JPH08140671A - 大腸菌変異株 - Google Patents
大腸菌変異株Info
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- JPH08140671A JPH08140671A JP6315626A JP31562694A JPH08140671A JP H08140671 A JPH08140671 A JP H08140671A JP 6315626 A JP6315626 A JP 6315626A JP 31562694 A JP31562694 A JP 31562694A JP H08140671 A JPH08140671 A JP H08140671A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】大腸菌内で発現された不安定蛋白質を安定に保
持する変異遺伝子を有することを特徴とする大腸菌変異
株、該大腸菌変異株を用いることを特徴とする大腸菌内
での不安定蛋白質の安定化方法、該大腸菌変異株を使用
することを特徴とする外来蛋白質の製造方法、および該
大腸菌変異株を外来遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子で形
質転換させたことを特徴とする形質転換体。 【効果】大腸菌内で発現された不安定蛋白質を安定に保
持する変異遺伝子を有する本発明の大腸菌変異株は、発
現した外来性有用蛋白質の菌体内分解を抑えることがで
きるため、汎用性の高い蛋白質発現系宿主を提供するこ
とができる。
持する変異遺伝子を有することを特徴とする大腸菌変異
株、該大腸菌変異株を用いることを特徴とする大腸菌内
での不安定蛋白質の安定化方法、該大腸菌変異株を使用
することを特徴とする外来蛋白質の製造方法、および該
大腸菌変異株を外来遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子で形
質転換させたことを特徴とする形質転換体。 【効果】大腸菌内で発現された不安定蛋白質を安定に保
持する変異遺伝子を有する本発明の大腸菌変異株は、発
現した外来性有用蛋白質の菌体内分解を抑えることがで
きるため、汎用性の高い蛋白質発現系宿主を提供するこ
とができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、菌体内における蛋白質
分解活性の低い大腸菌変異株に関する。さらに詳しく
は，大腸菌の菌体内で極めて不安定な蛋白質に対する分
解活性を減弱化させた大腸菌変異株、これを利用する不
安定蛋白質の大腸菌内での安定化方法、外来蛋白質の製
造方法、およびそれに用いる形質転換体に関する。
分解活性の低い大腸菌変異株に関する。さらに詳しく
は，大腸菌の菌体内で極めて不安定な蛋白質に対する分
解活性を減弱化させた大腸菌変異株、これを利用する不
安定蛋白質の大腸菌内での安定化方法、外来蛋白質の製
造方法、およびそれに用いる形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、大腸菌を用いて外来遺伝子の発現
により有用蛋白質を産生する場合において、大腸菌の菌
体内で急速に分解される蛋白質があることが知られてい
る。しかしながら、かかる有用蛋白質の菌体内分解を防
ぐための広く有効な方法は知られていないのが現状であ
る。
により有用蛋白質を産生する場合において、大腸菌の菌
体内で急速に分解される蛋白質があることが知られてい
る。しかしながら、かかる有用蛋白質の菌体内分解を防
ぐための広く有効な方法は知られていないのが現状であ
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、大腸
菌の菌体内で不安定なかかる有用蛋白質を安定に保持し
得る大腸菌変異株を提供することにある。本発明の他の
目的は、かかる大腸菌変異株を用いることにより、不安
定な蛋白質を大腸菌体内で安定化する方法を提供するこ
とにある。本発明の他の目的は、かかる大腸菌変異株を
用いることにより、外来蛋白質を製造する方法を提供す
ることにある。本発明のさらに他の目的は、かかる大腸
菌変異株を外来遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子で形質転
換させた形質転換体を提供することにある。
菌の菌体内で不安定なかかる有用蛋白質を安定に保持し
得る大腸菌変異株を提供することにある。本発明の他の
目的は、かかる大腸菌変異株を用いることにより、不安
定な蛋白質を大腸菌体内で安定化する方法を提供するこ
とにある。本発明の他の目的は、かかる大腸菌変異株を
用いることにより、外来蛋白質を製造する方法を提供す
ることにある。本発明のさらに他の目的は、かかる大腸
菌変異株を外来遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子で形質転
換させた形質転換体を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、熱ショッ
ク蛋白質（ＨＳＰ）遺伝子の発現に重要な役割を果たす
転写因子σ32をモデルとして選び、σ32を安定化する大
腸菌変異株を取得すれば、プロテアーゼの欠失とＨＳＰ
のシャペロン機能との相乗効果により、外来遺伝子の発
現産物をも安定化し得るものと期待し、研究を行った。
ク蛋白質（ＨＳＰ）遺伝子の発現に重要な役割を果たす
転写因子σ32をモデルとして選び、σ32を安定化する大
腸菌変異株を取得すれば、プロテアーゼの欠失とＨＳＰ
のシャペロン機能との相乗効果により、外来遺伝子の発
現産物をも安定化し得るものと期待し、研究を行った。
【０００５】即ち、生物が温度、圧力、放射線、紫外
線、金属イオン、酸素、無機または有機化合物等の外部
環境の変化に曝されると、それはストレスとして生物に
作用し、生物はこれらのストレスに対して細胞レベルで
様々な方法で対処する能力を備えている。このような応
答をストレス応答といい、その中心をなす反応はストレ
ス蛋白質と呼ばれる一群の蛋白質の発現であり、大腸菌
からヒトまで共通して働く生体防御機構である。これま
でのところ、最も研究が進んでいるストレス蛋白質は、
ＨＳＰである。
線、金属イオン、酸素、無機または有機化合物等の外部
環境の変化に曝されると、それはストレスとして生物に
作用し、生物はこれらのストレスに対して細胞レベルで
様々な方法で対処する能力を備えている。このような応
答をストレス応答といい、その中心をなす反応はストレ
ス蛋白質と呼ばれる一群の蛋白質の発現であり、大腸菌
からヒトまで共通して働く生体防御機構である。これま
でのところ、最も研究が進んでいるストレス蛋白質は、
ＨＳＰである。
【０００６】ＨＳＰは、高温時に誘導的に合成される
が、上記の様々なストレスによっても合成される。その
機能は、他のペプチドと結合して、正しい折り畳み（高
次構造の形成）や、第三の蛋白質や核酸との会合（複合
体の形成）、さらに複合体からの解離を助けるほか細胞
内での膜透過、局在化にも関与するなど、いわゆる分子
シャペロン（介添え分子）と呼ばれる機能を担っている
ことが最近明らかになってきた。ＨＳＰはストレスによ
り誘導的に合成されることから、生物がストレス時に一
時的にそれらの蛋白質を必要とすると考えられるが、恒
常的にある程度作られているものがあるので、平時でも
ＨＳＰは重要な役割を担っているものと考えられる。そ
して、ＨＳＰの発現には、転写因子σ32が中心的な役割
を果たしていることが知られている。かかるσ32は、通
常、大腸菌体内では極めて不安定であるが、σ32を安定
に保持し得る大腸菌変異株であれば、σ32を分解するプ
ロテアーゼを欠失しているはずであり、さらにσ32によ
って産生される大量のＨＳＰのシャペロン機能により、
外来遺伝子の発現により産生された有用蛋白質を安定に
保持し得るはずである。
が、上記の様々なストレスによっても合成される。その
機能は、他のペプチドと結合して、正しい折り畳み（高
次構造の形成）や、第三の蛋白質や核酸との会合（複合
体の形成）、さらに複合体からの解離を助けるほか細胞
内での膜透過、局在化にも関与するなど、いわゆる分子
シャペロン（介添え分子）と呼ばれる機能を担っている
ことが最近明らかになってきた。ＨＳＰはストレスによ
り誘導的に合成されることから、生物がストレス時に一
時的にそれらの蛋白質を必要とすると考えられるが、恒
常的にある程度作られているものがあるので、平時でも
ＨＳＰは重要な役割を担っているものと考えられる。そ
して、ＨＳＰの発現には、転写因子σ32が中心的な役割
を果たしていることが知られている。かかるσ32は、通
常、大腸菌体内では極めて不安定であるが、σ32を安定
