JPH08154687A

JPH08154687A - アンチセンスオリゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤

Info

Publication number: JPH08154687A
Application number: JP6332126A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Takaku; 洋高久; Kazuyuki Takai; 和幸高井; Kazumi Hosono; 和美細野
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-12-12
Filing date: 1994-12-12
Publication date: 1996-06-18

Abstract

(57)【要約】【目的】核酸分解酵素に抵抗性をもつアンチセンスオ
リゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤を提供する。【構成】オリゴヌクレオチドは、ヘアピンループを形
成することができ、ヌクレオチドの少なくとも１つが
２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであり、標的ＤＮＡ
又はＲＮＡに相補的な配列を含む。【効果】標的となるＤＮＡ又はＲＮＡとの間に安定し
た塩基対を形成し、生体内に存在するヌクレアーゼの分
解活性に対して抵抗性をもつ。更に、ウイルスの増殖を
阻害することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アンチセンスオリゴヌ
クレオチド及び抗ウイルス剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするレトロウイ
ルスは、宿主細胞内で複製し増殖する寄生体であり、宿
主細胞の働きを利用して増殖に必要なタンパク質を合成
する。レトロウイルスが宿主細胞に感染すると、逆転写
酵素（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；
以下、ｒｅｖタンパク質と称する）の働きによりＲＮＡ
からＤＮＡが合成される。後天性免疫不全症候群（ＡＩ
ＤＳ）を引き起こすＨＩＶ（ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏ
ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ）もレトロウイルス
に属し、Ｔ４リンパ球を宿主細胞とし、その細胞内で複
製し増殖する。レトロウイルスの代表例として、ＨＩＶ
のライフサイクルを図１に示す。ＨＩＶの親ウイルスが
宿主細胞に吸着すると、ウイルスＲＮＡが逆転写酵素に
より一本鎖ＤＮＡに転写され、二本鎖ＤＮＡになって染
色体ＤＮＡに組み込まれる。このプロウイルスＤＮＡ
は、潜伏期間中に宿主の染色体ＤＮＡとともに複製され
る。このＤＮＡは様々な機能を有し、何らかの刺激が加
わると、ＲＮＡへの転写が行なわれ、ＨＩＶの子ウイル
スが発生する。

【０００３】従って、宿主細胞のタンパク質合成系にお
いてｍＲＮＡからタンパク質が合成されるステップで、
アンチセンスオリゴヌクレオチドを投入し、ウイルス特
異的遺伝子の翻訳を阻害することができれば、特に、Ｈ
ＩＶのｒｅｖタンパク質をコードするｍＲＮＡの部位を
ターゲットとし、その領域に対して相補的なアンチセン
スオリゴヌクレオチドを結合させることができれば、ウ
イルス増殖を効果的に阻止することができる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ターゲ
ット遺伝子の特定領域の塩基配列に相補的な塩基配列を
有するだけのアンチセンスオリゴヌクレオチドを生体内
に導入しても、生体内に存在する種々の核酸分解酵素に
より簡単に分解されてしまい、ターゲット遺伝子と結合
する前に消失し、目的とする効果を得ることは事実上不
可能であるか、あるいは極めて困難である。本発明者
は、生体内で安定に存在し、しかもターゲット領域の遺
伝子に結合することのできるアンチセンスオリゴヌクレ
オチドを得るべく鋭意検討した結果、２’−Ｏ−メチル
リボヌクレオチドとヘアピンループとを有するオリゴヌ
クレオチドによって、前記の目的を達成することができ
ることを見出した。本発明は、こうした知見に基づくも
のである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、
（１）ヘアピンループを形成することができ、（２）ヌ
クレオチドの少なくとも１つが２’−Ｏ−メチルリボヌ
クレオチドであり、（３）標的ＤＮＡ又はＲＮＡに相補
的な配列を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドに
関する。更に、本発明は、前記のオリゴヌクレオチドを
含むことを特徴とする、抗ウイルス剤にも関する。

【０００６】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明のオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ又は標的ＲＮ
Ａに対して相補的な塩基配列からなるアンチセンス領域
を含むことにより、標的ＤＮＡ又は標的ＲＮＡと結合し
て２本鎖を形成することができる。標的となるＤＮＡ又
はＲＮＡは、ＤＮＡ遺伝子若しくはＲＮＡ遺伝子、又は
ｍＲＮＡの内、本発明のオリゴヌクレオチドと結合させ
てＤＮＡ又はＲＮＡの複製、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転
写及び／又はｍＲＮＡからタンパク質への翻訳、更には
ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写を妨害し、それらＤＮＡ又
はＲＮＡが有する正常な機能を発揮させないようにされ
る対象となるＤＮＡ又はＲＮＡである。

