８７は、ヒトＰＢＬとのＩｇＭκ抗ＣＤ
４モノクローナル抗体の反応性を示す。ヒトＰＢＬを各
クローンからの上清又はアイソタイプ整合された負の対
照モノクローナル抗体及びそれに続くＰＥに接合された
マウス抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体（上段）又はＦ
ＩＴＣに接合されたマウス抗ヒトＣＤ８Ａｂ（下段）の
いずれかを用いてインキュベートした。それぞれＦＩＴ
Ｃ又はＰＥに接合されたマウス抗ヒトμで、あらゆる結
合したヒトＩｇＭκを検出した。クローンの１つ、２Ｃ
１１−８（右側）及び対照ＩｇＭκ（左側）についての
代表的結果が示されている。予想通り、負の対照ＩｇＭ
κはＴ細胞と反応せず、ヤギ抗ヒトμは、おそらくはヒ
トＢ細胞である約１０％のＰＢＬと反応した。ＩｇＭκ
抗−ＣＤ４モノクローナル抗体の産生のレベルの高さ及
び優れた成長は、発達のためのクローナルハイブリドー
マ細胞を選択する上で重要な要因である。ハイブリドー
マの１つ２Ｃ１１−８からのデータは、最高５pg／細胞
／日が産生されうることを示している（図８９）。第２
のクローンの場合にも類似の結果が見られた。一般に観
察されるように、細胞が定常期成長に入るにつれて産生
は劇的に増大する。図８９は、細胞の成長及び小規模培
養におけるヒトＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体
の分泌を示す。総量２mlの中に１mlあたり２×１０5 細
胞の割合で重複培養を播種した。その後４日間２４時間
毎に、培養を収穫した。生存可能な細胞を計数すること
により細胞の成長を決定し、全ヒトμ（上の図版）につ
いてＥＬＩＳＡによりＩｇＭκ産生の量を計った。Ｉｇ
Ｍκの量を細胞の数で除することにより、一日細胞一個
あたりの産生を計算した（下の図版）。
【０５０５】図９０は、ヒトＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノク
ローナル抗体のエピトープ地図作製を示す。ＩｇＭκ抗
−ＣＤ４モノクローナル抗体２Ｃ１１−８（ＨＢ １１
６６８）により認識されるエピトープを位置設定するた
め競合結合フロー血球計算実験を使用した。これらの研
究のためには、ＣＤ４上の重複しないユニークエピトー
プに結合するマウス抗ＣＤ４モノクローナル抗体Ｌｅｕ
３ａ及びＲＰＡ−Ｔ４を用いた。減少する濃度のＲＰＡ
−ＴＡ又はＬｅｕ−３ａのいずれかで予備インキュベー
トされその後ひきつづき２Ｃ１１−８で染色させたＣＤ
４＋細胞のＰＥ螢光を、ＰＥ接合されたヤギ抗ヒトＩｇ
Ｍで検出した。Ｌｅｕ３ａによるヒトＩｇＭκ抗−ＣＤ
４モノクローナル抗体２Ｃ１１−８の結合については濃
度依存性競合が存在したが、ＲＰＡ−Ｔ４によるその結
合については存在しなかった。かくして、２Ｃ１１−８
により認識されたエピトープは、モノクローナル抗体Ｌ
ｅｕ３ａにより認識されたエピトープと類似していたか
又は同一であったが、ＲＰＡ−Ｔ４により認識されたも
のとは全く異なっていた。
【０５０６】要約すると、我々は、未変性ヒトＣＤ４と
特異的に反応しヒトＰＢＬＳをＣＤ４+ 及びＣＤ４- 副
次集団へと弁別するのに用いることのできるヒトＩｇＭ
κモノクローナル抗体を分泌する複数のハイブリドーマ
クローンを産生した。これらの抗体のうち少なくとも１
つはモノクローナル抗体Ｌｅｕ３ａにより構成されたエ
ピトープに又はその近くに結合する。このエピトープに
対して誘導されたモノクローナル抗体は、混合型の白血
球応答を阻害するものであることが示されてきた（Engl
eman et al., J.Eyp.Med. (1981) 153：193 ）。モノク
ローナル抗体Ｌｅｕ３ａのキメラバージョンは、菌状息
肉腫を患う患者においていくつかの臨床的効力を示した
（Knox et al.(1991) Blood 77：20）。
【０５０７】我々は同様に、ヒトＣＤ４免疫化に応答し
たマウスの一匹からハイブリドーマ細胞系統も分離し
た。クローニングされたハイブリドーマのうちの５つ
は、組換え型ヒトＣＤ４に結合しその他の糖タンパク質
抗原のパネルと交叉反応しない（ＥＬＩＳＡにより測定
される通り）ヒトＩｇＧκ（ヒトγ１／ヒトκ）抗体を
分泌する。ＩｇＧκハイブリドーマ、４Ｅ４．２及び２
Ｃ５．１の２つにより分泌されたモノクローナル抗体に
対する免疫化用ヒトＣＤ４抗原の結びつき及び解離の速
度を測定した。実験的に誘導された結合定数（Ｋａ）は
それぞれ抗体４Ｅ４．２及び２Ｃ５．１について約９×
１０7 Ｍ-1及び８×１０7 Ｍ-1であった。これらのＫａ
の値は、その他の者による臨床的試験において用いられ
てきた（Chenet al.(1993) Int.Immunol. ６：647 ）
マウスＩｇＧ抗ヒトＣＤ４抗体の範囲内に入る。
【０５０８】ここで、ヒト免疫グロブリンを発現するＢ
細胞が発達を受け、マウス免疫系の情況の下で抗原に応
答するという結論を下したい。抗原反応性は免疫グロブ
リン重鎖アイソタイプスイッチ及び可変領域体細胞突然
変異を導く。我々は又、これらのマウスからモノクロー
ナルヒト配列抗体を得るのに従来のハイブリドーマ技術
を用いることができるということも実証してきた。従っ
てこれらのトランスジェニック抗体は、ヒト標的抗原に
対するヒト抗体の供給源である。
【０５０９】本発明のトランスジェニックマウスを、下
記の表Ｂ及びＣから選択されたヒト抗原により免疫す
る。トランスジェニックマウスは前記ヒト抗原に結合す
るヒト抗体を生産する。免疫されたトランスジェニック
マウスからのＢ細胞を用いて、前記選択されたヒト抗原
に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
を作製する。
【０５１０】 表Ｂ ヒトＣＤ抗原 標示 認識される膜成分 CD1a gp49 CD1b gp45 CD1c gp43 CD2 CD58 (LFA-3)レセプタ、gp50 CD2R CD2 活性Ｔに限定されるエピトープ CD3 CD3 −複合体（５鎖）、gp／p 26, 20, 16 CD4 ClassII ／HIV レセプタ、gp59 CD5 gp67 CD6 gp100 CD7 gp40 CD8 クラス１レセプタ、gp32, αα又はαβダイマー CD9 p24 CD10 gp100, CALLA CD11a LFA-1, gp180／95 CD11b C3biレセプタ、 gp155／95 CD11c gp150 ／95 CDw12 p90-120 CD13 gp150 CD14 gp55 CD15 3-FAL, X−ハプテン CD16 FcRIII, gp50-65 CDw17 ラクトシルセラマイド CD18 CD11a, b, c に対するβ鎖 CD19 gp95 CD20 p37 ／32 CD21 C3d ／EBV-Rec. (CR2), p140 CD22 gp135, ミエリン関連gpに対する相同性 (MAG) CD23 FcεRII, gp45-50 CD24 gp41／38 CD25 IL-2R β鎖、gp55 CD26 gp120 CD27 p55(ダイマー) CD28 gp44 CD29 VLA β−抗原 β１−鎖、Plt GPIIa CD30 gp120, Ki-1 CD31 gp140, Plt, GPIIa CDw32 FcRII, GP40 CD33 gp67 CD34 gp105-120 CD35 CR1 CD36 gp90, Plt GPIV CD37 gp40-52 CD38 p45 CD39 gp70-100 CD40 gp50, NGF レセプタに対して相同 CD41 Plt GPIIb-IIIa 複合体及びGPIIb CD42a Plt GPIX, gp23 CD42b Plt GPIb, gp135 ／25 CD43 ロイコシアリン、gp95
