JPH08140694A - ハイブリドーマ - Google Patents
ハイブリドーマInfo
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- JPH08140694A JPH08140694A JP7118709A JP11870995A JPH08140694A JP H08140694 A JPH08140694 A JP H08140694A JP 7118709 A JP7118709 A JP 7118709A JP 11870995 A JP11870995 A JP 11870995A JP H08140694 A JPH08140694 A JP H08140694A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- monoclonal antibody
- hybridoma
- peptide
- schistosoma mansoni
- Prior art date
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0003—Invertebrate antigens
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】マンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質に、ドデシ
ル硫酸ナトリウムを有するｐＨ６．８のトリス−ＨＣｌ
バファー中でプロテアーゼＶ８を作用させ、２−メルカ
プトエタノールとドデシル硫酸ナトリウムとの混合物を
添加して蛋白質の分解反応を停止させ、次いで１００℃
で短時間沸騰させる制御された蛋白質分解によりマンソ
ン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質から単離され、分子量８Ｋ
Ｄであって、ＩｇＧ２ａアイソタイプ（Ｗ ２ ＡＤ
１２）の抗２８ＫＤモノクローナル抗体により認識され
るペプチドフラグメントを認識するアイソタイプＩｇＧ
２ａのモノクローナル抗体を生成し、１９８６年５月９
日付で第Ｉ−５５３号としてＣＮＣＭに寄託されたハイ
ブリドーマＷ２ ＡＤ １２。 【効果】 本発明のハイブリドーマＷ２ＡＤ１２が産生
するＩｇ２ａのモノクローナル抗体により、２８ＫＤ抗
原の分解生成物中の８ＫＤフラグメントを認識すること
ができる。
ル硫酸ナトリウムを有するｐＨ６．８のトリス−ＨＣｌ
バファー中でプロテアーゼＶ８を作用させ、２−メルカ
プトエタノールとドデシル硫酸ナトリウムとの混合物を
添加して蛋白質の分解反応を停止させ、次いで１００℃
で短時間沸騰させる制御された蛋白質分解によりマンソ
ン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質から単離され、分子量８Ｋ
Ｄであって、ＩｇＧ２ａアイソタイプ（Ｗ ２ ＡＤ
１２）の抗２８ＫＤモノクローナル抗体により認識され
るペプチドフラグメントを認識するアイソタイプＩｇＧ
２ａのモノクローナル抗体を生成し、１９８６年５月９
日付で第Ｉ−５５３号としてＣＮＣＭに寄託されたハイ
ブリドーマＷ２ ＡＤ １２。 【効果】 本発明のハイブリドーマＷ２ＡＤ１２が産生
するＩｇ２ａのモノクローナル抗体により、２８ＫＤ抗
原の分解生成物中の８ＫＤフラグメントを認識すること
ができる。
Description
【０００１】本発明は、１又は２以上のエピトープを有
する、マンソン住血吸虫（Ｓ.mansoni）の２８ＫＤ蛋白
質から単離されるペプチド及びその単離方法、並びにこ
の様にして単離されたペプチド抗原フラクションを認識
するためのモノクローナル抗体及び該ペプチドを単独で
又は他の適切な物質とともに含有してなり、中和抗体合
成を惹起する治療組成物に関する。
する、マンソン住血吸虫（Ｓ.mansoni）の２８ＫＤ蛋白
質から単離されるペプチド及びその単離方法、並びにこ
の様にして単離されたペプチド抗原フラクションを認識
するためのモノクローナル抗体及び該ペプチドを単独で
又は他の適切な物質とともに含有してなり、中和抗体合
成を惹起する治療組成物に関する。
【０００２】バルール等（Ｂalloul et al. ）は、モレ
キュラー アンド バイオケミカルパラシトロジー〔Ｍ