【０００７】標的ＤＮＡとしては、例えば、ＤＮＡウイ
ルス又は癌遺伝子の部分塩基配列を挙げることができ
る。ＤＮＡウイルスは、特に限定されず、例えば、ヘル
ペスウイルス、アデノウイルス又はワクシニアウイルス
を挙げることができ、癌遺伝子も特に限定されず、例え
ば、慢性骨髄性白血病を挙げることができる。標的ＤＮ
Ａとしては、前記ＤＮＡ遺伝子の部分配列、例えば、タ
ンパク質合成開始コドンＡＵＧ近傍の塩基配列を選択す
ることができる。また、標的ＲＮＡとしては、例えば、
ＲＮＡウイルス、例えば、インフルエンザウイルス、ラ
イノウイルス、ポリオウイルス、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１
などのＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列、例えば、タンパク
質合成開始部位を選択することができる。また、前記Ｄ
ＮＡ遺伝子からのｍＲＮＡや前記ＲＮＡウイルスのプロ
ウイルスＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの全配列又は部
分配列、特にはｒｅｖタンパク質をコードするｒｅｖ領
域又はその部分配列を挙げることができる。

【０００８】本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、ア
ンチセンス領域を構成する塩基数は特に限定されるもの
ではないが、一般的には１５〜３０塩基、好ましくは２
０〜２８塩基からなる。１５塩基よりも少ないと標的Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡと二重鎖を形成することが困難になり、
３０塩基よりも多くなると非特異的結合が起き、膜透過
が困難となるからである。標的ＤＮＡ又はＲＮＡに対す
る相補的塩基配列は、本発明のオリゴヌクレオチド内に
おいて連続して存在する必要はなく、標的ＤＮＡ又はＲ
ＮＡと二重鎖を形成することができる限り、非相補的塩
基１又はそれ以上が１又はそれ以上の箇所で相補的塩基
配列内に介在していてもよい。

【０００９】本発明のオリゴヌクレオチドは、ヘアピン
ループ構造を形成することができる塩基配列を含む。ヘ
アピンループ構造は、環状一本鎖のループ領域と、その
ループ領域端部から始まる二本鎖のステム領域とからな
る。ヘアピンループ構造は、本発明のオリゴヌクレオチ
ドの５’末端側、３’末端側又は内部領域のいずれの領
域に形成されてもよい。また、ヘアピンループ構造又は
ループ領域は、１つに限らず、複数個形成されてもよ
い。生体内に多く含まれる３’−エキソヌクレアーゼに
対する抵抗性を高めるためには、ヘアピンループ構造は
３’側にあることが好ましい。本発明のオリゴヌクレオ
チドにおけるヘアピンループ構造を構成する塩基数は特
に限定されるものではないが、一般的にはループ領域は
３〜８塩基、好ましくは４〜５塩基からなり、ステム領
域は５〜１５塩基対、好ましくは１０〜１３塩基からな
る。

【００１０】本発明によるオリゴヌクレオチドにおいて
は、ヌクレオチドの少なくとも１つが２’−Ｏ−メチル
リボヌクレオチドである。「２’−Ｏ−メチルリボヌク
レオチド」とは、リボヌクレオチドの糖部分の２’−水
酸基の水素原子をメチル基で置換したものである。その
構造式を、ＤＮＡ及びＲＮＡと共に図２に示す。図２に
示す２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの構造式中、円
で囲んだ「−ＯＣＨ₃」が置換した部分である。図２に
おいて、各オリゴヌクレオチドの糖部分に結合している
「Ｂ」は、どれも塩基を示しているが、２’−Ｏ−メチ
ルリボヌクレオチドの構造式に含まれる二重活字の
「Ｂ」は、それを含むオリゴヌクレオチドが２’−Ｏ−
メチルリボヌクレオチドであることを示している。な
お、後述する図３及び図５において用いる二重活字の
「Ｂ」も同じ意味である。前記の２’−Ｏ−メチルリボ
ヌクレオチドを導入すると、標的ＤＮＡ又はＲＮＡとの
結合安定性が向上するので、２個以上の２’−Ｏ−メチ
ルリボヌクレオチドを導入することが好ましい。また、
ヘアピンループのステム領域を構成することができるヌ
クレオチドの少なくとも１つが２’−Ｏ−メチルリボヌ
クレオチドであることが好ましく、ステム領域の二本鎖
の内の一方の一本鎖をすべて２’−Ｏ−メチルリボヌク
レオチドから構成するのが特に好ましい。更に、オリゴ
ヌクレオチドの５’末端が２’−Ｏ−メチルリボヌクレ
オチドであると、オリゴヌクレオチドの安定性が向上す
るので、より好ましい。

【００１１】更に、本発明のオリゴヌクレオチドにおい
て、各リン酸エステル結合のうち少なくとも１か所にホ
スホロチオエート結合を導入するのが好ましい。ホスホ
ロチオエート結合とは、リン酸ジエステル結合の酸素原
子をイオウ原子で置換したものであり、その構造式を図
２に示す。図２に示すホスホロチオエート結合の構造式
中、円で囲んだ「−Ｓ」が、置換した部分である。な
お、図２には、円で囲んだ「−ＯＣＨ₃」をヌクレオチ
ド中に含む２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドにホスホ
ロチオエート結合を導入した例のみを示すが、通常のリ
ボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドにホスホ
ロチオエート結合を導入してもよい。ホスホロチオエー
ト結合を導入した部位は、ヌクレアーゼに対する分解抵
抗性が向上するので、ホスホロチオエート結合の導入数
は多いほど好ましく、本発明のオリゴヌクレオチド全体
に導入するのが特に好ましい。