に保持し得る大腸菌変異株であれば、σ32を分解するプ
ロテアーゼを欠失しているはずであり、さらにσ32によ
って産生される大量のＨＳＰのシャペロン機能により、
外来遺伝子の発現により産生された有用蛋白質を安定に
保持し得るはずである。
【０００７】本発明者らは、このような考えに基づき不
安定蛋白質のモデルとして、熱ショックプロテイン（Ｈ
ＳＰ）遺伝子の発現に関わる転写因子σ32を用い、この
蛋白質を安定化させる大腸菌変異株の探索研究を行った
ところ、ｐｌｓＸ遺伝子を変異させた新規な大腸菌変異
株がσ32を安定化することを見出した。また、既知プロ
テアーゼの変異株の中でσ32を安定化する変異株の探索
を行ったところ、Ｌｏｎプロテアーゼ遺伝子およびＣｌ
ｐプロテアーゼ遺伝子の両方に変異を有する二重変異株
が顕著なσ32の安定化を示すことが見出された。本発明
は、これらの知見に基づき、さらに研究を進めて完成さ
れるに至ったものである。
安定蛋白質のモデルとして、熱ショックプロテイン（Ｈ
ＳＰ）遺伝子の発現に関わる転写因子σ32を用い、この
蛋白質を安定化させる大腸菌変異株の探索研究を行った
ところ、ｐｌｓＸ遺伝子を変異させた新規な大腸菌変異
株がσ32を安定化することを見出した。また、既知プロ
テアーゼの変異株の中でσ32を安定化する変異株の探索
を行ったところ、Ｌｏｎプロテアーゼ遺伝子およびＣｌ
ｐプロテアーゼ遺伝子の両方に変異を有する二重変異株
が顕著なσ32の安定化を示すことが見出された。本発明
は、これらの知見に基づき、さらに研究を進めて完成さ
れるに至ったものである。
【０００８】即ち、本発明の要旨は、（１） 大腸菌内
で発現された不安定蛋白質を安定に保持する変異遺伝子
を有することを特徴とする大腸菌変異株、（２） 熱シ
ョック転写因子σ32が安定化されている前記（１）記載
の変異株、（３） 不安定蛋白質が外来蛋白質である前
記（１）記載の変異株、（４） 変異遺伝子がｐｌｓＸ
遺伝子に変異を生じたものである前記（１）〜（３）い
ずれか記載の変異株、（５） 前記（１）〜（４）いず
れか記載の大腸菌変異株を用いることを特徴とする、大
腸菌内での不安定蛋白質の安定化方法、（６） Ｌｏｎ
およびＣｌｐプロテアーゼ遺伝子に共に変異を有する大
腸菌変異株を用いることを特徴とする、大腸菌内での不
安定蛋白質の安定化方法、（７） 不安定蛋白質が大腸
菌由来の蛋白質である前記（５）または（６）記載の安
定化方法、（８） 不安定蛋白質が外来蛋白質である前
記（５）または（６）記載の安定化方法、（９） 前記
（１）〜（４）いずれか記載の大腸菌変異株を使用する
ことを特徴とする外来蛋白質の製造方法、並びに（１
０） 前記（１）〜（４）いずれか記載の大腸菌変異株
を、外来遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換させ
たことを特徴とする形質転換体、に関する。
で発現された不安定蛋白質を安定に保持する変異遺伝子
を有することを特徴とする大腸菌変異株、（２） 熱シ
ョック転写因子σ32が安定化されている前記（１）記載
の変異株、（３） 不安定蛋白質が外来蛋白質である前
記（１）記載の変異株、（４） 変異遺伝子がｐｌｓＸ
遺伝子に変異を生じたものである前記（１）〜（３）い
ずれか記載の変異株、（５） 前記（１）〜（４）いず
れか記載の大腸菌変異株を用いることを特徴とする、大
腸菌内での不安定蛋白質の安定化方法、（６） Ｌｏｎ
およびＣｌｐプロテアーゼ遺伝子に共に変異を有する大
腸菌変異株を用いることを特徴とする、大腸菌内での不
安定蛋白質の安定化方法、（７） 不安定蛋白質が大腸
菌由来の蛋白質である前記（５）または（６）記載の安
定化方法、（８） 不安定蛋白質が外来蛋白質である前
記（５）または（６）記載の安定化方法、（９） 前記
（１）〜（４）いずれか記載の大腸菌変異株を使用する
ことを特徴とする外来蛋白質の製造方法、並びに（１
０） 前記（１）〜（４）いずれか記載の大腸菌変異株
を、外来遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換させ
たことを特徴とする形質転換体、に関する。
【０００９】以下に本発明の詳細について説明する。本
発明の大腸菌変異株は、大腸菌内で発現された不安定蛋
白質を安定に保持する変異遺伝子を有するものであり、
例えば熱ショック転写因子σ32が安定化されている大腸
菌変異株が挙げられる。具体的には、変異遺伝子がｐｌ
ｓＸ遺伝子に変異を生じたものが例示される。また、本
発明はこのような大腸菌変異株を用いて大腸菌内で発現
する不安定蛋白質を安定化する方法を提供する。該方法
には、前記のようなｐｌｓＸ遺伝子に変異を生じた新規
な大腸菌変異株の他に、既知の変異株ではあるが、Ｌｏ
ｎおよびＣｌｐプロテアーゼ遺伝子に共に変異を有する
大腸菌変異株を用いても不安定蛋白質を安定化すること
ができる。
発明の大腸菌変異株は、大腸菌内で発現された不安定蛋
白質を安定に保持する変異遺伝子を有するものであり、
例えば熱ショック転写因子σ32が安定化されている大腸
菌変異株が挙げられる。具体的には、変異遺伝子がｐｌ
ｓＸ遺伝子に変異を生じたものが例示される。また、本
発明はこのような大腸菌変異株を用いて大腸菌内で発現
する不安定蛋白質を安定化する方法を提供する。該方法
には、前記のようなｐｌｓＸ遺伝子に変異を生じた新規
な大腸菌変異株の他に、既知の変異株ではあるが、Ｌｏ
ｎおよびＣｌｐプロテアーゼ遺伝子に共に変異を有する
大腸菌変異株を用いても不安定蛋白質を安定化すること
ができる。
【００１０】ここで、本発明において不安定蛋白質と
は、大腸菌内で発現しても速やかに分解を受ける蛋白質
をいい、本来きわめて半減期の短い、例えば熱ショック
転写因子σ32のような大腸菌由来の蛋白質や大腸菌以外
の生物由来で好ましくは哺乳類由来の外来有用蛋白質の
うち大腸菌内で分解を受けやすく高発現が困難な蛋白質
を意味する。また、ここで言う「安定化」とは当該蛋白
質の半減期を有意に延長することをいう。半減期は、例
えば放射標識したアミノ酸を用いたパルス−チェイス実
験により測定することができる。
は、大腸菌内で発現しても速やかに分解を受ける蛋白質
をいい、本来きわめて半減期の短い、例えば熱ショック
転写因子σ32のような大腸菌由来の蛋白質や大腸菌以外
の生物由来で好ましくは哺乳類由来の外来有用蛋白質の
うち大腸菌内で分解を受けやすく高発現が困難な蛋白質
を意味する。また、ここで言う「安定化」とは当該蛋白
質の半減期を有意に延長することをいう。半減期は、例
えば放射標識したアミノ酸を用いたパルス−チェイス実
験により測定することができる。
【００１１】本発明の大腸菌変異株は、以下の方法によ
り取得することができる。σ32を不安定蛋白質のモデル
蛋白質として選び、σ32を安定化する変異株を選別す
る。σ32自体の発現量を確認するのは容易でないので、
σ32をコードする遺伝子ｒｐｏＨ遺伝子の３’端にｌａ
ｃＺ遺伝子を融合させたｒｐｏＨ−ｌａｃＺ融合遺伝子
の産物がβ−ガラクトシダーゼ活性により簡便に検出で
きることを利用し、σ32自体の定量と併用する。すで
に、ｒｐｏＨ遺伝子のほぼ全領域とｌａｃＺ遺伝子との
融合遺伝子であるＧＦ８０７の産物がσ32と同様に不安
定であることが明らかにされている(Nagai et al., Pro
c. Nat. Acad. Sci., 91, 10280-10284 (1994)) 。
り取得することができる。σ32を不安定蛋白質のモデル
蛋白質として選び、σ32を安定化する変異株を選別す
る。σ32自体の発現量を確認するのは容易でないので、
σ32をコードする遺伝子ｒｐｏＨ遺伝子の３’端にｌａ
ｃＺ遺伝子を融合させたｒｐｏＨ−ｌａｃＺ融合遺伝子
の産物がβ−ガラクトシダーゼ活性により簡便に検出で
きることを利用し、σ32自体の定量と併用する。すで
に、ｒｐｏＨ遺伝子のほぼ全領域とｌａｃＺ遺伝子との
融合遺伝子であるＧＦ８０７の産物がσ32と同様に不安
定であることが明らかにされている(Nagai et al., Pro
c. Nat. Acad. Sci., 91, 10280-10284 (1994)) 。
【００１２】大腸菌変異株の作成のために、まずＧＦ８
０７融合遺伝子をもつλファージで溶原化した大腸菌Ｍ
Ｃ４１００λＧＦ８０７にmini Tn10(tet)をもつλファ
ージλ１０９８を使って挿入変異を導入する。ＧＦ８０
７融合遺伝子をもつλファージ（λＧＦ８０７）および
その溶原菌ＭＣ４１００λＧＦ８０７は、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1991) Vol.88 p10515-10519 (Nagai,
H. et al) に記載の方法に従って作製することができ