【０５１１】表Ｃ CD44 Pgp-1, gp80-95 CD45 LCA, T200 CD45RA 制限処理されたT200, gp220 CD45RB 制限処理されたT200 CD45RO 制限処理されたT200, gp180 CD46 膜コファクター蛋白質(MCP) 、gp66／56 CD47 gp47-52, Ｎ−連結グリカン CD48 gp41, PI−連結 CDw49b VLA-α2 鎖、Plt GPIa CDw49d VLA-α4 鎖、gp150 CDw49f VLA-α6 鎖、Plt GPIc CDw50 gp148 ／108 CDw51 VNR-α鎖 CDw52 カンフ−１，gp21-28 CD53 gp32-40 CD54 ICAM-1 CD55 DAF (デシル保追因子) CD56 gp220 ／135, NKH1, N-CANのアイソ型 CD57 gp110, HNK1 CD58 LFA-3, gp40-65 CD59 gp18-20 CDw60 NeuAc-NeuAc-Gal- CD61 Integrin β3-, VNR-β鎖、Plt GPIIIa CD62 GMP-140 (PADGEM), gp140 CD63 gp53 CD64 FcRI, gp75 CDw65 セラミド−ドデカサッカライド 4C CD66 ホスホプロテイン gp180-200 CD67 P100, PI−連結 CD68 gp110 CD69 gp32／28, AIM CDw70 Ki-24 CD72 gp43／39 CD73 p69 CD74 gp41／35／33 CDw75 P53 CD76 gp85／67 CD77 グロボトリアアオシルセラミド (Gb3) CDw78
【０５１２】上記表Ｂは本発明のトランスジェニックマ
ウスを免疫し、そしてヒト抗原に対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを発生させるためのヒト
の分化のクラスター（cluster of differentiation）
（ＣＤ）の例のリストである。上記表Ｃは、本発明のト
ランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト抗原に対
するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを発
生させるためのヒトの非−ＣＤ抗原の例のリストであ
る。
【０５１３】本発明のトランスジェニックマウスを表Ｄ
から選択されたヒト−病原体又は抗原により免疫する。
トランスジェニックマウスは、ヒト病原体と結合する抗
体を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスか
らのＢ細胞を用いて、前記選択されたヒト病原体に対す
るモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製
する。
【０５１４】表Ｄ ＯＫＴ３ ＯＫＴ４ 腫瘍壊死因子 ＩｇＥ Ｈｅｒ−２ ＩＬ−２レセプタ（ｐ５５，ｐ７５） Ｌｙｍ−１ フィブリン α−フエトプロテイン Ｍｙ９ インシュリン インシュリンレセプタ 癌胎児性抗原（ＣＥＡ） グルコース転送蛋白質 β−インターフェロン γ−インターフェロン 組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＰＢＡ） α−インターフェロン 神経成長因子（ＮＧＦ） 内皮成長因子（ＥＧＦ） ＮＧＦレセプタ ＥＧＦレセプタ 血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ） ＰＧＤＦレセプタ インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１） ＩＧＦ−１レセプタ 毛様体向神経因子（ＣＮＦＦ） ＣＮＦＦレセプタ 脳由来向神経因子（ＢＤＮＦ） ＢＤＮＦレセプタ 神経分化因子（ＮＤＦ） ＮＤＦレセプタ ヘパリン結合向神経因子（ＨＢＮＦ） ＨＢＮＦレセプタ 形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α） ＴＧＦ−αレセプタ 形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β） ＴＧＦ−βレセプタ 骨成長因子−１（ＢＭＰ−１，ＯＭＰ−１） ＢＭＰ−１レセプタ 骨成長因子−２（ＢＭＰ−２，ＯＭＰ−２） ＢＭＰ−２レセプタ インターロイキン−１（ＩＬ−１） ＩＬ−１レセプタ インターロイキン−３（ＩＬ−３） ＩＬ−３レセプタ インターロイキン−４（ＩＬ−４） ＩＬ−４レセプタ インターロイキン−６（ＩＬ−６） ＩＬ−６レセプタ インターロイキン−８（ＩＬ−８） ＩＬ−８レセプタ インターロイキン−１２（ＩＬ−１２） ＩＬ−１２レセプタ インターロイキン−１３（ＩＬ−１３） ＩＬ−１３レセプタ 顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ
Ｆ） 顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ） 幹細胞因子（ＳＣＧＦ） ＩＬ−１β転換酵素 ＧＭ−ＣＳＦレセプタ Ｇ−ＣＳＦレセプタ スロンモモジュリン 補体因子 補体レセプタ プロテインＣ カドヘリン ギャップジャンクションプロテイン ＵＬＡ−４ ＩＣＡＭ−１ ＬＦＡ−３ ＥＬＡＭ Ｐ−セレクチン Ｅ−セレクチン 多剤耐性蛋白質（ＭＤＲ） 心房性ナトリウム利尿ペプチド Ｔ−細胞レセプタ（ＴＣＲ）ペプチド サブスタンスＰ アンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ） 共通急性リンパ球性白血病抗原（ＣＡＬＬＡ） Ｂ１６（黒色腫抗原） じゅう毛性刺激ホルモン（ＦＳＨ） 黄体形成ホルモン（ＬＨ）
【０５１５】上記表Ｄは、本発明のトランスジェニック
マウスを免疫し、そしてヒト病原体に対するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを発生せしめるため
の、ヒト病原体及びその抗原の例のリストである。
【０５１６】表Ｅ ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ウィルス抗原（ｇｐ１２０，
ｇｐ１６０等） ＨＩＶプロテアーゼ ＨＩＶ ＲＮアーゼＨ サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）及びＣＭＶウィルス抗
原（ｇＨ，ｇｐ等） ヒトＴ−細胞向リンパ性ウィルス−１（ＨＴＬＶ−２）
及びその表面抗原 ヒトＴ−細胞向リンパ性ウィルス−２（ＨＴＬＶ−２）
及び表面抗原 肝炎Ａウィルス及びウィルス抗原 肝炎Ｂウィルス及びウィルス抗原（例えば、HBsAg, HBc
Ag, HBeAg) 肝炎Ｃウィルス及びウィルス抗原 肝炎Ｄウィルス及びウィルス抗原 肝炎Ｘウィルス及びウィルス抗原 ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）及びウィルス抗原 バリセラ・ゾスター（Varicella zoster）ウィルス及び
ウィルス抗原 単純ヘルペスＩウィルス及びウィルス抗原 単純ヘルペスIIウィルス及びウィルス抗原 エボラ（又はアハブルグ）ウィルス及びウィルス抗原 日本脳炎Ｂウィルス（ＪＢＥ）及びウィルス抗原 カリホルニア脳炎ウィルス及びウィルス抗原 灰白髄炎ウィルス及びウィルス抗原 コクサッキーウィルス及びウィルス抗原 リノウィルス及びウィルス抗原 狂犬病（ラブドビリデー科）ウィルス及びウィルス抗原 インフルエンザ（オルトミキソウィルス科）ウィルス及
びウィルス抗原 パラミキソウィルス科（パラインフルエンザ１〜５、mu
mps)ウィルス及び抗原 麻疹ウィルス及びウィルス抗原 呼吸シンシチアルウィルス（ＲＳＶ）及びウィルス抗原 バリオラウィルス（天然痘）及びウィルス抗原 アデノウィルス（マスタデノウィルス）及びウィルス抗
原 エプスタイン−バール（単核症）ウィルス及びウィルス
抗原 プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falcipa
rum)及びウィルス抗原 コリネバクテリウム・ジフテリア及び表面抗原及び毒素 コリネバクテリウム・ヘモリティクム及び表面抗原及び
毒素 サルモネラ・スペーシス及び表面抗原及びＬＰＳ シゲラ・スペーシス及び表面抗原及びＬＰＳ プロテウス・ミラビリス・スペーシス及び表面抗原及び
ＬＰＳ シュードモナス・アエルギノーサ及び表面抗原 ビブリオ・コリラ及び表面抗原及び毒素 ビブリオ・パラヘモリティクス及び表面抗原及び毒素 ナイゼリア・メニンジティディス及び表面抗原 ナイゼリア・ゴノルホエア及び表面抗原 バシルス・アンスラシス及び表面抗原 クロストリジウム・ボツリヌム及び表面抗原及び毒素 クロストリジウム・テタニ及び表面抗原及び毒素 クロストリジウム・ペルフリンゲンス及び表面抗原及び
毒素 ヘモフィルス・インフルエンザ及び表面抗原 トレコネマ・パリドウム及び表面抗原 リステリア・モノシトゲネス及び表面抗原 ノカルジア・アステロイデス及び表面抗原 ニューモシスティス・カルニー及び表面抗原 パステウレラ・ロイコトキシン スタフィロコッカス・エンテロトキシン及びヒアルロニ