olecular and ＢiochemicalＰarasitoligy,１７（１９
８５）p.１０５〜１１４〕において、マンソン住血吸虫
の全ＲＮＡの試験管内翻訳生成物を構成する、分子量２
８ＫＤ、等電点６．３〜６．８のポリペプチドで構成さ
れる抗体の試験管内での合成を記述している。
キュラー アンド バイオケミカルパラシトロジー〔Ｍ
olecular and ＢiochemicalＰarasitoligy,１７（１９
８５）p.１０５〜１１４〕において、マンソン住血吸虫
の全ＲＮＡの試験管内翻訳生成物を構成する、分子量２
８ＫＤ、等電点６．３〜６．８のポリペプチドで構成さ
れる抗体の試験管内での合成を記述している。
【０００３】上記の著者は、２８ＫＤのポリペプチドを
単離し、抗原特性を発揮する原因となる一個又は複数個
のペプチド性エピトープを同定することを目的として、
研究を行なっている。
単離し、抗原特性を発揮する原因となる一個又は複数個
のペプチド性エピトープを同定することを目的として、
研究を行なっている。
【０００４】ＳＤＳを含有するバファー中でプロテアー
ゼにより蛋白質を部分消化することにより、ＳＤＳゲル
から単離される、蛋白質を構成するペプチドを分析する
ことは、公知である。この方法により、安定な部分消化
生成物が得られ、この生成物は、１５％ＳＤＳアクリル
アミドゲル上で夫々分離することが可能な程度に十分大
きい分子量を有する多数のペプチドからなっている。
〔クリーブランド等、ザジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー、２５２、ｐ１１０２〜１１０６、
（１９７７）〕。
ゼにより蛋白質を部分消化することにより、ＳＤＳゲル
から単離される、蛋白質を構成するペプチドを分析する
ことは、公知である。この方法により、安定な部分消化
生成物が得られ、この生成物は、１５％ＳＤＳアクリル
アミドゲル上で夫々分離することが可能な程度に十分大
きい分子量を有する多数のペプチドからなっている。
〔クリーブランド等、ザジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー、２５２、ｐ１１０２〜１１０６、
（１９７７）〕。
【０００５】本発明者は、マンソン住血吸虫の２８ＫＤ
蛋白質から、２８ＫＤ蛋白質により示される抗住血吸虫
抗原活性を発揮する１個又は２個以上のペプチドを単離
することを試みて、公知文献に記載された蛋白質加水分
解によるペプチドフラグメント単離技術をこの目的に使
用した。
蛋白質から、２８ＫＤ蛋白質により示される抗住血吸虫
抗原活性を発揮する１個又は２個以上のペプチドを単離
することを試みて、公知文献に記載された蛋白質加水分
解によるペプチドフラグメント単離技術をこの目的に使
用した。
【０００６】本発明は、マンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋
白質に、ドデシル硫酸ナトリウムを有するｐＨ６．８の
トリス−ＨＣｌバファー中でプロテアーゼＶ８を作用さ
せ、２−メルカプトエタノールとドデシル硫酸ナトリウ
ムとの混合物を添加して蛋白質の分解反応を停止させ、
次いで１００℃で短時間沸騰させる制御された蛋白質分
解によりマンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質から単離さ
れ、分子量８ＫＤであって、ＩｇＧ２ａアイソタイプ
（Ｗ ２ ＡＤ １２）の抗２８ＫＤモノクローナル抗
体により認識されるペプチドフラグメントを認識するア
イソタイプＩｇＧ２ａのモノクローナル抗体を生成し、
１９８６年５月９日付で第Ｉ−５５３号としてＣＮＣＭ
に寄託されたハイブリドーマＷ２ ＡＤ １２である。
白質に、ドデシル硫酸ナトリウムを有するｐＨ６．８の
トリス−ＨＣｌバファー中でプロテアーゼＶ８を作用さ
せ、２−メルカプトエタノールとドデシル硫酸ナトリウ
ムとの混合物を添加して蛋白質の分解反応を停止させ、
次いで１００℃で短時間沸騰させる制御された蛋白質分
解によりマンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質から単離さ
れ、分子量８ＫＤであって、ＩｇＧ２ａアイソタイプ
（Ｗ ２ ＡＤ １２）の抗２８ＫＤモノクローナル抗