【００１２】本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、
式 GmGAGATGCCT AAGGCTTTGT TATCmAmAmAmGmCmCm UmUmAm （式中、Ａはアデノシン残基であり、Ｃはシチジン残基
であり、Ｇはグアノシン残基であり、Ｔはチミジン残基
であり、Ａｍは２’−Ｏ−メチルアデノシン残基であ
り、Ｃｍは２’−Ｏ−メチルシチジン残基であり、Ｕｍ
は２’−Ｏ−メチルウリジン残基であり、Ｇｍは２’−
Ｏ−メチルグアノシン残基であり、各ヌクレオシド間の
結合は、ホスホジエステル結合であるかホスホロチオエ
ート結合であるものとする）で表される塩基配列をもつ
オリゴヌクレオチドである。

【００１３】本発明のオリゴヌクレオチドは、前記の標
的ＤＮＡ又はＲＮＡと結合することができ、しかも２’
−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含む前記要件を満足す
る限り、デオキシヌクレオシド、リボヌクレオシド、及
び／又はそれらの修飾体から形成することができ、塩基
数は特に限定されるものではないが、一般的には２０〜
６８塩基、特には３０〜５９塩基であるのが好ましい。
また、本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、アンチセ
ンス領域は、前記のヘアピンループ構造と別個に形成さ
れていてもよく、あるいは、アンチセンス領域の全体又
は一部が、ヘアピンループ構造の全体又は一部と一致し
ていてもよい。特には、アンチセンス領域の末端（好ま
しくは３’末端）に、ステム領域を形成することのでき
る相補的塩基配列を連結した構造が好ましい。

【００１４】本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ
−メチルリボヌクレオチド又はホスホロチオエート結合
を導入する部位を除いては、通常のホスホジエステル法
又はホスホトリエステル法、例えば、Ｈ−ホスホネート
法、又はホスホロアミダイト法によるＤＮＡ／ＲＮＡ自
動合成機を利用して合成することができる。２’−Ｏ−
メチルリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド
は、５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチルリボ
ヌクレオシド−３’−〔（２−シアノエチル）−（Ｎ，
Ｎ−ジイソプロピル）〕─ホスホロアミダイトユニット
を用いて、ホスホロアミダイト法によるＤＮＡ／ＲＮＡ
自動合成機を利用して合成することができる。ホスホロ
チオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、通常の
ポリヌクレオチド合成に用いられる酸化剤である水／ヨ
ウ素／ピリジン溶液の代わりに、１５％Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−テトラエチルチオラムジスルフィド／アセトニト
リル溶液を用いて合成することができる。

【００１５】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
を細胞内に存在させると、例えば、図１に示すように、
宿主細胞の核からウイルスのゲノムＲＮＡ（又はＤＮ
Ａ）が放出された場合に、そのゲノムＲＮＡ（又はＤＮ
Ａ）にアンチセンスオリゴヌクレオチドが結合し、細胞
質内の酵素によってゲノムＲＮＡ（又はＤＮＡ）が分解
されるので、子ウイルスの発生を防止することができ
る。また、宿主細胞の染色体ＤＮＡに取り込まれたウイ
ルスＤＮＡから転写されたｍＲＮＡが、宿主細胞の核か
ら細胞質に放出された場合にも、そのｍＲＮＡにアンチ
センスオリゴヌクレオチドが結合し、タンパク質への翻
訳をブロックするか、あるいは細胞質内の酵素によって
ｍＲＮＡが分解されので、この場合も子ウイルスの発生
を防止することができる。従って、本発明によるアンチ
センスオリゴヌクレオチドを抗ウイルス剤として使用す
ることができる。

【００１６】更に、本発明によるアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、（１）標的となるＤＮＡ又はＲＮＡ（例
えば、ｍＲＮＡ）との間に安定した塩基対を形成するこ
とができ、更に（２）生体内に存在するヌクレアーゼの
分解活性に対して抵抗性をもつので安定である。標的と
なるｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが形成する塩基対
の安定性の指標としては、例えば、融解温度（以下、Ｔ
ｍと称する）を用いることができる。一般に、オリゴヌ
クレオチドをホスホロチオエート型にすると、Ｔｍ値は
下がり（後述の実施例２参照）、塩基対の安定性は低下
するが、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを（好まし
くはステム領域に）導入したオリゴヌクレオチドでは、
Ｔｍ値が上昇する。この場合、ホスホロチオエート型で
あっても２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを導入する
ことにより（例えば、図５のオリゴマー６）、相当する
単純なヘアピンループ構造のもの（例えば、図５のオリ
ゴマー２）よりも、Ｔｍ値が上昇する。従って、本発明
のオリゴヌクレオチドは、安定した塩基対を形成するこ
とが可能である。