る。mini Tn10 (tet) とは、テトラサイクリン耐性遺伝
子を含むトランスポゾンであり、mini Tn10 (tet) をも
つλファージ（λ１０９８）は、具体的には、Gene(198
4) Vol.32 p369-379 (Way, J. C. et al)に記載の方法
に従って作成することができる。
０７融合遺伝子をもつλファージで溶原化した大腸菌Ｍ
Ｃ４１００λＧＦ８０７にmini Tn10(tet)をもつλファ
ージλ１０９８を使って挿入変異を導入する。ＧＦ８０
７融合遺伝子をもつλファージ（λＧＦ８０７）および
その溶原菌ＭＣ４１００λＧＦ８０７は、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1991) Vol.88 p10515-10519 (Nagai,
H. et al) に記載の方法に従って作製することができ
る。mini Tn10 (tet) とは、テトラサイクリン耐性遺伝
子を含むトランスポゾンであり、mini Tn10 (tet) をも
つλファージ（λ１０９８）は、具体的には、Gene(198
4) Vol.32 p369-379 (Way, J. C. et al)に記載の方法
に従って作成することができる。
【００１３】λ１０９８によるＭＣ４１００λＧＦ８０
７への挿入変異の導入は、例えば以下のようにして行
う。ＭＣ４１００λＧＦ８０７をＬ培地（１％バクトト
リプトン（Difco 製）、０．５％バクトイーストエキス
トラクト (Difco 製）、０．５％ＮａＣｌ）で培養す
る。この菌液にλ１０９８ファージ液を加えて培養した
培養液をＬ培地で希釈し、テトラサイクリンを含むMacC
onkey-Lactose 寒天培地（Difco 製）に塗布する。
７への挿入変異の導入は、例えば以下のようにして行
う。ＭＣ４１００λＧＦ８０７をＬ培地（１％バクトト
リプトン（Difco 製）、０．５％バクトイーストエキス
トラクト (Difco 製）、０．５％ＮａＣｌ）で培養す
る。この菌液にλ１０９８ファージ液を加えて培養した
培養液をＬ培地で希釈し、テトラサイクリンを含むMacC
onkey-Lactose 寒天培地（Difco 製）に塗布する。
【００１４】挿入変異のスクリーニングは、例えば以下
のようにして行う。λ１０９８により処理された大腸菌
ＭＣ４１００λＧＦ８０７を、テトラサイクリンを含む
MacConkey-Lactose 寒天培地 (Difco 製）上で培養し、
赤色の濃いコロニー（β−ガラクトシダーゼ活性の強い
株）を選別する。通常、約１０００個のテトラサイクリ
ン耐性株から約１個の赤の程度の濃いコロニーが選択さ
れる。
のようにして行う。λ１０９８により処理された大腸菌
ＭＣ４１００λＧＦ８０７を、テトラサイクリンを含む
MacConkey-Lactose 寒天培地 (Difco 製）上で培養し、
赤色の濃いコロニー（β−ガラクトシダーゼ活性の強い
株）を選別する。通常、約１０００個のテトラサイクリ
ン耐性株から約１個の赤の程度の濃いコロニーが選択さ
れる。
【００１５】選択株の中からσ32の安定性の高い株を選
別するため、選択株中のσ32量を測定する。測定法は例
えば以下のとおりである。候補株を３７℃のＬ培地で対
数増殖期中期まで培養し、培養液に１０％ＴＣＡを加え
生育を止める。これを遠心分離にかけ沈殿をアセトンで
洗浄、乾燥後、１％ＳＤＳ、１０ｍＭ Tris−ＨＣｌｐ
Ｈ８．０に溶解し煮沸する。さらに遠心分離にかけ、上
清の含有蛋白質量を測定する。蛋白質２０μｇ相当に等
体積の０．１％ＢＰＢ、１０％グリセロール、２％ＳＤ
Ｓ、１００ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ ｐ
Ｈ６．８を加え、煮沸後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかける。泳動後のゲルから蛋白質をブロッ
ティングしたメンブレンを１％スキムミルク（和光純薬
社製）を含むＴＢＳ（宝酒造社製）に浸し、室温で振盪
し、続いて抗σ32抗血清を１％スキムミルクを含むＴＢ
Ｓで希釈したものに浸し、室温で振盪する。続いて、メ
ンブレンを０．０１％ Tween 20 を含むＴＢＳで洗浄
し、パーオキシダーゼでラベルされた抗ウサギＩｇＧ抗
体を１％スキムミルクを含むＴＢＳで希釈したものに浸
し、室温で振盪する。続いて、メンブレンを洗浄した
後、染色し、σ32に相当する部分の染色の度合いから、
σ32の相対量を見積もる。
別するため、選択株中のσ32量を測定する。測定法は例
えば以下のとおりである。候補株を３７℃のＬ培地で対
数増殖期中期まで培養し、培養液に１０％ＴＣＡを加え
生育を止める。これを遠心分離にかけ沈殿をアセトンで
洗浄、乾燥後、１％ＳＤＳ、１０ｍＭ Tris−ＨＣｌｐ
Ｈ８．０に溶解し煮沸する。さらに遠心分離にかけ、上
清の含有蛋白質量を測定する。蛋白質２０μｇ相当に等
体積の０．１％ＢＰＢ、１０％グリセロール、２％ＳＤ
Ｓ、１００ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ ｐ
Ｈ６．８を加え、煮沸後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかける。泳動後のゲルから蛋白質をブロッ
ティングしたメンブレンを１％スキムミルク（和光純薬
社製）を含むＴＢＳ（宝酒造社製）に浸し、室温で振盪
し、続いて抗σ32抗血清を１％スキムミルクを含むＴＢ
Ｓで希釈したものに浸し、室温で振盪する。続いて、メ
ンブレンを０．０１％ Tween 20 を含むＴＢＳで洗浄
し、パーオキシダーゼでラベルされた抗ウサギＩｇＧ抗
体を１％スキムミルクを含むＴＢＳで希釈したものに浸
し、室温で振盪する。続いて、メンブレンを洗浄した
後、染色し、σ32に相当する部分の染色の度合いから、
σ32の相対量を見積もる。
【００１６】上記のようにして得られたσ32の含量の多
い変異株について、σ32の安定性を調べるため、パルス
−チェイス実験を行う。即ち、選択した変異株の最少培
地における対数増殖期の培養液に35Ｓ−メチオニンを加
えて１分間ラベルし、コールドメチオニンを加えて培養
を続け、タイムコースをとって培養液の一部をトリクロ
ロ酢酸で処理し、菌体を回収した後、抗β−ガラクトシ
ダーゼ抗体による免疫沈降反応でＧＦ８０７産物を特異
的に回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、オートラジオグ
ラフィで解析する。１分、２分、４分のチェイスで野生
型よりも顕著にＧＦ８０７産物の安定化が認められるも
のを選択する。
い変異株について、σ32の安定性を調べるため、パルス
−チェイス実験を行う。即ち、選択した変異株の最少培
地における対数増殖期の培養液に35Ｓ−メチオニンを加
えて１分間ラベルし、コールドメチオニンを加えて培養
を続け、タイムコースをとって培養液の一部をトリクロ
ロ酢酸で処理し、菌体を回収した後、抗β−ガラクトシ
ダーゼ抗体による免疫沈降反応でＧＦ８０７産物を特異
的に回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、オートラジオグ
ラフィで解析する。１分、２分、４分のチェイスで野生
型よりも顕著にＧＦ８０７産物の安定化が認められるも
のを選択する。
【００１７】上記の操作により、本発明のσ32を安定化
し得る大腸菌変異株を取得することができる。その１例
は、実施例に示すように、ｐｌｓＸのＮ末端領域に挿入
変異を有する変異株である。ここにｐｌｓＸ遺伝子は、
ｓｎ−グリセロール−３−リン酸要求性を示す変異株に
おいて、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸 アシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子ｐｌｓＢの変異株で発見された遺
伝子であって、その機能は未だ不明である。
し得る大腸菌変異株を取得することができる。その１例
は、実施例に示すように、ｐｌｓＸのＮ末端領域に挿入
変異を有する変異株である。ここにｐｌｓＸ遺伝子は、
ｓｎ−グリセロール−３−リン酸要求性を示す変異株に
おいて、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸 アシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子ｐｌｓＢの変異株で発見された遺
伝子であって、その機能は未だ不明である。
【００１８】本発明において不安定蛋白質安定化変異株
を取得する他の方法は、既知のプロテアーゼ欠失株につ
