JPH08149981A - Ｔ細胞α鎖による抗原特異的免疫制御の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗原特異的に免疫応答を調節する方法を提供
する。 【構成】 抗原を該抗原と特異的な有効量のＴＣＲα鎖
と接触させて、ＴＣＲα鎖が抗原特異的に免疫応答を調
節することからなる、抗原に対する免疫応答を調節する
方法。 【効果】 本発明のＴＣＲα鎖を使用することにより、
高度免疫または免疫不全症状を治療できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は１９９１年８月３０日出願の特許
出願番号Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０７／７５２，８２０の
一部継続出願である。

【０００２】

【産業上の利用分野】

１．発明の分野 本発明は、抗原特異的に免疫系を制御する方法に関す
る。興味のある抗原と結合することのできるＴ細胞レセ
プターα鎖は特定抗原への免疫応答を抑制または増強す
るようにデザインされたプロトコルに用いられる。本明
細書で記載される治療プロトコルはアレルギー、自己免
疫、移植拒絶および癌の治療に使用できる。

【０００３】

【従来の技術】

２．関連技術の記載 免疫学者らは免疫応答を制御するメカニズムを発見する
べく免疫系を長い間研究してきた。その結果、非特異的
に全体として免疫応答を抑制または増強する各種医薬ま
たはプロトコルが用いられてきた。しかしながら、この
型の制御は全免疫系に影響を及ぼすために満足のいくも
のではなかった。これは、特定抗原のみに対する免疫応
答の制御をもたらすような免疫系の特定成分の理解に基
づくものではないのである。例えば、アレルギーの治療
においては、個人の全免疫系を抑制することなく、特定
のアレルゲンへの免疫応答を選択的に抑制することが有
利となるであろう。可溶性Ｔ細胞レセプターα鎖が免疫
応答の抗原特異的媒介物であるという発見に部分的に基
づく本明細書に記載し、特許請求する発明は、特定抗原
への免疫応答を抑制または増強するためにＴ細胞レセプ
ターα鎖を使用する方法に関する。

【０００４】２．１．免疫応答の制御 外来抗原が個体に導入されると、Ｔ細胞およびＢ細胞と
してそれぞれ知られる機能的に異なるリンパ球集団によ
って仲介される細胞性免疫応答と体液性免疫応答の２つ
の主要要素からなる免疫応答が引き出される。Ｔ細胞は
免疫系において種々の他の細胞型を”ヘルプ”するか、
または、活性化するリンホカインを産生することによっ
て、抗原刺激に応答する。さらに、ある種のＴ細胞は細
胞障害性なエフェクター細胞となりうる。一方、Ｂ細胞
の応答は、主として抗原と直接結合する分泌産物である
抗体からなる。ヘルパーＴ細胞（Ｔ_H）は、その細胞表
面上にＣＤ４と呼ばれる糖タンパク質を発現することに
よって、細胞障害性Ｔ細胞やＢ細胞から区別できる。Ｃ
Ｄ４⁺ヘルパーＴ細胞が他の細胞型を制御するメカニズ
ムはまだ十分には説明されていないが、ＣＤ４⁺Ｔ細胞
集団におけるある種のサブセットの役割が研究されてき
た（Mosmann and Coffman, 1989, Ann. Rev.Immunol.
7:145-173）。タイプ１ヘルパー細胞（Ｔ_H1）は、活性
化されてインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびγ−
インターフェロンを産生し、一方タイプ２ヘルパー細胞
（Ｔ_H2）はＩＬ−４およびＩＬ−５を産生する。リンホ
カイン産生の特徴に基づくと、Ｔ_H1は他のＴ細胞の増殖
の促進に関与するように思われ、一方Ｔ_H2因子は特に、
Ｂ細胞の増殖、抗体合成、および抗体のクラススイッチ
を制御している。さらに、Ｔ_H1によって産生されるγ−
インターフェロンはＴ_H2の増殖と機能を阻害するので、
これら２つのＴ_H集団は相互に制御しているのかも知れ
ない。

【０００５】Ｂ細胞とＴ細胞応答はいずれも免疫抗原に
対するその精巧な特異性を顕著な特徴とするが、その抗
原認識のメカニズムは異なっている。抗体は固体表面上
または溶液中で抗原と直接結合するが、Ｔ細胞は抗原提
示細胞の表面などの固相上に存在する抗原と反応するの
みである。また、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）
でコードされるクラスＩまたはクラスII分子存在下で抗
原がＴ細胞に提示されなければならない。ＭＨＣは異な
る免疫機能をもつタンパク質をコードする一群の遺伝子
を言う。クラスＩの遺伝子産物はあらゆる細胞に見ら
れ、主な移植の拒絶反応の標的である。クラスIIの遺伝
子産物は、各種造血系の細胞上で主として発現され、免
疫応答中の細胞−細胞間の相互作用に関与する。クラス
IとクラスIIタンパク質はいずれも抗原提示細胞の表面
上にある抗原のレセプターとしても機能することが示さ
れた。Ｔ細胞と抗原との間の相互作用における他のレベ
ルの複雑さは、ＭＨＣのハプロタイプ（複合体中のすべ
ての対立遺伝子の組み合わせ）が、抗原提示細胞と応答
Ｔ細胞との間で同じ場合にのみ起こることである。した
がって、特定抗原に特異的なＴ細胞は、適合するＭＨＣ
を発現する細胞によって抗原が提示される場合にのみ応
答することになる。この現象はＭＨＣ−拘束として知ら
れている。

【０００６】１９７０年に、ガーションおよびコンドー
（Gershon and Kondo, 1970, Immunology 18:723）は、
Ｔ細胞が免疫応答の過程で負の影響も及ぼし得ることを
提唱した。この免疫制御の考えは当初疑問視されたが、
抗原が一定の免疫応答によって排除されて継続的な応答
がもはや必要でなくなった後の、免疫系の恒常性維持に
対する概念的な構成を提供したので、多くの免疫学者に
よって受け入れられるようになった。それ以降、抗原特
異的なサプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）が多くの実験系で報
告されてきた（Green et al., 1983, Ann. Rev. Immuno
l. 1:439-463;Dorf and Benacerraf, 1984, Ann. Rev.
Immunol. 2:127-158）。

【０００７】Ｔｓ作用のメカニズムを解明しようとする
試みの中で、Ｔ細胞培養上清中に多数の可溶性媒介物が
発見された。したがって、ＴｓはＴサプレッサー因子
（ＴｓＦ）の放出を介して機能し、次いでそのＴｓＦは
その他のＴ細胞やＢ細胞に作用することが推論された。
異なるＴｓサブセットとそのＴｓＦとの間の複合体相互
作用を明瞭にするために、実験データに基づいて精巧な
モデルが提唱された（Asherson et al., 1986, Ann. Re
v. Immunol. 4:37-68）。

【０００８】Ｔ細胞の機能的に異なるサブセットに対し
て特異的な細胞表面マーカーが同定されたので、Ｔｓお
よびそのＴｓＦに特徴的なマーカーの検索が試みられ
た。Ｔｓ表面の表現型の研究は最初、これらが細胞障害
性の可能性を有するＴ細胞によって共有されるマーカー
であるＣＤ８（Ｌｙｔ−２）を発現することを示した。
１９７６年になって、マウスでＴｓによって特異的に発
現される構造と反応すると思われる抗血清が報告された
（Murphy et al., 1976, J. Exp. Med. 144:699;Tada e
t al., 1976, J. Exp. Med. 144:713）。抗原をコード
する遺伝子のマッピング研究によって、これはマウスＭ
ＨＣ内のＩ−ＥαとＩ−Ｅβとの間のＩ領域に配置され
た。この遺伝子座はＩ−Ｊと呼ばれた。

【０００９】１９８０年代初期に、細胞性免疫の分野は
現象学から分子レベルの特性決定へと移っていった。こ
の移り変わりによって、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の
特性決定（下記セクション２．２参照）、各種リンホカ
インの同定、ならびにＭＨＣタンパク質の三次元構造の
解明などの多くの発見が得られた。しかしながら、分子
クローニングの技法をＴ細胞媒介性の抑制研究に応用す
ることは実を結ばなかった。例えば、ＴｓＦを均一にな
るまで生化学的に精製する試みは大部分成功しなかっ
た。マウスＭＨＣのI領域の遺伝子が単離され配列決定
されたとき、Ｉ−Ｊ遺伝子を説明するためにＩ−Ｅαと
Ｉ−Ｅβの間のＤＮＡでは十分でないと思われた。さら
に、ＴＣＲ β遺伝子の再配列のために多くの顔ぶれの
Ｔ細胞クローンとＴ細胞ハイブリドーマを試験したとこ
ろ、ヘルパーおよび細胞障害性Ｔ細胞のみがこのような
再配列を含んでおり、すべての試験したＴｓが陰性であ
ったが、これはＴｓが機能性レセプターを発現していな
いことを示している（Hedrick et al., 1985, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 82:531-535）。

【００１０】２．２．Ｔ細胞レセプターの構造と機能 抗原に対するＴおよびＢ細胞応答の特異性はこれらの細
胞によって発現される独特のレセプターの機能である。
Ｂ細胞がそのレセプターを抗体の形で分泌することが発
見されて、Ｂ細胞レセプターの研究は急速に進展した。
形質細胞腫は、元来モノクローナルである抗体産生細胞
の自然に発生する腫瘍である。これらの腫瘍は、抗体分
子の初期の精製ならびにその構造の特性決定に用いられ
た均質なタンパク質を絶えず提供してきた（Potter, 19
72, Physiol. Res. 52:631-710）。今や、細胞表面形が
膜貫通結合（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｃｈｏ
ｒｉｎｇ）のドメインを含む以外は、抗体がその膜結合
性対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）と同一であること
が証明された（Tonegawa, 1983, Nature 302:575-58
1）。

【００１１】一方、ＴＣＲに関する初期の研究では、Ｔ
ＣＲの分泌形を検出することに成功せず、したがって、
可溶性抗体を使用するアプローチは有効に用いられなか
った。さらに、Ｔ細胞の抗原認識におけるＭＨＣ拘束の
発見はＴＣＲの分析に別のレベルの困難さを付け加える
こととなった（Zinkernagel and Doherty, 1974, Natur
e 248:701-702）。当時、単一のＴＣＲが抗原とＭＨＣ
の両方に結合することを説明できるのか、あるいは２つ
の別々のレセプターが関与するのかは議論の分かれると
ころであった。しかしながら、ＴＣＲがＢ細胞レセプタ
ーと同一でないことは明瞭であると思われていた。

【００１２】モノクローナル抗体、組換えＤＮＡ法およ
び抗原特異的Ｔ細胞の長期間培養法の進展の到来によ
り、１９８０年代にはＴＣＲの同定がおおいに容易にな
った。Ｔ細胞のクローン集団に対して作成されたモノク
ローナル抗体は免疫Ｔ細胞とのみ特異的に反応すること
が見いだされた（Allison et al., 1982, J. Immunol.1
29:2293; Haskin et al., 1983, J. Exp. Med. 157:114
9; Samelson et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 80:6972）。これらの免疫沈降Ｔ細胞膜に対するクロ
ーン特異的抗体の使用により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで４
６，０００ダルトンの分子量のバンドが明らかとなっ
た。非還元的条件下では９０，０００ダルトンのバンド
が検出され、これはＴＣＲの二量体構造を示唆した。次
の実験により、機能性ＴＣＲがαおよびβとして知られ
る２つのジスルフィド結合した糖タンパク質からなるヘ
テロダイマーであることが確立された（Marrack and Ka
ppler,1987, Science 238:1073-1079）。ほぼ同じ頃、
αおよびβ鎖をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ク
ローンがヒトおよびマウスで単離された（Hedrick et a
l., 1984, Nature 308:149-153; Hedrick et al., 198
4, Nature 308:153-158;Yanagi et al., 1984, Nature
308:145-149）。ｃＤＮＡの配列分析により、コーディ
ング配列は抗体のコーディング配列と類似の再配列され
た遺伝子セグメントからなることが示された。受容細胞
中へのαおよびβ遺伝子の移入ということにより、抗原
特異性とＭＨＣ拘束を付与するのに必要かつ十分である
ことが示された（Dembic et al., 1986, Nature 320:23
2-238）。したがって、ヘテロダイマーＴＣＲが抗原と
ＭＨＣとの組み合わせの認識を司ると思われる。いくつ
かの研究は、αおよびβ可変領域が抗原およびＭＨＣの
認識方向にゆがめられていることを示唆する（Kappler
et al., 1987, Cell 49:263-271; Winoto et al., 198
6, Nature 324:679-682;.Tan et al., 1988, Cell 54:2
47-261）が、他方その他の研究は、認識がレセプター全
体によって現われる性質であることを示唆する（Kuo an
d Hood, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7614-7
618; Danska etal., 1990, J. Exp. Med. 172:27-3
3）。

【００１３】ＣＤ３は、ＴＣＲと非共有結合的に結合
し、かつＴＣＲの占有が引き金となるＴ細胞活性化に至
る膜内外の一連のシグナル伝達に関与するポリペプチド
の複合体である（Clevers et al., 1988, Ann. Rev. Im
munol. 6:629）。抗体によるＣＤ３の直接刺激はＴ細胞
活性化の通常の経路を模倣することが示された（Meuere
t al., 1983, J. Exp. Med. 158:988）。Ｔ細胞表面へ
のＣＤ３の輸送には、これが完全なヘテロダイマーＴＣ
Ｒ複合体と細胞内で結合することが必要である。ＴＣＲ
αおよびβ鎖の両方とＣＤ３ポリペプチドの複合体は
小胞体で組み立てられることが示された（Minami et a
l., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2688-2692;
Alarcon et al., 1988, J. Biol. Chem. 236:2953-296
1）。正しく形成された完全なレセプターであるＴＣＲ
／ＣＤ３は次いで機能性ユニットとして細胞表面に輸送
される。不完全に組み立てられたレセプター複合体はゴ
ルジ体を通ってリソソームに輸送され、そこで分解され
る。したがって、非結合αおよびβ鎖は通常Ｔ細胞の外
部に接近できないように思われる。完全なＴＣＲαおよ
びβレセプターでさえも分泌形では細胞外で容易に検出
されない。今まで、抗原認識におけるその機能はＴ細胞
表面で更にヘテロダイマーの形に限定されていると考え
られてきた。

【００１４】今や、αβＴＣＲは機能性Ｔ細胞の大部分
で発現されることが明らかとなった。γδヘテロダイマ
ーからなる第２のタイプのＴＣＲが同定されたが、これ
らのレセプターは末梢Ｔ細胞の一部でのみ発現されてお
り、その抗原特異的認識への関与はまだ証明されていな
い。構造的には、Ｔ細胞のαβおよびγδレセプターは
一次配列、遺伝子の組織化およびＤＮＡの再配列様式の
点で抗体分子ときわめて相同である（Davis and Bjorkm
an, 1988, Nature 334:395-402）。しかしながら、Ｔ細
胞抗原は以下の２つの主要な面で抗体と区別される：Ｔ
ＣＲは細胞表面にのみ見い出され、ＭＨＣでコードされ
る分子の存在下においてのみ抗原を認識する。

【００１５】２．３．可溶性Ｔ細胞レセプター 最近の研究は、ある場合にはＴＣＲが細胞からはずれる
または放出されることを示唆する（Guy et al., 1989,
Science 244:1477-1480; Fairchild et al., 1990, J.
Immunol. 145:2001-2009）。しかしながら、このような
分泌された分子が完全なＴＣＲであるのか、部分的断片
であるのか、またはＴＣＲと交差反応性のエピトープを
もつ他の分子であるのかは示されていない。本明細書で
記載する実施例によって示される発見以前は、機能的に
活性なＴＣＲα鎖が残りのＴＣＲ成分とは独立にＴ細胞
から放出されうるという考えは論争の的であり、疑問視
されていた。Ｋｌａｕｓｎｅｒとその同僚（Bonifacino
et al., 1990, Science 247:79-82）は、ＴＣＲαは保
持され、ＣＤ３δと複合体を形成しないときには小胞体
で分解されることを示し、さらに（Minami et al., 198
7, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2688-2692）ＣＤ３
−ＴＣＲ複合体の一部として細胞表面に輸送されないＴ
ＣＲαはリソソームで分解されることを示した。これら
の観察は、ＴＣＲαが細胞から放出される経路を否定す
るものである。同様に保持され、小胞体で分解されるＴ
ＣＲβの研究（Wileman et al., 1990, Cell Regulatio
n 1:907-919）は、ＴＣＲの組み立てと輸送はもっと複
雑であることを示唆する。例えば、ＴＣＲβ外来遺伝子
(transgene) を発現するＳＣＩＤマウスでは、ＴＣＲβ
は、ＴＣＲαまたはＣＤ３成分の非存在下に、未熟な胸
腺細胞の表面上で発現される（Kishi et al., 1991, EM
BO J. 10:93-100）。また、ＶＤＪとＣβ₁ドメインのみ
を含む、切形の(truncated) ＴＣＲβ鎖遺伝子を構築す
ると、このような分子は分解されるという予測に反して
分泌された（Gascoigne, 1990, J. Biol.Chem. 265:929
6-9301）。したがって、ある種の細胞では、ＴＣＲは少
量で、おそらくは他の未同定分子との複合体の形および
／または翻訳後の切形(truncatedform)で放出される可
能性が存在する。

【００１６】ＴＣＲαに対する抗体と反応する未同定の
可溶性制御因子または因子群の存在を多数の実験が報告
している。例えば、合成ポリペプチド抗原であるｐｏｌ
ｙ１８、ｐｌｕｓ １−Ａ^dに特異的なＣＤ４⁺ヘルパー
Ｔ細胞ハイブリドーマＡ１．１のｉｎ ｖｉｔｒｏアッ
セイにおいて、無細胞系での免疫制御活性が検出され
た；すなわち、該因子の厳密な抗原特異性がＴ細胞ハイ
ブリドーマの特異性と一致した（Zheng et al., 1988,
J. Immunol. 140:1351-1358）。ＴＣＲ ＶαおよびＶ
βに対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞表
面のＴＣＲ−ＣＤ３発現を特異的に阻害することが見い
だされたが、ＶαへのアンチセンスのみがＡ１．１の可
溶性制御活性の産生を阻害するが、Ｖβ（または対照オ
リゴヌクレオチド）は阻害しなかった（Zheng et al.,
1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3758-3762）。
ごく最近の研究において、Ａ１．１の抗原特異的制御活
性体がＴＣＲαに特異的なモノクローナル抗体カラムに
結合し、これから溶出され、代謝的に標識した上清から
の４６，０００ダルトンの分子量のタンパク質として決
定された；この活性体は抗−ＴＣＲβ、抗−ＴＣＲ Ｖ
β、または抗−ＣＤ３ε抗体によっては結合されない
（Bissonnette et al., 1991, J. Immunol. 146:2898-2
907）。ＴＣＲα鎖抗原決定基を共有するが、表面ＴＣ
Ｒ由来ではないＴｓ活性体が報告されているが、性状決
定されていない（Collins et al., 1990, J. Immunol.
145:2809-2812）。Ｔａｋａｄａ（1990, J. Immunol. 1
45:2846-2853 ）もＴＣＲα鎖抗原決定基を共有するＴ
ｓ活性体を報告するが、これはＭＨＣ拘束であった。こ
れらの結果とは対照的に、Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ（1990,
J.Immunol. 145:2001-2009）は、抗−ＴＣＲ Ｃαと反
応するが、抗−ＶβおよびＴＣＲ−β抗体とも反応する
ＤＮＰ−特異的Ｔｓ因子を報告した。本明細書に記載す
る発見以前は、観察される抗原特異的制御活性を司る可
溶性の免疫制御媒介物としてＴＣＲαの役割を同定し、
またこれを説明した者は誰もいなかった。

【００１７】可溶性ＴＣＲ分子を産生させるためにＴＣ
Ｒトランスメンブラン（膜貫通）領域を置換または削除
する３つの主な戦略が試みられた。最も直接的なアプロ
ーチでは、翻訳終止コドンをＴＣＲαまたはＴＣＲα／
βダイマーの上流に導入した。ｃＤＮＡでトランスフェ
クションしたＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞またはＨ
ｅｌａ細胞中で、ＴＣＲαはゴルジ体に入る前に非リソ
ソーム区画中で迅速に分解されることが報告されている
（Wileman et al., Cell．Biol. 110:973-986,1990; Li
ppincott-Schwartz et al., Cell, 54:209-220, 1988;
Baniyash et al., J. Biol. Chem. 263:9874-9878, 198
8; Bonifacino et al., Science 247:79-82, 1990; Bon
ifacino et al., Cell 63:503-513, 1990; Manolios et
al., Science 249:274-277, 1990; Shin et al., Scie
nce 259:1901-1904, 1993）。第２の戦略では、ＴＣＲ
αおよびβ鎖の細胞外ＶおよびＣドメインを、胎盤のア
ルカリ性ホスファターゼまたはＴｈｙ−１分子のグリコ
シル−ホスファチジルイノシトール膜アンカーとつなぎ
替えた（Lin et al., Science 249:677-679, 1990;Slan
etz et al., Eur. J. Immunol. 21:179-183, 1991）。
細胞をホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパー
ゼＣで処理することにより、対応する脂質に結合したＴ
ＣＲポリペプチドが可溶形態で膜から放出され、可溶化
ＴＣＲαβヘテロダイマーは抗−クロノタイプのモノク
ローナル抗体と特異的に反応することが示された。しか
しながら、放出されたＴＣＲポリペプチドの収率は少な
すぎたので、この分子を臨床的用途に用いることはでき
なかった。第３のアプローチは、ＴＣＲと免疫グロブリ
ンの不変領域（Gregoire et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 88:8077-8081, 1991; Weber et al., Nature 3
56:793-796, 1992）およびＣＤ３のゼータ鎖（Engel et
al., Science 256:1318-1321, 1992）とのハイブリッ
ドタンパク質を作ることであった。これらの融合タンパ
ク質は骨髄細胞または白血病細胞のトランスフェクショ
ンによって培地中に分泌され、これらの可溶性ＴＣＲ類
は、対応する細胞表面に結合したＴＣＲのすべての血清
学的に検出されるエピトープを保持していることが示さ
れた。しかしながら、これらの融合タンパク質は抗原の
低親和性認識を示し、免疫原性であるかも知れない。さ
らに、ＴＣＲα鎖のみの機能的発現は一度も成功しなか
った。