【００１７】一方、生体内には種々の酵素が存在する。
例えば、前記の３’エキソヌクレアーゼの他にも、５’
方向から切断するエキソヌクレアーゼや、中ほどから切
断するエンドヌクレアーゼ、更にＤＮＡ又はＲＮＡの二
重鎖を認識してＤＮＡ又はＲＮＡだけを切断する酵素
（例えば、ＲＮａｓｅＨ）もある。後述の実施例で示す
ように、本発明のオリゴヌクレオチドは、３’エキソヌ
クレアーゼ（例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、ク
レノウフラグメント）の分解活性に対して抵抗性をも
つ。また、細胞培養などの培地に用いる牛血清には種々
の核酸分解酵素が含まれているが、本発明のオリゴヌク
レオチドは牛血清に対しても抵抗性をもつため、牛血清
を含む培地からオリゴヌクレオチドを細胞に導入するこ
とが可能である。

【００１８】更に、アンチセンス核酸法において重要な
作用に、標的となるｍＲＮＡに結合して形成される細胞
内のＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のうち、ＲＮＡを特異的に切
断するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＨ）の働きがあ
る。これを利用すれば、細胞内のタンパク質合成を阻害
し、ウイルスの増殖を防ぐことができる。本発明のオリ
ゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡと二重鎖を形成し、ＲＮ
ａｓｅＨによる標的ＲＮＡの分解活性を有効に利用する
ことができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドの抗
ＨＩＶ活性は、後述の実施例に示すように、非常に高
い。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮ
Ａとの結合力又は安定性が高いことから、他のアンチセ
ンスＤＮＡよりも有効な薬剤となり得る。

【００１９】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：オリゴヌクレオチドの合成本実施例では、ＨＩＶのｒｅｖタンパク質をコードする
ｍＲＮＡに対する６種のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドを合成した。それらの構造を図５に示す。図５におい
て、Ａはアデノシン残基であり、Ｔはチミジン残基であ
り、Ｇはグアノシン残基であり、Ｃはシチジン残基であ
り、Ａ、Ｕ、Ｇ及びＣの「二重活字」は、それぞれ２’
−Ｏ−メチルリボヌクレオシドであり、ｓはホスホロチ
オエート結合である。オリゴマー１は、コントロール用
の未修飾のオリゴヌクレオチド（２３ｍｅｒ）である
〔配列表の配列番号１の配列を有する〕。オリゴマー２
は、３’側をヘアピンループ状にしてステム領域を１０
塩基にした比較用のオリゴヌクレオチド（３３ｍｅｒ）
である〔配列表の配列番号２の配列を有する〕。

【００２０】オリゴマー３は、オリゴマー１のリン酸ジ
エステル結合の酸素原子部分をイオウ原子で置換したホ
スホロチオエート型の比較用のオリゴヌクレオチド（２
３ｍｅｒ）である〔配列表の配列番号３の配列を有す
る〕。オリゴマー４は、オリゴマー２のリン酸ジエステ
ル結合の酸素原子部分をイオウ原子で置換したホスホロ
チオエート型の比較用のオリゴヌクレオチド（３３ｍｅ
ｒ）である〔配列表の配列番号４の配列を有する〕。オ
リゴマー５は、オリゴマー２のステム領域の３’側１本
鎖を２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドから形成したキ
メラ体であり、更に５’末端が２’−Ｏ−メチルグアノ
シン残基である、本発明によるオリゴヌクレオチド（３
３ｍｅｒ）である〔配列表の配列番号５の配列を有す
る〕。オリゴマー６は、オリゴマー５のリン酸ジエステ
ル結合の酸素原子部分をイオウ原子で置換したホスホロ
チオエート型の、本発明によるオリゴヌクレオチド（３
３ｍｅｒ）であって、ステム領域の３’側１本鎖を２’
−Ｏ−メチルリボヌクレオチドから形成したキメラ体で
あり、更に５’末端が２’−Ｏ−メチルグアノシン残基
である〔配列表の配列番号６の配列を有する〕。

【００２１】オリゴマー１及びオリゴマー２は、ホスホ
ロアミダイト法によるＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（ＡＢ
Ｉ社）を用いて合成した。ホスホロチオエート型のオリ
ゴマー３、オリゴマー４及びオリゴマー６は、通常のポ
リヌクレオチド合成に用いられる酸化剤である水／ヨウ
素／ピリジン溶液の代わりに、１５％Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−テトラエチルチオラムジスルフィド／アセトニト
リル溶液を用いて合成した。２’−Ｏ−メチルリボヌク
レオチドを含むキメラ体であるオリゴマー５及びオリゴ
マー６は、５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチ
ルリボヌクレオシド−３’−〔（２−シアノエチル）−
（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）〕−ホスホロアミダイトユ
ニットを用いて、ホスホロアミダイト法によるＤＮＡ／
ＲＮＡ自動合成機（ＡＢＩ社）により１０量体をまず合
成し、その後すぐに、ＤＮＡ合成用β−シアノエチルホ
スホロアミダイトユニットを用いて、次の２２量体を合
成し、最後に、再度５’−ジメトキシトリチル−２’−
Ｏ−メチルリボヌクレオシド−３’−〔（２−シアノエ
チル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）〕−ホスホロアミ
ダイトユニットを用いて合成した。２’−Ｏ−メチルリ
ボヌクレオチドを含むキメラ体オリゴマーの合成法の概
略を図３に示す。図３において、●は固相法の担体であ
り、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基であり、ｉＰｒは
イソプロピル基である。