ダーゼ及びコアギュラーゼ ストレプトコッカス（β−溶血性）及びヘモリシン及び
ストレプトキナーゼ グラム陰性リポポリサッカライド複合体（ＬＰＳ）
【０５１７】上記の表Ｅは、本発明のトランスジェニッ
クマウスを免疫し、そしてヒト病原体に対するモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマを発生させるため
のヒト病原体及びそれらの抗原の例のリストである。本
発明を理解の明確化の目的で例示によって幾分詳細に記
載してきたが、請求の範囲内で幾つかの変更および改良
を行えることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、再配列されていないゲノムＤＮＡ中お
よび再配列された免疫グロブリン重鎖遺伝子から発現さ
れるｍＲＮＡ中の相補性決定領域ＣＤＲ１，ＣＤＲ２お
よびＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＦＲ１，ＦＲ
２，ＦＲ３およびＦＲ４を表す。
【図２】図２はヒトλ鎖遺伝子座を表す。
【図３】図３はヒトκ鎖遺伝子座を表す。
【図４】図４はヒト重鎖遺伝子座を表す。
【図５】図５は、ヒトγ３およびγ１定常領域を含有す
る２５kb断片に次いでラット鎖３′エンハンサー配列を
含む７００bp断片に連結された再配列されたＩｇＭ遺伝
子を含有するトランスジェン構成物を表す。
【図６】図６は、生体内相同組換えによって軽鎖トラン
スジェンを形成させるために使うことができる断片を表
す、ヒトκ鎖遺伝子座の制限地図である。
【図７】図７はｐＧＰ１の作製を示す。
【図８】図８はｐＧＰ１中に含まれるポリリンカーの構
成を示す。
【図９】図９は、本発明のヒト重鎖トランスジェンを作
製するのに使う断片を示す。
【図１０】図１０はｐＨＩＧ１およびｐＣＯＮ１の作製
を示す。
【図１１】図１１は、ｐＲＥＧ２を形成させるためにｐ
ＲＥ３（ラットエンハンサー３′）中に挿入されるヒト
Ｃγ１断片を示す。
【図１２】図１２は ｐＨＩＧ３′およびｐＣＯＮの作
製を示す。
【図１３】図１３は、本発明のトランスジェンの作製に
使われるヒトＤ領域セグメントを含む断片を示す。
【図１４】図１４は、ｐＨＩＧ２（Ｄセグメント含有プ
ラスミド）の作製を示す。
【図１５】図１５は、本発明のトランスジェンの作製に
使われるヒトＪκおよびヒトＣκ遺伝子セグメントを包
含する断片を示す。
【図１６】図１６はｐＥμの構造を示す。
【図１７】図１７はｐＫａｐＨの作製を示す。
【図１８】図１８は、マウスの内因性免疫グロブリン重
鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガ
ティブ選別ベクターの作製を示す。
【図１９】図１９は、マウスの内因性免疫グロブリン重
鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガ
ティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２０】図２０は、マウスの内因性免疫グロブリン重
鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガ
ティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２１】図２１は、マウスの内因性免疫グロブリン重
鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガ
ティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２２】図２２は、マウスの内因性免疫グロブリン重
鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガ
ティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２３】図２３は、マウスの内因性免疫グロブリン軽
鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガ
ティブ選別ベクターの作製を示す。
【図２４】図２４は、マウスの内因性免疫グロブリン重
鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガ
ティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２５】図２５はκ鎖標的用ベクターの構造を示す。
【図２６】図２６はマウス重鎖標的用ベクターの構造を
示す。
【図２７】図２７はマウス重鎖標的用ベクターの構造を
示す。
【図２８】図２８はベクターｐＧＰｅの地図を示す。
【図２９】図２９はベクターｐＪＭ２の構造を示す。
【図３０】図３０はベクターｐＣＯＲ１の構造を示す。
【図３１】図３１はｐＩＧＭ１，ｐＨＣ１およびｐＨＣ
２のトランスジェン構成物を示す。
【図３２】図３２はｐγｅ２の構造を示す。
【図３３】図３３はｐＶＧＥ１の構造を示す。
【図３４】図３４はｐＨＣ１トランスジェニックマウス
中でのヒトＩｇ発現のアッセイ結果を示す。
【図３５】図３５はｐＪＣＫ１の構造を示す。
【図３６】図３６は合成重鎖可変領域の作製を示す。
【図３７】図３７は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＣ
Ｍ1 ，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２の略図である。
【図３８】図３８は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＧＧ１
並びにκ軽鎖小遺伝子座構成物ｐＫＣ１，ｐＫＶｅ１お
よびｐＫＣ２の略図である。
【図３９】図３９は、機能的に再配列された軽鎖遺伝子
を再構成するための方策を表す。
【図４０】図４０は血清ＥＬＩＳＡ結果を表す。
【図４１】図４１は、８匹のトランスジェニックマウス
からの血清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を表す。
【図４２】図４２はプラスミドｐＢＣＥ１の略図であ
る。
【図４３】図４３は、ＫＬＨ−ＤＮＰ（３７Ａ），ＫＬ
Ｈ（３７Ｂ）およびＢＳＡ−ＤＮＰ（３７Ｃ）に特異的
なＩｇＧおよびＩｇＭレベルを測定することによる、Ｋ
ＬＨ−ＤＮＰに対する本発明のトランスジェニックマウ
スの免疫応答を表す。
【図４４】図４４は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結
合しそしてヒトμ鎖を含んで成る抗体の存在を証明する
ＥＬＩＳＡデータを示す；各パネルは、免疫処置後の指
示日においてマウスから得られたプールした血清試料か
らの逆数系列希釈を示す。
【図４５】図４５は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結
合しそしてヒトγ鎖を含んで成る抗体の存在を証明する
ＥＬＩＳＡデータを示す；各パネルは、免疫処置後の指
示日においてマウスから得られたプールした血清試料か
らの逆数系列希釈を示す。
【図４６】図４６は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によ
って免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスの
リンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３
個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、
生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示
す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド
変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（も
しあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に
相当する領域が示されている。生殖細胞によってコード
されないヌクレオチドは小文字で示されている。推定ア
ミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオ
チド配列の下に与えられている。
【図４７】図４７は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によ
って免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスの
リンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３
個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、
生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示
す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド
変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（も
しあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に
相当する領域が示されている。生殖細胞によってコード
されないヌクレオチドは小文字で示されている。推定ア
ミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオ
チド配列の下に与えられている。
【図４８】図４８は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によ
って免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスの
リンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３
個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、
生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示
す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド
変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（も
しあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に
相当する領域が示されている。生殖細胞によってコード
されないヌクレオチドは小文字で示されている。推定ア
ミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオ
チド配列の下に与えられている。
【図４９】図４９は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によ
って免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスの
リンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３
個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、
生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示
す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド
変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（も
しあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に
相当する領域が示されている。生殖細胞によってコード
されないヌクレオチドは小文字で示されている。推定ア
ミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオ
チド配列の下に与えられている。
【図５０】図５０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によ
って免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスの
リンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３
個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、
生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示
す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド
変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（も
しあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に
相当する領域が示されている。生殖細胞によってコード
されないヌクレオチドは小文字で示されている。推定ア
ミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオ
チド配列の下に与えられている。
【図５１】図５１は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によ
って免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスの
リンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３
個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、
生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示
す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド
変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（も
しあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に
相当する領域が示されている。生殖細胞によってコード
されないヌクレオチドは小文字で示されている。推定ア
ミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオ
チド配列の下に与えられている。
【図５２】図５２は、ヒストグラム形式での図４０のデ
ータを示す；推定アミノ酸残基位置が縦座標として示さ
れ（左がアミノ末端方向であり、右がカルボキシ末端方
向である）そして配列変異の頻度が横座標として示され
る。
【図５３】図５３は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有する
ｖｋ６５．５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチ
ド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示さ
れる；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプ
タマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５４】図５４は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有する
ｖｋ６５．８と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチ
ド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示さ
れる；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプ
タマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５５】図５５は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有する