【００１８】ＶαおよびＶβポリペプチドの融合タンパ
ク質を用いる大腸菌中でのＴＣＲの発現が以前に報告さ
れている（Soo Hoo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 89:4759-4763, 1992）。しかしながら、タンパク質
の１％のみが再生タンパク質として回収できた。本発明
では、再生タンパク質の収率はサイトカインなどの典型
的な可溶性タンパク質と同程度であり、このため臨床用
途に均一なＴＣＲα分子を提供することができる。

【００１９】大腸菌中で動物タンパク質を発現するため
に、多くの研究者によって種々の系が開発されてきた。
しかしながら、この生物中で異種遺伝子を発現するには
多くの困難に遭遇することが多い。例えば、コドン使用
パターンとその翻訳開始シグナルにおいて、大腸菌と動
物遺伝子の間には有意な差異があり、このため細菌のリ
ボソーム上での動物ｍＲＮＡの有効な翻訳が妨害される
（Orormo et al., Nucl. Acids Res. 10:2971-2996, 19
82 ）。あるいは、大腸菌中で合成された異種タンパク
質は、宿主細胞のプロテアーゼ活性のために、有意なレ
ベルにまで蓄積されないかも知れない（Gottesman, Ann
u. Rev. Genet. 23:163-198, 1989）。さらに、ＴＣＲ
などの分泌分子または膜結合の分子は、安定性と溶解性
のためにグリコシル化およびジスルフィド架橋される必
要があるので、治療的に有用なタンパク質の物理的性状
が問題となりうる。このような安定性化のための工程を
細菌の細胞質中で行うことはできないので、大腸菌中で
生産された異種タンパク質は”封入体”(inclusion bod
ies)として知られる不溶性の凝集物をしばしば形成する
（Schein et al., Bio/Technology 7:1141-1149, 198
9）。本発明は大腸菌の封入体中に切形のＴＣＲαポリ
ペプチドを発現させ、生物的に活性なＴＣＲαを再生お
よび精製する方法を提供する。

【発明が解決しようとする課題】本発明はＴＣＲαを使
用して抗原特異的に免疫応答を調節する方法及びそれに
用いるＴＣＲαを生産する方法を提供することを目的と
する。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明は、抗原特異的に
免疫応答を調節するのにＴＣＲα鎖を利用する方法に関
する。 in vitro で評価できる次の２つの重要な特徴を
示すＴＣＲα鎖を、本発明の実施に際しての製造及び使
用のために選択する：本発明の方法に使用するＴＣＲα
鎖は、興味のある抗原に結合可能でなければならなず、
かつ、本明細書に記載される補助成分の存在下で、その
抗原に対して生じる特異的免疫応答を、例えば、該抗原
特異的免疫応答を抑制又は増強することによって調節し
なくてはならない。

【００２１】かかる性質を示すＴＣＲα鎖は、ヒト若し
くは動物においてin vivo で、又はin vitro で、抗原
特異的免疫応答のダウンレギュレーション又はアップレ
ギュレーションのために記載された手順で有利に使用す
ることができる。例えば、高度免疫応答、例えば、アレ
ルギー、自己免疫疾患、又は移植片拒絶の患者に、補助
成分の存在下で抗原特異的免疫応答を抑制する、原因と
なる抗原に特異的なＴＣＲα鎖の有効投与量をin vivo
で投与することができる。逆に、免疫抑制された患者の
体液を、免疫抑制作用を示す可溶性ＴＣＲα鎖の存在に
ついて試験することができる。患者の該抗原についての
免疫応答の増強は、可溶性ＴＣＲα鎖に特異的な抗体を
使用して該ＴＣＲα鎖を除去又は中和することによっ
て、又は該ＴＣＲα鎖の発現を阻害するアンチセンスオ
リゴヌクレオチドによって行うことができる。

【００２２】本発明で使用するＴＣＲα鎖を評価するの
に使用できる in vitro 分析法が本明細書に記載されて
いる。例えば、抗原結合を評価するのに幾つかのイムノ
アフィニティー法を使用することができ、試験されるＴ
ＣＲα鎖の調節機能を評価するには以下に詳細に記載す
るプラーク形成細胞（ＰＦＣ）分析法（以下、ＰＦＣ分
析法という）を使用することができる。簡単に説明すれ
ば、このＰＦＣ分析法においては、試験されるべきＴＣ
Ｒα鎖を、補助成分の存在下で、異種赤血球の如き免疫
原性のある溶解性担体と結合した興味のある抗原を含有
する脾臓細胞培養物に添加する。ＴＣＲα鎖の免疫調節
作用は、該培養物中のプラーク形成細胞の発生により示
される、２、３日で生じる免疫応答を吟味することによ
って評価される。即ち、免疫応答により、該担体（例え
ば、赤血球）に対する補体結合抗体を産生する細胞が生
じるが、これら細胞を、該細胞を補体及び該担体（例え
ば、赤血球）と混合して単一層に形成する分析法により
検出することができる。該担体の細胞溶解により、１つ
のプラーク形成細胞（ＰＦＣ）の存在に対応して、１つ
の澄んだプラークが生成する。培養液においてＰＦＣ生
成が阻害されれば、結合した抗原に特異的なＴＣＲα鎖
の介在により免疫応答が抑制されたことを示す。以下に
より詳細に説明するように、該分析法に使用する補助成
分は、Ｔ細胞を刺激するのに使用される抗原に直接結合
する、ＴＣＲα鎖の如き可溶性因子を除いた刺激された
Ｔ細胞の上清から調製される。該補助成分はそれ自体及
びそれだけでは、ＴＣＲα鎖が存在しなければ免疫応答
に何ら作用しない。

【００２３】本発明は、部分的に、Ｔ細胞ハイブリドー
マにより構造的に分泌される可溶性ＴＣＲα鎖を見出し
たことに基づく。実施例で明らかにするように、この分
泌されたＴＣＲα鎖はその抗原に直接結合でき、補助成
分の存在下で、該抗原に対して普通に生じる免疫応答を
抑制する。しかしながら、本発明は、あらゆるＴＣＲα
鎖遺伝子をクローン化し、発現し、そして、本明細書に
記載した技術及び方法を使用して、本発明を実施するに
際して該遺伝子産物をその適性について試験することが
できるので、天然に分泌されたＴＣＲα鎖を使用するこ
とだけに限定されない。加えて、本明細書に記載した分
析法は、抗原特異的に免疫調節機能を示す他の分子、例
えば、抗体、他のＴＣＲ成分を評価するのに使用でき
る。

【００２４】本発明の１態様においては、融合パートナ
ーとしてラットカルモジュリンを使用することに基づく
新規な融合遺伝子発現系を提供する。該系は、好ましく
は、生物活性を有するＴＣＲαタンパク質の高発現及び
精製に使用することができる。大腸菌内でのラットカル
モジュリンの発現は、大腸菌ｔｒｐプロモーター及びｔ
ｒｐＡターミネーターを含有する発現ベクターを用いる
ことによりうまく行われてきた（マツキら, Biotech, A
ppl. Biochem., 12:284-291, 1990)。この系では、ラッ
トカルモジュリンｃＤＮＡを、５’非翻訳配列を削除し
て大腸菌リボソーム結合部位についてのコンセンサス配
列を取り込むように修飾した。翻訳開始コドンの周囲の
大腸菌コンセンサスヌクレオチド配列に適する、Ｎ末端
アミノ酸のための多くのコドンが選ばれた。大腸菌内で
の発現を誘発することによって、可溶性ラットカルモジ
ュリンは全細胞性タンパク質の３０％を越える割合を占
めた。フェニル−セファロースカラムクロマトグラフィ
ーを使用して、純度９０％の組み換えカルモジュリン約
１００ｍｇが１リッターの培養液から得られた。本発明
においてラットカルモジュリン遺伝子の３’末端でＴＣ
Ｒα遺伝子を融合するために、トロンビンにより認識さ
れるプロテアーゼ切断部位をコードする追加の配列、つ
まりＬｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（チャン
(Chang), Eur. J. Biochem., 151:217-224, 1985)をカ
ルモジュリンのＣ末端に挿入する。この工夫は、次の多
くの理由で、ＴＣＲαタンパク質を切り離すのを可能に
する：１）発現レベルが高い、２）融合タンパク質が可
溶型で発現される、３）該タンパク質の精製が驚くほど
簡単である、４）各ＴＣＲαタンパク質についての個々
の再生(refolding) プロセスが不要である。

【００２５】５．発明の詳細な説明 本発明は、抗原特異的免疫応答の制御における、Ｔ細胞
抗原レセプターの抗原−結合性α鎖の使用を包含する。
本発明のある面に従えば、ＴＣＲα鎖の、抗原と結合す
る能力および該抗原に特異的な免疫応答を調節する能力
を評価する。この目的に使用するｉｎ ｖｉｔｒｏアッ
セイを本明細書に記載する。適当な活性を示すＴＣＲα
鎖を、例えば、組換えＤＮＡ法および／または化学合成
法で大量に生産し、特定抗原に対する免疫応答をアップ
レギュレーションまたはダウンレギュレーションするた
めに使用できる。例えば、過敏症反応、自己免疫応答お
よび移植片拒絶応答が、これらに対応する抗原に特異的
でかつ抗原特異的抑制を誘導するＴＣＲα鎖を用いて抑
制できる。あるいは、特定抗原に対する免疫応答を特異
的に増強するために、このようなα鎖の除去、または個
体中におけるこのようなα鎖の生産の阻害によって、抗
原に対する免疫を増大することができる。逆に、抗原に
対する免疫応答を増大するＴＣＲα鎖を同定して利用す
ることができる。

【００２６】本発明は、部分的には、抗原と直接結合
し、該抗原に対して生じる免疫応答を抑制するＴＣＲα
鎖の分泌形を発見したことに基づく。特に、抗原と結合
し、かつ適当な補助成分（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｃｏｍ
ｐｏｎｅｎｔ）の存在下に該抗原に対する免疫応答を阻
害するＴＣＲα鎖の分泌形を継続的に放出する合成ポリ
ペプチド抗原、ｐｏｌｙ １８、ｐｌｕｓ １−Ａ^dに
特異的なＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞ハイブリドーマである
Ａ１．１が記載される。本明細書に記載するＡ１．１
ＴＣＲα鎖遺伝子の単離およびそのｐｏｌｙ １８非反
応性Ｔ細胞系への移入（下記セクション６参照）、なら
びにＡ１．１ ＴＣＲα鎖遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏで
の転写および翻訳産物がこの制御活性を媒介することを
示したこと（下記セクション７参照）は、ＴＣＲβ鎖遺
伝子ではなく、ＴＣＲα鎖遺伝子が、抗原と直接結合
し、かつ制御機能を媒介する制御因子をコードする役目
をもっていることを示している。ＴＣＲα鎖の生産と抗
原特異的免疫制御剤としてのその使用を以下のセクショ
ンに詳述し、かつ実施例として記載する。

【００２７】５．１．ＴＣＲα鎖の生産 本発明は、抗原−結合性および免疫制御活性の両方を有
するＴＣＲα鎖（αおよびβの完全なＴ細胞表面抗原レ
セプターではない）に関する。抗原特異的制御活性をも
つ抗原結合性ＴＣＲαタンパク質が種々の方法により生
産される。例えば、ＴＣＲα鎖タンパク質の発現は組換
えＤＮＡ法および／または既知のアミノ酸配列に基づく
化学合成法により達成される。あるいは、この活性体を
持続的に放出するＴ細胞株の培養上清からＴＣＲα鎖を
直接精製することができる。

【００２８】５．１．１．ＴＣＲα鎖の評価 このようなＴＣＲα鎖生産に使用する方法のいかんにか
かわらず、分子の抗原結合能力および免疫制御活性は評
価されなければならない。例えば、ＴＣＲα鎖が興味あ
る抗原と直接結合する能力は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イ
ムノソルベントアッセイ）、免疫沈降、ウエスタンブロ
ット、またはラジオイムノアッセイなどを含むアッセイ
系で通常使用する抗体に変えてＴＣＲα鎖を用いる改変
免疫アッセイ法によって評価できるが、これに限定され
るものではない。

【００２９】抗原結合性ＴＣＲα鎖の免疫制御能力は、
抗原特異的な方法で免疫応答を検出できるいかなるアッ
セイ系を用いて評価してもよい。例えば、本明細書に記
載し、実施したＰＦＣアッセイを用いて、特定抗原に向
けられた免疫応答を抑制するＴＣＲα鎖を同定できる。
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）などの高度に免疫原性を持つ
担体の存在下に脾臓細胞を培養すると、免疫応答が生じ
てプラーク形成細胞が生じる。培養脾臓細胞をＳＲＢＣ
（または適当な溶血可能な担体）および補体と混合し、
混合物を単層として培養することにより、培養物当たり
のＰＦＣの数をアッセイできる。透明なプラークに囲ま
れた細胞（例えば、溶血赤血球）をＰＦＣとして計測す
る。脾臓細胞培養におけるＰＦＣ生成の阻害、すなわち
ＰＦＣ／培養の数の減少は、免疫応答の抑制を示す。Ｔ
ＣＲα鎖の抑制活性を試験して、抑制が抗原特異的であ
ることを確認するために、以下のＰＦＣアッセイを行っ
てもよい：興味ある抗原をＳＲＢＣと結合させ（Ａｇ−
ＳＲＢＣ）、非免疫マウスからの脾臓細胞に加える。該
抗原に特異的なＴＣＲα鎖の免疫制御効果は、以下に記
載する補助成分の存在下に試験すべきＴＣＲα鎖を培養
物に加えることにより（すなわち、補助成分は試験すべ
きＴＣＲα鎖を加える前、または同時に加えるべきであ
る）評価できる。対照培養物には、補助成分の非存在下
にＴＣＲα鎖を加えるか、その逆であり、あるいは無関
係な抗原を使用することができる。培養後、ＰＦＣ／培
養の数を各条件から評価する。試験培養物におけるＰＦ
Ｃ産生の阻害は、対照で観察された阻害と比較して、試
験したＴＣＲα鎖が、培養系で通常生じる免疫応答を抗
原特異的に抑制することを示す。

【００３０】試験系で使用した補助成分は、Ｔ細胞を刺
激するために使用された抗原と直接結合するＴＣＲα鎖
を含むあらゆる可溶性因子を除いた刺激されたＴ細胞の
上清を含む。その結果、補助成分自体は免疫応答を抑制
しない。抗原特異的ＰＦＣアッセイで用いられた担体／
インディケーターでｉｎ ｖｉｖｏ刺激されたＴ細胞か
ら補助成分は産生される。例えば、Ａｇ−ＳＲＢＣがタ
ーゲットである上記のＰＦＣアッセイ系に用いる補助成
分の調製には以下の手法が使用できる。ＳＲＢＣ−免疫
したマウスに由来する脾臓細胞からＢ細胞を除去し、豊
富なＴ細胞を培養するか、または再生産可能で継続的な
培養上清の供給源として使用できるＴ細胞ハイブリドー
マを産生するのに使用する。ＰＦＣアッセイを用いて、
抗−ＳＲＢＣ免疫応答を阻害するＴ細胞培養物の上清の
能力を試験する。該ＰＦＣアッセイでは、Ｔ細胞上清の
存在下または非存在下に培養脾臓細胞にＳＲＢＣを加え
る。抗−ＳＲＢＣ応答を阻害することが見いだされたＴ
細胞培養上清を次いでＳＲＢＣで吸着し、ＳＲＢＣと直
接結合する可溶性ＴＣＲα鎖のようなすべての可溶性因
子を除去する。次いでＰＦＣアッセイを用いて、吸着さ
れた上清の抗−ＳＲＢＣ免疫応答阻害能力を試験する。
抗−ＳＲＢＣ応答を阻害しないこれらの吸着された上清
は、抗原特異的免疫抑制活性を示すＴＣＲα鎖を同定す
るようにデザインされたＰＦＣアッセイ（すなわち、Ａ
ｇ−ＳＲＢＣターゲットを用いるＰＦＣアッセイ）にお
ける補助成分として使用される。あるいは、吸着工程を
必要としない補助成分を産生するＴ細胞ハイブリーマ；
例えば、培養上清中に補助成分を構成的に産生する、下
記のセクション８（図１参照）に記載のハイブリーマ３
−１−Ｖを作成してもよい。したがって、補助成分は、
それ自身に阻害的ではないが、ＴＣＲα鎖などの抗原特
異的因子が抗原特異的な方法で免疫応答を抑制できるよ
うな１またはそれ以上の因子を含む。このようなアッセ
イ系の実例を下記のセクション６．１．５．に記載す
る。

【００３１】逆に、免疫応答を増強するＴＣＲα鎖が同
様の方法で同定される。このような場合、吸着前にはＰ
ＦＣ産生の増加を示し、吸着後は活性を示さないＴ細胞
ハイブリーマまたはＴ細胞培養上清から調製した補助成
分を、Ａｇ−ＳＲＢＣに対する免疫応答を抗原特異的に
増強するＴＣＲα鎖を同定するようにデザインされたＰ
ＦＣアッセイに用いることができる。上記のアッセイ系
は免疫応答を評価するために非感作脾臓細胞培養物を用
いており、また補助成分の調製に担体−感作脾臓細胞培
養物を用いているので、培養脾臓細胞には動物由来の供
給源（例えば、マウス、ラット、ウサギおよび非ヒト霊
長類）を使用することに限定されうる。しかしながら、
ヒトＴＣＲα鎖の免疫制御活性の試験に使用することは
できる。実際、多くのヒト免疫機能が動物を基礎とする
アッセイ系で試験されている。例えば、補体媒介性の溶
血などのヒト抗体エフェクター機能、および抗体依存性
細胞の細胞障害性がそれぞれ動物血清と動物エフェクタ
ー細胞を用いて実施できる。しかしながら、動物脾臓細
胞培養物に代えてヒト細胞培養物を用いて上記のＰＦＣ
アッセイを改変することが好ましい。例えば、特定抗原
に対する免疫応答に及ぼすＴＣＲα鎖の影響は、Ｔｈｏ
ｍａｓら（1980, J. Immunol. 125:2402）（Thomas, 19
82, J. Immunol. 128:1386も参照のこと）の記載する逆
溶血ＰＦＣアッセイを用いて評価することができる。こ
のアッセイ系では、ポークウィードマイトジェンで刺激
したＴ細胞の上清を補助成分の供給源として用いること
ができる。

【００３２】５．１．２．Ｔ細胞の選択 本発明の方法で用いるＴＣＲα鎖の供給源および／また
はＴＣＲα鎖の生産に用いる遺伝物質の供給源として使
用できる抗原特異的Ｔ細胞は、当業界で周知の多数のｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ法により作成および選択できる。Ｔ細胞
の供給源は末梢血、リンパ節、脾臓、およびその他のリ
ンパ球器官、ならびに腫瘍結節のようなＴ細胞が浸潤す
る組織部位でありうる。密度勾配遠心またはＣＤ２、Ｃ
Ｄ３、ＣＤ４、ＣＤ８などのＴ細胞表面マーカーに対す
る抗体を用いる細胞ソーティング法によって、Ｔ細胞画
分を他のタイプの細胞から分離してよい。これらの方法
は、パニング、アフィニティクロマトグラフィー、フロ
ーサイトメトリー、磁気ビーズ分離などを含むがこれに
限定されない。Ｔ細胞では発現されないマーカーに対す
る抗体を用いて非Ｔ細胞集団を除去するか、あるいは種
々の基質への付着などの非Ｔ細胞の膜の性質を利用して
Ｔ細胞の比率を増す、ネガティブ選択法を用いることも
できる。さらに興味あるＴ細胞サブセットを選択するに
は、ヘルパーおよび細胞障害性／サプレッサーＴ細胞の
選択にはそれぞれ抗−ＣＤ４および抗−ＣＤ８のような
より特異的なマーカー、または記憶細胞のようなＴ細胞
サブセット上で発現したマーカーに対する抗体を用いて
上記の方法を応用できる。

【００３３】抗原特異的なＴ細胞系は、適当な照射抗原
提示細胞およびサイトカインの存在下に、最適濃度の特
定抗原で繰り返し刺激することにより、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで作成できる。抗原−提示細胞は自己由来またはＭＨ
Ｃ適合性の供給源から得るべきであり、これはマクロフ
ァージ、樹枝状細胞、ランゲルハンス細胞、ＥＢＶ−形
質転換Ｂ細胞または未分離の末梢血単核細胞でありう
る。サイトカインはインターロイキン１、２、４および
６などの天然または組換え型の各種インターロイキンを
含みうる。このような方法の１例については、例えば、
Tanaka et al., 1990, J. Immunol. 145:2846-2853を参
照されたい。