【００２２】実施例２：ＲＮＡを用いたオリゴヌクレオ
チドのＴｍ値測定本実施例においては、標的ＲＮＡとアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドとにより塩基対を形成させた後、温度を上
昇させて吸光度曲線の極大値を求め、塩基対が剥がれる
温度（Ｔｍ値）を指標として塩基対の安定性を評価し
た。ＨＩＶプロウイルスＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ
のｒｅｖタンパク質をコードする領域を含む４５ｍｅｒ
ＲＮＡを化学合成し、これを標的とした。標的ＲＮＡの
塩基配列を図５に示す。前記実施例１で調製したオリゴ
マー１〜６のそれぞれについて、オリゴマー０．２ＯＤ
₂₆₀ 及び標的である４５ｍｅｒＲＮＡ０．２ＯＤ₂₆₀
を、１０ｍＭ−Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 及び１００ｍＭ−ＮａＣ
ｌ（ｐＨ７．４）から調製した緩衝液０．７ｍｌに加
え、９０℃で５分間加熱した後、室温になるまで徐々に
冷却して、よりきれいに塩基対を形成させた。反応液を
ＵＶセルに移し替え、２分間に１℃ずつ温度を上昇させ
ていきながら、ＵＶ測定器（島津製作所製ＵＶ−２２０
０Ａ）で波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。得
られた吸光度曲線より一次微分を行なって極大値を算出
し、これをＴｍ値とした。温度（℃）と変性度（％）と
の関係を図４に示す。図４において、吸光度曲線１はオ
リゴマー１、吸光度曲線２はオリゴマー２、吸光度曲線
３はオリゴマー３、吸光度曲線４はオリゴマー４、吸光
度曲線５はオリゴマー５、吸光度曲線６はオリゴマー６
のそれぞれの結果を示す。また、図４の吸光度曲線より
算出したＴｍ値を以下の表１に示す。

【００２３】

【表１】アンチセンスオリゴヌクレオチドＴｍ値（℃）オリゴマー１６０．８オリゴマー２５１．７オリゴマー３４９．９オリゴマー４４０．１オリゴマー５７０．６オリゴマー６６０．２

【００２４】オリゴマー１及びオリゴマー３、又はオリ
ゴマー２及びオリゴマー４を比較すると、ホスホロチオ
エート結合の導入によりＴｍ値が下がり、塩基対の安定
性が低下することが分かる。ところが、ステム領域に
２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを導入したオリゴマ
ー６は、ホスホロチオエート型であっても、オリゴマー
２に比べ、Ｔｍ値が上がっており、２’−Ｏ−メチルリ
ボヌクレオチドは、標的ＲＮＡとオリゴヌクレオチドと
の塩基対形成の安定化に寄与していることが分かる。

【００２５】実施例３：ヘビ毒ホスホジエステラーゼを
用いたオリゴヌクレオチドの耐酵素活性試験本実施例では、オリゴマーを３’方向から順に切断して
いく３’エキソヌクレアーゼ活性を示す核酸分解酵素と
してヘビ毒ホスホジエステラーゼ（以下、ＳＶＰＤと称
する）を用いて、核酸分解酵素に対する耐性試験を行な
った。ＳＶＰＤは、通常の未修飾のオリゴマーであれ
ば、速やかに分解する。前記実施例１で調製したオリゴ
マー１〜６について、１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．
５）、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ₂ 及び１００ｍＭ−ＮａＣｌ
から調製した緩衝液０．５ｍｌに、オリゴマー０．２Ｏ
Ｄ₂₆₀ を入れ、ＳＶＰＤ（ベーリンガーマンハイム社）
０．０２５μｇ（６ｕｎｉｔｓ）を加えて、３７℃で保
温しながら、タイムコースを取った。吸光度は、ＵＶ測
定器（島津製作所製ＵＶ−２２００Ａ）により波長２６
０ｎｍで測定した。ＳＶＰＤ添加から１０００秒経過後
のオリゴマー１の分解度を１００％として、各オリゴマ
ーの分解度を表した。結果を図６に示す。図６におい
て、直線１はオリゴマー１、直線２はオリゴマー２、そ
して直線３−６はオリゴマー３〜６の結果を示す。

【００２６】未修飾のオリゴマー１は、時間を追うごと
に、指数関数的に素早く切断された。しかし、オリゴマ
ー２は、未修飾であるが、ヘアピンループを有し、ステ
ム領域が１０塩基あるため、抵抗性を示した。オリゴマ
ー３〜６には、全く切断された様子は見当たらなかっ
た。オリゴマー３及び４は、ホスホロチオエート型であ
るために切断されなかった。また、オリゴマー５は、オ
リゴマー２と同じようにステム領域が１０塩基あり、
２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを導入したために切
断されなかった。オリゴマー６は、更に、オリゴマー５
のホスホロチオエート型であるので切断されなかった。