ｖｋ６５．１５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオ
チド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示
される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘ
プタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５６】図５６は、同時に注入された２つの重複断片
の間での相同組換えによる軽鎖小遺伝子座の形成を示
す。
【図５７】抗原結合の特異性を示すＣＥＡ及び非ＣＥＡ
抗原と反応性あるモノクローナル抗体についてのＥＬＩ
ＳＡの結果を示す。
【図５８】ヒトＶＤＪ及びマウス恒常領域配列を有する
写しを増幅するべくＰＣＲにより増幅された１０個のＣ
ＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。
【図５９】ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン及びヒ
トκミニ遺伝子座トランスジーンの両方を支持するマウ
スから得た血清のさまざまな希釈度に対するＥＬＩＳＡ
の結果を示している；マウスはヒトＣＤ４で免疫化され
たものであり、示されているデータは、ヒトＣＤ４と反
応性をもちそれぞれヒトκ、ヒトμ、又はヒトγエピト
ープを有する抗体を表わしている。
【図６０】３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳによ
り決定される、ヒトμ又はマウスμについてのリンパ球
染色の相対的分布を示す。
【図６１】３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳによ
り決定される、ヒトκ又はマウスκについてのリンパ球
染色の相対的分布を示す。
【図６２】３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳによ
り決定される、マウスλについてのリンパ球染色の相対
的分布を示している。
【図６３】４つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳによ
り決定される、マウスλ又はヒトκについてのリンパ球
染色の相対的分布を示す。
【図６４】免疫化されていない血清中のヒトμ、ヒト
γ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、及びマウ
スλ鎖の量を示す。
【図６５】さまざまな遺伝子型の免疫化されていない０
０１１マウスの血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウ
スμ、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す
散乱プロットを示している。
【図６６】００１１マウスにおける抗ヒトＣＤ４タイタ
ーを示す。
【図６７】ヒトＣＤ４での００１１マウスの免疫化に続
く免疫化後３週間目又は７週間目に採取した血清中の抗
−ＣＤ４抗体内のヒトμ、ヒトγ、又はヒトκ鎖を含む
抗体力価を示す。
【図６８】ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンＰＨＣ
１及びＰＨＣ２、及び軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーン
ｐＫＣ１，ｐＫＣｌｅ及び指示された部位でＰＫＣ２と
Ｃｏ４の間の相同組換えにより作り出された軽鎖ミニ遺
伝子座トランスジーンの概略図である。
【図６９】Storb et al. (1989) 前掲書中、からとられ
た、ネズミラムダ軽鎖遺伝子座の連鎖地図を示す。点刻
囲みは偽遺伝子を表わす。相同遺伝子ターゲティングに
よるマウスλ遺伝子座の失活を概略的に表わしている。
【図７０】重鎖恒常領域遺伝子といった遺伝子を欠失さ
せるための相同組換えターゲッティングトランスジーン
の構造を概略的に示す。
【図７１】「免疫グロブリン遺伝子」、 Honjo, T, Al
t, FW, 及びRabbits TH (eds) Academic Press, NY (19
89) p129 から取られたＢＡＬＢ／ｃマウス重鎖遺伝子
座の地図を示す。構造遺伝子は上部ラインに閉じた囲み
で示されている。第２及び第３のラインは表示された記
号を伴って制限部位を示している。
【図７２】マウス重鎖遺伝子座α恒常領域遺伝子のヌク
レオチド配列を示す。
【図７３】マウス重鎖遺伝子座Ｊ4 遺伝子内に２つのbp
フレームシフトを導入するためのフレームシフトベクタ
ー（プラスミドＢ）の構成を示す。
【図７４】高度免疫中のトランスジェニック動物のアイ
ソタイプ特異応答を示す。反応性のヒトμ及びγ１の相
対的レベルは、比色ＥＬＩＳＡ検定法（ｙ−軸）によっ
て示されている。我々は、フロイントアジュバント中の
ＣＥＡの腹腔内注入により、同型接合のＪＨＤバックグ
ラウンド内で３匹の生後７〜１０週目の雄のＨＣ１系統
５７のトランスジェニック動物（＃１９９１，＃２３５
６，＃２３５７）を免疫化した。図は、ＣＥＡでコーテ
ィングされたマイクロタイターウエルに対するプールし
た血清（各注入に先立って収集したもの）の２５０倍希
釈液の結合を描いている。
【図７５】クラススイッチ組換えにより媒介されたトラ
ンスジーンでコードされたγ１アイソタイプの発現を示
す。２つの異なるヒトγ１発現ハイブリドーマ内の組込
まれたトランスジーンのゲノミック構造は、μ及びγ１
スイッチ領域の間の組換えと一貫性をもつ。図７５は、
３つのトランスジーン発現ハイブリドーマから分離した
ＰａｃＩ／ＳｆｉＩ消化されたＤＮＡのサザンブロット
を示す。左から右へ：クローン９２−０９Ａ−５Ｈ１−
５、ヒトγ１+ ／μ- ；クローン９２−９０Ａ−４Ｇ２
−２、ヒトγ１+ ／μ- ；クローン９２−０９Ａ−４Ｆ
７−Ａ５−２、ヒトγ１- ，μ+ 。３つのハイブリドー
マは全て、ＨＣｌ−５７の組込みについて半接合でＪＨ
Ｄ分断について同型接合の生後７カ月のマウス（マウス
＃１９９１）から誘導される。ブロットは、ヒトγ１ス
イッチ領域の３′半部分にまたがる２．３kbのＢｇｌII
／ＳｆｉＩ ＤＮＡフラグメントから誘導されたプロー
ブでハイブリッド形成される。μ発現ハイブリドーマの
中にはいかなるスイッチ産物も見い出せないが、２つの
γ１発現ハイブリドーマ９２−０９Ａ−５Ｈ１−５及び
９２−０９Ａ−４Ｇ２−２は、それぞれ、５．１kb及び
５．３kbのＰａｃＩ／ＳｆｉＩフラグメントを結果とし
てもたらすスイッチ産物を含む。
【図７６】図７６は、μからγ１へのクラススイッチを
産生させることのできる考えられる２つの欠失メカニズ
ムの図である。ヒトμ遺伝子には、μを欠失するべく組
換えできる４００bpの直接的反復（σμ及びΣμ）がフ
ランキングしている。このメカニズムによるクラススイ
ッチングはつねに６．４kbのＰａｃＩ／ＳｆｉＩフラグ
メントを生成するが、一方μ及びγ１スイッチ領域の間
の組換えによるクラススイッチは、個々のスイッチ事象
の間でサイズの変動を示しながら、４kbと７kbの間のＰ
ａｃＩ／ＳｆｉＩフラグメントを生成する。図７５で検
討されている２つのγ１発現ハイブリドーマは、μ及び
γ１スイッチ領域の間で組換えを受けていると思われ
る。
【図７７】トランススイッチにより生成されたキメラヒ
ト／マウス免疫グロブリン重鎖を示す。トランススイッ
チ産物のｃＤＮＡクローンは、高度免疫されたＨＣ１ト
ランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７；動物及
び免疫計画の説明については図７４に対する凡例を参照
のこと）から分離した脾臓とリンパ節のＲＮＡの混合物
の逆転写及びＰＣＲ増幅により生成された。１０個の無
作為にとり出したクローンの部分的ヌクレオチド配列が
示されている。小文字は、コードされた生殖細胞系を表
わし、大文字は、既知の生殖細胞系配列に割当てること
のできないヌクレオチドを示す。これらは体細胞突然変
異、Ｎヌクレオチド又は切形Ｄセグメントであることが
考えられる。両面タイプはマウスγ配列を表わす。
【図７８】再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高
度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けること