【００３４】照射した支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌ
ｌ）、抗原およびサイトカインの存在下に、限界希釈ク
ローニング法を用いるＴ細胞クローニングにより、抗原
特異的Ｔ細胞のクローン集団を得ることができる。ある
いは、抗原特異的Ｔ細胞と、ＢＷ５１４７やＢＷ１１０
０などの融合パートナー腫瘍株との融合、次いでＨＡＴ
選択と再クローニングを行うことによってＴ細胞ハイブ
リドーマを作製できる。抗原特異的Ｔ細胞もまた、ＣＤ
３に対するモノクローナル抗体を使用することによりク
ローン化し、増殖することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ供
給源から直接得た細胞を用いて、Ｔ細胞クローンおよび
Ｔ細胞ハイブリドーマを作成し、次いで抗原特異性を試
験して選択することができ、あるいはまた、抗原特異的
Ｔ細胞系をクローニングおよび融合の前に確認すること
ができる。Ｔ細胞クローンは７−１４日毎に抗原または
抗−ＣＤ３で繰り返し刺激することにより長期間培養状
態に維持し、次いでサイトカインで増大させることがで
き、一方、Ｔ細胞ハイブリドーマは定期的な抗原刺激を
行うことなく適当な培地中で生育させることができる。

【００３５】モノクローナルなＴ細胞集団の抗原特異性
は、増殖および／または抗原に応答してこれらの細胞が
産生するリンホカイン産生を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ
アッセイで評価できる。Ｔ細胞の表現型は種々のＴ細胞
マーカーに対する抗体で染色することにより確認でき
る。このような抗原特異的Ｔ細胞は、構成的にＴＣＲα
鎖を分泌するか、またはそのα鎖の放出のためには活性
化シグナルを必要としうる。好ましくは、組換えＤＮＡ
および／または化学合成法によってＴＣＲα鎖を生産す
るのに必要な遺伝子物質の供給源として抗原特異的Ｔ細
胞を用いてもよい。このアプローチを用いて、天然に生
じるＴＣＲα鎖を分泌しないかもしれないある種の抗原
−特異的Ｔ細胞を、本発明に従って用いられるＴＣＲα
鎖の遺伝子物質の供給源として使用することができる。

【００３６】５．１．３．ＴＣＲα鎖コーディング配列
の単離 ｃＤＮＡ調製のためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）は所望のα鎖を生産する細胞供給源から得ることが
でき、一方ＴＣＲαのためのゲノミック配列はあらゆる
細胞供給源から得ることができる。上記セクション５．
１．２．で記載するようにして作成したＴ細胞はいずれ
もＴＣＲα鎖のコーディング配列の供給源として、およ
び／またはｃＤＮＡまたはゲノミックライブラリーを調
製するために利用できる。さらに、リンパ球器官（例え
ば、脾臓、リンパ節、胸腺および末梢血リンパ球）の一
部をすりつぶして、ＤＮＡまたはＲＮＡ抽出の供給源と
して使用できる。あるいは、Ｔ細胞株をＤＮＡまたはＲ
ＮＡの簡便な供給源として使用できる。ＴＣＲαコーデ
ィング配列を含む遺伝子操作された微生物または細胞株
を、この目的のためのＤＮＡの簡便な供給源として使用
できる。

【００３７】ｃＤＮＡまたはゲノミックライブラリーは
当業界で周知の方法を用いて作成したＤＮＡ断片から調
製できる。ＴＣＲα配列の一部と相同なヌクレオチドプ
ローブでこのようなライブラリーをスクリーニングする
ことによりＴＣＲαをコードする断片を同定できる。こ
の点において、ヒトおよびマウスではＴＣＲαのための
単一の不変領域遺伝子（Ｃα）が存在することに注意す
べきである。どちらの種についてもＣαをコードするヌ
クレオチド配列が公知であるので、不変領域と相同なＤ
ＮＡプローブを当業界での標準法で合成して、上記セク
ション５．１．２．で記載したようなＴ細胞から、ＴＣ
Ｒα遺伝子またはＴＣＲα ｃＤＮＡの合成に使用でき
るｍＲＮＡ転写物を単離し、このようなＴ細胞から調製
したｃＤＮＡライブラリー中の適当なＴＣＲα配列また
はゲノミッククローンを同定するのに用いることができ
る。あるいは、所望のＴＣＲα鎖の可変領域に特異的な
オリゴヌクレオチドを構築できるが、この場合には可変
領域の配列によりケースバイケースでデザインしなけれ
ばならない。不変領域に基づいてデザインされたオリゴ
ヌクレオチドプローブは、あらゆるＴＣＲα鎖遺伝子ま
たはコーディング配列を”釣りあげる”のに使用できる
ので、この点において有利である。コーディング配列の
一部をクローニングおよび発現に使用できるが、全長ク
ローン、すなわちＴＣＲαのための全コーディング領域
を含むものが発現には好ましい。この目的には、ＤＮＡ
の単離、適当な制限断片の作成、クローンとライブラリ
ーの構築、および組換え体をスクリーニングするための
当業者に周知の技術を使用できる。当業者に公知の方法
をこの目的に使用できる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら
（1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Co
ld Spring Harbor Laboratory, N.Y.）に記載の方法を
参照されたい。下記セクション６の実施例による特定の
態様においては、ＴＣＲα鎖遺伝子のための完全ヌクレ
オチドコーディング配列が図２に示すＴ細胞ハイブリド
ーマ、Ａ１．１から単離された。

【００３８】あるいは、直接クローン化できるＴＣＲα
配列のｃＤＮＡまたはゲノムのコピーを作製するため
に、特異的ＴＣＲα配列に由来するオリゴヌクレオチド
プローブをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法のプライ
マーとして用いることができる。かかるＰＣＲ法の総説
については、例えば、Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．，１９
８９の”ＰＣＲ法、ＤＮＡ増幅の原理と応用”（Ed.,
H.A.Erlich, Stockton Press, N.Y.); および”分子生
物学における最近のプロトコル”（Vol.2, Ch.15,Eds.
Ausubel et al., John Willey & Sons, 1988）を参照さ
れたい。

【００３９】ＴＣＲαコーディング配列を同定しクロー
ン化する方法のいかんにかかわらず、発現クローニング
法はスクリーニングの手間を実質的に減少させるために
利用できる。最近になって、抗体遺伝子をクローニング
し発現させる１段階法が報告されている（McCafferty e
t al., 1990, Nature 348:552-554; Winter and Milste
in, 1991, Nature 349:293-299）。この技法に基づい
て、ＴＣＲα鎖遺伝子を、λやｆｄなどのバクテリオフ
ァージのコートタンパク質遺伝子に隣接する部位でベク
ター中に直接クローニングできる。ＴＣＲα遺伝子をも
つファージはその表面上に融合タンパク質を発現し、そ
の結果、抗原またはＴＣＲα−特異的抗体を含むカラム
を用いて結合活性をもつファージ粒子を選択および単離
できる。正しいＴＣＲα遺伝子を同定するのに、一過性
遺伝子発現系もまた利用できる。例えば、ＣＯＳ細胞系
（例えば、Gerard & Gluzman, 1986, Mol. Cell. Biol.
6(12) 4570-4577）を使用できるが、ＣＤ３δ鎖遺伝子
と同時トランスフェクションしておいたＣＯＳ細胞の抽
出物中でＴＣＲα鎖の発現を検出すべきである（Bonifa
cino et al., 1990, Cell 63:503-513）。

【００４０】ＴＣＲαのクローニングおよび発現のため
の本発明の実施において、ヌクレオチドコーディング配
列の縮重のために、あらゆる公知の抗原特異的ＴＣＲα
鎖遺伝子の類似のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ
配列を使用してもよい。このような変更は欠失、付加ま
たは異なるヌクレオチド残基による置換を含むが、これ
によって同一または機能的に均等な遺伝子産物をコード
する配列が得られる。遺伝子産物は配列内のアミノ酸残
基の欠失、付加または置換を含んでもよいが、これはサ
イレントチェンジであり生物活性を持つ産物を生産す
る。このようなアミノ酸の置換は含まれる残基の極性、
電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性
の類似性に基づいて実施することができる。例えば、負
に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン
酸を含み；正に荷電したアミノ酸はリジンおよびアルギ
ニンを含み；同様の親水性度をもつ非荷電極性側鎖を有
するアミノ酸は以下のものを含む：ロイシン、イソロイ
シン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グ
ルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チ
ロシン。

【００４１】ＴＣＲα鎖配列は、安定性および半減期を
改良するなど、ｉｎ ｖｉｖｏで使用できるような改良
された性質をもつ遺伝子産物を得るように修飾できる。
例えば、ＴＣＲα鎖遺伝子またはその可変領域を、Ｉｇ
Ｇなどのヒト免疫グロブリン遺伝子の不変領域と連結す
ることによってハイブリッド遺伝子を構築できる。これ
に応用できる技術については、Capon et al., 1989, Na
ture 337:525-531を参照されたい。

【００４２】５．１．４．α鎖コーディング配列の発現 生物学的に活性を持つＴＣＲα鎖を発現させるために
は、ＴＣＲαをコードするヌクレオチド配列または上記
セクション５．１．３に記載する機能的均等物を、適当
な発現ベクター、すなわち挿入したコーディング配列の
転写および翻訳に必要な要素を含むベクター中に挿入す
る。ＴＣＲαコーディング配列の修飾形は安定性、生産
性、精製または発現産物の収率を増強するように操作で
きる。例えば、ＴＣＲαと異種タンパク質を含む融合タ
ンパク質または切断可能な融合タンパク質を発現するよ
うに操作することができる。このような融合タンパク質
はアフィニティクロマトグラフィー、例えば異種タンパ
ク質に特異的なカラム上に固定することにより容易に単
離される。切断部位がＴＣＲα部分と異種タンパク質と
の間に操作されている場合、切断部位を分断する適当な
酵素または薬剤で処理することによりクロマトグラフィ
ーカラムからＴＣＲα鎖が放出される（例えば、Booth
et al., 1988, Immunol. Lett. 19:65-70;および Garde
lla et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:15854-15859
）。

【００４３】ＴＣＲαコーディング配列および適当な転
写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターの構築には当
業者に公知の方法を使用できる。これらの方法はｉｎ
ｖｉｔｒｏの組換えＤＮＡ技法、合成法およびｉｎ ｖ
ｉｖｏ組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis
et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manu
al, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.を参照のこ
と。

【００４４】ＴＣＲαコーディング配列の発現には種々
の宿主−発現ベクター系を用いることができる。これら
はＴＣＲαコーディング配列を含む組換えバクテリオフ
ァージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ
発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；ＴＣ
Ｒαコーディング配列を含む組換え酵母発現ベクターで
形質転換された酵母；ＴＣＲαコーディング配列を含む
組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモ
ザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、
ＴＭＶ）で感染するか、または組換えプラスミド発現ベ
クター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植
物細胞系；ＴＣＲαコーディング配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染
した昆虫細胞系；あるいはＴＣＲαコーディング配列を
含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイ
ルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）で感染し
た動物細胞系、または安定な発現をするように操作され
た形質転換された動物細胞系を含むが、これに限定され
ない。下記のセクショ７に記載する実施例に示すよう
に、発現産物のグリコシル化はＴＣＲα免疫制御活性に
は必要でないように思われる。したがって、細菌発現系
を高収率のＴＣＲα生産に利用することが有利でありえ
る。しかしながら、グリコシル化は免疫制御活性には必
要でないけれども、ｉｎ ｖｉｖｏで適用するには重要
であるかも知れない；例えば、グリコシル化産物はｉｎ
ｖｉｖｏで半減期が増加することが示されるかも知れ
ない。このような場合、翻訳および翻訳後の修飾ができ
るような発現系、例えば哺乳動物、昆虫、酵母または植
物発現系を用いることができる。

【００４５】使用する宿主／ベクター系により、構成お
よび誘導プロモーター、転写エンハンサー要素、転写タ
ーミネーターなどを含む多数の適当な転写および翻訳要
素を発現ベクターに使用できる（例えば、Bitter et a
l., 1987, Methods in Enzymolozy 153:516-544参
照）。例えば、バクテリア系でクローニングするには、
バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐ
ｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）
などの誘導プロモーターを使用できる。哺乳動物細胞系
でクローニングするには、哺乳動物細胞のゲノム由来の
プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモータ
ー）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例え
ば、レトロウイルスのロングターミナルリピート；アデ
ノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．
５Ｋプロモーター）を使用できる。組換えＤＮＡまたは
合成法によって作成したプロモーターも挿入したＴＣＲ
αコーディング配列の転写をさせるために使用できる。

【００４６】細菌系では、発現すべきＴＣＲαの使用目
的によって、多数の発現ベクターを有利に選択できる。
例えば、大量のＴＣＲαを生産しようとするときは、容
易に精製できる高レベルの融合タンパク質産物の発現を
導くベクターが好ましい。ＴＣＲαの回収を助ける切断
部位を含むように操作されたものが好ましい。このよう
なベクターは大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther
et al., 1983, EMBOJ. 2:1791）を含むが、これに限定
されない。該ベクターでは、ＴＣＲαコーディング配列
をｌａｃ Ｚコーディング領域とインフレームでベクタ
ーに連結し、その結果、ハイブリッドＴＣＲα−ｌａｃ
Ｚタンパク質が産生されるようにする；ｐＩＮベクター
（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic acids Res. 13:310
1-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem.
264:5503-5509）等。

【００４７】酵母では、構成または誘導プロモーターを
含む多数のベクターを使用できる。総説としては、Curr
ent Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988,
Ed.Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley
Interscience, Ch. 13; Grant et al., 1987, Expressi
on and Secretion Vectors for Yeast, in Methodsin E
nzymology, Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press,
N.Y., Vol. 153, pp.516-544; Glover, 1986, DNA Clo
ning, Vol.II, IRL Press, Wash., D.C., Ch.3; および
Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeas
t, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Ac
ad. Press, N.Y., Vol.152, pp.673-684; および The M
olecular Biology of the Yeast Saccaromyces, 1982,
Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, V
ols. I and II を参照されたい。ＡＤＨまたはＬＥＵ２
などの構成酵母プロモーターまたはＧＡＬなどの誘導プ
ロモーターを使用できる（Cloning in Yeast, Ch.3, R.
Rothstein In:DNA Cloning Vol.11, A Practical Appr
oach, Ed. DM Glover, 1986, IRL Press, Wash.,D.
C.）。あるいは、外来ＤＮＡ配列の酵母染色体への組み
込みを促進するベクターを使用してもよい。

【００４８】植物発現ベクターを使用する場合、ＴＣＲ
αコーディング配列の発現には多数のプロモーターのい
ずれで行ってもよい。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮ
Ａおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプ
ロモーター（Brisson et al., 1984, Nature 310:511-5
14）；またはＴＭＶへのコートタンパク質プロモーター
（Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6:307-311）を使
用できる；あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット
などの植物プロモーター（Coruzzi et al., 1984, EMBO
J. 3:1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 22
4:838-843）；またはダイズｈｓｐ１７．５−Ｅまたは
ｈｓｐ１７．３−Ｂなどのヒートショックプロモーター
（Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-56
5）を使用できる。これらの構築物をＴｉプラスミド、
Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形
質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレー
ションなどを用いて植物に導入できる。このような技法
の総説については、例えば、Weissbach & Weissbach, 1
988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic
Press, NY, Section VIII, pp.421-463; および Griers
on & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed.,
Blackie, London, Ch.7-9 を参照されたい。ＴＣＲα
の発現に用いることのできる別の発現系は昆虫系であ
る。このような系の１つでは、オートグラファ・カリフ
ォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が外来遺伝子
の発現に使用される。このウイルスはスポドプテラ・フ
ルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄ
ａ）細胞中で増殖する。ＴＣＲαコーディング配列をこ
のウイルスの非本質的領域（例えば、多角体遺伝子）に
クローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、多角
体プロモーター）の制御下におくことができる。ＴＣＲ
αコーディング配列をうまく挿入すると、多角体遺伝子
の不活化および非閉塞（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄ）組
換えウイルス（すなわち、多角体遺伝子によってコード
されるタンパク質性のコートを欠くウイルス）の生産を
もたらす。次いでこれらの組換えウイルスを用いてスト
ドプテラ・フルギペルダ細胞を感染し、該細胞中で挿入
遺伝子を発現させる（例えば、Smith et al., 1983, J.
Viol.46:584; Smith, 米国特許第４，２１５，０５１
号を参照）。

【００４９】真核細胞系、そして好ましくは哺乳動物発
現系は、発現した哺乳動物タンパク質の適切な翻訳後修
飾をおこすことが可能である。一次転写の適切なプロセ
シング、グリコシル化、リン酸化、および遺伝子産物の
有利な分泌のための細胞の仕組みをもつ真核細胞をＴＣ
Ｒα発現のための宿主細胞として使用すべきである。哺
乳動物細胞系が好ましい。このような宿主細胞系はＣＨ
Ｏ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、
−２９３およびＷ１３８を含んでもよいが、これに限定
されない。

【００５０】例えば好ましいプロセシングおよび／また
は他のＴ細胞分子との結合のために、Ｔ細胞宿主中での
ＴＣＲαの生産はその活性を増強するかも知れない。こ
のような発現が好ましい場合には、Ｔ細胞腫瘍細胞株、
Ｔ細胞ハイブリドーマ，補助成分を生産するＴ細胞、ま
たは免疫制御因子を生産するＴ細胞を含むが、これに限
定されないＴ細胞宿主が使用できる。

【００５１】組換えウイルスまたは発現を指示するため
のウィルス要素を用いる哺乳動物細胞系を操作できる。
例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いる場合に
は、ＴＣＲαコーディング配列をアデノウイルス転写／
翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３分節
系リーダー配列と連結できる。このキメラ遺伝子を次い
でｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ組換えによっ
てアデノウイルスゲノム中に挿入してもよい。ウイルス
ゲノムの非本質的領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）
への挿入は、生存可能でかつ感染宿主中でＴＣＲα鎖を
発現できる組換えウイルスをもたらす（例えば、Logan
& Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 81:3655-3
659 参照）。あるいは、ワクシニアウイルス７．５Ｋプ
ロモーターが使用できる（例えば、Mackett et al., 19
82, Proc. Natl. Acad. Sci. USA79:7415-7419; Macket
t et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et
al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931
参照）。特に興味あるのは、染色体外要素として複製す
る能力をもつウシパピローマウイルスに基づくベクター
である（Sarver et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1:48
6）。このＤＮＡがマウス細胞中に入ったすぐ後に、プ
ラスミドは細胞当たり約１００から２００コピーで複製
する。挿入されたｃＤＮＡの転写は宿主染色体へのプラ
スミドの組み込みを必要としないので、高レベルの発現
をもたらす。これらのベクターはｎｅｏ遺伝子などの選
択可能なマーカーをプラスミド中に含むことにより安定
な発現に使用できる。あるいは、レトロウイルスゲノム
を修飾して、宿主細胞中でのＴＣＲα鎖遺伝子の導入と
発現ができるベクターとして用いることができる。（Co
ne & Mulligan, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
1:6349-6353）。高レベルの発現は、メタロチオネインI
IＡプロモーターおよびヒートショックプロモーターを
含むが、これに限定されない誘導可能なプロモーターを
用いて達成することもできる。

【００５２】組換えタンパク質を長期間、高収率で産生
させるには、安定な発現が好ましい。ウイルスの複製オ
リジンを含む発現ベクターをむしろ用いて、適当な発現
制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配
列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）に
よって制御されるＴＣＲα ｃＤＮＡ、および選択可能
なマーカーで宿主細胞を形質転換できる。組換えプラス
ミド中における選択可能なマーカーは、選択耐性を与
え、細胞の染色体中にプラスミドを安定に組み込ませ、
増殖してフォーカスを形成し、次いでこれをクローン化
して細胞系中に増やすことができる。例えば、外来ＤＮ
Ａの導入の後、操作された細胞を高栄養培地中で１−２
日生育させ、次いで選択培地に切り替えてもよい。多数
の選択系が使用でき、これには、それぞれｔｋ^-、ｈｇ
ｐｒｔ^-またはａｐｒｔ^-細胞中で用いることができる、
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et a
l., 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチン−グアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szyb
alski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202
6）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラー
ゼ（Lowry et al., 1980, Cell 22:817）遺伝子が含ま
れるが、これらに限定されるものではない。また、メト
トレキセートへの耐性を与えるｄｈｆｒ（Wigler et a
l., 1980, Natl. Acad.Sci. USA 77:3567; O'Hare et a
l., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 ）；
マイコフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ（Mulligan
& Berg, 1981,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:207
2）；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎ
ｅｏ（Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol.
150:1）；およびヒグロマイシンへの耐性を与えるｈｙ
ｇｒｏ（Santerre et al., 1984, Gene 30:147）遺伝子
のための選択の基礎としては、代謝拮抗物質耐性を用い
ることができる。最近、さらなる選択可能な遺伝子、す
なわち細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利
用するようにさせるｔｒｐＢ；ヒスチジンの代わりにヒ
スチノールを細胞が利用するようにさせるｈｉｓＤ（Ha
rtman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:8047）；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害
剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチ
ン、ＤＦＭＯへの耐性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカ
ルボキシラーゼ）（McConlogue L., 1987, In: Current
Communications in Molecular Biology, Cold Spring
Harbor Laboratory ed.）が記載されている。