【００２７】実施例４：ウシ血清を用いたオリゴヌクレ
オチドの耐性試験オリゴマー１〜６のそれぞれについて、オリゴマー０．
１ＯＤ₂₆₀ （１μｌ）、１０倍濃縮Ｔ４キナーゼ緩衝液
１μｌ、〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ１μｌ、滅菌水６μｌ、及
びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社）０．５
μｌをチューブに取り、３７℃で、３０分間反応させ
た。反応終了後、フェノール／クロロホルム１０μｌを
加えて、水層を抽出し、２０％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切出しを行ない、エタノール沈殿を行な
い、乾燥させて、５’末端に³²Ｐでラベル化したオリゴ
マー１〜６を得た。この５’末端を³²Ｐでラベル化した
オリゴマー１〜６のそれぞれについて、５０ｐｍｏｌ量
（約１×１０⁵ ｃｐｍ量）を、１０％牛血清を含むダル
ベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）２００μｌに
加え、３７℃で１６時間保温した後、電気泳動（３時
間）を行ない比較した。結果を図７に示す。オリゴマー
１は、痕跡もなく切断されたのに対して、オリゴマー２
〜６は、切断されずに残っていた。前記実施例３のＳＶ
ＰＤ耐性試験と同様に、ヘアピン構造をとったり、２’
−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを導入したり、ホスホロ
チオエート型にすることにより、切断されなくなること
がわかる。

【００２８】実施例５：ＤＮＡポリメラーゼＩを用いた
耐酵素活性試験前記実施例４で調製した５’末端を³²Ｐでラベル化した
オリゴマー１〜６のそれぞれについて、オリゴマー０．
１ｐｍｏｌとＤＮＡポリメラーゼＩ（東洋紡績社）０．
５μｌ（５ｕｎｉｔｓ）を、５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．２）２μｌ、１００ｍＭ−ＭｇＳＯ₄ ２μ
ｌ、１ｍＭジチオトレイトール（以下、ＤＴＴと称す
る）２μｌ、１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（以下、Ｂ
ＳＡと称する。）１μｌ、及び滅菌水１０μｌの緩衝液
に溶かし、３７℃で反応させた。反応開始から、０分、
３０分、６０分、９０分、１２０分及び２４０分毎に、
反応溶液６μｌを取り出した。取り出した反応液に、フ
ェノール／クロロホルム１０μｌを加えて、水層を抽出
し、抽出液を２０％ポリアクリルアミドゲルで３時間電
気泳動させた。結果を図８（オリゴマー１及び２）及び
図９（オリゴマー３〜６）に示す。

【００２９】未修飾のオリゴマー１は、３０分後にはそ
のほとんどが切断された。しかし、ヘアピンループを有
するオリゴマー２は、９０分後にはそのほとんどが切断
されたが、６０分経過した時点ではかなりの量が残留し
ていた。オリゴマー３及びオリゴマー４に関しては、ホ
スホロチオエート型なので安定である。しかし、オリゴ
マー３については、チオエート化が完全ではなかったの
で、切断が観測される。ところで、ヘアピンループを有
し、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを導入したオリ
ゴマー５は、１２０分後にほとんど消失し、２４０分後
にすべて消失した。それに対して、更にホスホロチオエ
ート型としてオリゴマー６は切断はされなかった。な
お、オリゴマー５が分解された理由は、大腸菌由来のＤ
ＮＡポリメラーゼＩには複数の酵素活性を示す特徴（例
えば、一本鎖ＤＮＡに対する３’エキソヌクレアーゼ活
性、二本鎖ＤＮＡに対する５’エキソヌクレアーゼ活
性、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリットに対してＲＮＡを特異
的に切断するＲＮａｓｅＨ活性等）があるので、厳密な
意味で３’エキソヌクレアーゼ活性のみを純粋に評価し
ていることにはならないためである。

【００３０】実施例６：クレノウフラグメントを用いた
耐酵素活性試験前記実施例５で述べたように、大腸菌由来のＤＮＡポリ
メラーゼＩを用いた耐酵素活性試験では、２’−Ｏ−メ
チルリボヌクレオチドを導入したオリゴマー５は耐酵素
抵抗性を示さなかった。そこで、クレノウフラグメント
を用いることによって、オリゴマー５の有する耐３’エ
キソヌクレアーゼ活性を評価した。前記実施例４で調製
した５’末端を³²Ｐでラベルしたオリゴマー２及び５の
それぞれについて、４０ｐｍｏｌを、緩衝液〔５０ｍＭ
−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ−ＭｇＳＯ₄ 、
０．１ｍＭ−ＤＴＴ、０．５ｍｇ／ｍｌ−ＢＳＡ〕２０
μｌに溶かし、クレノウフラグメント（東洋紡績社）
（５ｕｎｉｔｓ）を加えて、３７℃で反応させた。その
反応液を一定時間ごとに取り出し、その取り出した反応
液に、フェノール／クロロホルム１０μｌを加えて、水
層を抽出し、電気泳動を行ない、ラジオオートグラフィ
ーを行なった。結果を図１０に示す。オリゴマー５につ
いて、前記実施例５では大腸菌由来のＤＮＡポリメラー
ゼＩによる切断反応が観察されたのに対して、クレノウ
フラグメントでは切断反応が観察されなかった。従っ
て、生体内に多く含まれる３’エキソヌクレアーゼに対
しては、ホスホロチオエート型にしなくても、強い抵抗
性を示すことが明らかになった。