体により認識されるペプチドフラグメントを認識するア
イソタイプＩｇＧ２ａのモノクローナル抗体を生成し、
１９８６年５月９日付で第Ｉ−５５３号としてＣＮＣＭ
に寄託されたハイブリドーマＷ２ ＡＤ １２である。
【０００７】本発明の好ましい実施態様の一例において
は、Ｖ８プロテアーゼによる２８ＫＤ蛋白質の酵素分解
は、３０℃で３０分間行なわれる。
は、Ｖ８プロテアーゼによる２８ＫＤ蛋白質の酵素分解
は、３０℃で３０分間行なわれる。
【０００８】本発明の他の好ましい実施態様では、蛋白
質加水分解反応を停止される為に使用される混合物は、
１０％ＳＤＳ３μｌ当り２−メルカプトエタノール１μ
ｌの割合からなっている。
質加水分解反応を停止される為に使用される混合物は、
１０％ＳＤＳ３μｌ当り２−メルカプトエタノール１μ
ｌの割合からなっている。
【０００９】本発明の更に他の好ましい実施態様では、
２８ＫＤ蛋白質を溶解させるトリス−ＨＣｌバファー
は、１００〜１２５ｍＭのバファーでＳＤＳ０．０８〜
０．１２％を含む。
２８ＫＤ蛋白質を溶解させるトリス−ＨＣｌバファー
は、１００〜１２５ｍＭのバファーでＳＤＳ０．０８〜
０．１２％を含む。
【００１０】本発明の更に他の好ましい実施態様では、
ラット、ウサギ等の抗２８ＫＤポリクローナル血清を使
って行なわれるウェスターン ブロッティングによりな
される、蛋白質加水分解による単離ペプチドの抗原活性
のチェックは、ラット、ウサギ、マウス等の免疫グロブ
リンに対するペルオキシダーゼによりラベルされた抗体
により、６ＫＤのペプチドエピトープを明らかにしてい
る。
ラット、ウサギ等の抗２８ＫＤポリクローナル血清を使
って行なわれるウェスターン ブロッティングによりな
される、蛋白質加水分解による単離ペプチドの抗原活性
のチェックは、ラット、ウサギ、マウス等の免疫グロブ
リンに対するペルオキシダーゼによりラベルされた抗体
により、６ＫＤのペプチドエピトープを明らかにしてい
る。
【００１１】本発明の更に他の好ましい実施態様では、
抗２８ＫＤモノクローナル抗体を使用して行なわれるウ
ェスターン ブロッティングによりなされる、蛋白質加
水分解による単離ペプチドの抗原活性のチェックは、８
ＫＤのペプチドエピトープを明らかにしている。
抗２８ＫＤモノクローナル抗体を使用して行なわれるウ
ェスターン ブロッティングによりなされる、蛋白質加
水分解による単離ペプチドの抗原活性のチェックは、８
ＫＤのペプチドエピトープを明らかにしている。
【００１２】本発明は、更に、２８ＫＤ抗原を認識する
ＩｇＭアイソタイプモノクローナル抗体を生成するハイ
ブリドーマ Ｍ ５ ＢＤ ９を提供する。
ＩｇＭアイソタイプモノクローナル抗体を生成するハイ
ブリドーマ Ｍ ５ ＢＤ ９を提供する。
【００１３】本発明は、更に、マンソン住血吸虫の２８
ＫＤポリペプチドの制御された加水分解により単離され
る８ＫＤペプチドフラグメントに対応するストリップを
認識するＩｇＧ２ａアイソタイプのモノクローナル抗体
を生成するハイブリドーマＷ２ ＡＤ １２（１９８６
年５月９日付でNo. Ｉ−５５３としてＣＮＣＭに寄託）
を提供する。
ＫＤポリペプチドの制御された加水分解により単離され
る８ＫＤペプチドフラグメントに対応するストリップを
認識するＩｇＧ２ａアイソタイプのモノクローナル抗体
を生成するハイブリドーマＷ２ ＡＤ １２（１９８６
年５月９日付でNo. Ｉ−５５３としてＣＮＣＭに寄託）
を提供する。
【００１４】本発明によれば、ハイブリドーマ Ｍ ５
ＢＤ ９及びＷ ２ ＡＤ １２は、下記の様にして
得られる：マンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質群に対す
るモノクローナル抗体は、ラットＬＯＵ ＩＲ ９８３
Ｆの骨髄種細胞株〔バザン等、１９８０Ａnn Ｉmmuno
l. （パスツール研究所）１３１Ｄ：３５９〕と完全フ
ロイントアジュバントの存在下に１５日の間隔でマンソ
ン住血吸虫の蛋白質の２８ＫＤ群を２５μｇずつ２回合
計５０μｇを皮下注射して免疫化したＬＯＵラットの脾
臓培養細胞とを使用して、ラットの同種細胞のかけ合せ
ハイブリダイゼーションにより得た。
ＢＤ ９及びＷ ２ ＡＤ １２は、下記の様にして
得られる：マンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質群に対す