【００５３】５．１．５．ＴＣＲα鎖発現産物の精製 遺伝的に操作された細胞によるＴＣＲαタンパク質産物
の発現は、例えばウエスタンブロットやラジオイムノ−
沈降、酵素連結イムノアッセイなどのイムノアッセイに
よって免疫学的に評価できる。しかしながら、発現系の
成功を最終的に試験するには、生物学的に活性を持つＴ
ＣＲα遺伝子産物の産生を見ることである。宿主細胞が
遺伝子産物を分泌する場合には、培養した形質移入宿主
細胞から得た無細胞培地のＴＣＲαまたはその免疫制御
活性をアッセイするとよい。遺伝子産物が分泌されない
場合には、細胞溶解産物のこのような活性をアッセイす
る。いずれの場合でも、ＴＣＲα活性の評価には多数の
アッセイを用いることができ、これらには発現したＴＣ
Ｒαの抗体への結合能力を測定するアッセイ、上記セク
ション５．１．１．で記載し、かつ下記セクション６．
１．５．で実例を示すＰＦＣアッセイなどの免疫機能を
評価するアッセイを含むが、これらに限定されない。

【００５４】いったん高レベルの生物学的に活性なＴＣ
Ｒαを生産するクローンを同定したら、このクローンを
増やして大量のタンパク質を生産するのに使用できる。
該タンパク質は当業界で周知の方法により精製でき、こ
の方法にはイムノアフィニティー精製、高速液体クロマ
トグラフィーなどを含むクロマトグラフ法を含むが、こ
れらに限定されない。タンパク質が培養細胞によって分
泌される場合には、ＴＣＲαは培地から容易に回収され
うる。

【００５５】Ｔ細胞の粗培養培地からＴＣＲαを精製す
る方法は、クローン化した発現産物の精製にも適用でき
る。例えば、下記の実施例で用いたＡ１．１細胞からの
ＴＣＲαを、硫酸アンモニウム沈殿とそれに続くアフィ
ニティークロマトグラフィーによってＴ細胞の粗培養培
地から精製することができる（Zheng et al., 1988,J.
Immunol. 140:1351-1358; Bissonnette et al., 1991,
J. Immunol. 146:2898-2907）。すべてのマウスＴＣＲ
α鎖上に共有される抗原決定基または抗原またはその特
異的抗原エピトープを含む抗原あるいは断片に特異的な
精製モノクローナル抗体を、臭化シアンで活性化したセ
ファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させ、ア
フィニティークロマトグラフィーに使用できる。このよ
うにして粗培養培地から精製したタンパク質の生物学的
活性は３０００倍に増えていることが示された。あるい
は、異なるＶα遺伝子ファミリーの産物に対して作製さ
れた抗体であっても、どの特定のＶα遺伝子セグメント
が問題のα鎖タンパク質をコードしているかが分かって
いれば使用できる。さらに、特定のＴＣＲα鎖の可変領
域に対する抗体を作製して、これを他の無関係なＴＣＲ
α鎖の混合物からα鎖を精製するのに使用することがで
きる。この場合には、十分な量のタンパク質が存在して
いれば、混合培養(bulk culture)Ｔ細胞の粗培養培地か
らでも特定のα鎖を単離できる。

【００５６】ＴＣＲαコーディング配列を、切断可能な
融合タンパク質としてコードするように操作した場合に
は、アフィニティー精製法を用いてＴＣＲαの精製を容
易に行うことができる。例えば、プロテアーゼ因子Ｘａ
切断認識配列を、ＴＣＲαのカルボキシル末端とマルト
ース結合タンパク質との間に操作できる。得られる融合
タンパク質は、マルトース結合タンパク質が結合するア
ミロースを結合させたカラムを用いて容易に精製でき
る。次いでＴＣＲα融合タンパク質を、マルトース含有
緩衝液で溶出し、次いでファクターＸａで処理する。切
断したＴＣＲα鎖を第２のアミロースカラムに通してさ
らに精製してマルトース結合タンパク質（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
を除去する。本発明のこの面を用いると、あらゆる切断
部位または酵素切断基質を、ＴＣＲα配列と、精製に使
用しうる結合パトナー（例えばそれに対するイムノアフ
ィニティカラムを調製できる抗原）をもつ第２のペプチ
ドまたはタンパク質との間に操作することができる。

【００５７】５．１．６．ＴＣＲα鎖を生産するための
別法 いったん特異的ＴＣＲα鎖遺伝子が分子的にクローン化
され、そのＤＮＡ配列が決定されると、そのタンパク質
産物は上記したものに加えて多数の方法によって生産す
ることができる。例えば、ＤＮＡ配列から演繹されるア
ミノ酸配列基づいて、固相化学合成法を用いてＴＣＲα
鎖を全面的にまたは部分的に生産できる（Creighton, 1
983, Proteins Structures and Molecular Principles,
W.H. Freeman and Co., N.Y. pp.50-60参照）。このア
プローチは分子の活性部位に対応するタンパク質の小さ
い部分を作製するのに特に有用である。抗原と結合する
ＴＣＲα鎖の場合、ＶおよびＪ遺伝子セグメントによっ
てコードされるタンパク質のアミノ末端にある可変領域
が抗原結合に重要である可能性が高い。したがって、α
鎖の可変領域に対応する合成ペプチドが生産されてもよ
い。さらに、α鎖不変領域の特定部分を含む大きいペプ
チドであっても、例えばもしもその領域が完全な免疫制
御応答を達成するさいに補助因子と相互作用するために
重要であることが分かっている場合には、合成してよ
い。

【００５８】クローン化ＤＮＡ配列に基づいてＴＣＲα
鎖を生産する別の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの無細胞系
におけるその遺伝子の転写および翻訳である。下記セク
ション７で実施例として示す特定の態様においては、Ａ
１．１ ＴＣＲα鎖遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写お
よび翻訳すると、その産物はＳＤＳ−ＰＡＧＥで約３
２，０００ダルトンの分子量のタンパク質であることが
示された。このタンパク質は非グリコシル化ＴＣＲαポ
リペプチド鎖に対応する。このような無細胞のｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ系は大スケールのタンパク質の産生のためには
設計されないが、このアプローチの利点は、他のタンパ
ク質合成の非存在下に特定の免疫学的反応における特定
のＴＣＲα鎖の寄与を決定的に示す方法を提供すること
である。

【００５９】抗体結合部位によってタンパク質のコンホ
メーションを分子的に模倣することは、特定ＴＣＲα鎖
の結合特異性と同様の結合特異性をもつタンパク質を生
産する別の方法を提供する。例えば、抗−イディオタイ
プ抗体または同じ抗原決定基に対するモノクローナル抗
体は、ＴＣＲα鎖の可変ドメインと構造的に同一の結合
部位を有するかも知れない。本明細書で記載するＰＦＣ
アッセイで評価されるＴＣＲα鎖免疫制御機能を示すこ
のような抗体をＴＣＲα鎖の代わりに使用できる。一定
の状況下、例えばかかる抗体が天然型α鎖よりも長いｉ
ｎ ｖｉｖｏ半減期を有することが示されたような場合
には、このような抗体を使用することが好ましい。以下
に記載する別の治療的応用においては、ＴＣＲα鎖と結
合し、かつこれを中和するモノクローナル抗体が望まし
い。これらの抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏの診断アッセイ、
例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡなどの人体を
循環するＴＣＲα鎖の検出にも使用できる。このような
モノクローナル抗体は当業界で周知の技法を用いて容易
に大量生産ができる。

【００６０】ＴＣＲαを模倣する抗体の生産には、これ
に限定する訳ではないが、マウス、ウサギ、ハムスタ
ー、ラットおよび非ヒト霊長類を含む各種の宿主動物を
所望の抗原または抗−ＴＣＲα鎖抗体で感作してＴＣＲ
α鎖を模倣する抗体を産生させて、該ＴＣＲα鎖のその
抗原への抗原特異的結合を競合的に阻害する能力、なら
びに本明細書で記載するＰＦＣアッセイで評価する抗原
に対する特異的免疫応答を制御する能力を測定する。Ｔ
ＣＲα鎖と結合し、かつこれを中和する抗体を生産する
には、宿主動物をＴＣＲα鎖自体で感作する。宿主の種
により免疫応答を増強するために各種のアジュバントが
使用でき、これにはフロインドの完全および不完全アジ
ュバント、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リソレ
シチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポ
リアニオン、ペプチド、オイル懸濁物、キーホールリン
ペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢ
ＣＧ（ｂａｃｃｉｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉ
ｎ）やコルネバクテリウム・プルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用
なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。

【００６１】モノクローナル抗体は連続的継代細胞系に
よって抗体分子の生産をもたらすいかなる技法によって
調製してもよい。これに限定する訳ではないが、最初に
ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Nature, 1975,
256:495-497）によって記載されたハイブリドーマ法、
ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kosbor et al., 1983,Im
munology Today, 4:72 Cote et al., 1983, Proc. Nat
l. Acad. Sci. 80:2026-2030）およびＲＢＶ−ハイブリ
ドーマ法（Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies
and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-9
6）を含む。適当な抗原特異性のマウス抗体分子からの
遺伝子をヒト抗体分子由来の遺伝子とスプライシングし
て”キメラ抗体”を作製するために開発された技術を使
用できる（例えば、Morrison et al., 1984, Proc. Nat
l. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger et al., 198
4, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Natur
e 314:452-454）。さらに、単鎖抗体の生産のために記
載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を単
鎖抗体の生産に応用できる。

【００６２】特定の所望の結合部位を含む抗体断片を公
知の方法で作製できる。例えば、このような断片はこれ
に限定する訳ではないが、抗体分子のペプシン消化によ
って生産されるＦ（ａｂ’）₂断片、およびＦ（ａ
ｂ’）₂断片のジスルフィド架橋を還元して作成される
Ｆａｂ断片を含む。あるいは、所望の特異性を有するモ
ノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能に
するＦａｂ発現ライブラリー（Huse et al., 1989, Sci
ence, 246:1275-1281）の構築のために記載された方法
を使用することができる。

【００６３】５．２．免疫調節剤としてのＴＣＲα鎖の
使用 ＴＣＲα鎖の抗原特異的免疫制御活性は、ヒトまたは動
物被験者におけるｉｎｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ
での広範囲な利用を提供する。抗原と結合することがで
き、かつｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイした免疫制御活性
を示すいかなるＴＣＲα鎖、またはその断片、およびそ
の誘導体も本発明の方法の実施に使用できる。補助成分
の因子が被験者の血清中に存在する場合には、ＴＣＲα
鎖を単独の活性剤として投与できる。しかしながら、Ｔ
ＣＲα鎖は補助成分に見られる生物学的に活性な因子、
成長因子または阻害物質と組み合わせて投与されうる。
抗原と結合することができ、かつ該抗原に対して通常生
じる免疫応答を抑制するＴＣＲα鎖は、過敏症、移植拒
絶、および自己免疫障害などの抗原特異的免疫応答のダ
ウンレギュレーションに特に有用でありうる。あるい
は、このようなＴＣＲα鎖またはこのようなＴＣＲα鎖
と結合する因子の除去または中和は、癌や免疫不全症な
どの疾患に対する免疫応答を増強する手段として有用で
ありうる。本発明の別の態様においては、免疫応答を増
強する抗原に特異的なＴＣＲα鎖を利用して、このよう
な抗原特異的な応答をｉｎ ｖｉｖｏで増強することが
できる。

【００６４】５．２．１．抗原特異的免疫抑制 抗原特異的免疫抑制を示す抗原結合性ＴＣＲα鎖は、免
疫反応が有害であり、抗原特異的にこのような応答を抑
制することが好ましい状態の治療に使用できる。本発明
により治療されるこのような疾患は、これに限定する訳
ではないが、過敏症（タイプI−IV）、自己免疫疾患な
らびに器官や組織の移植後の移植片拒絶応答を含む。

【００６５】過敏症は通常４群に分類される。タイプI
反応は抗原特異的ＩｇＥが引き金となるマスト細胞の脱
顆粒反応から生じる即時型過敏症である。タイプIの疾
患の例には、花粉、カビ胞子、昆虫の一部分、動物のふ
け、ハチおよびヘビ毒、工業的ダスト、ハウスダスト、
食品および薬剤などの物質によって引き起こされる通常
のアレルギーを含む。タイプII反応は、特定抗体、通常
はＩｇＧおよびＩｇＭの、細胞破壊に至る標的細胞への
作用によって引き起こされる。タイプIIの疾患の例に
は、輸血反応、胎児赤芽球症、自己免疫溶血性貧血、重
症筋無力症およびグレーヴス病を含む。タイプIII反応
は、抗原−抗体複合体形成とそれに続く抗体エフェクタ
ーメカニズムの活性化によって引き起こされる。タイプ
IIIの疾患の例には、免疫複合糸球体腎炎、グッドパス
チュア症候群およびある型の関節炎を含む。タイプIV反
応はＴ細胞、マクロファージ、繊維芽細胞およびその他
の細胞型を含む細胞−媒介性反応である。これらはまた
遅延型過敏症とも呼ばれる。アレルギー性接触皮膚炎が
このタイプの代表例である。

【００６６】自己免疫疾患とは、免疫系が自己抗原と反
応することによって組織破壊に至る一群の疾患をいう。
これらの応答は抗体、自己反応性Ｔ細胞、またはその両
方によって媒介される。その状態の多くは過敏症として
上記したものと重複する。いくつかの重要な自己免疫疾
患には糖尿病、自己免疫甲状腺炎、多発性硬化症、リュ
ーマチ性関節炎、全身性紅斑性狼瘡、および重症筋無力
症が含まれる。

【００６７】ＭＨＣについての基本的理解が組織のタイ
プ分けに技術的進歩をもたらし、これによって器官や組
織の移植の成功率が実質的に改良された。今日一般に行
われている移植手術のいくつかは、腎臓、心臓、肝臓、
皮膚、膵臓小島および骨髄などの器官および組織を含
む。しかしながら、供与者と受容者が遺伝的に同一でな
い状況においては、移植片拒絶が起こり得る。

【００６８】上記した特定の疾患に限定する訳ではない
が、これを含むすべての状況にとって、不都合な免疫反
応のダウンレギュレーションが宿主にとって有益であ
る。この点において、抗原特異的ＴＣＲαは、その他の
正常な免疫機能をすべて保持しながら、Ｔ細胞、抗体ま
たはその両方によって媒介される免疫応答を特異的に抑
制するのに使用できる。例えば、実験的アレルギー性脳
脊髄炎（ＥＡＥ）は、精製ミエリン塩基性タンパク質を
投与することによってマウスに誘導できるヒト多発性硬
化症の動物モデルである。Ｔ_Hがこの疾患の病原論に決
定的な役割を演じることが示された（Wraith et al., 1
989, Cell 57:709-715）。一定のマウス系統において自
己反応性Ｔ細胞によって認識される抗原決定基の数は限
定されている。さらに、自己免疫ＴＣＲの構築に使用さ
れたＶαおよびＶβ遺伝子セグメントも同様に限定され
るので、少数の脳炎発生エピトープに対するＴ細胞応答
の多数が同一ＴＣＲをもつ。ＴＣＲ抗原決定基に対する
抗体を用いてｉｎ ｖｉｖｏでの抗原特異的Ｔ細胞を除
いて、これによって疾患からの保護を得ることに成功し
ている（Owhashi and Heber-Katz, 1988, J. Exp. Med.
168:2153-2164）。本発明を実施するには、このような
自己反応性Ｔ細胞からＴＣＲα鎖遺伝子を単離し、適当
な宿主細胞中で発現させ、そのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび
ｉｎ ｖｉｖｏでの抗原特異的免疫応答の抑制能力を試
験すればよい。この目的にＴＣＲα鎖を使用すること
は、多発性硬化症や重症筋無力症などのある種のヒト疾
患において自己免疫Ｔ細胞が検出され、これらも同様に
ある種のＶαおよびＶβ対立遺伝子に限定された用途を
有するという最近の知見（Oksenberg et al., 1989, Pr
oc.Natl. Acad. Sci. USA 86:988-992 ）に照らして特
に重要である。

【００６９】本発明によると、上記の症状は、関連抗原
に対して生じる免疫応答を抑制する、その抗原に特異的
な有効投与量のＴＣＲα鎖を患者に投与することによっ
て治療されうる。使用するＴＣＲα鎖の選択は、本明細
書で記載するＰＦＣアッセイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏの
免疫制御アッセイにより評価できる。ＴＣＲα鎖は各種
の方法で投与され、これには注射、注入、腹腔内および
経口が含まれるが、これらに限定されない。ＴＣＲαお
よびその関連誘導体、類似体、例えば、可変領域に由来
するペプチドを単独活性剤として、または他の化合物と
組み合わせて使用できる。このような組成物は、リン酸
緩衝化食塩水、食塩水および滅菌水などの生理学的に許
容できる担体とともに投与されうる。あるいは、ＴＣＲ
αの送達にリポソームを使用できる。この点において、
リポソームは細胞特異的抗原を認識しこれと結合する抗
体と複合体とし、これによってＴＣＲα組成物の”ター
ゲッティング”手段を提供する。

【００７０】有効投与量とはｉｎ ｖｉｖｏで関連抗原
に対して生じたであろう免疫応答を抑制するのに必要な
量である。使用するＴＣＲαの量は投与法、他の活性化
合物の使用などにより変化する。一般に、０．１μｇ〜
１００μｇ／ｍｌの循環血清レベルをもたらすような投
与量が用いられる。抗原特異的応答を抑制するための最
も有効な濃度は、下記のセクション６．１．５．に記載
するＰＦＣアッセイのようなｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
に各種濃度のＴＣＲαを加え、達成した阻害レベルをモ
ニターすることにより決定される。

【００７１】５．２．２．抗原特異的免疫刺激 ある種の疾患は不十分なまたは欠陥性の免疫応答から起
こる。免疫応答の障害は免疫系の特定部分の欠如または
常軌を逸した機能によるか、あるいはこれらの応答を特
異的にダウンレギュレーションする因子の存在によるか
もしれない。後者の場合、例えば特定抗原に向けられた
免疫応答を抑制する抗原特異的ＴＣＲαが患者によって
過剰生産されているかも知れない。このような場合、Ｔ
ＣＲαの除去または中和はこのような抑制から応答細胞
を救い、これによってそれが認識する抗原に対する有効
性を増大させるであろう。本明細書に記載するＰＦＣア
ッセイを用いて、抗原特異的免疫抑制効果を示す循環性
または可溶性ＴＣＲα鎖の存在について、血清などの患
者の体液をアッセイすることができる。次いで、循環性
抑制分子を除去または中和するためにＴＣＲα鎖への抗
体を用いて患者を治療することができる。

【００７２】腫瘍特異的免疫応答が示されているにもか
かわらず、連続的に腫瘍が増殖することはＴ細胞媒介性
の抑制で説明できる。種々の実験的腫瘍系において、抗
原特異的ＴｓおよびＴｓＦの排除が、潜在的な抗−腫瘍
応答を明らかにすることが報告されている（North, 198
2, J. Exp. Med. 55:106-107; Hellstrom et al., 197
8, J. Exp. Med. 49:799-804; Nepom et al., 1977, Bi
ochim. Biophy. Acta.121-148）。抗原特異的サプレッ
サー因子が、腫瘍細胞によって、または腫瘍抗原のある
種の抑制原因エピトープを認識する際に活性化されるＴ
ｓによって直接放出されるのかも知れない（Sercarz an
d Krzych, 1991, Immunol. Today 12:111-118）。元来
はＴｓＦに対して生じたモノクローナル抗体が、Ｔ細胞
ハイブリドーマによって産生される腫瘍特異的Ｔサプレ
ッサー因子とも反応するのかも知れない（Steele et a
l., 1985, J. Immunol. 134:2767-2778）。この抗体と
結合するＴｓＦのいくつかは、抗−ＴＣＲα抗体と結合
する。したがって、腫瘍抗原に対する適当な特異性をも
つＴＣＲα鎖は、腫瘍免疫性の低下（ｄａｍｐｅｎｉｎ
ｇ）に関与し、この場合、このようなＴＣＲαの除去ま
たは中和は、腫瘍特異性応答の回復および増強に有利で
あるだろう。

【００７３】患者中における天然型ＴＣＲα鎖の活性
は、その活性を中和する、すなわち抗原との結合能力お
よび／または得られる抗原特異的免疫抑制効果を中和す
る該α鎖に特異的な抗体をｉｎ ｖｉｖｏ投与すること
により阻害されるであろう（上記セクション５．１．
４．参照）。ＴＣＲαの不変または可変領域への抗体が
使用できるが、その特定抗原に特異的なＴＣＲα鎖のみ
が中和され、これによって免疫応答が抗原特異的な方法
で増強されるので、可変領域に結合するものが好ましい
かもしれない。あるいは、検出可能なレベルの可溶性腫
瘍抗原特異的ＴＣＲα鎖をもつ癌患者の血清を、抗体を
含むカラムにｅｘ ｖｉｖｏで通す、すなわちプラズマ
フェレーシスによって、α鎖または抗原またはそのペプ
チドに吸着させることができる。