【００３１】実施例７：ＲＮａｓｅＨ活性ＨＩＶ−１のｒｅｖ領域に相当する４５ｍｅｒＲＮＡを
用いて、オリゴマー１、５及び６についてＲＮａｓｅＨ
による標的ＲＮＡの分解活性について評価した。オリゴ
マー１、５又は６のそれぞれについて、１０ｐｍｏｌを
取り出し、５’末端を³²Ｐでラベルした４５ｍｅｒＲＮ
Ａ（１ｐｍｏｌ）と緩衝液〔２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ₂ 、１００ｍＭ
−ＫＣｌ、０．１ｍＭ−ＤＴＴ〕３０ｍｌとを加え、６
０℃で加熱した後、室温になるまで徐々に冷却させ、更
にＲＮａｓｉｎ（プロメガ社）（４０ｕｎｉｔｓ）及び
ＲＮａｓｅＨ（プロメガ社）０．５ｕｎｉｔｓを加え
て、３７℃で反応させた。その反応溶液を０分、１５
分、及び３０分ごとに取り出し、抽出後に電気泳動を行
ない、ラジオオートグラフィーを行なった。結果を図１
１に示す。オリゴマー５及び６については反応時間が遅
いが、オリゴマー１、５及び６は、どれも同じ部位で切
断されていることがわかった。これにより、ヘアピン構
造をとっていてもＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡの分解
活性があることがわかった。

【００３２】実施例８：抗ＨＩＶ活性ＨＩＶのｒｅｖタンパク質をコードするｍＲＮＡのスプ
ライシングアクセプター（以下、ｓａと称する）をター
ゲットとするオリゴマー６は、非常にｍＲＮＡとの結合
が強く（前記実施例２）、またエキソヌクレアーゼに対
して安定で（前記実施例５）、更には１０％ウシ血清中
でも安定である（前記実施例４）ことがわかったので、
次にオリゴマー６の抗ＨＩＶ活性を測定した。オリゴマ
ー６は、ｒｅｖ領域のスプライシングアクセプターのＨ
ＩＶ−１ｍＲＮＡ（塩基番号５５２６位〜５５４８位）
に相補的なオリゴマーである。抗ＨＩＶ活性の測定に
は、成人Ｔ細胞白血病の原因ウイルスＨＴＬＶ−１によ
りトランスフォームされたヒト細胞株ＭＴ−４細胞（山
梨医科大学中島氏より分与）を標的細胞とし、ＨＩＶの
一種であるＨＴＬＶ−III Ｂを使用した。各種濃度の試
験物質を添加した培養液（非働化牛胎児血清１０％、ペ
ニシリン１００ＩＵ／ｍｌ及びストレプトマイシン１０
０μｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０培地）を９６穴マ
イクロタイタープレートに分注し、ＨＩＶ感染ＭＴ−４
細胞（２．５×１０⁴ 細胞／ｗｅｌｌ、９６穴、ＭＯ
Ｉ：０．０１）を感染直後に加えた。ＭＴ−４細胞に及
ぼす試験物質の細胞障害性をみるために、同様に種々の
濃度の試験物質を含む培養液を調製し、ウイルス非感染
ＭＴ−４細胞を加えた。両者をＣＯ₂ インキュベーター
で３７℃５日間培養した後、生細胞をテトラゾリウム
（ＭＴＴ）法（Ｐａｕｗｅｌｓ，Ｒ．ｅｔａｌ．，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０，３０９−３２
１，１９８９）を用いて染色し、ＨＩＶ感染細胞及び非
感染細胞それぞれの生細胞数（×１０⁴ ／ｍｌ）を測定
した。結果を図１２及び表２に示す。抗ウイルス活性
は、ＨＩＶ感染による細胞障害を試験物質が５０％保護
する濃度〔ＥＣ５０：５０％有効濃度（ｅｆｆｅｃｔｉ
ｖｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）〕で表した。表２
において、ＣＣ５０は５０％細胞障害濃度の意味であ
る。オリゴマー６は、ＥＣ５０＝０．１６μＭと非常に
高い活性を示した。

【００３３】

【表２】試験薬剤ＣＣ５０ＥＣ５０オリゴマー６（μＭ）＞８．００＝０．１６ＡＺＴ（μＭ）＝２０１．７４＝０．０１３ｄｄＣ（μＭ）＝２９８５．４６＝０．７８ｄｄＩ（μＭ）＞５０００．００＝１７．０１

【００３４】

【発明の効果】本発明のオリゴヌクレオチドは、標的と
なるＤＮＡ又はＲＮＡとの間に安定した塩基対を形成
し、生体内の各種ヌクレアーゼの分解活性に対して抵抗
性をもつ。更に、このオリゴヌクレオチドからなる本発
明の抗ウイルス剤は、ウイルスの増殖を阻害することが
できる。

【００３５】

【配列表】

【００３６】配列番号：１配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡアンチセンス：Ｙｅｓ配列 GGAGATGCCT AAGGCTTTGT TAT 23

【００３７】配列番号：２配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡアンチセンス：Ｙｅｓ配列 GGAGATGCCT AAGGCTTTGT TATCAAAGCC TTA 33