るモノクローナル抗体は、ラットＬＯＵ ＩＲ ９８３
Ｆの骨髄種細胞株〔バザン等、１９８０Ａnn Ｉmmuno
l. （パスツール研究所）１３１Ｄ：３５９〕と完全フ
ロイントアジュバントの存在下に１５日の間隔でマンソ
ン住血吸虫の蛋白質の２８ＫＤ群を２５μｇずつ２回合
計５０μｇを皮下注射して免疫化したＬＯＵラットの脾
臓培養細胞とを使用して、ラットの同種細胞のかけ合せ
ハイブリダイゼーションにより得た。
【００１５】融合後、プレート上でのラジオイムノロジ
カルテストにより、抗２８ＫＤ抗体生成細胞を選択し
た。成虫のホモジェネートをポリビニルプレートに固定
し、次いでハイブリット培養物の上澄液中に存在する抗
体と接触させた。抗原−抗体リンケージは、ヨード１２
５によりラベルされた、ラットのＩｇＧｓに対する第二
の抗体の添加により、明確にされた。このテストでの陽
性細胞は、限界希釈培養法により、クローン化された。
カルテストにより、抗２８ＫＤ抗体生成細胞を選択し
た。成虫のホモジェネートをポリビニルプレートに固定
し、次いでハイブリット培養物の上澄液中に存在する抗
体と接触させた。抗原−抗体リンケージは、ヨード１２
５によりラベルされた、ラットのＩｇＧｓに対する第二
の抗体の添加により、明確にされた。このテストでの陽
性細胞は、限界希釈培養法により、クローン化された。
【００１６】上記以外の本発明の構成は、以下の記載か
ら明らかとなろう。
ら明らかとなろう。
【００１７】本発明の理解を容易ならしめるために、本
発明方法を行なう実施例及び本発明によるペプチドの抗
原活性の特性を示す実施例を示す。
発明方法を行なう実施例及び本発明によるペプチドの抗
原活性の特性を示す実施例を示す。
【００１８】以下の実施例は、単に本発明の実例を示す
ためのものであって、本発明を何ら限定するものではな
い。
ためのものであって、本発明を何ら限定するものではな
い。
【００１９】参考例１マンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質から単離されたペプ
チドの調製 第１段階：マンソン住血吸虫の２８ＫＤの抗原の調製 ゴールデンハムスターの門脈に灌流することにより集め
られた成虫マンソン住血吸虫（プエルトリコ系統）を、
ポッター−エルベーセム ホモジナイザー内のＰＢＳバ
ファー中でホモジナイズし、ホモジナイズ生成物を５０
００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
チドの調製 第１段階：マンソン住血吸虫の２８ＫＤの抗原の調製 ゴールデンハムスターの門脈に灌流することにより集め
られた成虫マンソン住血吸虫（プエルトリコ系統）を、
ポッター−エルベーセム ホモジナイザー内のＰＢＳバ
ファー中でホモジナイズし、ホモジナイズ生成物を５０
００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
【００２０】抗原約２mgを、レムリによるバッチ方式の
バファーシステム〔ネイチャー（１９７０）、２２７、
p.６８０〜６８５にレムリにより記述されている〕を使
用して、プレート上の１３％ポリアクリルアミドゲル上
で分画した。
バファーシステム〔ネイチャー（１９７０）、２２７、
p.６８０〜６８５にレムリにより記述されている〕を使
用して、プレート上の１３％ポリアクリルアミドゲル上
で分画した。
【００２１】電気泳動後、ゲルをクーマシー ブリリア
ント ブルーにより染色した。染色ストリップを外科用
メスで切断し、支持ゲルの注型により得られた溶出ゲル
に移行させた。
ント ブルーにより染色した。染色ストリップを外科用
メスで切断し、支持ゲルの注型により得られた溶出ゲル
に移行させた。
【００２２】溶出は、４０〜６０Ｖで６〜１２時間行な
った。溶出速度は、分離したゲルのパーセンテージ及び
溶出した蛋白質の分子サイズの関数である。サンプルの
泳動は、２Ｍ ＮａＣｌ−グリセロール層の界面で止め
られた。
った。溶出速度は、分離したゲルのパーセンテージ及び
溶出した蛋白質の分子サイズの関数である。サンプルの
泳動は、２Ｍ ＮａＣｌ−グリセロール層の界面で止め
られた。
【００２３】全てのペプチドがグリセロール層中へ溶出
せしめられた時点で、電気泳動を停止し、各サンプルを