いて、σ32を安定化する株をスクリーニングする方法が
挙げられる。σ32の安定化に関与する因子として、Ｄｎ
ａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ等が知られている（Tilly,
K. et al., J. Bacteriol., 171, 1585-1589 (1989))
。しかし、これら自身はプロテアーゼではない。また
大腸菌には、熱ショック誘導性でエネルギー依存性のプ
ロテアーゼが２種（Ｌｏｎ、Ｃｌｐ）知られているが、
いずれもσ32の分解には直接関与していないといわれて
いる（Maurizi, M. R., Experientia 48, 178-201 (199
2)) 。
を取得する他の方法は、既知のプロテアーゼ欠失株につ
いて、σ32を安定化する株をスクリーニングする方法が
挙げられる。σ32の安定化に関与する因子として、Ｄｎ
ａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ等が知られている（Tilly,
K. et al., J. Bacteriol., 171, 1585-1589 (1989))
。しかし、これら自身はプロテアーゼではない。また
大腸菌には、熱ショック誘導性でエネルギー依存性のプ
ロテアーゼが２種（Ｌｏｎ、Ｃｌｐ）知られているが、
いずれもσ32の分解には直接関与していないといわれて
いる（Maurizi, M. R., Experientia 48, 178-201 (199
2)) 。
【００１９】そこで、σ32を安定化する株を直接スクリ
ーニングする必要がある。被験菌は、各種のプロテアー
ゼ欠失株をλＧＦ８０７で溶原化し、あるいはＭＣ４１
００λＧＦ８０７株にＰ１トランスダクションにより他
のプロテアーゼ欠失株からプロテアーゼ欠失部位を導入
することにより調製し、ＧＦ８０７の産物（σ32とβ−
ガラクトシダーゼの融合蛋白質）の安定性を前記と同様
にして測定する。プロテアーゼ欠失株のλＧＦ８０７に
よる溶原化を行う方法は以下のとおりである。Ｌ培地で
一晩培養したプロテアーゼ欠失株の培養液を寒天１．５
％を含むＬ培地のプレートにまき、コンラージ棒で均一
にひろげ、λＧＦ８０７溶液をスポットする。これを３
７℃で一晩保温し、スポットの部分から菌をかきとり、
Ｘ−gal(４０ｍｇ／Ｌ）を含むＬ培地プレートにひろ
げ、３７℃で一晩培養後、青いコロニーを選択すること
により、プロテアーゼ欠失株のλＧＦ８０７による溶原
菌が得られる。
ーニングする必要がある。被験菌は、各種のプロテアー
ゼ欠失株をλＧＦ８０７で溶原化し、あるいはＭＣ４１
００λＧＦ８０７株にＰ１トランスダクションにより他
のプロテアーゼ欠失株からプロテアーゼ欠失部位を導入
することにより調製し、ＧＦ８０７の産物（σ32とβ−
ガラクトシダーゼの融合蛋白質）の安定性を前記と同様
にして測定する。プロテアーゼ欠失株のλＧＦ８０７に
よる溶原化を行う方法は以下のとおりである。Ｌ培地で
一晩培養したプロテアーゼ欠失株の培養液を寒天１．５
％を含むＬ培地のプレートにまき、コンラージ棒で均一
にひろげ、λＧＦ８０７溶液をスポットする。これを３
７℃で一晩保温し、スポットの部分から菌をかきとり、
Ｘ−gal(４０ｍｇ／Ｌ）を含むＬ培地プレートにひろ
げ、３７℃で一晩培養後、青いコロニーを選択すること
により、プロテアーゼ欠失株のλＧＦ８０７による溶原
菌が得られる。
【００２０】また、ＭＣ４１００λＧＦ８０７株へのＰ
１トランスダクションは、例えば以下のようにして行
う。すなわち、Ｐ１vir ファージを増殖させようとする
菌株（形質導入の供与菌、ここではプロテアーゼ欠失
株）をＬ培地で一晩培養し、培養液をＬ培地に加えて振
盪培養する。これに０．１Ｍ ＣａＣｌ2 、Ｐ１vir フ
ァージ液を加えて、培養液が透明になるまで振盪を続け
る。培養液が透明になったら、クロロホルムを加え、遠
心分離にかけ、上清を回収する。
１トランスダクションは、例えば以下のようにして行
う。すなわち、Ｐ１vir ファージを増殖させようとする
菌株（形質導入の供与菌、ここではプロテアーゼ欠失
株）をＬ培地で一晩培養し、培養液をＬ培地に加えて振
盪培養する。これに０．１Ｍ ＣａＣｌ2 、Ｐ１vir フ
ァージ液を加えて、培養液が透明になるまで振盪を続け
る。培養液が透明になったら、クロロホルムを加え、遠
心分離にかけ、上清を回収する。
【００２１】一方、ＭＣ４１００λ８０７株をＬ培地で
３７℃で一晩培養した培養液を遠心分離にかけ、菌体を
回収し、０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 、０．００５Ｍ ＣａＣ
ｌ2に懸濁する。この菌液と先に調製したＰ１vir ファ
ージ液を混合し、室温で静置する。続いて、１Ｍ Ｎａ
−Citrate を加え、遠心分離にかけ、菌体を回収し、再
び１Ｍ Ｎａ−Citrate に懸濁する。これを適当な選択
寒天培地に塗布し、培養することによってプロテアーゼ
遺伝子の欠失が形質導入されたＭＣ４１００λ８０７株
の変異株が得られる。
３７℃で一晩培養した培養液を遠心分離にかけ、菌体を
回収し、０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 、０．００５Ｍ ＣａＣ
ｌ2に懸濁する。この菌液と先に調製したＰ１vir ファ
ージ液を混合し、室温で静置する。続いて、１Ｍ Ｎａ
−Citrate を加え、遠心分離にかけ、菌体を回収し、再
び１Ｍ Ｎａ−Citrate に懸濁する。これを適当な選択
寒天培地に塗布し、培養することによってプロテアーゼ
遺伝子の欠失が形質導入されたＭＣ４１００λ８０７株
の変異株が得られる。
【００２２】その結果、実施例に示すように、大腸菌Ｓ
Ｇ２２０９４株にλＧＦ８０７を溶原化して得たＳＧ２
２０９４λＧＦ８０７株、およびＭＣ４１００λＧＦ８
０７株にＳＧ２２０９４株のΔｃｌｐＰ::Ｃｍとｌｏｎ
−５１０変異をＰ１トランスダクションにより導入して
得た変異株が、ＧＦ８０７の産物に対する優れた安定性
を示し、本発明の目的物であることがわかった。ＳＧ２
２０９４株は、Ｃｌｐプロテアーゼ遺伝子およびＬｏｎ
プロテアーゼ遺伝子が欠失している株であり、Dr. S. G
ottesman (National Institutes of Health, National
Cancer Institute, Bethesda, Maryland 20892) より入
手できる。
Ｇ２２０９４株にλＧＦ８０７を溶原化して得たＳＧ２
２０９４λＧＦ８０７株、およびＭＣ４１００λＧＦ８
０７株にＳＧ２２０９４株のΔｃｌｐＰ::Ｃｍとｌｏｎ
−５１０変異をＰ１トランスダクションにより導入して
得た変異株が、ＧＦ８０７の産物に対する優れた安定性
を示し、本発明の目的物であることがわかった。ＳＧ２
２０９４株は、Ｃｌｐプロテアーゼ遺伝子およびＬｏｎ
プロテアーゼ遺伝子が欠失している株であり、Dr. S. G
ottesman (National Institutes of Health, National
Cancer Institute, Bethesda, Maryland 20892) より入
手できる。
【００２３】以上のようにして得られる本発明の不安定
蛋白質を安定化する大腸菌は、従来の大腸菌で発現させ
ても分解を受けやすく高発現が困難な外来有用蛋白質も
安定化し得るので、汎用性の高い蛋白質発現系宿主とし
て使用することができる。すなわち、本発明はこれらの
大腸菌変異株を常法により外来有用蛋白質をコードする
ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子で形質転換し、該形質転
換体を用いて該外来有用蛋白質を製造する方法をも提供
するものである。
蛋白質を安定化する大腸菌は、従来の大腸菌で発現させ
ても分解を受けやすく高発現が困難な外来有用蛋白質も
安定化し得るので、汎用性の高い蛋白質発現系宿主とし
て使用することができる。すなわち、本発明はこれらの
大腸菌変異株を常法により外来有用蛋白質をコードする
ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子で形質転換し、該形質転
換体を用いて該外来有用蛋白質を製造する方法をも提供
するものである。
【００２４】外来有用蛋白質を発現するように大腸菌変
異株を形質転換するには、外来有用蛋白質をコードする
ＤＮＡを用いて、公知の方法（例えば Sambrook, J. et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yor
k, 1989年等参照）を参考にして行えばよい。すなわ
ち、まず前記ＤＮＡをプロモーター配列、ＳＤ配列、複