を示している。
【図７９】図７８では抗原に対する一次反応を図７９で
は二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ
重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配
列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からの
ヌクレオチド変更は、各クローンについて表わされてい
る。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、
大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示
している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめ
られている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示
されている。ＣＤＲ３配列内の小文字はＨＣｌトランス
ジーン内に含まれている既知のＤセグメントに対する同
一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の
最後に表わされている。割当てされていない配列は、Ｎ
領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又
は、場合によって、これらは単にあまりにも短かすぎて
既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを
区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無
作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。
生後４週間の雌のＨＣｌ系統２６−ＪＨＤマウス（＃２
５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一
回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。
Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は０．０
６％（２／３，１９８bp）である。図７９の二次応答：
１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡク
ローン。生後２カ月の雌ＨＣｌ系統２６−ＪＨＤマウス
（＃３２０４）に対して１カ月にわたり３回ＨＥＬ及び
フロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全ア
ジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完
全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮ
Ａを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全
体的頻度は１．６％（５２／３，１９８bp）。
【図８０】広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限され
ていることを示している：体細胞突然変異及びクラスス
イッチはＢ細胞の同じ集団内で発生する。ＣＥＡに対し
高度免疫された（免疫化計画については図６８参照）Ｈ
Ｃｌ系統５７のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃
２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶＨ２
５１ ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。図
８０：ＩｇＭ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−
μｃＤＮＡクローン。ＣＤＲｓ１及び２の周囲残基を含
む１５６bpのセグメントのヌクレオチド配列。体細胞突
然変異の全体的レベルは０．１％（５／３，７４４bp）
である。
【図８１】図８１：ＩｇＧ：２３の無作為にとり上げた
ＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。ＣＤＲｓ１〜３及
び周囲残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセ
グメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は１．１％
（６５／５，６５８bp）である。図８０中のμ配列との
比較のため；最初の１５６個のヌクレオチドに対する突
然変異頻度は１．１％（４１／３，５８８bpである）。
記号の説明については、図８０及び８１の凡例を参照の
こと。
【図８２】ＶＨ５１Ｐ１及びＶＨ５６Ｐ１が、免疫化を
受けていないマウス内の広範な体細胞突然変異を示す。
生後９週目の免疫化を受けていない雌のＨＣ２系統２５
５０のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃５２５
０）からのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分
的ヌクレオチド配列。１９ＶＨ５６ｐ１セグメントでの
体細胞突然変異の全体的頻度は、２．２％（１０１／
４，６７４bp）である。単一のＶＨ５１ｐ１セグメント
内の体細胞突然変異の全体的頻度は２．０％（５／２４
６bp）である。記号の説明については図７８及び７９に
対する凡例を参照のこと。
【図８３】分析された内因性Ｉｇ遺伝子座をもつ２重ト
ランスジェニックマウスは、ヒトＩｇＭκ陽性Ｂ細胞を
含んでいる。異なる遺伝子型をもつ４匹のマウスの脾臓
から分離された細胞のＦＡＣＳ。左欄：対照マウス（＃
９９４４、生後６週目の雌、ＪＨ＋／−，ＪＣκ＋／
−；異型接合野生型マウス重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座、
非トランスジェニック）。第２欄：ヒト重鎖トランスジ
ェニック（＃９８７７、生後６週目の雌ＪＨ−／−，Ｊ
Ｃκ−／−，ＨＣ２系統２５５０±；分断されたマウス
の重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ
２トランスジーンについて半接合）。第３欄：ヒトκ−
軽鎖トランスジェニック（＃９８７８、生後６週目の雌
ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＫＣｏ４系統４４３７＋；
分断されたマウスの重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座について
同型接合で、ＫＣｏ４トランスジーンについて半接
合）。右欄：２重トランスジェニック（＃９８７９、生
後６週目の雌、ＪＨ−／−ｍ ＪＣκ−／−，ＨＣ２系
統２５５０＋，ＫＣｏ４系統４４３７＋；分断されたマ
ウスの重鎖及びκｋ−軽鎖遺伝子座について同型接合
で、ＨＣ２及びＫＣｏ４トランスジーンについて半接
合）。上段：マウスλ軽鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ
軸）の発現について染色された脾細胞。第２段：ヒトμ
重鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染
色された脾細胞、第３段：マウスのμ重鎖（ｘ軸）及び
マウスのκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細
胞。下段：マウスＢ２２０抗原の発現について染色され
た脾細胞のヒストグラム（対数螢光：ｘ軸：細胞数：ｙ
軸）。２つの色図版の各々について、表示された象眼の
各々の中の細胞の相対数は、ヨウ化プロピジウム染色及
び光散乱に基づくｅ−パラメータゲートの百分率として
与えられている。下段に表示されている試料の各々にお
けるＢ２２０＋細胞の分画は、リンパ球光散乱ゲートの
百分率として与えられている。
【図８４】２重トランスジェニックマウスの血清中の分
泌された免疫グロブリンレベル。内因性重鎖及びκ−軽
鎖遺伝子座分断について同型接合の１８の個々のＨＣ２
