JPH0815430B2 - アスコルビン酸オキシダ−ゼの安定化法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアスコルビン酸オキシダーゼ（以下ASOと略
する）の安定化法に関し、より詳しくはASOを含有する
溶液に適当な塩を主として使用することによりASOを安
定化する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

臨床化学分析における生体成分を酵素的に測定する方
法は数多く開発されている。この方法には、ウリカー
ゼ、アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリセロ−
３−リン酸オキシダーゼなどのオキシダーゼが広く用い
られている。これらのオキシダーゼの作用で生成された
過酸化水素はパーオキシダーゼと水素供与体の発色系を
用いる方法で比色定量されるのが一般的である。

この場合、パーオキシダーゼを用いる反応系において
は、生体試料中に存在するアスコルビン酸の干渉を著し
く受け易い。そこで、この解決策のひとつとして測定試
薬中にASOを共存させることによってアスコルビン酸を
酸化分解して、その干渉を排除することが一般的に行な
われている。

しかしながら、溶液中のASOは極めて不安定であるこ
とから、試薬保存中にASOの失活が起こる。

従来、ASOの失活防止にカタラーゼ、ゼラチン、グロ
ブリン、パーオキシダーゼ、メトヘモグロビン又はヘマ
チン等を添加すると有効であることが報告されている
〔化学：第17巻、第10号、第844頁及び第６回臨床化学
分析談話会夏期セミナー講演予講集：第106頁〕。しか
し、これらの報告にみられるカタラーゼ又はパーオキシ
ダーゼ等は、ASO安定化効果のうえで不十分なものであ
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは、溶液中に含有されるASOの安定性を向
上する目的で、種々検討を行った結果、塩を使用するこ
とにより、ASOの失活防止が可能になることを見い出
し、本発明を完成するに至った。

〔問題点を解決するための手段〕

即ち、本発明はASOを含有する溶液に、金属または陽
性の塩基性基と陰性の酸基とから成る化合物、もしくは
該化合物とカタラーゼ及び／又はパーオキシダーゼと酸
化性色素カップラーを併用して添加することを特徴とす
るASOの安定化法である。

本発明の化合物とは、適当な塩を意味し、金属はナト
リウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウ
ム、ストロンチウム、マンガン、銅、ニッケル、コバル
ト及び鉄等から選ばれる陽イオンであり、また陽性の塩
基性基はアンモニウムであり、陰性の酸基は塩素、臭
素、ヨウ素、硫酸、酢酸及びリン酸から選ばれる陰イオ
ンとから成る安定化剤である。

カタラーゼとパーオキシダーゼは、上記安定化剤と併
用して使用する。この場合、両酵素は別々に、或いは一
緒に、通常0.01U/ml以上を使用する。パーオキシダーゼ
と一緒に用いる酸化性色素カップラーは、アニリン系、
フェノール系等公知のものを使用する。

本発明のASOを含有する溶液とは、ASOと緩衝液を溶解
させた、PH4〜9.5の溶液を意味する。この溶液の中に安
定化剤を1mM以上を、場合によりカタラーゼ及び／又は
パーオキシダーゼと酸化性色素カップラーを併用して添
加する。

ASO含有溶液は、例えば尿酸、遊離脂肪酸、グルコー
ス、中性脂肪、コレステロール、リン脂質、乳酸等の測
定を目的とする酵素的測定法における各々の基質とオキ
シダーゼが作用して過酸化水素を生成させる酵素反応
系、及び過酸化水素をパーオキシダーゼと水素供与体の
発色系により比色定量を行なうに必要な測定試薬を含
む。通常、この試薬形態は１試薬系タイプか、または２
試薬系タイプにまとめられているので、後者の場合には
ASOを含有する試薬中に安定化剤を添加する。しかし、
酵素反応系で使用する共役酵素が金属を必要とする場合
には、その金属使用量は通常1mM〜10mM程度で酵素触媒
作用が行われており、それ以上の濃度を添加して本発明
の目的とすることはできない。

緩衝液は、一般的にPH4〜9.5の範囲で維持できるリン
酸塩、ビス−トリス、ADA、PIPES、ACES、イミダゾー
ル、BES、MOPS、TES、HEPES等を用いる。