製開始点、マーカー遺伝子等発現制御に必要な配列を有
する適当なベクターに組み込む。使用しうるベクターの
例としては、ｐＥＴ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２３３、
ｐＰＬ−Ｌａｍｂｄａ等が挙げられる。ここで例示した
ベクターはいずれも市販されているので容易に入手する
ことができる。次に、外来有用蛋白質をコードするＤＮ
Ａが組み込まれた発現用ベクターを塩化カルシウム法、
エレクトロポレーション法等の方法で該大腸菌変異株に
導入し、目的とする形質転換体をスクリーニングする。
得られた形質転換体は公知の方法で培養し、必要があれ
ば発現誘導を行う。形質転換体からの目的蛋白質の回収
および精製は、形質転換体を破砕して遠心分離し、上清
を回収し、ゲル濾過や各種のカラムクロマトグラフィー
等、蛋白質の精製に使用されている通常の方法で精製す
ればよい。また、目的蛋白質がペリプラズムに存在する
場合には、Willsky らの方法（J. Bacteriol., 127, 59
5-609 (1976)) 等を参考にして精製することができる。
異株を形質転換するには、外来有用蛋白質をコードする
ＤＮＡを用いて、公知の方法（例えば Sambrook, J. et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yor
k, 1989年等参照）を参考にして行えばよい。すなわ
ち、まず前記ＤＮＡをプロモーター配列、ＳＤ配列、複
製開始点、マーカー遺伝子等発現制御に必要な配列を有
する適当なベクターに組み込む。使用しうるベクターの
例としては、ｐＥＴ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２３３、
ｐＰＬ−Ｌａｍｂｄａ等が挙げられる。ここで例示した
ベクターはいずれも市販されているので容易に入手する
ことができる。次に、外来有用蛋白質をコードするＤＮ
Ａが組み込まれた発現用ベクターを塩化カルシウム法、
エレクトロポレーション法等の方法で該大腸菌変異株に
導入し、目的とする形質転換体をスクリーニングする。
得られた形質転換体は公知の方法で培養し、必要があれ
ば発現誘導を行う。形質転換体からの目的蛋白質の回収
および精製は、形質転換体を破砕して遠心分離し、上清
を回収し、ゲル濾過や各種のカラムクロマトグラフィー
等、蛋白質の精製に使用されている通常の方法で精製す
ればよい。また、目的蛋白質がペリプラズムに存在する
場合には、Willsky らの方法（J. Bacteriol., 127, 59
5-609 (1976)) 等を参考にして精製することができる。
【００２５】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。
【００２６】実施例１ 大腸菌ＭＣ４１００λＧＦ８０７株へのmini Tn10(tet)
による挿入変異の導入 大腸菌ＭＣ４１００λＧＦ８０７株は、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA (1991)Vol.88 p10515-10519 (Nagai, H.
et al) に記載の方法に従って作成されたものを、その
著者より譲り受けた。このＭＣ４１００λＧＦ８０７を
５ｍｌのＬ培地で３７℃で一晩培養したのち、２０ｍｌ
のＬ培地を新たに加え、３７℃で３０分培養した。この
菌液に４０μｌのλ１０９８（１．９×１０11ｐｆｕ／
ｍｌ）ファージ液、０．５ｍｌの１Ｍ ＭｇＳＯ4 を加
え、３７℃で６０分振盪培養した。培養液をＬ培地で１
００倍に希釈し、１０μｌをテトラサイクリン１０ｍｇ
／Ｌを含むMacConkey-Lactose 寒天培地（Difco 製）１
枚に塗布した。
による挿入変異の導入 大腸菌ＭＣ４１００λＧＦ８０７株は、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA (1991)Vol.88 p10515-10519 (Nagai, H.
et al) に記載の方法に従って作成されたものを、その
著者より譲り受けた。このＭＣ４１００λＧＦ８０７を
５ｍｌのＬ培地で３７℃で一晩培養したのち、２０ｍｌ
のＬ培地を新たに加え、３７℃で３０分培養した。この
菌液に４０μｌのλ１０９８（１．９×１０11ｐｆｕ／
ｍｌ）ファージ液、０．５ｍｌの１Ｍ ＭｇＳＯ4 を加
え、３７℃で６０分振盪培養した。培養液をＬ培地で１
００倍に希釈し、１０μｌをテトラサイクリン１０ｍｇ
／Ｌを含むMacConkey-Lactose 寒天培地（Difco 製）１
枚に塗布した。
【００２７】実施例２ 挿入変異株のスクリーニング λ１０９８により処理された大腸菌ＭＣ４１００λＧＦ
８０７を、テトラサイクリン１０ｍｇ／Ｌを含むMacCon
key-Lactose 寒天培地（Difco 製）上で、３９．５℃で
一晩培養し、赤色の濃いコロニー（β−ガラクトシダー
ゼ活性の強い株）を選別した。この試験により約１００
０個のテトラサイクリン耐性株から約１個の赤の程度の
濃いコロニーを選択した。
８０７を、テトラサイクリン１０ｍｇ／Ｌを含むMacCon
key-Lactose 寒天培地（Difco 製）上で、３９．５℃で
一晩培養し、赤色の濃いコロニー（β−ガラクトシダー
ゼ活性の強い株）を選別した。この試験により約１００
０個のテトラサイクリン耐性株から約１個の赤の程度の
濃いコロニーを選択した。
【００２８】実施例３ σ32含量の多い変異株の選択 赤の程度の濃いコロニーを形成する候補株２４株を３７
℃のＬ培地で対数増殖期中期まで培養し、培養液０．５
ｍｌに０．５５ｍｌの１０％ＴＣＡを加え生育を止め
た。これを１００００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にか
け沈殿をアセトンで洗浄、乾燥後、５０μｌの１％ＳＤ
Ｓ、１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ ｐＨ８．０に溶解し５分
間煮沸した。さらに１００００ｒｐｍ、１０分間の遠心
分離にかけ、上清の含有蛋白質量を MicroＢＣＡ蛋白質
定量キット（ピアス社製）を用いて測定した。
℃のＬ培地で対数増殖期中期まで培養し、培養液０．５
ｍｌに０．５５ｍｌの１０％ＴＣＡを加え生育を止め
た。これを１００００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にか
け沈殿をアセトンで洗浄、乾燥後、５０μｌの１％ＳＤ
Ｓ、１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ ｐＨ８．０に溶解し５分
間煮沸した。さらに１００００ｒｐｍ、１０分間の遠心
分離にかけ、上清の含有蛋白質量を MicroＢＣＡ蛋白質
定量キット（ピアス社製）を用いて測定した。
【００２９】蛋白質２０μｇ相当に等体積の０．１％Ｂ
ＰＢ、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、１００ｍＭ
ＤＴＴ、５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ ｐＨ６．８を加え、
５分間煮沸後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけた。泳動後のゲルからイモビロンＰメンブレン
（ミリポア社製）に蛋白質をブロッティングした。ブロ
ッティングにはアトー社のブロッティング装置を用い
た。ブロッティングの終わったメンブレンを１％スキム
ミルク（和光純薬社製）を含むＴＢＳ（宝酒造社製）に
浸し、室温で１時間振盪し、続いて抗σ32抗血清を１％
スキムミルクを含むＴＢＳで１０００倍に希釈したもの
に浸し、室温で１時間振盪した。続いて、メンブレンを
０．０１％ Tween 20(和光純薬社製）を含むＴＢＳで２
０分間ずつ３回洗浄し、パーオキシダーゼでラベルされ
た抗ウサギＩｇＧ抗体（ベーリンガーマンハイム社製）
を１％スキムミルクを含むＴＢＳで８００倍に希釈した
ものに浸し、室温で１時間振盪した。続いて、メンブレ
ンを０．０１％ Tween 20(和光純薬社製）を含むＴＢＳ
で２０分間ずつ３回、ＴＢＳで１回洗浄し、コニカイム
ノステイン（コニカ社製）を用いてメンブレンを染色
し、σ32に相当する部分の染色の度合いから、σ32の相
対的量を見積もった。この試験により、野生株よりも顕
著にσ32含量の多い変異株を５株選択した。
ＰＢ、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、１００ｍＭ