【００７４】ｉｎ ｖｉｖｏの使用のためには、抗体を
注射、注入、腹腔および経口を含むが、これに限定され
ない各種の方法で投与することができる。抗体はリン酸
緩衝化食塩水、食塩水および滅菌水を含む生理学的に許
容できる担体中で投与する。抗体の使用量は投与方法、
他の活性化合物の使用などにより変化するが、一般には
遊離の全身性ＴＣＲα鎖のすべてでなくともその大半が
結合するような飽和投与量である。ｅｘ ｖｉｖｏ吸着
のためには、抗体またはカラムに結合させる抗原の量
は、患者の血清中のすべての遊離のＴＣＲα鎖でなくと
もその大半を除去するのに十分な量である。

【００７５】特定の免疫抑制性ＴＣＲα鎖の発現および
全身性放出を阻害して、これによって抗原特異的免疫応
答を選択的に増強するために、アンチセンスオリゴヌク
レオチドを使用できる。この点においては、触媒活性を
示す相補的オリゴヌクレオチド、すなわちリボザイムの
アプローチを使用できる。一般的には例えば、ＰＣＴ国
際公開ＷＯ９０／１１３６４；Sarver et al., 1990, S
cience 247:1222-1225を参照されたい。完全ＴＣＲαを
使用するよりも、Ｖαアンチセンスまたは各ＴＣＲα鎖
に対するリボザイムオリゴヌクレオチドを使用する方
が、興味ある特定ＴＣＲαのみを阻害するので好まし
い。この目的のためには、公知のいかなるＴＣＲα鎖配
列のｍＲＮＡに相補的なヌクレアーゼ耐性アンチセンス
Ｖαオリゴデオキシヌクレオチドを合成してもよい。こ
れが抗原特異的Ｔ細胞に取り込まれると、これらの薬剤
が塩基対によってその相補的なｍＲＮＡ配列とハイブリ
ダイズし、翻訳をブロックしてコードされるタンパク質
産物の産生を阻止しうる（このような技術の総説として
は、Green et al., 1986, Ann. Rev. Biochem. 55:569-
597を参照）。

【００７６】本発明の別の態様においては、興味ある抗
原に特異的であって、かつ特異的免疫応答を増強するＴ
ＣＲα鎖を上記セクション５．１．１．に記載したよう
にして同定できる。特定抗原に対する患者の免疫応答を
増強するために、治療的に有効な投与量のこのようなＴ
ＣＲα鎖を患者に投与してよい。べつの態様において
は、本発明は実質的に純粋な融合ポリペプチドＲ₁−
［Ｘ₁］−Ｒ₂（式中、Ｒ₁は担体ペプチド、Ｒ₂は構造遺
伝子によってコードされるポリペプチド、そしてＸ₁は
タンパク質分解酵素認識配列である）を提供する。”担
体ペプチド”は融合ペプチド配列のアミノ末端に位置す
る。原核生物の場合、本発明の融合ポリペプチドの担体
ペプチドは融合タンパク質を封入体、外質、外膜、また
は好ましくは外部環境へと輸送するように機能しうる。
真核生物の場合、担体ペプチドは小胞体を通って融合ポ
リペプチドを輸送するように機能すると信じられる。次
いで分泌タンパク質はゴルジ体を通って、分泌小胞へ
と、そして細胞外空間へと、そして好ましくは外部環境
へと輸送される。本発明の担体ペプチドはカルモデュリ
ン（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）ポリペプチドを含むが、こ
れに限定されない。本発明に従って使用できる担体ペプ
チドの範疇は、プレプロペプチドおよびタンパク質分解
酵素認識部位を含む外膜ペプチドを含む。許容できる担
体ペプチドはまたホルモンのアミノ末端プロ領域を含
む。本明細書に記載する同様の性質をもつ他の担体ペプ
チドは当業者に公知であり、過度の実験を必要とせずに
容易に確認できる。

【００７７】本発明のある態様においては、担体ペプチ
ドが発現ベクター中に含まれ、これは特に担体タンパク
質のＮ−末端近傍に特異的に位置する。本発明の実施例
で使用するベクターはカルモデュリンヌクレオチド配列
を使用するが、融合タンパク質を小胞体（真核生物の場
合）へと、そして外部環境へと、または封入体（原核生
物の場合）へと輸送する手段を提供する他の配列も本発
明には同様に有効であろう。上記したこのような配列は
当業者には公知である。

【００７８】本発明の担体ペプチドのカルボキシ末端
は、構造遺伝子によってコードされるポリペプチドが融
合タンパク質から容易に分離できるように、タンパク質
分解酵素認識部位を含む。切断認識部位に差異があれ
ば、タンパク質分解の特異性の異なる酵素が存在する可
能性がある。好ましくは、切断部位はトロンビンによっ
て認識される配列、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙである。この認識部位は、構造遺伝子によってコ
ードされる予期せぬ程高レベルの活性タンパク質の産生
を可能にする。ファクターＸａプロテアーゼによって認
識されるような他の切断部位は当業者に知られるように
なるであろう。

【００７９】本発明の融合ポリペプチドは構造遺伝子に
よってコードされるポリペプチドを、好ましくは融合ポ
リペプチドのカルボキシ末端に含む。いかなる構造遺伝
子も該担体ペプチドと切断部位と共同して発現される。
構造遺伝子は、融合ポリペプチドが単一のユニットとし
て発現されるように、発現ベクター中で担体および切断
部位と機能しうるように結合される。本発明の融合ポリ
ペプチドの産生に使用できる構造遺伝子の例は、ＴＣＲ
αの細胞膜外ドメインのみを含む切形のＴＣＲαをコー
ドする。

【００８０】本発明は実質的に純粋なポリペプチドを提
供する。ここで使用する”実質的に純粋な”とは、天然
で結合しうる他のタンパク質、脂質、炭化水素または他
の物質を実質的に含まないポリペプチドをいう。ポリペ
プチドのエピトープに結合するモノクローナル抗体を用
いるアフィニティークロマトグラフィーなどのタンパク
質精製のための標準法を用いてポリペプチドを精製する
ことが当業者には可能である。実質的に純粋なポリペプ
チドはポリアクリルアミドゲルで単一の主要バンドをも
たらす。ポリペプチドの純度はアミノ末端アミノ酸配列
分析によって決定できる。ポリペプチドには、ポリペプ
チドの活性が保持されている限り、該ポリペプチドの機
能的断片も含まれる。ポリペプチドの生物学的活性を有
するより小さいペプチドも本発明に含まれる。

【００８１】本発明はまた、融合ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドも提供する。これらのポリヌクレ
オチドはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡ配列を含む。
融合ポリペプチドの全部または一部をコードするすべて
のポリヌクレオチドもまた、その切断産物が生物学的活
性を有するポリヌクレオチドをコードする限り、ここに
含まれると理解される。このようなポリヌクレオチド
は、天然、合成、および故意に変更を加えたポリヌクレ
オチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドに部位特異的
突然変異を誘発することができる。ポリヌクレオチド配
列はまた、アンチセンス配列および遺伝コードの結果と
して縮重する配列を含む。天然には２０のアミノ酸が存
在し、これらの多くが１以上のコドンによって特定され
る。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされ
る融合ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化しな
い限り、すべての縮重ヌクレオチド配列が本発明に含ま
れる。

【００８２】本発明のＤＮＡ配列は上記したいくつかの
方法によって得ることができる。例えば、当業界で周知
のハイブリダイゼーション法を用いてＤＮＡを単離でき
る。これに限定する訳ではないが、これらには１）共有
するヌクレオチド配列を検出するための、ゲノミックま
たはｃＤＮＡライブラリーへのプローブのハイブリダイ
ゼーション；２）共有する構造上の特徴を検出するため
の、発現ライブラリーの抗体スクリーニング；および
３）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）による合成を含
む。

【００８３】所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の
全配列が分かっている場合には、ＤＮＡ配列の合成法は
しばしばえり抜きの方法である。所望のポリペプチドの
アミノ酸残基の全配列が未知の場合には、ＤＮＡ配列の
直接合成は不可能であり、えり抜きの方法はｃＤＮＡ配
列の合成である。ｃＤＮＡ配列を単離する標準法の中
で、高レベルで遺伝子発現をするドナー細胞中に豊富な
ｍＲＮＡの逆転写から誘導されるプラスミドまたはファ
ージが有するｃＤＮＡライブラリーを形成するこは興味
深い。ポリメラーゼ連鎖反応法と組み合わせて使用する
と、まれな発現産物であってもクローン化できる。ポリ
ペプチドのアミノ酸配列のかなりの部分が分かっている
場合には、ターゲットのｃＤＮＡ中に推定的に存在する
配列を複製する、標識した１本または２本鎖のＤＮＡま
たはＲＮＡプローブ配列を作製して、これをあらかじめ
１本鎖形に変性しておいたｃＤＮＡのクローン化コピー
上で実施するＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法
に使用してもよい（Jay et al., Nucl. Acid Res. 11:2
325, 1983）。

【００８４】本発明の融合ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列は、適当な宿主細胞中にＤＮＡ移入することに
よってｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させることができる。”
宿主細胞”とは、その中でベクターを増殖させ、そのＤ
ＮＡを発現させる細胞である。この語はまた、当該宿主
細胞のすべての子孫も含む。複製中に突然変異が起こり
得るので、すべての子孫が親細胞と同一ではないかも知
れないことが理解される。しかしがら、このような子孫
も”宿主細胞”という語を使用する場合には含まれる。
本発明の好ましい宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ，Ｓ．ａｕｒ
ｅｕｓおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むが、その
他の当業界で公知のグラム陰性およびグラム陽性生物
も、発現ベクターが宿主中における発現を可能にする複
製オリジンを含む限り、使用できる。安定な移入法、言
い換えれば外来ＤＮＡが継続的に宿主中で維持される方
法は当業界で公知である。

【００８５】本発明においては、ポリヌクレオチド配列
を組換え発現ベクター中に挿入できる。”組換え発現ベ
クター”の語は、ＴＣＲαの遺伝子配列と、例えば担体
ペプチドおよび切断部位とを挿入または組み込むように
操作された、当業界で公知のプラスミド、ウイルスまた
は他のビヒクルをいう。このような発現ベクターは、挿
入された遺伝子配列の宿主による有効な翻訳を容易にす
るプロモーター配列を含む。発現ベクターは典型的には
複製オリジン、プロモーター、ならびに形質転換された
細胞の表現型の選択を可能にする特定遺伝子を含む。本
発明の使用に適したベクターは、これに限定される訳で
はないが、細菌中での発現に用いられるＴ７−ベースの
発現ベクター（Rosenberg et al., Gene 56:125, 198
7）、哺乳動物細胞中での発現に用いられるｐＭＳＸＮ
Ｄ発現ベクター（Lee and Nathans,J. Biol. Chem. 26
3:3521, 1988）および昆虫細胞中での発現に用いられる
バキュロウイルス由来のベクターを含む。ＤＮＡセグメ
ントは、プロモーター（例えば、Ｔ７、メタロチオネイ
ンI、またはポリヘドリンプロモーター）などの制御要
素と機能しうるように結合されてベクター中に存在しう
る。

【００８６】例えば、本発明の融合ペプチドの発現は、
酵素β−ガラクトシダーゼの調節によりラクトース利用
を媒介するラクトースまたはｌａｃオペロンを含む大腸
菌の染色体ＤＮＡの制御下におかれうる。ｌａｃ制御系
はＩＰＴＧにより誘導しうる。ＩＰＴＧが添加されるま
でｌａｃプロモーターの抑制を許すｌａｃ Ｉｑリプレ
ッサー遺伝子を含むようにプラスミドを構築できる。当
業界で公知のその他のプロモーター系は、ベータラクタ
マーゼ、ラムダプロモーター、プロテインＡプロモータ
ー、およびトリプトファンプロモーター系を含む。これ
らが最もよく使用されるが、他の微生物プロモーターも
同様に使用できる。ベクターはレプリコン部位ならびに
宿主細胞と適合性の種に由来する制御配列を含む。さら
に、ベクターは、形質転換された細胞中での表現型選択
を提供することのできる特定遺伝子を含むことができ
る。例えば、ベータラクタマーゼ遺伝子は、ベータラク
タマーゼ遺伝子をもつベクターを含む形質転換細胞にア
ンピシリン耐性を与える。

【００８７】本発明の融合ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド配列を原核または真核生物中で発現させ
ることができる。宿主は微生物、酵母、昆虫および哺乳
動物有機体を含みうる。真核のまたはウイルスの配列を
もつＤＮＡ配列を原核細胞中で発現させる方法は当業界
で周知である。宿主中で発現および複製できる生物学的
に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターが
当業界で公知である。このようなベクターは本発明のＤ
ＮＡ配列を組み込むのに使用できる。本発明の宿主細胞
は融合タンパク質の切断部位を認識する酵素を自然にコ
ードしてよい。しかしながら、その中で融合ポリペプチ
ドの発現が望まれる宿主が切断部位を認識する酵素を固
有にもっていない場合には、このような酵素をコードす
る遺伝子配列を、融合タンパク質のためのポリヌクレオ
チド配列とともに宿主細胞に同時トランスフェクション
することができる。

【００８８】組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は
当業者に周知の慣用法によって実施できる。宿主が大腸
菌などの原核生物である場合には、ＤＮＡ取り込みので
きるコンピテント細胞を、指数的成長期の後に回収した
細胞から調製し、次いで当業界で周知の方法によってＣ
ａＣｌ₂法で処理することができる。あるいは、MgCl₂ ま
たはRbClを用いることもできる。形質転換はまた、宿主
細胞の原形質体が形成された後に、またはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。

【００８９】宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム
共沈殿、マイクロインジェクションなどの慣用的な機械
的方法、エレクトロポレーション、リポソームに封入し
たプラスミドやウイルスベクターの挿入のようなＤＮＡ
トランスフェクション法を使用できる。真核生物細胞は
また、本発明の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列と、単純ヘルペスチミシンキナーゼ遺伝子などの選択
可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子とで同
時トランスフェクションできる。別の方法では、真核細
胞を一時的に感染または形質転換してタンパク質を発現
させるために、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）また
はウシパピローマウイルスなどの真核ウイルスベクター
を使用する（Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring
Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982）。

【００９０】本発明の微生物または真核生物で発現させ
たポリペプチドの単離および精製法は、例えば分取クロ
マトグラフィーによる分離、およびモノクローナルまた
はポリクローナル抗体などの使用を含む免疫学的分離な
どのいかなる慣用法によっても行うことができる。以上
の記載は本発明を一般的に記載する。以下の特定の実施
例を参照することにより本発明はさらに完全に理解され
るが、該実施例は説明の目的で記載するものであり、本
発明の範囲を限定するものではない。

【００９１】

【実施例】

６．実施例：レトロウィルス遺伝子移入により証明され
るＴＣＲα鎖の免疫調節活性 6.1. 材料及び方法 6.1.1. 動物 Ｃ５７Ｂ１／１０及びＣ５７Ｂ１／６動物をジャクソン
・ラボラトリーズ（バーハーバー，ＭＥ）から購入し
た。 6.1.2. 細胞株 Ａ1.１（フォテダー(Foteder) ら, 1985, J. Immunol.
135:3028-3033)、Ｂ９（フォテダーら, 1985, J. Immun
ol. 135:3028-3033)、ＢＷ１１００（ホワイト(White)
ら, 1989, J. Immunol. 143:1822-1825)、１７5.２（グ
ライヘンハウス(Glaichenhaus)ら, 1991, J. Immunol.
146:2095）及びＡ1.１ＴＣＲ遺伝子を発現するこれら細
胞株の誘導体（以下の6.1.4.節を参照のこと）を、ＲＰ
ＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ中で維持した。また、多く
の細胞株を無タンパク、無血清培地（セル・バイオテク
ノロジーズ，ロックビル，ＭＤ）にも順応させた。

【００９２】6.1.3. 抗体及び抗原 ＣＤ３εに特異性を有するモノクローナル抗体（１４５
−２Ｃ１１，ハムスターＩｇＧ）（レオ(Leo) ら, 198
7, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1374-1378)、及び
ＴＣＲ Ｃαに特異性を有するモノクローナル抗体（Ｈ
２８−７１0.１６，ハムスターｌｇＧ）（ベッカー (Be
cker) ら, 1989, Cell 58: 911-921）をプロテインＡア
フィニティクロマトグラフィー（プロテインＡ Superos
e, ファルマシア）により精製した。表面ＣＤ３の蛍光
染色及びＦＡＣＳ分析（ゼング(Zheng) ら, 1989, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3758-3762）及びＨ２８
−７１０での抗体アフィニティクロマトグラフィーを先
に記載されたようにして行った（ビソネッテ (Bissonet
te) ら, 1991, J. Immunol 146:28-98-2907 ）。ＳＲＢ
Ｃは、モース・バイオロジカルズ（エドモントン，Ａ
Ｂ）又はコロラド・シアラム社（デンバー，ＣＯ）から
購入した。選択合成ポリペプチド、つまりポリ１８及び
その構造に基づくペプチド（図４に挙げた）を、先に記
載されたようにして調製した（フォテダーら, 1985, J.
Immunol. 135:3028-3033)。

【００９３】6.1.4. Ｔ細胞ハイブリドーマ内へのＴＣ
Ｒ遺伝子のレトロウィルス移入 全細胞ＲＮＡを通常のグアニジン−イソチオシアネート
及び塩化セシウム法により１０⁹ 細胞から単離した。ポ
リＡ⁺ ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロースアフィニティ
クロマトグラフィーにより回収した。第１鎖合成をオリ
ゴ−ｄＴプライマーと逆転写酵素を使用して行い、第２
鎖合成をＤＮＡポリメラーゼＩ及びＲＮアーゼ(RNase)
Ｈを使用して行った。メチル化された平滑末端二本鎖
（ｄｓ）ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩリンカーに連結した。Ｅ
ｃｏＲＩ消化に続いて、ｄｓｃＤＮＡをその大きさにつ
いてアガロースゲル上で選別し、スペルミン沈澱により
精製し、そしてλｇｔ１０内にクローン化した。該λＤ
ＮＡを in vitro でパッケージした（ギガパックゴール
ド，ストラタジーン，ラホヤ，ＣＡ）。約２０0,０００
個のプラークを、³²Ｐ放射性ラベル化Ｃα及びＣβプロ
ーブを使用する in situハイブリダイゼーションにより
スクリーニングした。該ＣαプローブとＣβプローブ
は、（牛インシュリン特異的Ｔ細胞ハイブリドーマから
調製した）ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
のに使用した。標準ジデオキシ配列決定用に、陽性クロ
ーンからの挿入ＤＮＡをＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ
１９に連結した。

【００９４】本明細書に記載の実施例で使用する全ての
レトロウィルスベクターはＮ２ベクターの誘導体である
（ケラー (Keller) ら, 1985, Nature 318:149-154）。
Ａ1.１ＴＣＲα及びβｃＤＮＡは全配列を決定した。簡
単に説明すれば、Ａ1.１αｃＤＮＡは、Ｖα_1.2(アーデ
ン(Arden) ら, 1985, Nature 316:783-787）及びＪαＴ
Ａ６５遺伝子セグメントを使用し、Ａ1.１βｃＤＮＡ
は、Ｖβ₆(バース(Barth) ら, 1985, Nature 316:517-5
23）、Ｄβ₂(スイ(Sui) ら, 1984, Nature 311:344-34
9）及びＪβ_2.7(ガスコイン(Gascoigne) ら, 1984, Nat
ure 310:387-391）遺伝子セグメントを使用する。α鎖
ｃＤＮＡの発現をレトロウィルスＬＴＲから始め、β鎖
の発現をＴＣＲ Ｖβ₂ プロモーター及びＴＣＲβエン
ハンサーの制御下で行った。両挿入物をＮ２ベクターの
ＸｈｏＩ部位内にクローン化した。これら構築物をパッ
ケージング細胞株ψ２（マーン (Mann) ら, 1983, Cell
33: 153-159）及びＰＡ３１７（ミラー (Miller) 及び
ブチモア(Buttimore) ら, 1986, Mol. Cell. Biol., 6:
2895-2902）内にトランスフェクションした。該クロー
ン化されたプロデューサー細胞株は、標準法（ミラー及
びブチモアら, 1986, Mol. Cell. Biol., 6: 2895-290
2）により測定したところ、５×１０⁵ 〜１×１０ ⁶ の
力価を有した。受容体Ｔ細胞ハイブリドーマを、該プロ
デューサー細胞株の上清により、記載されたようにして
（ケラーら, 1985, Nature 318:149-154）感染させ、Ｇ
４１８（0.８〜1.０ｍｇ／ｍｌ）中で１０日間選択し
た。Ａ1.１αを発現する１７5.２細胞の場合には、抗Ｃ
Ｄ３で蛍光染色してからＦＡＣＳｔａｒプラス（ベクト
ン−ディッキンソン）を使用した細胞選別により更に選
択を行った。形質導入されたＴＣＲ遺伝子の発現は、抗
Ｖβ₆ モノクローナル抗体（パイネ(Payne) ら, 1988,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7695-7698)又は抗ＣＤ
３のいずれかを使用するＦＡＣＳ分析により、又はコン
トロール及び感染した受容体Ｔ細胞ハイブリドーマから
のＲＮＡのＰＣＲ分析により確認した。Ｖα₁ 及びＣα
遺伝子セグメントに特異的なプライマーをＰＣＲに使用
した。増幅した産物をＡ1.１αｃＤＮＡの接合部領域に
特異的な５’末端ラベル化アンチセンスオリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズさせた。