パスツールピペットにより取り出した。次いで、各サン
プルは、凍結乾燥により濃縮されるに先立って、ＳＤＳ
と塩類とを除去するために、水により透析された。分画
された蛋白質は、次いで、プレート中１３％ポリアクリ
ルアミドゲル上で再分析された。
せしめられた時点で、電気泳動を停止し、各サンプルを
パスツールピペットにより取り出した。次いで、各サン
プルは、凍結乾燥により濃縮されるに先立って、ＳＤＳ
と塩類とを除去するために、水により透析された。分画
された蛋白質は、次いで、プレート中１３％ポリアクリ
ルアミドゲル上で再分析された。
【００２４】上述の分画方法により得られた分子量２８
ＫＤの蛋白質は、抗体反応を惹起させること、及びその
抗血清は、成虫のＲＮＡ及びマンソン住血吸虫のシスト
ソームラ（Ｓchistosomulas ）のＲＮＡの双方の試験管
内翻訳生成物中の対応する２８ＫＤ抗原を免疫溶出させ
る（immuno-precipitate）ことを特徴とする。この蛋白
質は、下記の第２段階による処理に使用される。
ＫＤの蛋白質は、抗体反応を惹起させること、及びその
抗血清は、成虫のＲＮＡ及びマンソン住血吸虫のシスト
ソームラ（Ｓchistosomulas ）のＲＮＡの双方の試験管
内翻訳生成物中の対応する２８ＫＤ抗原を免疫溶出させ
る（immuno-precipitate）ことを特徴とする。この蛋白
質は、下記の第２段階による処理に使用される。
【００２５】第２段階：マンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋
白質の加水分解によるペプチドの単離 ２８ＫＤ蛋白質１０μｇをＳＤＳ０．１％を含有する１
２５ｍＭトリス−ＨＣｌバファー（ｐＨ６．８）３０μ
ｌに溶解した。
白質の加水分解によるペプチドの単離 ２８ＫＤ蛋白質１０μｇをＳＤＳ０．１％を含有する１
２５ｍＭトリス−ＨＣｌバファー（ｐＨ６．８）３０μ
ｌに溶解した。
【００２６】プロテアーゼＶ８を１μｇ加え、２８ＫＤ
の抗原の酵素分解を水浴上３７℃で３０分間行なった。
の抗原の酵素分解を水浴上３７℃で３０分間行なった。
【００２７】２−メルカプトエタノール１μｌ及び１０
％ＳＤＳ３μｌを添加して、反応を停止させた。全体を
水浴上１００℃に昇温させて６分間保持した。
％ＳＤＳ３μｌを添加して、反応を停止させた。全体を
水浴上１００℃に昇温させて６分間保持した。
【００２８】抗原特性を決定したペプチドからなるサン
プルを集めた。
プルを集めた。
【００２９】実施例１参考例１で得たペプチドの抗原的応答の分析 参考例１で得たペプチド１０μｇを２０％ポリアクリル
アミドゲル上に析出させた。
アミドゲル上に析出させた。
【００３０】この様にして分画されたペプチドをタウビ
ン等（１９８４、ジャーナル オブイミュノロジカル
メソッド ７２、p.４７１）の方法に従って、ニトロセ
ルロース シート上に移した。
ン等（１９８４、ジャーナル オブイミュノロジカル
メソッド ７２、p.４７１）の方法に従って、ニトロセ
ルロース シート上に移した。
【００３１】ニトロセルロース シートは、先ず、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ及び抗体５０μｌを含むリン酸一ナト
リウム及びリン酸二ナトリウム１０ｍＭ（ｐＨ７．２）
により緩衝された３％ＢＳＡ溶液により飽和せしめられ
た。使用した抗体は、ラット又はウサギのポリクローナ
ル血清の抗体であるか、或いはモノクローナル腹水抗体
であるか、或いはハイブリドーマ、特にハイブリドーマ
Ｗ ２ ＡＤ １２、Ｍ ５ ＢＤ ９から得られた
抗体であった。
１５Ｍ ＮａＣｌ及び抗体５０μｌを含むリン酸一ナト
リウム及びリン酸二ナトリウム１０ｍＭ（ｐＨ７．２）
により緩衝された３％ＢＳＡ溶液により飽和せしめられ
た。使用した抗体は、ラット又はウサギのポリクローナ
ル血清の抗体であるか、或いはモノクローナル腹水抗体
であるか、或いはハイブリドーマ、特にハイブリドーマ
Ｗ ２ ＡＤ １２、Ｍ ５ ＢＤ ９から得られた
抗体であった。
【００３２】抗原と抗体とを室温で一夜接触させてお
き、ウェスターン ブロットを得た後、リン酸塩バファ
ー中３０分間に３度洗浄した。
き、ウェスターン ブロットを得た後、リン酸塩バファ
ー中３０分間に３度洗浄した。