／ＫＣｏ４ ２重トランスジェニックマウスからのマウ
スγ及びλ及びヒトμ，γ及びκ。マウス：（＋）ＨＣ
２系統２５５０（組込み１回につき最高５つのＨＣ２コ
ピー）、ＫＣｏ４系統４４３６（組込み１回につき１〜
２つのＫＣｏ４コピー）；（○）ＨＣ２系統２５５０，
ＫＣｏ４系統４４３７（組込み一回につき最高１０個の
ＫＣｏ４コピー）；（×）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ
４系統４５８３（組込み一回につき最高５つのＫＣｏ４
コピー）；（□）ＨＣ２系統２５７２（組込み１回につ
き３０〜５０のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統４４３７；
（△）ＨＣ２系統５４６７（組込み１回につき２０〜３
０個のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統４４３７。
【図８５】ヒト抗原に対するヒト抗体応答を示す。図８
５：組換え型ヒト可溶性ＣＤ４に対する一次応答。ヒト
ＩｇＭ及びヒトκ軽鎖のレベルが、４つの２重トランス
ジェニックマウスからの出血前（○）及び免疫化後
（●）の血清について報告されている。
【図８６】図８６：インビボでヒトＩｇＧに対するスイ
ッチが起こる。非特異的交叉反応性を阻害するべく１．
５μ／mlの余分なＩｇＥ，κ及び１％の正常なマウス血
清の存在下で使用されたペルオキシダーゼ接合されたポ
リクローナル抗ヒトＩｇＧを用いて、ヒトＩｇＧ（円）
を検出した。ヒトκ軽鎖（正方形）は、１％の正常なマ
ウスの血清の存在下でペルオキシダーゼ接合されたポリ
クローナル抗ヒトκ試薬を用いて、検出した。１匹のマ
ウス（＃９３４４；ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統
４４３６）からの代表的結果が示されている。各々の点
は、重複ウエルの平均からバックグラウンド吸収を引い
たものを表わしている。
【図８７】ヒトＣＤ８＋リンパ球からヒトＣＤ４＋リン
パ球を弁別するハイブリドーマ上清を用いたヒトＰＢＬ
のＦＡＣＳ分析を示す。
【図８８】トランスジェニックマウスの血清内のヒトα
−ＣＤ４ＩｇＭ ａｎｆ ＩｇＧを示す。
【図８９】トランスジェニックマウスのα−ヒトＣＤ４
ハイブリドーマモノクローナル、２Ｃ１１−８をＲＰＡ
−ＴＡ及びＬｅｕ−３Ａモノクローナルと比較する競合
結合実験を示す。
【図９０】培養された２Ｃ１１−８ハイブリドーマのＩ
ｇ発現についての産生データを示す。本発明のトランス
ジェニックマウスを、下記の表Ｂ及びＣから選択された
ヒト抗原により免疫する。トランスジェニックマウスは
前記ヒト抗原に結合するヒト抗体を生産する。免疫され
たトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて、前
記選択されたヒト抗原に対するモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマを作製する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 機能的に分断された内因性重鎖対立遺伝
    子の同型接合対、機能的に分断された内因性軽鎖対立遺
    伝子の同型接合対、非相同免疫グロブリン重鎖トランス
    ジーンの少なくとも１つのコピー、及び異種性免疫グロ
    ブリン重鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピーを
    含み、抗原での免疫化に続いて抗体応答を行なう、トラ
    ンスジェニックマウス。
  2. 【請求項２】 前記機能的に分断された内因性重鎖対立
    遺伝子がＪH 領域相同組換えノックアウトであり、前記
    機能的に分断された内因性軽鎖対立遺伝子がＪk 領域相
    同組換えノックアウトであり、前記異種性免疫グロブリ
    ン重鎖トランスジーンがHC１又はHC２ヒトミニジーント
    ランスジーンであり、前記異種性軽鎖トランスジーンが
    KC２又はKCleヒトκトランスジーンであり、前記抗原が
    ヒト抗原である、請求項１に記載のトランスジェニック
    マウス。
  3. 【請求項３】 抗体応答には、ヒトμ鎖含有免疫グロブ
    リン及びヒトγ鎖含有免疫グロブリンを含む抗体の集団
    が含まれている、請求項１に記載のトランスジェニック
    マウス。
  4. 【請求項４】 抗体応答には、抗体の集団が含まれ、こ
    の集団が、 −ヒト配列可変領域とヒト配列恒常領域で基本的に構成
    されている重鎖及び軽鎖を含む抗体；及び −ヒト配列可変領域とマウス配列恒常領域で基本てき構
    成されている重鎖を含む抗体、を含んでいる、請求項１
    に記載のトランスジェニックマウス。
  5. 【請求項５】 マウス配列恒常領域がマウスγ恒常領域
    である、請求項４に記載のトランスジェニックマウス。
  6. 【請求項６】 約８×107 Ｍ-1の解離定数でヒトCD４に
    特異的に結合する非相同免疫グロブリンの集団が非相同
    抗体に含まれている、請求項１に記載のトランスジェニ
    ックマウス。
  7. 【請求項７】 HC1-26+;JHD++;JKD++;KC2-1610++;HCl-2
    6+;JHD++;JKD++;KC2-1610+;HCl-26+;JHD++;JKD++;KCle-
    1527+; 及びHCl-26+;JHD++;JKD++;KCle-1399+.から成る
    グループの中から選択された遺伝子型を有する、請求項
    ２に記載のトランスジェニックマウス。
  8. 【請求項８】 HCl-26+;JHD++;JKD++;KCle-1527+及びHC
    l-26+;JHD++;JKD++;KCle-1399+から成るグループの中か
    ら選ばれた遺伝子型を有し、抗体応答には、ヒトμ鎖含
    有免疫グロブリン、ヒトγ鎖含有免疫グロブリン及び、
    各々基本的にヒト可変領域及びマウス恒常領域から成る
    重鎖を含むキメラ免疫グロブリンを含む抗体の集団が含
    まれている、請求項２に記載のトランスジェニックマウ
    ス。
  9. 【請求項９】 （１）機能的スイッチ組換え配列を含み
    トランススイッチを行なうことのできる少なくとも１つ
    のマウス恒常領域遺伝子を含む同型接合の機能的に分断
    された内因性重鎖遺伝子座及び、（２）機能的ヒト重鎖
    可変領域をコードするべく再配置可能でしかもトランス
    スイッチを受けることのできる機能的スイッチ組換え配
    列を含むヒト重鎖トランスジーン、を含むゲノムを含む
    トランスジェニックマウス。
  10. 【請求項１０】 機能的ヒト軽鎖可変領域をコードする
    べく再配置でき、ヒト配列軽鎖を発現するヒト軽鎖トラ
    ンスジーンをさらに含む、請求項９に記載のトランスジ
    ェニックマウス。
  11. 【請求項１１】 同型接合の機能的に分断された内因性
    軽鎖遺伝子座をさらに含む、請求項９に記載のトランス
    ジェニックマウス。
  12. 【請求項１２】 ヒトトランスジーンによりコードされ
    るヒト配列可変領域及び内因性マウス重鎖恒常領域遺伝
    子によりコードされるマウス恒常領域配列から成るキメ
    ラ重鎖及び軽鎖を含む抗体を含む血清をさらに含む、請
    求項11に記載のトランスジェニックマウス。
  13. 【請求項１３】 基本的にヒト可変領域及びヒト恒常領
    域から成るヒト重鎖及び軽鎖を含む抗体が血清にさらに
    含まれている、請求項12に記載のトランスジェニックマ
    ウス。
  14. 【請求項１４】 ヒトトランスジーンと内因性マウス重
    鎖恒常領域遺伝子の間のトランススイッチにより生成さ
    れた配列によってコードされたキメラ重鎖を検出可能な
    量有する血清を含むトランスジェニックマウス。
  15. 【請求項１５】 第１の時点でヒト配列重鎖を産生し、
    第２の時点でヒト可変領域及びマウス恒常領域から成る
    キメラ重鎖を産生するべくトランススイッチするＢ細胞
    を含むトランスジェニックマウス。
  16. 【請求項１６】 ヒト配列重鎖可変領域及びマウス配列
    重鎖恒常領域及びマウス配列重鎖恒常領域を含むキメラ
    重鎖を含むキメラ抗体を産生し、かつさらに、ヒト配列