【００９５】6.1.5. 抗原特異的調節活性の in vitro
分析 Ａ1.１誘導抗原特異的調節活性を分析するために、簡単
な抗原特異的系を用いた（ゼングら, 1988, J. Immunol
140:1351-1358; ビソネッテら, 1991, J. Immunol 14
6:28-98-2907;ゼングら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 86: 3758-3762）。Ｃ５７Ｂ１／６又はＣ５７Ｂ
１／１０マウスからの脾臓細胞（１×１０ ⁷ ）を、１０
％ＦＣＳ及び５×１０^-5Ｍ ２−ＭＥを補充したＲＰＭ
Ｉ１６４０の１ｍｌ培養液の中に入れた。各培養液に、
ポリ１８又は置換されたポリペプチドと結合した１％Ｓ
ＲＢＣ５０μｌを加えた。該培養液に、“補助成分”
（10〜15％）と共に又は“補助成分”なしで、濾過滅菌
したハイブリドーマ上清を添加することによって、抑制
活性を評価した。この補助成分は、前記の5.1.1.節に記
載したようにして（ゼングら, 1988, J. Immunol 140:1
351-1358; ビソネッテら, 1991, J. Immunol 146:28-98
-2907 を参照のこと）、ＳＲＢＣに免疫感作した動物か
らのマウスＴ細胞を培養した後、その上清をＳＲＢＣで
吸着して調製した。また、Ｔ細胞ハイブリドーマの培養
上清、つまり３−１−Ｖ（以下の８節に記載されてい
る）を補助上清として使用してもよい（図１）。該培養
液を３７℃で加湿した９２％空気／８％ＣＯ₂ 中でイン
キュベートし、５日後に抗ＳＲＢＣＰＦＣ評価を行っ
た。本明細書に示した全ての実験において、Ｔ細胞ハイ
ブリドーマの上清も該補助上清も、単独で添加した場合
には免疫応答に影響を与えなかった。従って、本明細書
に記載した全コントロール及び実験培養液は補助上清を
含有し、補助上清なしの結果は示されていない。

【００９６】6.1.6. Ｔ細胞誘導タンパク質へのビオチ
ン複合ペプチドの直接結合 ペプチドＥＹＫ（ＥＹＡ)₄ＥＹＫ及びＥＹＫＥＹＡＥＹ
ＡＡＹＡＥＹＡＥＹＫを、記載されたようにして（ベイ
ヤー(Bayer) 及びウィルチェック (Wilcheck),1980, Me
thods Biochem. Anal., 26:1-45）ビオチンと複合化さ
せ、改良ＥＬＩＳＡ分析法（ガリナ(Gallina) ら, 199
0, J. Immunol., 145:3570-3577）により細胞上清にお
ける抗原結合活性を評価した。無タンパク、無血清培地
で成育した細胞株からの上清をセントリコン３０濾過シ
ステム（アミコン，ダンバース，ＭＡ）上で約５０〜２
００分の１に濃縮し、炭酸緩衝液（ｐＨ9.６）で種々の
濃度に希釈して、イムノロンIIプレート（ダイナテッ
ク，シャンティリー，ＶＡ）上に３７℃で２時間コーテ
ィングした。ＰＢＳ＋0.０５％ツィーン２０で洗浄後、
結合した物質を１：５００の希釈度で１００μｌのビオ
チン化ペプチドと共に３７℃で１時間インキュベート
し、洗浄し、１：２０００に希釈したエキストラアビジ
ン−アルカリ性ホスファターゼ複合体（シグマ）と共に
インキュベートし、洗浄し、そしてリン酸ニトロフェニ
ル基質（シグマ）で発色させた。適当にインキュベート
した（４℃で一晩であることが多い）後にＯＤ４１０ｎ
ｍを測定した。幾つかの実験において、結合についての
競合性を評価するために、ウェルあたり１００ｎｇ〜１
μｇの（ビオチンなしの）ペプチド、並びに活性ビオチ
ン化ペプチドを添加した。

【００９７】6.2. 結果 6.2.1. ＴＣＲβを伴った又は伴わないＴＣＲαの移入
が抗原特異的活性をもたらす能力を与える 図３Ｂに示すように、ＥＹＫ（ＥＹＡ)₄と結合したＳＲ
ＢＣが培養液中に存在する場合に、Ａ1.１の上清による
抗ＳＲＢＣ ＰＦＣ応答の阻害が認められたが、結合し
ていないＳＲＢＣ又は他のペプチドと結合したＳＲＢＣ
が存在する場合は認められなかった。Ａ1.１により証明
される免疫調節活性の優れた抗原特異性は以前に記載さ
れており（ゼングら, 1988, J. Immunol 140:1351-135
8; ビソネッテら, 1991, J. Immunol 146:28-98-2907
）、これら結果の幾つかを図４に纏めた。

【００９８】細胞株１７5.２はＴＣＲβ及びＣＤ３成分
を発現するが、機能性ＴＣＲα遺伝子を欠いている（グ
ライヘンハウスら, 1991, J. Immunol. 146:2095）。１
７5.２細胞をＡ1.１−ＴＣＲαを発現するレトロウィル
スで感染して（前記の6.1.4.節を参照のこと）該細胞を
Ｇ４１８中で選択し、次いで、ＣＤ３⁺ 細胞の細胞選別
により更に選択した。選択した細胞上でのＣＤ３の発現
（図３Ａ）により、ＴＣＲα鎖が該選択した細胞（１７
5.２−Ａ1.１α）内で発現されることが確認された。１
７5.２−Ａ1.１αからの上清を集めて in vitro 分析法
で試験した。図３Ｂに示すように、これらの上清はＡ1.
１の上清と同じ抗原特異的調節活性を示したが、１７5.
２からの上清は活性を持たなかった。１７5.２のもとの
ＴＣＲ及び特異性はＡ1.１のものと完全に無関係である
（グライヘンハウスら, 1991, J.Immunol. 146:2095）
から、これらの結果は、Ａ1.１ＴＣＲα鎖遺伝子の発現
が抗原特異的調節活性をもたらすことに帰着することを
明らかにしている。加えて、この免疫調節活性はＴＣＲ
αに対する抗体を添加することにより中和され得、これ
は、該上清中で分泌されたＴＣＲα鎖がこの活性の原因
であることを示している（図５）。コントロールとし
て、図６Ａ及びＢは、Ａ1.１により認識されたものとは
異なるポリ１８のエピトープに特異的なＴ細胞ハイブリ
ドーマＢＢ１９からのＴＣＲα遺伝子のトランスフェク
ションが、１７5.２の２つのサブクローン（ＡＦ５及び
ＡＦ６）の細胞表面上でのＣＤ３発現を誘発したことを
示している。しかしながら、親クローンＢＢ１９のよう
に、該トランスフェクタントはそれらの上清中に如何な
る免疫調節活性ももたらさなかった（図７）。従って、
ポリ１８特異的Ｔ細胞の全てが免疫調節活性を有するＴ
ＣＲα鎖を分泌するとは限らない。

【００９９】この観察結果を更に究明するために、もう
１つの細胞株、つまりＢ９をＡ1.１のＴＣＲα又はβを
保持するレトロウィルスベクターで感染させた。Ａ1.１
のように、Ｂ９はＴＣＲα及びβの両方を発現し、Ｉ−
Ａ^d で示される抗原、つまりポリ１８に応答してＩＬ２
を産生する（フォテダーら, 1985, J. Immunol. 135:30
28-3033)。図８に示すように、Ｂ９ではなくＡ1.１から
の上清が抗原特異的調節活性を示し、Ａ1.１ＴＣＲα鎖
を発現するＢ９細胞（Ｂ９−Ａ1.１α）もこの活性をも
たらしたが、Ａ1.１ＴＣＲβ鎖を発現するＢ９細胞（Ｂ
９−Ａ1.１β）はもたらさなかった。Ａ1.１からのＴＣ
Ｒαとβの両方を発現するＢ９細胞（Ｂ９−Ａ1.１α
β）は該調節活性をもたらしたので、後者はＴＣＲβの
遮断作用によるのではない。

【０１００】Ｂ９−Ａ1.１αの上清を固定化抗ＴＣＲα
抗体で抗体アフィニティクロマトグラフィーにより分画
して、抗原特異的調節活性について試験した。この分析
において、ＳＲＢＣに結合した４つのペプチドのパネル
を使用した。図９に示すように、Ｂ９−Ａ1.１αからの
可溶性活性成分が抗ＴＣＲαに結合して溶出した。置換
されていないペプチド及び（残基３又は１０で置換され
たペプチドではなく）アミノ酸７で置換されたペプチド
について認められた特異性は、Ａ1.１からの抗原特異的
活性の特徴を示している（ビソネッテら, 1991, J. Imm
unol 146:2898-2907）（図４を参照のこと）。先に議論
したように、この特異性は、Ａ1.１ＴＣＲにより認識さ
れるポリ１８エピトープと相関関係を有している（ビソ
ネッテら, 1991, J. Immunol 146:28-98-2907 ）。

【０１０１】Ｂ９に加えて、レトロウィルスベクターを
用いて、Ａ1.１ＴＣＲα遺伝子をもう１つのポリ１８特
異的細胞株、つまりＢ1.１に形質導入した。Ｇ４１８で
の選択ののち、Ｂ1.１−Ａ1.１α細胞株が抗原特異的免
疫調節活性をもたらすことが見出された。なお、もとの
細胞株（Ｂ1.１）はこれをもたらさない。かくして、２
つのＴＣＲα^+b+ （ｂはβを表す）Ｔ細胞ハイブリドー
マ（Ｂ９，Ｂ1.１）及び１つのＴＣＲα^-b+ Ｔ細胞ハイ
ブリドーマ（１７5.２）が、Ａ1.１ＴＣＲα遺伝子の遺
伝子移入後にポリ１８特異的調節活性をもたらした。Ｔ
ＣＲβ非存在下でのＡ1.１ＴＣＲαの発現が抗原特異的
調節活性をもたらすことができるか否かを更に明らかに
するために、Ａ1.１ＴＣＲα又はＡ1.１ＴＣＲβをＢＷ
１１００細胞に移入した。ＢＷ１１００細胞は完全なＴ
ＣＲα及びβを欠いている（ホワイトら, 1989, J. Imm
unol., 143:1822-1825）ので、ＴＣＲα遺伝子移入のあ
らゆる効果が直接ＴＣＲαによるものとなる。図１０に
示すように、ＢＷ１１００−Ａ1.１βではなくＢＷ１１
００−Ａ1.１αからの上清が免疫調節活性を示した。他
の遺伝子移入実験で、この活性はＡ1.１の抗原特異性を
示した。

【０１０２】6.2.2. ＴＣＲαの遺伝子移入は直接抗原
結合活性をもたらすことと相関関係がある ここに記載した実験は、Ａ1.１から放出されたＴＣＲα
鎖が抗原に直接結合することを明らかにするものであ
る。それは、このＴＣＲα鎖に生物学的活性を付与す
る、他の細胞のものと比較して際立った特徴である。図
１１Ａに示すように、Ａ1.１及びＡ1.１ＴＣＲαを発現
する細胞株からの上清は、改良ＥＬＩＳＡ分析法（前記
の6.1.6.を参照のこと）で検出される抗原結合成分を含
有している。この抗原結合は、未ラベル化ペプチドによ
り効果的に競合されたが、２つの不適当なペプチドによ
っては競合されなかった（図１１Ｂ）。これら２つのペ
プチドのうちの１つはただ１つの残基でのみ該抗原性ペ
プチドと相違している。この置換は、抗原提示分析 (an
tigen presentation assay) においてＡ1.１ＴＣＲにつ
いての（ボイヤー(Boyer) ら, 1990, Eur. J. Immunol.
20: 2145-2148）及びＡ1.１誘導調節活性についての
（ビソネッテら, 1991, J. Immunol 146:28-98-2907 ）
ペプチドの抗原性を消失させることが以前に示されてい
る。これら結果は、抗原結合活性が、Ａ1.１ＴＣＲαを
発現する細胞の生物学的に活性な産物であることを示し
ており、かつ、この分子による抗原結合の特徴がその生
物学的活性を付与していることを示している。

【０１０３】6.3. 考察 ここに提示したデータは、ＴＣＲα鎖がＡ1.１細胞から
放出され、（本発明者らの生物学的分析においてはＳＲ
ＢＣに結合した）特異的抗原に結合し、そしてin vitro
でのＳＲＢＣへの免疫応答の阻害の誘発に関係してい
ることを明白に証明している。ＣＤ４⁺ Ｔ細胞ハイブリ
ドーマ、つまりＡ1.１は、合成抗原ポリ１８及び関連ペ
プチドに特異的な免疫調節活性を構成的に放出する（ゼ
ングら,1988, J. Immunol 140:1351-1358; ビソネッテ
ら, 1991, J. Immunol 146:28-98-2907 ）。ここに記載
したような他のＴ細胞株の中へのＡ1.１ＴＣＲα遺伝子
の遺伝子移入は、この抗原特異的調節活性を構成的にも
たらす能力を与える（図３、８、９及び１０）。Ａ1.１
ＴＣＲβ鎖の移入は、この作用をもたらすこともそれに
干渉することもない（図８）。各形質導入された受容体
Ｔ細胞株により産生する可溶性活性成分の抗原特異性は
Ａ1.１のものと同一である。この活性成分は、モノクロ
ーナル抗ＴＣＲα抗体と結合し（図９）、その溶出した
活性成分はＡ1.１上清により示されるのと（ビソネッテ
ら, 1991, J. Immunol 146:28-98-2907 ）同じ厳密な抗
原特異性を示した。

【０１０４】この実施例は、ＴＣＲα鎖がＣＤ３／ＴＣ
Ｒ複合体から独立した形で細胞から放出され、そして抗
原特異的免疫応答を調節することも明確に証明してい
る。具体的には、ＢＷ１１００へのＡ1.１ＴＣＲα遺伝
子の移入は、ＢＷ１１００がＴＣＲβを完全に欠いてい
るにもかかわらず、抗原特異的調節活性を構成的にもた
らした（図１０）。ここに記載した結果は、ＰＦＣ分析
においてこの分子に活性を与えるものはＡ1.１ＴＣＲα
鎖による抗原の直接認識であること（図１１）、及び他
のＴ細胞はエピープに直接結合できないＴＣＲα鎖を放
出するためにかかる活性を示さないことも示している。

【０１０５】本発明の範囲を限定するつもりはないが、
ＴＣＲαがどのようにして免疫応答を媒介するかについ
て、この時点で少なくとも２つのモデルを提案すること
ができる。例えば、ＴＣＲαと抗原の複合体が免疫原性
であるので、ＴＣＲへの調節的免疫応答をもたらす可能
性がある。最近の研究は、特異的Ｔ細胞（リダー(Lide
r) ら, 1988, Science 239:181-183 ; サン(Sun) ら, 1
988, Nature 332:843-845) 又はＴＣＲのＶ領域におけ
る領域に対応するペプチド（バンデンバルク (Vandenba
rk) ら, 1989, Nature 341:541-544; ハウエル (Howel
l) ら, 1989, Science 246: 668-670) での免疫感作
が、in vivo で劇的な免疫調節作用をもたらし得ること
を示している。Ａ1.１ＴＣＲα鎖に関連する調節作用
は、 in vitro でのかかるＴＣＲ“ワクチン法”の形態
を象徴しているかも知れない。

【０１０６】また、ある未確認分子が抗原結合ＴＣＲα
鎖と結合してこの第２分子が該系に生物学的機能を付与
しているかも知れない。例えば、イワタら（イワタら,
1989, J. Immunol., 143:3917-3924）は、グリコシル化
阻害活性を有する分子と、幾つかのＴ細胞ハイブリドー
マの上清の中に放出された、ＴＣＲ決定基を保持する分
子との可溶性複合体を記載している。

【０１０７】７．実施例： in vitro 転写及び翻訳によ
る生物学的に活性なＴＣＲα鎖の産生 7.1. 材料及び方法 7.1.1. in vitro 転写及び翻訳 ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブをマウスのＣα及び
Ｃβ遺伝子の既知の配列に基づいて設計した。該プロー
ブを合成してポリ１８特異的Ａ1.１ハイブリドーマ細胞
から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
るのに用いた。Ａ1.１からの完全長ＴＣＲα及びＴＣＲ
βｃＤＮＡの特性決定を行い、そしてBluescriptベクタ
ー（ストラタジェン，ラホヤ，ＣＡ）内にクローン化し
た。Ｃα及びＣβの両方についてのＲＮＡを真核性 in
vitro 転写系（ＢＲＬ，ガイセルブルグ，ＭＤ）を使用
して in vitro で転写した。次いで、該ＲＮＡをウサギ
網状赤血球溶解産物系（ＢＲＬ，ガイセルブルグ，Ｍ
Ｄ）を使用して in vitro で翻訳した。オートラジオグ
ラフィー用に、³⁵Ｓ−Ｍｅｔ（ニューイングランドヌク
レアー，ボストン，ＭＡ）を該翻訳に含めた。生物学的
分析用に放射性ヌクレオチドの非存在下で該物質を翻訳
した。次いで、 in vitro で翻訳された該材料を、モノ
クローナル抗ＴＣＲα又は抗ＴＣＲβ抗体でのアフィニ
ティクロマトグラフィーにより濃縮した。ラベル化した
物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、エンハンスで処
理し、そしてＸ線フィルムに暴露した。前記の6.1.5.節
に記載した系におけるようにして、生物学的活性を分析
した。

【０１０８】7.2. 結果 Ｔ細胞ハイブリドーマ、つまりＡ1.１から他のＴ細胞株
へのＴＣＲα遺伝子の移入が、抗原特異的免疫調節活性
をもたらす能力を移入したという前記の６節における研
究結果に加えて、この遺伝子により産生される純粋な組
み換えＴＣＲαタンパク質がこの系において生物学的活
性を有するか否かを確認することが重要である。以前の
研究では、かかる生物学的に活性な因子をつくるＴ細胞
からのｍＲＮＡが in vitro で翻訳されて調節活性を生
じ得ることが示されている。それから類推して、ＴＣＲ
αＲＮＡの in vitro 翻訳が、生物学的に活性なタンパ
ク質を生成するかも知れない。 7.2.1. in vitro 転写及び翻訳産物 in vitro での転写及び翻訳により、非グリコシル化Ｔ
ＣＲαタンパク質について３2,０００ダルトンの予測し
た大きさのタンパク質が生成し、このタンパク質は抗Ｔ
ＣＲα抗体に特異的に結合して抗ＴＣＲβ抗体には結合
しないことが分かった（図１２及び１３）。 7.2.2. in vitro でつくられた翻訳産物の免疫調節活
性 該ＴＣＲαタンパク質は、ＰＦＣ分析において生物活性
を有することが分かり、そしてこの活性は抗ＴＣＲα抗
体に完全に結合（そして溶出）した（図１３）。図１３
Ａにおいて、 in vitro で翻訳されたＴＣＲαからの免
疫調節活性は抗ＴＣＲβ抗体カラムの濾液（非吸着画
分）中に及び抗ＴＣＲα抗体カラムの溶出液（吸着画
分）中に見出された。活性濾液（抗ＴＣＲβ）及び溶出
液（抗ＴＣＲα）の力価測定により、これら活性が類似
のものであることが示された。in vitro で転写され翻
訳されたＴＣＲαは免疫調節活性を示したが、ＴＣＲβ
ＲＮＡから産生されたタンパク質は示さなかった。

【０１０９】7.3. 考察 上に詳述した実験を前記の６節に記載した研究と結び付
けると、組み換えＴＣＲαが生物学的機能を有している
ことは明らかである。かくして、かかる生物学的に活性
な因子をコードするＴＣＲα鎖遺伝子は、種々の発現系
で発現されて生物学的活性を有する産物、即ち、その標
的抗原に向けられた免疫応答を特異的に抑制できるＴＣ
Ｒα鎖を産生することができる。

【０１１０】８．実施例：補助成分活性をもたらすＴ細
胞ハイブリドーマの生成 8.1. 材料及び方法 8.1.1. 動物 Ｃ５７Ｂ１／６動物をジャクソン・ラボラトリーズ（バ
ーハーバー，ＭＥ）から購入した。 8.1.2. 細胞系及び試薬 ＢＷ１１００及びＴ細胞ハイブリドーマをＲＰＭＩ１６
４０＋１０％ＦＣＳ中で維持した。ＣＤ４に向けられた
モノクローナル抗体（ＧＫ1.５）（ジアリナス(Dialyna
s) ら, 1983, Immunol. Rev., 74:29）をアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル，Ｍ
Ｄ）から得た。ウサギ及びモルモットの補体をそれぞれ
サイカン (SciCan) （エドモントン，アルベルタ，カナ
ダ）及びＧＩＢＣＯ（グランドアイランド，ＮＹ）から
得た。両補体試料を使用前にまず低バックグラウンド活
性についてスクリーニングした。抗ラットＩｇＧ抗体で
コーティングした磁性ビーズをダイナール(Dynal) から
購入した。