【００３３】次いで、ウサギ免疫グロブリン（ポリクロ
ーナル抗体の場合）又はラット免疫グロブリン（モノク
ローナル抗体の場合）に対して働くペルオキシダーゼ
（パスツール製）でラベルされた抗体を加え、“ブロッ
ト”とともに２時間インキュベートした。更に３回洗浄
を行ない、冷メタノール２０％、４−クロロ−１−ナフ
トール３０mg、リン酸バファー１００ｍｌ当りＨ2 Ｏ2
０．１％、０．１５ＮＮａＣｌを含む溶液を添加するこ
とにより、免疫コンプレックスの存在を明らかにした。
ーナル抗体の場合）又はラット免疫グロブリン（モノク
ローナル抗体の場合）に対して働くペルオキシダーゼ
（パスツール製）でラベルされた抗体を加え、“ブロッ
ト”とともに２時間インキュベートした。更に３回洗浄
を行ない、冷メタノール２０％、４−クロロ−１−ナフ
トール３０mg、リン酸バファー１００ｍｌ当りＨ2 Ｏ2
０．１％、０．１５ＮＮａＣｌを含む溶液を添加するこ
とにより、免疫コンプレックスの存在を明らかにした。
【００３４】添附した図１にウェスターン ブロッティ
ングを示す。
ングを示す。
【００３５】図１において、ブロック１の下部には、本
発明による蛋白質分解により単離されたペプチドが示さ
れ、その上部には、２８ＫＤ蛋白質が示されている。ブ
ロック２は、健康なウサギの血清により得られた“ブロ
ット”を示す。ブロック３は、ハイブリドーマ Ｗ ２
ＡＤ １２に由来するモノクローナル抗体で得られた
“ブロット”を示す。ブロック４は、ポリクローナル
ウサギ抗２８ＫＤ血清で得られた“ブロット”を示す。
発明による蛋白質分解により単離されたペプチドが示さ
れ、その上部には、２８ＫＤ蛋白質が示されている。ブ
ロック２は、健康なウサギの血清により得られた“ブロ
ット”を示す。ブロック３は、ハイブリドーマ Ｗ ２
ＡＤ １２に由来するモノクローナル抗体で得られた
“ブロット”を示す。ブロック４は、ポリクローナル
ウサギ抗２８ＫＤ血清で得られた“ブロット”を示す。
【００３６】このウェスターン ブロッティングは、感
染後のマンソン住血吸虫幼虫に対して細胞毒性を有する
モノクローナル抗体Ｗ ２ ＡＤ １２は、２８ＫＤの
蛋白質に由来する８ＫＤフラグメントを認識したことを
示している。
染後のマンソン住血吸虫幼虫に対して細胞毒性を有する
モノクローナル抗体Ｗ ２ ＡＤ １２は、２８ＫＤの
蛋白質に由来する８ＫＤフラグメントを認識したことを
示している。
【００３７】アナフィラキシー的に抗体を認識すること
は、マンソン住血吸虫に対する保護的応答を惹起する点
において、このペプチドの重要性を示唆している。
は、マンソン住血吸虫に対する保護的応答を惹起する点
において、このペプチドの重要性を示唆している。
【００３８】ウサギ血清により認識される６ＫＤフラグ
メントに備えられたエピトープは、ラットのモノクロー
ナル抗体によっては認識されず、このことは、２８ＫＤ
抗原の特定の一又は他のエピトープの認識は、個々の種
に関して特異的であることを示している。
メントに備えられたエピトープは、ラットのモノクロー
ナル抗体によっては認識されず、このことは、２８ＫＤ
抗原の特定の一又は他のエピトープの認識は、個々の種
に関して特異的であることを示している。
【００３９】実施例２モノクローナル抗体を使用する本発明による抗原ペプチ
ドの認識のチェック Ａ ２８ＫＤ抗原の分解生成物中に制限寸法のペプチド
エピトープを探すことにより、特にハイブリドーマＷ
２ ＡＤ １２から得られたアイソタイプＩｇＧ２ａの
モノクローナル抗体により、８ＫＤフラグメントを認識
することが可能となった。
ドの認識のチェック Ａ ２８ＫＤ抗原の分解生成物中に制限寸法のペプチド
エピトープを探すことにより、特にハイブリドーマＷ
２ ＡＤ １２から得られたアイソタイプＩｇＧ２ａの
モノクローナル抗体により、８ＫＤフラグメントを認識
することが可能となった。
【００４０】好酸球増加症に関連して、試験管中でのこ
のモノクローナル抗体の細胞毒性的活性（下記表１に示
す）は、８ＫＤのこのペプチドが有する１個又はそれ以
上のエピトープの重要性を示している。
のモノクローナル抗体の細胞毒性的活性（下記表１に示
す）は、８ＫＤのこのペプチドが有する１個又はそれ以
上のエピトープの重要性を示している。
【００４１】
【表１】
【００４２】細胞毒性テストは、カプロン等〔Ｅur.