ＤＴＴ、５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ ｐＨ６．８を加え、
５分間煮沸後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけた。泳動後のゲルからイモビロンＰメンブレン
（ミリポア社製）に蛋白質をブロッティングした。ブロ
ッティングにはアトー社のブロッティング装置を用い
た。ブロッティングの終わったメンブレンを１％スキム
ミルク（和光純薬社製）を含むＴＢＳ（宝酒造社製）に
浸し、室温で１時間振盪し、続いて抗σ32抗血清を１％
スキムミルクを含むＴＢＳで１０００倍に希釈したもの
に浸し、室温で１時間振盪した。続いて、メンブレンを
０．０１％ Tween 20(和光純薬社製）を含むＴＢＳで２
０分間ずつ３回洗浄し、パーオキシダーゼでラベルされ
た抗ウサギＩｇＧ抗体（ベーリンガーマンハイム社製）
を１％スキムミルクを含むＴＢＳで８００倍に希釈した
ものに浸し、室温で１時間振盪した。続いて、メンブレ
ンを０．０１％ Tween 20(和光純薬社製）を含むＴＢＳ
で２０分間ずつ３回、ＴＢＳで１回洗浄し、コニカイム
ノステイン（コニカ社製）を用いてメンブレンを染色
し、σ32に相当する部分の染色の度合いから、σ32の相
対的量を見積もった。この試験により、野生株よりも顕
著にσ32含量の多い変異株を５株選択した。
【００３０】この中の一株ＭＫＴ８からゲノムＤＮＡを
分離した。方法は以下のとおりである。この変異株を２
ｍｌのＬ培地で３７℃で一晩培養し、１２０００ｒｐ
ｍ、５分の遠心分離で菌体を集めた。５６７μｌのＴＥ
（１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０）に懸濁して、１０％ＳＤＳを３０μｌ、２０ｍ
ｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（シグマ社製）溶液を３μ
ｌ加えて攪拌し、３７℃に１時間保温した。これに、５
Ｍ ＮａＣｌを０．１ｍｌ加え、攪拌し、さらに、１０
％ＣＴＡＢ、０．７Ｍ ＮａＣｌを８０μｌ加え、６５
℃に１０分保温した。つづいて、８００μｌのクロロホ
ルム／イソアミルアルコール混液（クロロホルム２４体
積にイソアミルアルコール１体積を加えたもの）を加
え、攪拌した。１２０００ｒｐｍ、５分の遠心分離で水
相とクロロホルム相に分離し、水相を回収後、８００μ
ｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
混液（ＴＥ飽和フェノール（和光純薬社製）とクロロホ
ルム／イソアミルアルコール混液を等量ずつ混ぜたも
の）を加え、攪拌後、１２０００ｒｐｍ、５分の遠心分
離で水相とフェノール／クロロホルム相に分離した。水
相に３００μｌのイソプロピルアルコールを加え、攪拌
後、１２０００ｒｐｍ、５分の遠心分離でＤＮＡを沈殿
させた。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、乾燥後、Ｄ
ＮＡを１００μｌのＴＥに溶解した。
分離した。方法は以下のとおりである。この変異株を２
ｍｌのＬ培地で３７℃で一晩培養し、１２０００ｒｐ
ｍ、５分の遠心分離で菌体を集めた。５６７μｌのＴＥ
（１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０）に懸濁して、１０％ＳＤＳを３０μｌ、２０ｍ
ｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（シグマ社製）溶液を３μ
ｌ加えて攪拌し、３７℃に１時間保温した。これに、５
Ｍ ＮａＣｌを０．１ｍｌ加え、攪拌し、さらに、１０
％ＣＴＡＢ、０．７Ｍ ＮａＣｌを８０μｌ加え、６５
℃に１０分保温した。つづいて、８００μｌのクロロホ
ルム／イソアミルアルコール混液（クロロホルム２４体
積にイソアミルアルコール１体積を加えたもの）を加
え、攪拌した。１２０００ｒｐｍ、５分の遠心分離で水
相とクロロホルム相に分離し、水相を回収後、８００μ
ｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
混液（ＴＥ飽和フェノール（和光純薬社製）とクロロホ
ルム／イソアミルアルコール混液を等量ずつ混ぜたも
の）を加え、攪拌後、１２０００ｒｐｍ、５分の遠心分
離で水相とフェノール／クロロホルム相に分離した。水
相に３００μｌのイソプロピルアルコールを加え、攪拌
後、１２０００ｒｐｍ、５分の遠心分離でＤＮＡを沈殿
させた。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、乾燥後、Ｄ
ＮＡを１００μｌのＴＥに溶解した。
【００３１】このＤＮＡ溶液１０μｌとCharomid (ニッ
ポンジーン社製）１μｇを制限酵素BamHI(宝酒造社製）
で消化し、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用い
てライゲーション後、λパッケージングキット（ニッポ
ンジーン社製）を用いてＤＮＡをパッケージングし、大
腸菌ＭＲｉ８０株を形質転換した。これを、テトラサイ
クリン１０ｍｇ／Ｌとアンピシリン５０ｍｇ／Ｌを含む
Ｌ培地のプレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。得
られたテトラサイクリン耐性かつアンピシリン耐性の菌
を５０ｍｌのＬ培地で３０℃で一晩培養し、菌液からＱ
ＩＡＧＥＮ（QIAGEN社製）でプラスミドを抽出し、プラ
スミド１μｇをパーキンエルマーアップライドバイオシ
ステムズ社製のＤＮＡ塩基配列解析キットおよび解析装
置で解析した。解析用のプライマーの塩基配列は、以下
のとおりである。 プライマー１：5'CCATTGCTGTTGACAAAGGG プライマー２：5'CCAACGCTTTTCCCGAGATC その結果、この変異株はｐｌｓＸ遺伝子のＮ末端領域を
コードする位置への挿入変異であることが明らかになっ
た。
ポンジーン社製）１μｇを制限酵素BamHI(宝酒造社製）
で消化し、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用い
てライゲーション後、λパッケージングキット（ニッポ
ンジーン社製）を用いてＤＮＡをパッケージングし、大
腸菌ＭＲｉ８０株を形質転換した。これを、テトラサイ
クリン１０ｍｇ／Ｌとアンピシリン５０ｍｇ／Ｌを含む
Ｌ培地のプレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。得
られたテトラサイクリン耐性かつアンピシリン耐性の菌
を５０ｍｌのＬ培地で３０℃で一晩培養し、菌液からＱ
ＩＡＧＥＮ（QIAGEN社製）でプラスミドを抽出し、プラ
スミド１μｇをパーキンエルマーアップライドバイオシ
ステムズ社製のＤＮＡ塩基配列解析キットおよび解析装
置で解析した。解析用のプライマーの塩基配列は、以下
のとおりである。 プライマー１：5'CCATTGCTGTTGACAAAGGG プライマー２：5'CCAACGCTTTTCCCGAGATC その結果、この変異株はｐｌｓＸ遺伝子のＮ末端領域を
コードする位置への挿入変異であることが明らかになっ
た。
【００３２】実施例４ 既知プロテアーゼ欠失株からσ32安定化株の選択 （１）ＭＣ４１００λＧＦ８０７株のＰ１トランスダク
ションによる既知プロテアーゼ欠失株の作成 プロテアーゼ欠失株から調製したＰ１vir ファージ溶菌
液をＭＣ４１００λＧＦ８０７株に感染させ、プロテア
ーゼ近傍または内部の選択マーカーにより、プロテアー
ゼ遺伝子の欠失がＭＣ４１００λＧＦ８０７株に導入さ
れた組み換え株を選択した。
ションによる既知プロテアーゼ欠失株の作成 プロテアーゼ欠失株から調製したＰ１vir ファージ溶菌
液をＭＣ４１００λＧＦ８０７株に感染させ、プロテア
ーゼ近傍または内部の選択マーカーにより、プロテアー
ゼ遺伝子の欠失がＭＣ４１００λＧＦ８０７株に導入さ
れた組み換え株を選択した。
【００３３】（２）Ｐ１トランスダクションによるＭＣ
４１００λＧＦ８０７株への大腸菌ＳＧ２２０９４株の
ΔｃｌｐＰ::Ｃｍの導入 ＳＧ２２０９４株をＬ培地で一晩培養し、培養液０．１
ｍｌを５ｍｌのＬ培地に加え、約９０分振盪培養した。
これに、０．１Ｍ ＣａＣｌ2 を０．０５ｍｌ加え、Ｐ
１vir ファージ液（１×１０10ｐｆｕ／ｍｌ）を０．２
ｍｌ加えて、培養液が透明になるまで振盪を続けた。培
養液が透明になったところでクロロホルムを３滴加え、
３０００ｒｐｍで１０分の遠心分離にかけ、上清を回収
した。一方、ＭＣ４１００λ８０７株をＬ培地で３７℃
で一晩培養した培養液を３０００ｒｐｍで１０分の遠心
分離にかけ、菌体を回収し、１ｍｌの０．１Ｍ ＭｇＣ