【０１１１】8.1.3. Ｔ細胞ハイブリドーマの生成 ＳＲＢＣに免疫感作したＣ５７Ｂ１／６マウスからの脾
臓細胞を得て、補体の存在下、ＣＤ４に対する抗体（Ｇ
Ｋ1.５）で処理した。全てのＩｇＧ⁺ 細胞を除去するた
めに、該ＣＤ４を除いた細胞を引き続き抗ラットＩｇＧ
抗体でコーティングした磁性ビーズ（ダイナールビー
ズ）と反応させた。残ったＴ細胞をリンフォライトＭ
(lympholyte M) （セダーラン・ラボラトリーズ，Ｐ
Ａ）上で遠心分離し、成育可能なＴ細胞をＰＥＧの存在
下で１：１の比率でＢＷ１１００と融合させた。ハイブ
リドーマを、ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリ
ン及びウアバインの存在下で選択した。フィラー細胞と
してマウス赤血球を使用した。成育について陽性と判断
されたウェルの上清を、前記の6.1.5.に詳細に記載した
ようにして、ＰＦＣ分析において、Ａ1.１の上清と組み
合わせて補助上清と置き代わる能力について試験した。
活性を有する培養液を二次培養液に分割し、二次細胞株
の活性を再試験した。活性を有する二次細胞株を再度分
割して、活性を有するものを0.４細胞／ウェルでクロー
ン化した。クローンを活性について再スクリーニングし
た。

【０１１２】8.2. 結果 8.2.1. Ｔ細胞ハイブリドーマは補助成分活性をもたら
す ＣＤ４⁺ Ｔ細胞及びＩｇＧ⁺ Ｂ細胞を除いたＳＲＢＣ免
疫感作マウス脾臓細胞をＢＷ１１００と融合した。クロ
ーニング後、かかるＴ細胞ハイブリドーマの１つ、つま
り３−１−Ｖが、Ａ1.１上清の存在下で試験した場合に
抗原特異的免疫調節活性の媒介において補助上清と置き
代われる補助活性を培養上清中にもたらすことが分かっ
た（図１）。３−１−Ｖ上清は、それがＡ1.１ＴＣＲα
遺伝子の天然に分泌された産物であるか in vitro で翻
訳された産物であるかに関わり無く、Ａ1.１上清との組
み合わせで機能する。従って、抗原特異的ＴＣＲα鎖と
共に使用する補助成分を再現性よくかつ構造的に分泌す
るＴ細胞のモノクローナル集団を得ることができる。

【０１１３】９．実施例：ＴＣＲα遺伝子のｃＤＮＡク
ローニング 当該技術分野で周知の技術を使用してＴ細胞からｃＤＮ
Ａライブラリーを調製することができる。ヒト及びマウ
スにおけるＴＣＲα（Ｃα）のための単一のＣ領域遺伝
子をコードするヌクレオチド配列は既知である（ウィル
ソン(Willson)ら, Immunol. Rev., 101:149-172, 198
8）ので、Ｃαに相同なＤＮＡプローブは標準法により
合成でき、かかるライブラリーをスクリーニングしてＴ
ＣＲαｃＤＮＡを同定するのに用いることができる。ま
た、特異的ＴＣＲα配列から誘導したオリゴヌクレオチ
ドプローブをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法（ムリ
ス (Mullis) ら, Method in Enzymol., 155: 335-350,
1987）におけるプライマーとして使用して、直接にクロ
ーン化され得るＴＣＲα配列のｃＤＮＡを生成すること
ができる（ローマン−ローマン(Roman-Roman) ら, 199
1, Eur. J. Immunol.,21:927-933）。

【０１１４】ヘルパーＴ細胞ハイブリドーマ、つまりＡ
1.１は上に記載されており（フォテダーら, 1985, J. I
mmunol. 135: 3028-3033）、ポリ１８（ポリ（Ｇｌｕ−
Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ)₅））と命
名した合成ポリペプチドに特異的なＴＣＲα及びβ分子
を発現し、そして特異抗原及びＩ−Ａｄの存在下で、リ
ンフォカインを放出する。このＴ細胞ハイブリドーマ
は、抗原特異的抑制に関与するポリ１８特異的可溶性因
子の構成的産生も行う。Ａ1.１により産生した因子がＡ
1.１細胞上でＴＣＲにより示されたのと同じ優れた抗原
特異性を示したこと（ゼングら, 1988, J. Immunol 14
0:1351-1358）、及びＡ1.１誘導因子の免疫調節活性が
少なくとも部分的にＴＣＲαタンパク質によりコードさ
れたこと（ビソネッテら, 1991, J. Immunol 146:28-98
-2907 ）が示されている。

【０１１５】Ａ1.１細胞のＴＣＲαｃＤＮＡをＣαプロ
ーブを使用してｃＤＮＡライブラリーからクローン化し
た。慣用のグアニジン−イソチオシアネート及び塩化セ
シウム法により、ｍＲＮＡを１０⁹ 細胞から単離し、オ
リゴ−ｄＴセルロースアフィニティクロマトグラフィー
により回収した。オリゴ−ｄＴプライマー及び逆転写酵
素を使用して第１鎖ｃＤＮＡを合成し、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ及びＲＮアーゼＨを使用して第２鎖ｃＤＮＡを合
成した。メチル化した平滑末端二本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩリンカーに連結した。ＥｃｏＲＩ消化に続いて、該
ＤＮＡをその大きさについてアガロースゲルに対して選
別し、スペルミン沈澱により精製し、λｇｔ１０内にク
ローン化した。該ファージＤＮＡを in vitro でギガパ
ックゴールド（商標）（ストラタジェン）を使用してパ
ッケージした。約２０0,０００個のプラークを、³²Ｐ放
射性ラベル化Ｃαプローブを使用した in situハイブリ
ダイゼーションによりスクリーニングした。陽性クロー
ンからの挿入ＤＮＡを標準ジデオキシ配列決定用にＭ１
３ｍｐ１８内に連結した。Ａ1.１ＴＣＲαｃＤＮＡの完
全ヌクレオチド配列を図１４に示す。

【０１１６】ハチ毒ホスホリパーゼＡ₂ （ＰＬＡ₂ ）に
特異的なＴＣＲα及びβ鎖を発現するＰＬＡ₂ 特異的グ
リコシル化阻害因子（ＧＩＦ）産生ハイブリドーマ（３
Ｂ３）が確立されている（モリら, Int. Immunol., 5:8
33-842, 1993）。このＴ細胞ハイブリドーマは、同類の
抗原及び抗原提示細胞での刺激で、免疫抑制因子、つま
りＧＩＦ、及びＰＬＡ₂ 結合ＧＩＦを構成的に産生す
る。蓄積された証拠により、抗原結合ＧＩＦが in vivo
で該抗原への免疫応答を特異的に抑制すること、及び該
抗原結合ＧＩＦが該細胞上で発現しているＴＣＲαによ
り少なくとも部分的にコードされるかも知れないことが
示されている（イワタら, J. Immunol., 141:3270-327
7, 1988; イワタら, J. Immunol., 143:3917-3924, 198
9; モリら,Int. Immunol., 5:833-842, 1993）。

【０１１７】３Ｂ３細胞のＴＣＲαｃＤＮＡを、ムリス
ら, Nucl. Acids. Res., 8:3895-3950, 1980に記載され
た方法に従ってＰＣＲによりクローン化した。ファース
トトラック（商標）ｍＲＮＡ単離キット（インビトロゲ
ン (Invitrogen) ）を使用して、５×１０⁷ ３Ｂ３細胞
からｍＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ合成システム（ファ
ルマシア）を使用してｃＤＮＡを生成させた。その生成
後に、Ｔ４リガーゼ（タカラ）を使用してｃＤＮＡを
５’末端及び３’末端で連結して環状ＤＮＡを構築し
た。マウスＣαＤＮＡをコードするオリゴヌクレオチド
プライマーをＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（アプライド・バ
イオシステムズ）によりホスホルアミダイト(phosphora
midite) 法を用いて合成した（バウケージ (Beaucage)
ら, Tetrahedron Lett., 22: 1859-1862, 1981）。

【０１１８】これらプライマーの配列は以下の通りであ
る。 ５’−ＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＡＧＧＴＣＴＧＣＡＡ
ＧＡ−３’ ５’−ＴＴＧＡＡＡＧＴＴＴＡＧＧＴＴＣＡＴＡＴＣ−
３’ ＰＣＲは、ＴａｑｌＤＮＡポリメラーゼ（タカラ）によ
り、鋳型ｃＤＮＡ、プライマー及びｄＮＴＰの存在下、
サーモ・サイクラー(thermo cycler) 中で行った。ＰＣ
Ｒの条件は、変性工程が９４℃で１分；アニーリング工
程が５４℃で１分；及び伸長工程が７２℃で２分で、こ
れらを３５サイクルした。増幅したｃＤＮＡを、ＴＡク
ローニングシステム（商標）（インビトロゲン）のｐＣ
Ｒ１０００ベクター内にサブクローン化した。該挿入物
のＤＮＡ配列は、ジデオキシ配列決定法（サンガー (Sa
nger) ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-546
7,1977）により確認した。３つの異なるＴＣＲαｃＤＮ
Ａをクローン化し配列決定した。それらのうちの２つ
は、３Ｂ３ハイブリドーマの融合パートナー細胞、つま
りＢＷ５１４７（チエン(Chien) ら, Nature, 312:31-3
5, 1984 ; クマー(Kumar) ら, J. Exp. Med., 170: 218
3-2188, 1989）から生じたものであると同定された。他
のＴＣＲαｃＤＮＡはＢＷ５１４７内では発現されない
ことが、このＴＣＲα遺伝子の異なる部分をコードする
幾つかのＰＣＲプライマーを使用して確認された。この
ことは、このＴＣＲαがＰＬＡ₂ 特異的Ｔ細胞から生じ
たことを示すものである。このＴＣＲαｃＤＮＡをコー
ドする２つの独立クローンを単離し、それらのＤＮＡ配
列が同一であることを確認した。この３Ｂ３誘導ＴＣＲ
αｃＤＮＡのＤＮＡ配列を図１５に示す。このＴＣＲα
ｃＤＮＡは２６８アミノ酸オープンリーディングフレー
ムをコードし、最初の２０アミノ酸はシグナルペプチド
であると同定された（マクエリゴット (McElligott)
ら, J. Immunol., 140:4123-4131, 1988）。

【０１１９】10．実施例：大腸菌内での組み換えＴＣＲ
αの発現−直接発現 10.1. ＴＣＲαのための発現プラスミドの構築 Ａ1.１ＴＣＲαの細胞外領域をコードする発現プラスミ
ドを構築するために、オリゴヌクレオチドをプライマー
として使用してＰＣＲによりＤＮＡフラグメントを増幅
した。細胞外領域においてアミノ酸２６〜２４０をコー
ドし、５’末端にＣｌａＩ制限部位、Shine-Dalgano 配
列（シェラー(Scherer) ら, Nucl. Acids. Res., 8:389
5-3950, 1980）及びｍｅｔ開始コドンを含み、３’末端
に２つの停止コドンとＢａｍＨＩ制限部位を含むＡ1.１
ＴＣＲαｃＤＮＡを２つのプライマーによりＰＣＲを使
用して増幅した。これらプライマーの配列は以下の通り
である。 ５’−ＡＡＣＡＴＣＧＡＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡ
ＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡ
ＧＡＡＴＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣ−３’ ５’−ＡＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＡＧ
ＴＴＴＡＧＧＴＴＣＡＴＡＴＣ−３’

【０１２０】他に断らない限り、各ＰＣＲサイクルの変
性工程は９４℃で１分に設定し、伸長工程は７２℃で２
分であった。該ＤＮＡフラグメントをＣｌａＩ及びＢａ
ｍＨＩで消化し、ｔｒｐプロモーター及びｔｒｐＡター
ミネーターを保持する発現プラスミドｐＳＴ８１１ベク
ター（図１６、特開昭６３−２６９９８３）内にその特
有のＣｌａＩ及びＢａｍＨＩ部位においてクローン化し
た。ｐＳＴ８１１−Ａ1.１ＴＣＲαＳ５と呼ぶ新規なプ
ラスミド（図１７）でコンピテントＲＲ１大腸菌宿主細
胞を形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、ｐＳ
Ｔ８１１ベクター上に保持された抗生物質（アンピシリ
ン）耐性マーカー遺伝子によった。合成オリゴヌクレオ
チド及び全ＴＣＲα遺伝子のＤＮＡ配列を、プラスミド
ＤＮＡのＤＮＡ配列決定法により確認した。２６〜２０
３アミノ酸をコードする、異なる切形のＡ1.１ＴＣＲα
を含有するもう１つの発現プラスミドを以下の３’末端
のプライマーを使用して構築した。 ５’−ＣＧＴＴＧＧＴＣＴＧＴＴＣＧＡＡＧＴＧＧＡＴ
ＴＡＴＣＣＧＴＡＧＧＣＡＡ−３’ 増幅したＤＮＡをｐＳＴ８１１ベクターに挿入して、ｐ
ＳＴ８１１−Ａ1.１ＴＣＲαＳ３と呼ぶ発現プラスミド
を生成した。

【０１２１】10.2. ＴＣＲα産生大腸菌の培養 プラスミドｐＳＴ８１１−Ａ1.１ＴＣＲαＳ５又はｐＳ
Ｔ８１１−Ａ1.１ＴＣＲαＳ３を保持するＲＲ１大腸菌
を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５０ｍｌ
のルリア培地中で培養し、一晩３７℃で成育した。該接
種源培養液を0.８％グルコース、0.４％カザミノ酸、１
０ｍｇ／リッターチアミン及び５０ｍｇ／リッターアン
ピシリンからなる１リッターのＭ９培地に他の菌が入ら
ないように移し、３時間３７℃で培養した。この最初の
インキュベーションの終盤に、４０ｍｇのインドールア
クリル酸を添加し、該培養液を更に５時間３７℃でイン
キュベートした。

【０１２２】11. 実施例：大腸菌内での組み換えＴＣＲ
αの発現−融合発現系 11.1. 発現プラスミドの構築 マツキらは、カルモジュリンｃＤＮＡ及びｔｒｐプロモ
ーターを保持するラットカルモジュリン発現プラスミ
ド、つまりｐＴＣＡＬ７を開発した（マツキら,Biotec
h. Appl. Biochem., 12: 284-291, 1990）（図１８）。
融合タンパク質を発現するために、トロンビン切断配列
も含有するカルモジュリンｃＤＮＡの３’末端に幾つか
のクローニング部位を生じさせた。詳しくは、ｐＴＣＡ
Ｌ７に挿入されたカルモジュリンｃＤＮＡを次の２つの
プライマーを使用するＰＣＲにより増幅した：１つはＣ
ｌａＩ部位を含有するカルモジュリンｃＤＮＡの５’末
端をコードし、他の１つはカルモジュリンｃＤＮＡの
３’末端の配列、つまりトロンビン切断部位及びＢａｍ
ＨＩ、ＸｂａＩ、ＮｏｔＩ及びＢｇｌ II 部位を与え
た。 ５’−ＣＧＣＡＡＴＣＧＡＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＡＡＡ
ＡＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡ−
３’ ５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡ
ＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＴＴＴＴＧＣＡ
ＧＴＣＡＴＣ−３’ 増幅したＤＮＡフラグメントをＣｌａＩ及びＢｇｌ II
で消化し、ＣｌａＩ及びＢｇｌ II で消化したｐＴＣＡ
Ｌ７プラスミドのより大きなフラグメントに挿入した。
ｐＣＦ１と呼ぶこの新規なプラスミド（図１９）でコン
ピテントＤＨ５大腸菌宿主細胞を形質転換した。該合成
オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定法
により確認した。

【０１２３】11.2. ＴＣＲαのための発現プラスミドの
構築 アミノ酸２１〜２４１をコードする、３Ｂ３由来ＴＣＲ
α細胞外領域のＤＮＡフラグメントを、それぞれ５’末
端用にＸｂａＩ部位を含有し、３’末端用に停止コドン
とＮｏｔＩ部位を含有する２つのプライマーを使用する
ＰＣＲにより、ｐＣＲ１０００−３Ｂ３ＴＣＲαプラス
ミドから増幅した。それらプライマーの配列は以下の通
りである。 5'−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧ
ＣＡＧＡＧＴ−3' 5'−ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＴＴＴＴＧＡＡＡＧ
ＴＴＴＡＧＧＴＴ−3' 増幅したＤＮＡフラグメントをＸｂａＩ及びＮｏｔＩで
消化したｐＣＦ１プラスミドと連結した。ｐＣＦ１−３
Ｂ３ＴＣＲαと呼ぶこの新規なプラスミド（図２０）で
コンピテントＷ３１１０大腸菌細胞を形質転換し、その
ＤＮＡ配列を確認した。

【０１２４】アミノ酸２６〜２４０をコードするＡ1.１
由来ＴＣＲαｃＤＮＡも、以下の２つのプライマーを使
用して上記の方法によりｐＣＦ１に挿入して、新規な発
現プラスミドｐＣＦ１−Ａ1.１ＴＣＲαＳ５を構築し
た。 ５’−ＧＡＴＣＴＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＴＣ
ＣＣＴＣＡＧＴＧ−３’ ５’−ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＡＡＧＴＴ
ＴＡＧＧＴＴＣＡＴＡＴＣ−３’ ＴＣＲαを産生する大腸菌の培養は実施例１０に記載し
た。この発現系において、カルモジュリン３Ｂ３ＴＣＲ
α又はカルモジュリンＡ1.１ＴＣＲαＳ５の融合タンパ
ク質が可溶型で発現され、全タンパク質の約１０％であ
った（図２１）。

【０１２５】12. 実施例：組み換えＴＣＲαの精製 12.1. 組み換えＴＣＲαの精製及び再生−直接発現系 Ａ1.１ＴＣＲαＳ５を発現する細胞約１ｇ湿量を３０ｍ
ｌの水に懸濁し、フレンチ−プレスにより５６２kg／cm
² （８０００ｐｓｉ）で４回破壊した。破壊した細胞ペ
レットを４℃で１５０００×ｇ、１０分間の遠心分離に
より得、水で２回洗浄した。ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動分析により、該ペレットの大部分がＡ1.１
ＴＣＲαＳ５タンパク質であることが明らかになった
（図２２）。１〜２ｍｇと見積もられる不溶性のＡ1.１
ＴＣＲαＳ５を含有するペレット画分を４ｍｌの適当な
混合液に添加して、該混合液中の成分の最終濃度が８Ｍ
尿素、５０ｍＭ酢酸ナトリウム及び0.１ｍＭ ＥＤＴＡ
となるようにした。該混合液を室温に３時間維持してＡ
1.１ＴＣＲαＳ５を可溶化した。残存する不溶性物質を
室温で１５０００×ｇで１０分間遠心分離して除去し
た。

【０１２６】可溶性Ａ1.１ＴＣＲαＳ５の再生／再酸化
のために、上清画分を４０ｍｌの適当な混合液にゆっく
りと攪拌しながら添加して、該混合液中の成分の最終濃
度が2.５Ｍ尿素、５ｍＭ酢酸ナトリウム、0.０１ｍＭ
ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ8.５）、１ｍＭ
グルタチオン（還元型）及び0.１ｍＭグルタチオン（酸
化型）となるようにした。４℃で１６時間経過した後、
４００μｌのトリフルオロアセテート（ＴＦＡ）を該混
合液に添加した。該混合液を、室温下、１ｍｌ／分の流
速で、0.１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／水で平衡化した逆相バ
イダック(Vydac) Ｃ４カラム（１×１０ｃｍ）にかけ
た。該サンプルをカラムにかけた後、カラムを１０％
（ｖ／ｖ）アセトニトリルの0.１％ＴＦＡ／水で洗浄し
た。カラムに結合したＡ1.１ＴＣＲαＳ５物質をアセト
ニトリル３０〜４０％（ｖ／ｖ）の濃度勾配の0.１％Ｔ
ＦＡ／水で溶出させた。Ｃ４カラムから取った画分溶液
を還元することなくＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分析し、画分２５〜３０に精製されたＡ1.
１ＴＣＲαＳ５タンパク質を同定した。これら画分をプ
ールし真空条件下で乾燥した。該乾燥タンパク質をＰＢ
Ｓに溶解したが、他の類似の緩衝液を使用してもよい。
Ａ1.１ＴＣＲαＳ３を上記と同じ操作により精製して再
生を行った。

【０１２７】12.2. 組み換えＴＣＲαの精製−融合発現
系 ３Ｂ３ＴＣＲαを発現する細胞約１ｇ湿量を１００ｍｌ
の５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ8.０）に懸濁し、
フレンチ−プレスにより５６２kg／cm² （８０００ｐｓ
ｉ）で４回破壊した。４℃で１５０００×ｇ、１０分間
の遠心分離により上清を取り、２ｍＭグルタチオン（還
元型）及び0.２ｍＭグルタチオン（酸化型）を含有する
５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液に対して、４℃で一晩透析
した。該サンプル溶液を適当な混合液に添加して、該混
合液中の成分の最終濃度が１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍ
Ｍ ＣａＣｌ₂ 及び５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ となるようにし
た。この混合液を、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ8.
０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ₂ 及び
５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ で平衡化したフェニルセファロース
６の流れが速く高さが低いサブカラム（ファルマシア，
３×６ｃｍ）に４℃でかけ、0.５ｍｌ／分の流速で流し
た。同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、カルモジュリン
−ＴＣＲα融合タンパク質を５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ8.０）で溶出し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分析した結果、該融合タンパク質は高度に
純化されていることが示された（図２３）。