    重鎖可変領域及びヒト配列重鎖恒常領域を含むヒト重鎖
    を含む抗体を産生するＢ細胞を含むトランスジェニック
    マウス。
  17. 【請求項１７】 前記キメラ抗体がヒト配列軽鎖を含
    む、請求項16に記載のトランスジェニックマウス。
  18. 【請求項１８】 キメラ抗体が、少なくとも約１×107
    Ｍ-1の親和力で予め定められた抗原（例えば免疫原）に
    結合する、請求項17に記載のトランスジェニックマウ
    ス。
  19. 【請求項１９】 予め定められた抗原がヒトCD４又はヒ
    トCEA である、請求項18に記載のトランスジェニックマ
    ウス。
  20. 【請求項２０】 ２つのヒトＶH 遺伝子セグメント、８
    つのヒトＤ遺伝子セグメント、６つのヒトＪH 遺伝子セ
    グメント、１つのヒトＪ−μエンハンサー、１つのヒト
    μスイッチ領域、１つの完全ヒトμＣH 遺伝子、１つの
    ヒト不稔写しプロモーター、１つのヒトγスイッチ領
    域、１つの完全ヒトγＣH 遺伝子及び重鎖３′エンハン
    サーを含むヒト重鎖トランスジーンを含むゲノムを有
    し、前記未配置のヒト重鎖トランスジーンにマウスＶH
    遺伝子セグメント、マウスＤ遺伝子セグメント、マウス
    ＪH 遺伝子セグメント、マウスＣH 遺伝子、マウススイ
    ッチ領域、及びマウス重鎖エンハンサーが欠如し、この
    マウスのＢリンパ球がＶ−Ｄ−Ｊジョイニングにより前
    記未配置のヒト重鎖トランスジーンを再配置して、前記
    トランスジーン上の前記完全ヒトμ又は完全ヒトγＣH
    遺伝子によりコードされた恒常領域に対するポリペプチ
    ド結合の中で発現される重鎖可変領域をコードする枠内
    ジョイニングされたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子を産生している、
    トランスジェニックマウス。
  21. 【請求項２１】 前記ヒト重鎖トランスジーンが、プリ
    スイッチ不稔写しの第１のエキソン及びγ１スイッチ領
    域を含むヒト重鎖遺伝子座の 5.3kbのHind IIIフラグメ
    ントを含み、前記Ｂリンパ球が前記ヒト重鎖トランスジ
    ーンと再配置して、このトランスジェニックマウスのＢ
    リンパ球内でヒトμ又はヒトγ鎖として発現される重鎖
    可変領域をコードする枠内ジョイニングされたＶ−Ｄ−
    Ｊ遺伝子を形成している、請求項20に記載のトランスジ
    ェニックマウス。
  22. 【請求項２２】 前記トランスジーンがさらにヒト重鎖
    遺伝子座の 0.7kbのXba Ｉ／Hind IIIフラグメントを含
    み、この 0.7kbのXba Ｉ／Hind IIIフラグメントが基本
    的に前記 5.3kbγ１フラグメントのすぐ上流にあってこ
    のフラグメントに隣接する配列で構成されており、さら
    に前記ヒト重鎖遺伝子座の隣接する上流の 3.1kbのXba
    Ｉフラグメントを含んでいる、請求項21に記載のトラン
    スジェニックマウス。
  23. 【請求項２３】 前記ヒト重鎖トランスジーンには、結
    びつけられたスイッチ領域と不稔写しに付随するエキソ
    ン及びこの不稔写し開始部位の上流の約４kbのフランキ
    ング配列を含むヒトγ１恒常領域、及び、５′CAG GAT
    CCA GAT ATCAGT ACC TGA AAC AGG GCT TGC31 51GAG CAT
    GCA CAG GAC CTG GAG CAC ACA CAGCCT TCC ３′という
    オリゴヌクレオチドプライマーでPCR 増幅されうるラッ
    ト重鎖３′エンハンサーが含まれている、請求項22に記
    載のトランスジェニックマウス。
  24. 【請求項２４】 前記ヒト重鎖トランスジーンにはpHCl
    のNotIインサートが含まれている、請求項23に記載のト
    ランスジェニックマウス。
  25. 【請求項２５】 前記pHClのNotIインサートの１つの無
    傷の生殖細胞系コピーを含み、血清中でヒトμ及びヒト
    γ１鎖の両方を発現する、請求項24に記載のトランスジ
    ェニックマウス。
  26. 【請求項２６】 前記ヒト重鎖トランスジーンがアイソ
    タイプスイッチを受け、かくして枠内ジョイニングされ
    たＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子が、最初ヒトμ恒常領域に対するペ
    プチド結合内で発現され次にこのトランスジェニックマ
    ウスのＢリンパ球の中のヒトγ恒常領域に対するペプチ
    ド結合の中で発現されるヒト重鎖可変領域をコードする
    ことになっている、請求項25に記載のトランスジェニッ
    クマウス。
  27. 【請求項２７】 血清中でヒトμ及びヒトγ１鎖を発現
    し、各々のヒトμ又はヒトγ１鎖にはＶＤＪ遺伝子とし
    て枠内ジョイニングされたヒトＶH 遺伝子セグメント、
    ヒトＤ遺伝子セグメント及びヒトＪH 遺伝子セグメント
    によりコードされるポリペプチド配列で基本的に構成さ
    れている可変領域が含まれている、pHCl又はpIGM１のNo
    tIインサートの無傷の組込まれた生殖細胞系コピーを含
    むトランスジェニックマウス。
  28. 【請求項２８】 さらに、マウスＪH 遺伝子セグメント
    が欠如した機能的に分断された内因性重鎖遺伝子座が含
    まれている、請求項20に記載のトランスジェニックマウ
    ス。
  29. 【請求項２９】 ヒト又はヒトγ１恒常領域を含み前記
    ヒト重鎖トランスジーンによりコードされた免疫グロブ
    リン鎖をその血清中で発現し、基本的にpHClのNotIイン
    サートから成るヒト重鎖トランスジーンの無傷の組込ま
    れた生殖細胞系コピーを有するトランスジェニックマウ
    ス。
  30. 【請求項３０】 トランスジェニックマウスの血清中で
    ヒト免疫グロブリンを含む抗体を産生するための方法に
    おいて、請求項１又は20に記載のトランスジェニックマ
    ウスを予め定められた抗原で免疫化する段階及び体液性
    免疫応答のための適切な時間の後この動物から血清を収
    集する段階を含む方法。
  31. 【請求項３１】 請求項１又は20に記載のトランスジェ
    ニックマウスのＢ細胞を不死化することのできる第２の
    細胞と融合された、予め定められた抗原で免疫化された
    このＢ細胞を含むハイブリドーマにおいて、ヒト重鎖を
    含むモノクローナル抗体を再生し、このモノクローナル
    抗体が前記予め定められた抗原に結合するハイブリドー
    マ。
  32. 【請求項３２】 予め定められた抗原がヒト抗原であ
    る、請求項31に記載のハイブリドーマ。
  33. 【請求項３３】 ヒト抗原が CEA, CD４又はNCA-２であ
    る、請求項32に記載のハイブリドーマ。
  34. 【請求項３４】 少なくとも１×107 Ｍ-1の親和力で、
    モノクローナル抗体がヒト抗原に結合する、請求項31に
    記載のハイブリドーマ。
  35. 【請求項３５】 ハイブリドーマが機能的に分断された
    マウス免疫グロブリン対立遺伝子を含んでいる、請求項
    31に記載のハイブリドーマ。
  36. 【請求項３６】 約８×107 Ｍ-1の親和力で、モノクロ
    ーナル抗体がヒトCD４に結合する、請求項34に記載のハ
    イブリドーマ。
  37. 【請求項３７】 請求項31に記載のハイブリドーマによ
    り再生されるヒトモノクローナル抗体。
  38. 【請求項３８】 前記ヒト抗原が、 CEA, CD４又はNCA-
    ２である、請求項37に記載のヒトモノクローナル抗体。
  39. 【請求項３９】 所定の抗原がヒトCD抗原である、請求
    項31に記載のハイブリドーマ。
  40. 【請求項４０】 所定の抗原がヒト非−CD抗原である、
    請求項31に記載のハイブリドーマ。
  41. 【請求項４１】 所定の抗原がヒト病原体又はヒト病原
    体の抗原である請求項31に記載のハイブリドーマ。
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