ｌ2 、０．００５Ｍ ＣａＣｌ2 に懸濁した。この菌液
０．１ｍｌと先に調製したＰ１vir ファージ液０．１ｍ
ｌを混合し、室温で１５分静置した。続いて、０．２ｍ
ｌの１Ｍ Ｎａ−Citrate を加え、３０００ｒｐｍで１
０分の遠心分離にかけ、菌体を回収し、再び、０．１ｍ
ｌの１Ｍ Ｎａ−Citrate に懸濁した。これを２０ｍｇ
／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬ培地のプレートに
塗布し、３７℃で培養することによってΔｃｌｐＰ::Ｃ
ｍが形質導入されたＭＣ４１００λ８０７株の変異株が
得られた。
４１００λＧＦ８０７株への大腸菌ＳＧ２２０９４株の
ΔｃｌｐＰ::Ｃｍの導入 ＳＧ２２０９４株をＬ培地で一晩培養し、培養液０．１
ｍｌを５ｍｌのＬ培地に加え、約９０分振盪培養した。
これに、０．１Ｍ ＣａＣｌ2 を０．０５ｍｌ加え、Ｐ
１vir ファージ液（１×１０10ｐｆｕ／ｍｌ）を０．２
ｍｌ加えて、培養液が透明になるまで振盪を続けた。培
養液が透明になったところでクロロホルムを３滴加え、
３０００ｒｐｍで１０分の遠心分離にかけ、上清を回収
した。一方、ＭＣ４１００λ８０７株をＬ培地で３７℃
で一晩培養した培養液を３０００ｒｐｍで１０分の遠心
分離にかけ、菌体を回収し、１ｍｌの０．１Ｍ ＭｇＣ
ｌ2 、０．００５Ｍ ＣａＣｌ2 に懸濁した。この菌液
０．１ｍｌと先に調製したＰ１vir ファージ液０．１ｍ
ｌを混合し、室温で１５分静置した。続いて、０．２ｍ
ｌの１Ｍ Ｎａ−Citrate を加え、３０００ｒｐｍで１
０分の遠心分離にかけ、菌体を回収し、再び、０．１ｍ
ｌの１Ｍ Ｎａ−Citrate に懸濁した。これを２０ｍｇ
／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬ培地のプレートに
塗布し、３７℃で培養することによってΔｃｌｐＰ::Ｃ
ｍが形質導入されたＭＣ４１００λ８０７株の変異株が
得られた。
【００３４】このようにして得られた変異株の中の一株
ＭＫＨ１０１１について、以下のようにしてＰＣＲを行
い、ｌｏｎ−５１０変異を同時に持つ株であることを確
かめた。変異株のコロニーを１０μｌのＴＥに懸濁し、
その１μｌを鋳型ＤＮＡとして、GeneＡｍｐキット（パ
ーキンエルマーアップライドバイオシステム社製）およ
びモデル９６００サーマルサイクラー（パーキンエルマ
ーアップライドバイオシステム社製）を用いてＰＣＲ反
応を行った。反応は９６℃１分、５５℃１分、７２℃３
分のサイクルを２５回行った。ＰＣＲ反応物をアガロー
スゲル電気泳動にかけ、反応生成物の大きさにより、ｌ
ｏｎ−５１０変異の有無を確かめた。ＰＣＲに用いたプ
ライマーＤＮＡの塩基配列は以下のとおりである。 プライマー３：5'CGCTGGATGCTATCGCTAAG プライマー４：5'AAGGGCAAGCCCGATCCGCC このようにして、変異遺伝子がＬｏｎおよびＣｌｐプロ
テアーゼ遺伝子である二重変異株を得ることができた。
ＭＫＨ１０１１について、以下のようにしてＰＣＲを行
い、ｌｏｎ−５１０変異を同時に持つ株であることを確
かめた。変異株のコロニーを１０μｌのＴＥに懸濁し、
その１μｌを鋳型ＤＮＡとして、GeneＡｍｐキット（パ
ーキンエルマーアップライドバイオシステム社製）およ
びモデル９６００サーマルサイクラー（パーキンエルマ
ーアップライドバイオシステム社製）を用いてＰＣＲ反
応を行った。反応は９６℃１分、５５℃１分、７２℃３
分のサイクルを２５回行った。ＰＣＲ反応物をアガロー
スゲル電気泳動にかけ、反応生成物の大きさにより、ｌ
ｏｎ−５１０変異の有無を確かめた。ＰＣＲに用いたプ
ライマーＤＮＡの塩基配列は以下のとおりである。 プライマー３：5'CGCTGGATGCTATCGCTAAG プライマー４：5'AAGGGCAAGCCCGATCCGCC このようにして、変異遺伝子がＬｏｎおよびＣｌｐプロ
テアーゼ遺伝子である二重変異株を得ることができた。
【００３５】実施例５ パルス−チェイス実験によるσ32の安定性の検討 （１） 各菌株（実施例４で得られたＬｏｎおよびＣｌ
ｐプロテアーゼ遺伝子の二重変異株、Ｌｏｎプロテアー
ゼ遺伝子の単独変異株、Ｃｌｐプロテアーゼ遺伝子の単
独変異株、野生株）を３７℃、Ｍ９培地（６ｇ／Ｌ Ｎ
ａ2 ＨＰＯ4 、３ｇ／Ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 、０．５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ ＮＨ4 Ｃｌ、０．１ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 、１ｍＭ ＭｇＳＯ4 ）で対数増殖期まで培養
し、１００μＣｉ／ｍｌで35Ｓ−Ｍｅｔ（４５．０ＴＢ
ｑ／ｍｍｏｌ）を添加した後１分後に１００μｌをサン
プリングして１１０μｌの５０％ＴＣＡ溶液に加えた。
これをチェイス開始として図１に示された時間ごとに同
量をサンプリングして同様に処理した。これらを１００
００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけ、沈澱をアセト
ンで洗浄し、乾燥した後、５０μｌの１％ＳＤＳ、１０
ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に溶解し、５分間煮沸し
た。さらに１００００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にか
け、上清２５μｌに対し１ｍｌの２％ＴＸ１００、トリ
ス緩衝生理食塩水を加え、抗σ32抗血清を１μｌ添加し
て、４℃で一晩静置した。
ｐプロテアーゼ遺伝子の二重変異株、Ｌｏｎプロテアー
ゼ遺伝子の単独変異株、Ｃｌｐプロテアーゼ遺伝子の単
独変異株、野生株）を３７℃、Ｍ９培地（６ｇ／Ｌ Ｎ
ａ2 ＨＰＯ4 、３ｇ／Ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 、０．５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ ＮＨ4 Ｃｌ、０．１ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 、１ｍＭ ＭｇＳＯ4 ）で対数増殖期まで培養
し、１００μＣｉ／ｍｌで35Ｓ−Ｍｅｔ（４５．０ＴＢ
ｑ／ｍｍｏｌ）を添加した後１分後に１００μｌをサン
プリングして１１０μｌの５０％ＴＣＡ溶液に加えた。
これをチェイス開始として図１に示された時間ごとに同
量をサンプリングして同様に処理した。これらを１００
００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけ、沈澱をアセト
ンで洗浄し、乾燥した後、５０μｌの１％ＳＤＳ、１０
ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に溶解し、５分間煮沸し
た。さらに１００００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にか
け、上清２５μｌに対し１ｍｌの２％ＴＸ１００、トリ
ス緩衝生理食塩水を加え、抗σ32抗血清を１μｌ添加し
て、４℃で一晩静置した。
【００３６】翌日、ＩｇＧＳＯＲＢ（The Enzyme Cente
r 社製) を１０μｌ添加し、さらに４℃で１時間静置し
た後、１００００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけ、
沈澱を１ｍｌの２％ＴＸ１００、トリス緩衝生理食塩水
で３回、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で１回洗浄
し、２０μｌの０．１％ＢＰＢ、１０％グリセロール、
２％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ６．８）に溶解した。５分間煮沸した後、１００
００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけ、上清をＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルを乾燥
した後、富士フィルムＢＡＳ２０００用ＩＰに１６時間
露光し、ＢＡＳ２０００を用いてσ32に相当するバンド
の放射能を測定することにより、σ32の量の時間経過に
対する変化を測定した。
r 社製) を１０μｌ添加し、さらに４℃で１時間静置し
た後、１００００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけ、