【０１２８】該溶出画分を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含
有する５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ8.０）に対し
て４℃で一晩透析した。５０ｍｌの透析した画分にＣａ
Ｃｌ ₂ を最終2.５ｍＭ濃度まで添加し、１％のトロンビ
ン（シグマ）を加えて２５℃で６時間インキュベートし
て該融合タンパク質を消化した。消化を止めるために、
ＥＤＴＡを４ｍＭの最終濃度まで該反応液に添加し、次
いで、５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ8.０）に対し
て透析した。透析後、該混合液を限外濾過により５ｍｌ
まで濃縮して、２倍濃度のＰＢＳ緩衝液で平衡化された
ＴＳＫ Ｇ２０００ゲル濾過カラム（東洋曹達）にか
け、ＨＰＬＣにより３ｍｌ／分の流速で分画した。２ｍ
ｇの精製された３Ｂ３ＴＣＲαタンパク質が画分２４〜
２６に回収された。

【０１２９】13. 実施例：組み換えＴＣＲαの生物学的
活性 13.1. 組み換えＡ1.１ＴＣＲαの in vitro 免疫抑制活
性 組み換えＡ1.１ＴＣＲαの生物活性を評価するために、
簡単な抗原特異的系を使用した（ゼングら, 1988, J. I
mmunol 40:1351-1358 ; ゼングら, 1989, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86: 3758-3762 ;ビソネッテら, 1991,
J. Immunol 146:2898-2907）。Ｃ５７Ｂ１／６又はＣ５
７Ｂ１／１０マウスからの１×１０⁷ 個の脾臓細胞を、
１０％ＦＣＳ及び５×１０^-5Ｍ ２−メルカプトエタノ
ール（２−ＭＥ）を補充したＲＰＭＩ１６４０の１ｍｌ
培養液に入れた。ポリ１８（ＥＹＫ（ＥＹＡ)₅）又は置
換されたポリペプチドと結合した５０μｌの１％ＳＲＢ
Ｃを各培養液に加えた。該培養液に、“補助成分”（１
０〜１５％）と共に又は“補助成分”なしで組み換えＴ
ＣＲαを添加することによって抑制活性を評価した。こ
の補助成分は、ＳＲＢＣに免疫感作した動物からのマウ
スＴ細胞を培養した後、その上清をＳＲＢＣで吸着して
調製した。該培養液を３７℃で加湿した９２％空気／８
％ＣＯ₂ 中でインキュベートし、５日後に抗ＳＲＢＣ
ＰＦＣ評価（プラーク形成細胞）を行った。本明細書に
示した全ての実験において、Ａ1.１細胞培養上清を正の
コントロールとして使用した。組み換えＡ1.１ＴＣＲα
Ｓ５（c.f.実施例10.1）の免疫抑制活性は、図２４ａに
示す投与量依存挙動において認められた。この図は、２
つのコード化した実験からの結果を示しており、組み換
えＴＣＲα分子を力価測定し、次いで、各希釈液をコー
ド化したものである。組み換えＡ1.１ＴＣＲαＳ３（c.
f.実施例10.1）の免疫抑制活性も、投与量依存的に認め
られた（図２４ｂ）。

【０１３０】13.2. 組み換えＡ1.１ＴＣＲαの抗原特異
的免疫抑制活性 Ａ1.１誘導ＴＣＲα鎖の優れた免疫特異性は記載されて
いる（ビソネッテら,1991, J. Immunol 146:2898-2907;
グリーン (Green)ら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88: 8475-8479）。ＴＣＲα鎖の免疫抑制活性は、
ポリ１８又はＥＹＫＥＹＡＥＹＡＥＹＡＥＹＡを使用し
たときに認められるが、ＥＹＡＥＹＡＥＹＡＥＹＡＥＹ
Ａ及びＥＹＫＥＹＡＥＹＡＡＹＡＥＹＡの如き置換され
たペプチドを使用したときは検出されなかった。かくし
て、組み換えＡ1.１ＴＣＲαＳ５の抗原特異性は、これ
ら４つのペプチドを使用することにより評価された。組
み換えＴＣＲαタンパク質は、ポリ１８又はＥＹＫＥＹ
ＡＥＹＡＥＹＡＥＹＡが共に存在する場合だけ４×１０
^-10 Ｍの最終濃度で抑制活性を示した（図２５）。該図
は四回の実験からの結果を表しており、その左側に掲げ
た各ペプチド（又は生理食塩水）をコード化した試験管
に添加したものである。次いで、該コード化した試料を
使用してＳＲＢＣに結合し、補助上清存在下で分析培養
した。補助上清が存在しないどの場合にも、抑制は認め
られなかった。なお、各実験については、異なったコー
ドを用いていた。

【０１３１】13.3. 組み換えＴＣＲαのin vivo 免疫抑
制活性 組み換えＴＣＲαがin vivo で免疫応答を調節するか否
かを評価するために、組み換え３Ｂ３ＴＣＲαタンパク
質を、ハチ毒ＰＬＡ₂ で免疫感作したマウスに投与し
た。抗原として、ハチ毒ＰＬＡ₂ のＤＮＰ（ジニトロフ
ェニル）誘導体を標準操作により調製した。Ｂａｌｂ／
Ｃマウスを、２ｍｇのミョウバンに吸着させたＤＮＰ−
ＰＬＡ₂ １０μｇの腹腔内注射により免疫感作した。組
み換え３Ｂ３ＴＣＲαを、−１、０、２、４、６日目に
１回当たり５μｇの投与量で腹腔内注射し、コントロー
ルのマウスにはＰＢＳだけを投与した。免疫後２週間目
に各マウスから血清を採取し、抗ＤＮＰ−ＩｇＧ１及び
抗ＤＮＰ−ＩｇＥをＥＬＩＳＡ（イワタら, J. Immuno
l., 141:3270-3277, 1988）により測定した。抗ＤＮＰ
−ＩｇＧ１及び抗ＤＮＰ−ＩｇＥはかなり抑制された
（表１）。抗原特異性を評価するために、ＤＮＰ−オボ
アルブミンを抗原として使用して組み換え３Ｂ３ＴＣＲ
αの活性を評価した。予測通り、ＤＮＰ−オボアルブミ
ンへの抗ＤＮＰ抗体応答は、組み換えＴＣＲαで免疫感
作されたマウスの処理によって影響を受けなかった。

【０１３２】これらの結果は、組み換えＴＣＲαタンパ
ク質の抗原特異的な免疫抑制活性を示している。どのマ
ウスも組み換えＴＣＲαタンパク質への副作用を示さな
かった。これは、自己免疫疾患及びアレルギーの如き障
害を媒介する免疫応答を抑制するのに、該組み換えＴＣ
Ｒαタンパク質を使用できる可能性を示すものである。

【０１３３】 表１ 組み換え３Ｂ３ＴＣＲαによるＢａｌｂ／ｃマウスの 抗ハプテン抗体応答の抑制 ────────────────────────────────── 抗 DNP IgE（μg/ml) ^a 抗 DNP IgG1 （μg/ml) ^a ────────────────────────────────── PBS (N=4) 0.50 ± 0.26 56.8 ± 9.8 3B3TCRα (N=6) 0.12 ± 0.03 ^b 5.8 ± 2.6 ^b ────────────────────────────────── ａ）ミョウバン吸着ＤＮＰ−ＰＬＡ₂ での免疫感作後２週間 ｂ）ｐ＜0.０５

【０１３４】本発明は、本発明の１側面を説明する意図
のもとに例示したこれら態様によってはその範囲を限定
されるものではなく、また、機能的に等価であるあるゆ
る微生物が本発明の範囲内にある。事実、本明細書に示
し記載した発明に加えて本発明を部分的に変更した多様
な態様が、前記の記載及び添付の図面から当業者に明白
となるであろう。かかる変更した態様は添付の特許請求
の範囲の範囲内にある。本明細書で引用した全ての刊行
物は参照によりそっくりそのまま本明細書に取り込まれ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｔ細胞ハイブリドーマ、つまり３−１
−Ｖが、Ａ1.１細胞からの抗原特異的ＴＣＲα鎖の存在
下で免疫調節活性を媒介する補助成分を産生することを
示している。

【図２】図２は、Ａ1.１細胞から単離したＴＣＲα遺伝
子の完全ヌクレオチド配列を示している。該遺伝子のＣ
領域に下線が付してある。

【図３】図３は、Ａ1.１細胞から１７5.２細胞へのＴＣ
Ｒαの遺伝子移入（１７5.２−Ａ1.１α）が抗原特異的
調節活性をもたらす能力を与えることを示している。
（Ａ）Ａ1.１ＴＣＲαの移入前後の１７5.２細胞上での
ＣＤ３の発現。（Ｂ）関連する抗原、（Ｃ）担体（ＳＲ
ＢＣ）単独、及び（Ｄ）関連しないコントロール抗原、
の存在下でのＡ1.１、１７5.２、及び１７5.２−Ａ1.１
α上清中の抗原特異的調節活性。

【図４】図４は、ハイブリドーマＡ1.１からのＴＣＲα
鎖の調節活性を試験するのに用いたペプチドを示してい
る。

【図５】図５は、Ａ1.１細胞によりもたらされた免疫調
節活性がＴＣＲα鎖への抗体により中和されることを示
している。

【図６】図６は、Ａ1.１ＴＣＲαの移入及び抗ＣＤ３抗
体での選択後の（Ａ）ＡＦ５細胞及び（Ｂ）ＡＦ６細胞
（１７5.２の２つのサブクローン）上でのＣＤ３の発現
を示している。

【図７】図７は、ＢＢ１９細胞から１７5.２細胞へのＴ
ＣＲαの遺伝子移入は抗原特異的免疫調節活性をもたら
す能力を与えないことを示している。

【図８】図８は、Ａ1.１細胞からＢ９細胞へのＴＣＲα
の遺伝子移入（Ｂ９−Ａ1.１α）が抗原特異的調節活性
をもたらす能力を与えることを示している。

【図９】図９は、Ｂ９−Ａ1.１αから放出された調節活
性が抗ＴＣＲαと結合して、Ａ1.１細胞からの該活性と
同じ抗原特異性を示すことを示している。

【図１０】図１０は、ＴＣＲβを欠いている細胞内での
Ａ1.１ＴＣＲαの発現が抗原特異的調節活性をもたらす
のに十分であることを示している。

【図１１】図１１は、Ａ1.１ＴＣＲαを発現するＡ1.１
及び他の細胞系の上清中の抗原特異的結合活性を示して
いる。

【図１２】図１２は、 in vitro で翻訳されたＡ1.１Ｔ
ＣＲα及びβポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示して
いる。

【図１３】図１３は、 in vitro で翻訳されたＡ1.１Ｔ
ＣＲα遺伝子産物の調節活性は抗ＴＣＲαと結合するが
抗ＴＣＲβとは結合しないことを示している。

【図１４】図１４は、Ａ1.１ＴＣＲαｃＤＮＡの完全ヌ
クレオチド配列及び演繹されるアミノ酸配列を示してい
る。

【図１５】図１５は、３Ｂ３由来ＴＣＲαｃＤＮＡの完
全ヌクレオチド配列及び演繹されるアミノ酸配列を示し
ている。

【図１６】図１６は、ｔｒｐプロモーター及びｔｒｐＡ
ターミネーターを保持する発現プラスミドｐＳＴ８１１
を示している。

【図１７】図１７は、発現プラスミドｐＳＴ８１１−Ａ
1.１ＴＣＲαＳ５を示している。

【図１８】図１８は、ラットカルモジュリンｃＤＮＡ及
びｔｒｐプロモーターを保持する発現プラスミドｐＴＣ
ＡＬ７を示している。

【図１９】図１９は、ラットカルモジュリン及びｔｒｐ
プロモーターを保持しかつｐＴＣＡＬ７からの追加のク
ローニング部位を含有する発現プラスミドｐＣＦ１を示
している。

【図２０】図２０は、発現プラスミドｐＣＦ１−３Ｂ３
ＴＣＲαを示している。

【図２１】図２１は、２つの発現プラスミドからの大腸
菌産生カルモジュリン−ＴＣＲαのＳＤＳ−ＰＡＧＥを
示している。

【図２２】図２２は、大腸菌発現Ａ1.１ＴＣＲαＳ５タ
ンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。

【図２３】図２３は、大腸菌発現３Ｂ３ＴＣＲα（カル
モジュリン−ＴＣＲα融合タンパク質）のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥを示している。

【図２４】図２４は、組み換えＡ1.１ＴＣＲαＳ５（図
２４ａ）及び組み換えＡ1.１ＴＣＲαＳ３（図２４ｂ）
の免疫抑制活性が投与量依存性であることを示してい
る。

【図２５】図２５は、ポリ１８又はＥＹＫＥＹＡＥＹＡ
ＥＹＡＥＹＡを使用したときにＴＣＲα鎖の免疫抑制活
性が認められることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/00 8318−4Ｈ 14/725 8318−4Ｈ 19/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｋ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 ダグラス アール． グリーン アメリカ合衆国 92130 カリフォルニア 州 サンディエゴ， ティネボルン サー クル 4153 (72)発明者 アラン フォテダー アメリカ合衆国 92130 カリフォルニア 州 サンディエゴ， ナンバー 65 ケラ ム コート 13167 (72)発明者 レイド ピー． ビッソネット アメリカ合衆国 92130 カリフォルニア 州 サンディエゴ， ナンバー 105 カ ーメル ビュー 4039 (72)発明者 三箇山 俊文 日本国群馬県群馬郡群馬町福島314−５ (72)発明者 石井 保之 アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア 州 サンディエゴ， カミニト メリアー ド 4082

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗原を該抗原と特異的な有効量のＴＣＲα
   鎖と接触させて、ＴＣＲα鎖が抗原特異的に免疫応答を
   調節することからなる、抗原に対する免疫応答を調節す
   る方法。
2. 【請求項２】補助成分の存在下にＴＣＲα鎖を抗原と接
   触させる請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】補助成分が、ＴＣＲα鎖の非存在下では免
   疫調節効果を有していない刺激されたＴ細胞によって産
   生される可溶性因子を含む請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】補助成分が、可溶性ＴＣＲα鎖を除いた刺
   激されたＴ細胞によって産生される可溶性因子を含む請
   求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】補助成分がＴ細胞ハイブリドーマによって
   産生される請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】ＴＣＲα鎖が抗原特異的に免疫応答を抑制
   する請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載の
   方法。
7. 【請求項７】ＴＣＲα鎖が抗原特異的に免疫応答を増強
   する請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載の
   方法。
8. 【請求項８】ＴＣＲα鎖を、該ＴＣＲα鎖と結合するた
   めの有効量で該ＴＣＲα鎖に特異的な抗体と接触させ、
   これによって免疫応答を増強することからなる、ＴＣＲ
   α鎖によって抑制された抗原特異的免疫応答を増強する
   方法。
9. 【請求項９】抗体を固定化して、ＴＣＲα鎖を除去する
   請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】抗体がＴＣＲα鎖と結合してその活性を
    中和する請求項８に記載の方法。
11. 【請求項１１】Ｔ細胞をＴＣＲα鎖メッセージと相補的
    なアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させて、ＴＣ
    Ｒα鎖の発現および分泌が阻害される、Ｔ細胞によって
    分泌されるＴＣＲα鎖によって抑制された抗原特異的免
    疫応答を増強する方法。
12. 【請求項１２】アンチセンスオリゴヌクレオチドがＴＣ
    Ｒα鎖メッセージの可変領域と相補的である請求項１１
    に記載の方法。
13. 【請求項１３】以下の工程： （ａ）溶血可能な担体と結合した抗原を含む脾臓細胞の
    試験培養を、補助成分の存在下に、ＰＦＣ生成によって
    示唆される免疫応答が起きるのに十分な時間で、ＴＣＲ
    α鎖を含むことが疑われる試料に暴露し；そして（ｂ）
    試験培養中のＰＦＣ生成を試料を含まない対照培養と比
    較し、ここで対照と比較したＰＦＣ生成の減少が、抗原
    特異的に免疫応答を抑制するＴＣＲα鎖の存在を示し、
    また対照と比較したＰＦＣ生成の増加が、抗原特異的に
    免疫応答を増強するＴＣＲα鎖の存在を示す、からな
    る、抗原に対する免疫応答を調節する可溶性抗原特異的
    ＴＣＲα鎖を体液中で検出する方法。
14. 【請求項１４】ＴＣＲα鎖が抗原特異的に免疫応答を抑
    制する請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】ＴＣＲα鎖が抗原特異的に免疫応答を増
    強する請求項１３に記載の方法。
16. 【請求項１６】以下の工程： （ａ）溶血可能な担体と結合した抗原を含む脾臓細胞の
    試験培養を、補助成分の存在下に、ＰＦＣ生成によって
    示される免疫応答が起きるのに十分な時間で、精製ＴＣ
    Ｒα鎖に暴露し；そして（ｂ）試験培養中のＰＦＣ生成
    を精製ＴＣＲα鎖を含まない対照培養と比較し、ここで
    対照と比較したＰＦＣ生成の減少が、ＴＣＲα鎖が抗原
    特異的に免疫応答を抑制することを示し、また対照と比
    較したＰＦＣ生成の増加が、ＴＣＲα鎖が抗原特異的に
    免疫応答を増強することを示す、からなるｉｎ ｖｉｔ
    ｒｏアッセイ系で評価するときに、抗原と結合すること
    ができ、かつ該抗原に対する免疫応答を調節する精製Ｔ
    ＣＲα鎖。
17. 【請求項１７】抗原特異的に免疫応答を抑制する請求項
    １６に記載の精製ＴＣＲα鎖。
18. 【請求項１８】抗原特異的に免疫応答を増強する請求項
    １６に記載の精製ＴＣＲα鎖。
19. 【請求項１９】以下の式： Ｒ₁−［Ｘ₁］−Ｒ₂ （式中、Ｒ₁は担体ペプチド、Ｘ₁はタンパク質分解酵素
    認識配列、そしてＲ₂は構造遺伝子によってコードされ
    るポリペプチドである）で示される実質的に純粋な融合
    ポリペプチド。
20. 【請求項２０】担体ペプチドがカルモデュリンである請
    求項１９に記載の融合ポリペプチド。
21. 【請求項２１】構造遺伝子によってコードされるポリペ
    プチドがＴ細胞レセプターアルファ（ＴＣＲα）鎖であ
    る請求項１９に記載の融合ポリペプチド。
22. 【請求項２２】ＴＣＲα鎖が該ポリペプチドの細胞膜外
    ドメインである請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
23. 【請求項２３】タンパク質分解酵素認識配列がトロンビ
    ンによって認識される請求項１９に記載の融合ポリペプ
    チド。
24. 【請求項２４】タンパク質分解酵素認識配列が Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ である請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
25. 【請求項２５】請求項１９に記載の融合ポリペプチドを
    コードする単離されたポリヌクレオチド配列。
26. 【請求項２６】請求項２５に記載のポリヌクレオチド配
    列を含む組換え発現ベクター。
27. 【請求項２７】ベクターがウイルスである請求項２６に
    記載のベクター。
28. 【請求項２８】ベクターがプラスミドである請求項２６
    に記載のベクター。
29. 【請求項２９】ベクターが表現型選択マーカーＤＮＡ配
    列を含む請求項２８に記載のベクター。
30. 【請求項３０】表現型選択マーカーが、β−ラクタマー
    ゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
    ーゼからなる群より選択される請求項２９に記載のベク
    ター。
31. 【請求項３１】請求項２６に記載のベクターを含む宿主
    細胞。
32. 【請求項３２】宿主細胞が真核である請求項３１に記載
    の宿主細胞。
33. 【請求項３３】宿主細胞が原核である請求項３１に記載
    の宿主細胞。
34. 【請求項３４】原核細胞がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃ
    ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス・ア
    ウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕ
    ｓ）およびシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄ
    ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からなる群より選択
    される請求項３３に記載の宿主細胞。
35. 【請求項３５】以下の工程： （ａ）ＴＣＲα鎖をコードするポリヌクレオチド配列を
    機能しうる結合様式で含むベクターで形質転換した宿主
    細胞を培養し；そして（ｂ）実質的に純粋で生物学的に
    活性なＴＣＲα鎖を単離する、からなる、実質的に純粋
    で生物学的に活性なＴＣＲα鎖の生産方法。
36. 【請求項３６】ＴＣＲα鎖をコードするポリヌクレオチ
    ドが以下の式： Ｒ₁−［Ｘ₁］ （式中、Ｒ₁は担体ペプチド、そしてＸ₁はタンパク質分
    解酵素認識配列である）のポリペプチドをコードするポ
    リヌクレオチドと機能しうるように結合されている請求
    項３５に記載の方法。
37. 【請求項３７】担体ペプチドがカルモデュリンである請
    求項３６に記載の方法。
38. 【請求項３８】タンパク質分解酵素認識配列がトロンビ
    ンによって認識される請求項３６に記載の方法。
39. 【請求項３９】タンパク質分解酵素認識配列が Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ である請求項３８に記載の方法。
40. 【請求項４０】ＴＣＲα鎖が該ポリペプチドの細胞膜外
    ドメインである請求項３５に記載の方法。
41. 【請求項４１】融合ペプチドからＴＣＲα鎖部分を切断
    することをさらに含む請求項３６に記載の方法。
42. 【請求項４２】免疫抑制に必要量の実質的に精製された
    ＴＣＲα鎖および医薬的に不活性な担体を含む医薬組成
    物。
43. 【請求項４３】ＴＣＲα鎖が細胞膜外ドメインである請
    求項４２に記載の医薬組成物。
44. 【請求項４４】ＴＣＲα鎖が細胞膜外ドメインである請
    求項１、８または１３のいずれかに記載の方法。
45. 【請求項４５】ＴＣＲα鎖が細胞膜外ドメインである請
    求項１６に記載のＴＣＲα鎖。