【００３８】配列番号：３配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチドアンチセンス：Ｙｅｓ配列の特徴存在位置：１．．２３特徴を決定した方法：Ｅ他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
結合である。配列 GGAGATGCCT AAGGCTTTGT TAT 23

【００３９】配列番号：４配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチドアンチセンス：Ｙｅｓ配列の特徴存在位置：１．．３３特徴を決定した方法：Ｅ他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
結合である。配列 GGAGATGCCT AAGGCTTTGT TATCAAAGCC TTA 33

【００４０】配列番号：５配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチドアンチセンス：Ｙｅｓ配列の特徴特徴を表す記号： modified base 存在位置：１特徴を決定した方法：Ｅ他の情報：Ｇはｇｍである。特徴を表す記号： modified base 存在位置：２４．．３３特徴を決定した方法：Ｅ他の情報：Ｃはｃｍであり、Ｇはｇｍであり、Ｕはｕｍ
であり、Ａは２′−Ｏ−メチルアデノシンである。配列 GGAGATGCCT AAGGCTTTGT TATCAAAGCC UUA 33

【００４１】配列番号：６配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチドアンチセンス：Ｙｅｓ配列の特徴特徴を表す記号： modified base 存在位置：１特徴を決定した方法：Ｅ他の情報：Ｇはｇｍである。特徴を表す記号： modified base 存在位置：２４．．３３特徴を決定した方法：Ｅ他の情報：Ｃはｃｍであり、Ｇはｇｍであり、Ｕはｕｍ
であり、Ａは２′−Ｏ−メチルアデノシンである。存在位置：１．．３３特徴を決定した方法：Ｅ他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
結合である。配列 GGAGATGCCT AAGGCTTTGT TATCAAAGCC UUA 33

【００４２】配列番号：７配列の長さ：４５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＲＮＡアンチセンス：Ｎｏ配列 AUAACAAAGC CUUAGGCAUC UCCUAUGGCA GGAAGAAGCG GAGAC 45

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＩＶのライフサイクル及びアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの作用を模式的に示す説明図である。

【図２】２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ＤＮＡ、
ＲＮＡ及びホスホロチオエート結合の化学構造を示す説
明図である。

【図３】２’−Ｏ−メチルリボ／デオキシリボキメラオ
リゴヌクレオチドの合成方法を示す説明図である。

【図４】実施例２で行った、標的ＲＮＡと各種アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドとが形成する二重鎖の熱安定性
の差異を示すグラフである。

【図５】実施例１で合成した各種アンチセンスオリゴヌ
クレオチドの塩基配列及び標的ＲＮＡの塩基配列を示す
説明図である。

【図６】実施例３で行った、ＳＶＰＤによるオリゴマー
１〜６の分解経過を示すグラフである。

【図７】実施例４で行った、ウシ血清存在下で分解させ
たオリゴマー１〜６の電気泳動の結果を示す図面に代わ
る写真である。

【図８】実施例５で行った、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉを作用させたオリゴマー１及び２の電気泳動の結果を
示す図面に代わる写真である。

【図９】実施例５で行った、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉを作用させたオリゴマー３〜６の電気泳動の結果を示
す図面に代わる写真である。

【図１０】実施例６で行った、クレノウフラグメントを
作用させたオリゴマー２及び５のの電気泳動の結果を示
す図面に代わる写真である。

【図１１】実施例７で行った、オリゴマー１、５及び６
と結合した標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨによる特異的分解
活性を、電気泳動の結果によって示す図面に代わる写真
である。

【図１２】実施例８で行った、ＨＩＶ感染細胞及びＨＩ
Ｖ非感染細胞に対するオリゴマー６の抗ＨＩＶ活性を示
すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（１）ヘアピンループを形成することが
でき、（２）ヌクレオチドの少なくとも１つが２’−Ｏ
−メチルリボヌクレオチドであり、（３）標的ＤＮＡ又
はＲＮＡに相補的な配列を含むことを特徴とするオリゴ
ヌクレオチド。
【請求項２】ヘアピンループのステム領域を構成する
ことができるヌクレオチドの少なくとも１つが２’−Ｏ
−メチルリボヌクレオチドである請求項１に記載のオリ
ゴヌクレオチド。
【請求項３】ヘアピンループを３’側に形成すること
ができる請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】少なくとも１つのホスホロチオエート結
合を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌ
クレオチド。
【請求項５】ウイルスの遺伝子に対して相補的である
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド。
【請求項６】ウイルスがＨＩＶである請求項５に記載
のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】式 GmGAGATGCCT AAGGCTTTGT TATCmAmAmAmGmCmCm UmUmAm （式中、Ａはアデノシン残基であり、Ｃはシチジン残基
であり、Ｇはグアノシン残基であり、Ｔはチミジン残基
であり、Ａｍは２’−Ｏ−メチルアデノシン残基であ
り、Ｃｍは２’−Ｏ−メチルシチジン残基であり、Ｕｍ
は２’−Ｏ−メチルウリジン残基であり、Ｇｍは２’−
Ｏ−メチルグアノシン残基であり、各ヌクレオシド間の
結合は、ホスホジエステル結合であるかホスホロチオエ
ート結合であるものとする）で表される塩基配列をもつ
請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを
含むことを特徴とする、抗ウイルス剤。