沈澱を１ｍｌの２％ＴＸ１００、トリス緩衝生理食塩水
で３回、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で１回洗浄
し、２０μｌの０．１％ＢＰＢ、１０％グリセロール、
２％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ６．８）に溶解した。５分間煮沸した後、１００
００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけ、上清をＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルを乾燥
した後、富士フィルムＢＡＳ２０００用ＩＰに１６時間
露光し、ＢＡＳ２０００を用いてσ32に相当するバンド
の放射能を測定することにより、σ32の量の時間経過に
対する変化を測定した。
【００３７】この実験の結果を図１に示す。図１から明
らかなように、Ｌｏｎプロテアーゼ遺伝子、Ｃｌｐプロ
テアーゼ遺伝子の単独の変異では安定化はほとんどみら
れないのに対し、Ｌｏｎプロテアーゼ遺伝子およびＣｌ
ｐプロテアーゼ遺伝子の二重変異株は、野生株に比べて
約５倍のσ32の安定性の増大（半減期の延長）を示し
た。
らかなように、Ｌｏｎプロテアーゼ遺伝子、Ｃｌｐプロ
テアーゼ遺伝子の単独の変異では安定化はほとんどみら
れないのに対し、Ｌｏｎプロテアーゼ遺伝子およびＣｌ
ｐプロテアーゼ遺伝子の二重変異株は、野生株に比べて
約５倍のσ32の安定性の増大（半減期の延長）を示し
た。
【００３８】（２） 実施例３で得られたｐｌｓＸ遺伝
子の変異株と野生株を用いて、前記（１）と同様にして
パルス−チェイス実験を行った。その結果を図２に示す
が、ｐｌｓＸ遺伝子の変異株は、野生株に比べて約３倍
のσ32の安定性の増大（半減期の延長）を示した。
子の変異株と野生株を用いて、前記（１）と同様にして
パルス−チェイス実験を行った。その結果を図２に示す
が、ｐｌｓＸ遺伝子の変異株は、野生株に比べて約３倍
のσ32の安定性の増大（半減期の延長）を示した。
【００３９】
【発明の効果】大腸菌内で発現された不安定蛋白質を安
定に保持する変異遺伝子を有する本発明の大腸菌変異株
は、発現した外来性有用蛋白質の菌体内分解を抑えるこ
とができるため、汎用性の高い蛋白質発現系宿主を提供
することができる。
定に保持する変異遺伝子を有する本発明の大腸菌変異株
は、発現した外来性有用蛋白質の菌体内分解を抑えるこ
とができるため、汎用性の高い蛋白質発現系宿主を提供
することができる。
【図１】図１は、Ｌｏｎプロテアーゼ遺伝子およびＣｌ
ｐプロテアーゼ遺伝子の二重変異株についてのパルス−
チェイス実験の結果を示す図である。
ｐプロテアーゼ遺伝子の二重変異株についてのパルス−
チェイス実験の結果を示す図である。
【図２】図２は、ｐｌｓＸ遺伝子の変異株についてのパ
ルス−チェイス実験の結果を示す図である。
ルス−チェイス実験の結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19 1:21）
Claims (10)
- 【請求項１】 大腸菌内で発現された不安定蛋白質を安
定に保持する変異遺伝子を有することを特徴とする大腸
菌変異株。 - 【請求項２】 熱ショック転写因子σ32が安定化されて
いる請求項１記載の変異株。 - 【請求項３】 不安定蛋白質が外来蛋白質である請求項
１記載の変異株。 - 【請求項４】 変異遺伝子がｐｌｓＸ遺伝子に変異を生
じたものである請求項１〜３いずれか記載の変異株。 - 【請求項５】 請求項１〜４いずれか記載の大腸菌変異
株を用いることを特徴とする、大腸菌内での不安定蛋白
質の安定化方法。 - 【請求項６】 ＬｏｎおよびＣｌｐプロテアーゼ遺伝子
に共に変異を有する大腸菌変異株を用いることを特徴と
する、大腸菌内での不安定蛋白質の安定化方法。 - 【請求項７】 不安定蛋白質が大腸菌由来の蛋白質であ
る請求項５または請求項６記載の安定化方法。 - 【請求項８】 不安定蛋白質が外来蛋白質である請求項
５または請求項６記載の安定化方法。 - 【請求項９】 請求項１〜４いずれか記載の大腸菌変異
株を使用することを特徴とする外来蛋白質の製造方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜４いずれか記載の大腸菌変
異株を、外来遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換
させたことを特徴とする形質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6315626A JPH08140671A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | 大腸菌変異株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6315626A JPH08140671A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | 大腸菌変異株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08140671A true JPH08140671A (ja) | 1996-06-04 |
Family
ID=18067633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6315626A Pending JPH08140671A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | 大腸菌変異株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08140671A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0866132A3 (en) * | 1997-03-19 | 1999-12-08 | Hsp Research Institute, Inc. | Escherichia coli protease mutant as host cell |
| US6159708A (en) * | 1997-06-20 | 2000-12-12 | Hsp Research Institute, Inc. | Chaperone expression plasmids |
| US7494801B2 (en) | 2002-12-12 | 2009-02-24 | Showa Denko K.K. | Method of selecting Escherichia coli strain which highly expresses exogenous genes, Escherichia coli mutant strains selected by this method and process for producing enzymes and compounds using the same |
-
1994
- 1994-11-25 JP JP6315626A patent/JPH08140671A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0866132A3 (en) * | 1997-03-19 | 1999-12-08 | Hsp Research Institute, Inc. | Escherichia coli protease mutant as host cell |
| US6159708A (en) * | 1997-06-20 | 2000-12-12 | Hsp Research Institute, Inc. | Chaperone expression plasmids |
| US7494801B2 (en) | 2002-12-12 | 2009-02-24 | Showa Denko K.K. | Method of selecting Escherichia coli strain which highly expresses exogenous genes, Escherichia coli mutant strains selected by this method and process for producing enzymes and compounds using the same |
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