Ｊ. Ｉ mmunol.,８、１２７〜１３３、１９７８〕の方
法により行なった。
Ｊ. Ｉ mmunol.,８、１２７〜１３３、１９７８〕の方
法により行なった。
【００４３】又、表１中（ａ）及び（ｂ）は、以下のこ
とを示す： (a) ５６℃で１時間加熱した種々の血清（最終希釈度１
／１６）の存在下に、住血吸虫の幼虫を１８時間予備感
作した。
とを示す： (a) ５６℃で１時間加熱した種々の血清（最終希釈度１
／１６）の存在下に、住血吸虫の幼虫を１８時間予備感
作した。
【００４４】(b) 細胞毒性のパーセンテージ（平均±平
均からの標準偏差値）は、健康なラットからの腹膜腔細
胞の存在下（実効細胞／ターゲット比＝ ６０００／
１）に感作された住血吸虫の幼虫の培養４８時間後に測
定した。
均からの標準偏差値）は、健康なラットからの腹膜腔細
胞の存在下（実効細胞／ターゲット比＝ ６０００／
１）に感作された住血吸虫の幼虫の培養４８時間後に測
定した。
【００４５】抗２８ＫＤウサギ血清は、このペプチドが
有する１個又は２個以上のエピトープを認識しなかった
が、６ＫＤの他のペプチドは認識した。
有する１個又は２個以上のエピトープを認識しなかった
が、６ＫＤの他のペプチドは認識した。
【００４６】Ｗ ２ ＡＤ １２のモノクローナル抗体
は、２８ＫＤの抗原群の２個のペプチドを認識した。
は、２８ＫＤの抗原群の２個のペプチドを認識した。
【００４７】Ｂ ＩｇＭのモノクローナル抗体、即ちハ
イブリドーマＭ ５ ＢＤ ９から得られたアイソタイ
プは、２８ＫＤグループの２つの蛋白質の一方のみを認
識した。
イブリドーマＭ ５ ＢＤ ９から得られたアイソタイ
プは、２８ＫＤグループの２つの蛋白質の一方のみを認
識した。
【００４８】図２は、モノクローナル抗体Ｍ ５ ＢＤ
９及びＷ ２ ＡＤ １２並びに前述のポリクローナ
ルウサギ血清を使用して本発明方法により得た２８ＫＤ
の抗原群のウェスターン ブロティングの結果を示す。
９及びＷ ２ ＡＤ １２並びに前述のポリクローナ
ルウサギ血清を使用して本発明方法により得た２８ＫＤ
の抗原群のウェスターン ブロティングの結果を示す。
【図１】図１は、本発明の実施例１で得られたウェスタ
ーン ブロティングの結果を示す写真である。
ーン ブロティングの結果を示す写真である。
【図２】図２は、本発明の実施例２で得られたウェスタ
ーン ブロティングの結果を示す写真である。
ーン ブロティングの結果を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｑ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 595070279 アンスティトゥー ナショナル ド ラ サンテ エ ド ラ ルシェルシュ メデ ィカル フランス国 75654 パリ セデクス 13 リュド トルビアク 101 (72)発明者 ジャン マルク バルール フランス国 59000 リール リュ ボン ト ポレ51 (72)発明者 レイモンド ピアース フランス国 59113 スクラン リュ ド フランドル 23 (72)発明者 ジャン マリー グルジヒ フランス国 59700 マルカン バロイ ユ リュムーニエ １ (72)発明者 アンドレ カプロン フランス国 59133 ファルムパン リュ デュ カピテーヌ ジャスマン 58
Claims (1)
- 【請求項１】 マンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質に、
ドデシル硫酸ナトリウムを有するｐＨ６．８のトリス−
ＨＣｌバファー中でプロテアーゼＶ８を作用させ、２−
メルカプトエタノールとドデシル硫酸ナトリウムとの混
合物を添加して蛋白質の分解反応を停止させ、次いで１
００℃で短時間沸騰させる制御された蛋白質分解により
マンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質から単離され、分子
量８ＫＤであって、ＩｇＧ２ａアイソタイプ（Ｗ ２
ＡＤ １２）の抗２８ＫＤモノクローナル抗体により認
識されるペプチドフラグメントを認識するアイソタイプ
ＩｇＧ２ａのモノクローナル抗体を生成し、１９８６年
５月９日付で第Ｉ−５５３号としてＣＮＣＭに寄託され
たハイブリドーマＷ２ ＡＤ １２。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| FR8609663 | 1986-07-03 | ||
| FR8609663A FR2601037B1 (fr) | 1986-07-03 | 1986-07-03 | Peptide presentant des proprietes antigeniques isole de la proteine 28 kd de s. mansoni et son procede d'isolement, anticorps monoclonaux reconnaissant au moins un epitope dudit peptide et application de celui-ci dans l'induction de la synthese d'anticorps neutralisants |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62167665A Division JPS63258598A (ja) | 1986-07-03 | 1987-07-03 | ペプチドの単離方法、ペプチド及びワクチン組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08140694A true JPH08140694A (ja) | 1996-06-04 |
Family
ID=9337029