〔作用効果〕

ASOを含有する溶液に、本発明の安定化剤を添加する
ことにより無添加に比べ、ASOの安定化が極めて大き
い。

なお、溶液中のASOの酵素活性は以下の方法で測定す
る。

1.反応液の組成 （１） 0.2Mリン酸カリウム及び1mMエチレンジアミン
テトラ酢酸・２ナトリウム塩を含む1mMアスコルビン酸
溶液。

（２） 10mMリン酸２ナトリウム溶液。

（３） 1U/mlASOを含有する溶液（ASOは使用時0.08〜
0.35U/mlに0.05％BSA含有10mMリン酸２ナトリウムで希
釈する）。

2.反応条件及びASOの力価 試験管にアスコルビン酸溶液0.5mlとリン酸２ナトリ
ウム溶液0.5mlを加え、30℃で25分間予備加温する。次
に、ASOを含有する溶液0.1mlを加え、30℃で５分間反応
させた後、0.2N塩酸溶液を3.0ml加えて反応を停止させ
る。この時、分解されるアスコルビン酸量を245nmの吸
光度の減少量から求める。この際のアスコルビン酸のミ
リモル吸光係数はε＝10〔mmol^-1×１×cm^-1〕を用い、
ASOの力価を算出する。

ASO力価の表示は、上記条件下で１分間に１μモルの
アスコルビン酸が分解されるASO量を１単位として行
う。

以下、実施例により本発明を詳細に説明する。

実施例 １ （１） 方 法 2U/mlASO〔ベーリンガー・マンハイム社製〕を含有す
る50mMHEPES−水酸化ナトリウム緩衝液（PH7.0）を100m
l調整した。これに、第１表に示される塩類を50mMずつ
添加して、25℃で12日間保存した場合のASO活性の残存
率を測定した。この結果を第１表に示す。

（２） 結 果 第１表から明らかなように、いずれのASO溶液も無添
加に比べ、本発明の塩類の添加で、ASOの保存安定性が
著しく向上した。

実施例 ２ （１） 方 法 2U/mlASO及び50mM塩化カリウムを含有する次の緩衝液
を各々100ml調整した。これらに、第２表に示される酵
素、100U/mlカタラーゼ及び／または1U/mlパーオキシダ
ーゼと3mMN−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−ｍ−トルイジンを含有させてASO活性の
残存率を測定した。この結果を第２表に示す。

50mMリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）。

50mMHEPES−水酸化ナトリウム緩衝液（PH7.0）。

50mMビス−トリス−塩酸緩衝液（PH7.0）。

（２） 結 果 第２表から明らかなように、いずれの緩衝液も無添加
に比べ、本発明の塩類と酵素カタラーゼ及び／又はパー
オキシダーゼを併用して添加することで、ASOの保存安
定性が向上した。

実施例 ３ （１） 方 法 遊離脂肪酸測定試薬（２試薬系）のうち、ASOを含有
する方の試薬、即ち0.3mMコエンザイムＡ、1.5mMアデノ
シントリフォスフェート、0.4U/mlアシルコエンザイム
Ａシンセターゼ、1mM塩化マグネシウム、2mM4−アミノ
アンチピリン1U/mlASOを含有する50mMリン酸カリウム緩
衝液（PH7.0）を100ml調製した。これに50ml塩化カリウ
ムまたは100U/mlカタラーゼと10U/mパーオキシダーゼを
添加して、２〜８℃で７日間保存した場合のASO活性の
残存率を測定した。この結果を第３表に示す。

（２） 結 果 第３表から明らかなように、ASOを含有した生体成分
を測定する試薬系においても無添加に比べ、塩及びカタ
ラーゼ及び／又はパーオキシダーゼの添加で、ASOの保
存安定性が著しく向上した。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アスコルビン酸オキシダーゼを含有する溶
   液に、金属または陽性の塩基性基と陰性の酸基とから成
   る化合物、もしくは該化合物とカタラーゼ及び／又はパ
   ーオキシダーゼと酸化性色素カップラーを併用して添加
   することを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安
   定化法。
2. 【請求項２】金属がナトリウム、カリウム、リチウムま
   たはマグネシウムである、特許請求の範囲第１項記載の
   安定化法。
3. 【請求項３】陽性の塩基性基がアンモニウムである、特
   許請求の範囲第１項の安定化法。
4. 【請求項４】陰性の酸基が塩素、臭素、ヨウ素、硫酸、
   酢酸またはリン酸である、特許請求の範囲第１項記載の
   安定化法。