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62167665A Pending JPS63258598A (ja) | 1986-07-03 | 1987-07-03 | ペプチドの単離方法、ペプチド及びワクチン組成物 |
| JP7118709A Pending JPH08140694A (ja) | 1986-07-03 | 1995-05-17 | ハイブリドーマ |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62167665A Pending JPS63258598A (ja) | 1986-07-03 | 1987-07-03 | ペプチドの単離方法、ペプチド及びワクチン組成物 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (2) | JPS63258598A (ja) |
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| DE (1) | DE3785614T2 (ja) |
| DK (1) | DK340887A (ja) |
| ES (1) | ES2056834T3 (ja) |
| FR (1) | FR2601037B1 (ja) |
| PT (1) | PT85248B (ja) |
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| US20040006204A1 (en) | 2002-04-02 | 2004-01-08 | Miriam Tendler | Synthetic active peptide fragments |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2420706C3 (de) * | 1974-04-29 | 1979-11-22 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zum Herstellen von spezifischen Antigenen aus Schistosomen und jene enthaltendes Mittel |
| CH642682A5 (en) * | 1979-01-26 | 1984-04-30 | D Immunologie Et De Biolog Par | Peptide substance obtained from a trematode and its use as a medicinal product |
| US4396600A (en) * | 1980-12-18 | 1983-08-02 | Gus Gallucci | Adult schistosome worm-derived antigenic substance and method of obtaining same |
-
1986
- 1986-07-03 FR FR8609663A patent/FR2601037B1/fr not_active Expired
-
1987
- 1987-07-02 ES ES87401554T patent/ES2056834T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-02 EP EP87401554A patent/EP0251933B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-02 DK DK340887A patent/DK340887A/da not_active Application Discontinuation
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- 1987-07-02 DE DE8787401554T patent/DE3785614T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-07-03 JP JP62167665A patent/JPS63258598A/ja active Pending
- 1987-07-03 PT PT85248A patent/PT85248B/pt not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-05-17 JP JP7118709A patent/JPH08140694A/ja active Pending
Also Published As
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| DK340887A (da) | 1988-01-04 |
| DK340887D0 (da) | 1987-07-02 |
| JPS63258598A (ja) | 1988-10-26 |
| FR2601037B1 (fr) | 1988-10-21 |
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| FR2601037A1 (fr) | 1988-01-08 |
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| DE3785614D1 (de) | 1993-06-03 |
| ATE88639T1 (de) | 1993-05-15 |
| EP0251933A1 (fr) | 1988-01-07 |
| DE3785614T2 (de) | 1993-08-12 |
| PT85248A (fr) | 1987-08-01 |
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