JPH0816063B2

JPH0816063B2 - 腫瘍細胞増殖阻害剤

Info

Publication number: JPH0816063B2
Application number: JP60501854A
Authority: JP
Inventors: アールトワードジク，ダニエル; ジエイトダロ，ジヨージ
Original assignee: オンコゲン
Priority date: 1985-03-15
Filing date: 1985-03-19
Publication date: 1996-02-21
Anticipated expiration: 2011-02-21
Also published as: JPS61501708A

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景発明の分野造血細胞の及びそれによる分化及び増殖の複雑さは、
これらの事象を調整する単離された因子のリストが連続
的に増加するに従って、次第に明らかになりつつある。
ほとんどの場合、これらの因子は、広範囲の機能を有す
る多くの他の蛋白質と共に非常に微量に存在する。単離
されそして活性を有することが証明された因子は、γ−
インターフェロン、血小板増殖因子、コロニー刺激因
子、インターロイキン−２、エリスロポイエチンのごと
きポリペプチド及び蛋白質、並びに多数の他のリンホカ
インを包含する。これらの血液成分の単離、精製及び特
徴付けには実質的な興味が存在する。なぜなら、これら
は癌のごとき疾患の治療及び説明に使用される可能性が
あるからである。

天然に存在する因子の単離には多くの落とし穴が存在
する。存在しそして類似の特性を有するであろう他の因
子から目的因子を分離する分離系が開発されなければな
らない。第２に、存在する他の特質に対比して注目の物
質を特異的に又は実質上特異的に特徴付ける、種々の画
分を測定するための幾つかの手段が与えられなければな
らない。注目のポリペプチドが極端に高い活性を有する
場合、目的生成物を単離する困難さは非常に増強され
る。第３に、注目の生成物に不都合な影響を与えない方
法、特にすべての変性を回避する方法を得なければなら
ない。さらに、組成物中には注目の物質に作用してそれ
を変化せしめる他の物質がしばしば存在し、その結果、
最終的に得られるなんらかの目的の活性を有する物質は
天然に存在する物質ではない。最後に、目的生成物を十
分に純粋な形で単離した後、例えばアミノ酸配列決定、
グリコシル化数、ジスルフィド橋、及びこれらに類する
事項により、そのポリペプチドを物理的に特徴付けるこ
とを試みなければならない。さらに、物質をその生理学
的特性について特徴付けなければならない。

最後に、精製された化合物の単離の後でさえ、該化合
物の生理学的活性の特徴付けはしばしば捕えどころがな
いことが証明されよう。多くの状況において、活性は１
又は複数の他の化合物の存在、狭い濃度範囲、特定の宿
主細胞、又はこれらに類するものに依存し得るので、化
合物の生理学的活性を見出しそしてその活性に影響を与
える他のパラメーターを証明せるために、実質的直感的
努力及び延長された実験期間が必要とされる。

従来技術の記載 Holley等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1980）77:5989−
5992は、上皮細胞増殖阻害物質を記載している。Nelson
−Hamilton及びHolley,前掲，（1983）80:5636−5640
は、アフリカミドリザル細胞（BSC−１）により分泌さ
れる蛋白質への放射性標識されたメチオニンの導入にお
ける増殖阻害物質及び上皮増殖因子の効果を記載してい
る。Morgan等,Thromb.Haemost.（1980）42:1652−60ヒ
ト血小板ファクター４のアミノ酸配列を与えている。Da
wes等,Thromb.Res.（1983）29:569−81、及びScherntha
ner等,Acta Med.Austriaca（suppl.）（1976）６:375−
９は、血小板ファクター４に対するポリクローナル抗体
を報告している。Lawler,Thromb.Res.（1981）21:121−
７はβ−スロンボグロブリンと血小板ファクター４の配
列及び構造を比較している。

発明の概要次の性質を少なくとも１つ、すなわち正常細胞の増殖
を阻害しないが腫瘍の増殖を阻害することができる;pp6
0srcオートホスホリレーションを刺激することができ
る；腫瘍細胞からの52kD蛋白質の分泌を誘導することが
できる；及び哺乳類血小板から単離することができそし
て前記の性質の少なくとも１つを示すポリペプチドの少
なくとも一部分と実質的に同等のアミノ酸配列を有す
る；を有することによって特徴付けられるポリペプチド
組成物及びその用途が提供される。このポリペプチドは
実質上純粋な形で提供される。

図面の簡単な説明第１図は、無胸腺（athymic）マウスにおける腫瘍の
増殖に対するオンコスタチン−Ａの効果を比較する図表
である。

具体的な態様の詳細な記載哺乳動物新生物細胞増殖阻害を行う、ポリペプチド、
誘導体、断片、又はそれらの類以外を含んで成る組成物
が提供される。この発明のポリペプチドは血小板の抽出
により得られるエタノール性HCl画分中の天然ポリペプ
チドに関し、このものは文献中で血小板ファクター４と
呼ばれ、そして以後オンコスタチン−４（Oncostatin−
Ａ）と称する。このポリペプチドは穏和な温度（０〜25
℃）、低いpH、一般に約pH3以下、通常pH2において安定
である。このポリペプチドは、約5,000〜8,000の範囲、
一層正確には約6,000〜7,500の範囲、さらに特定すれば
約7,000の分子量を有する。このポリペプチドは、高等
動物、特に霊長類、さらに特定すればヒトの血小板から
得られる。

使用されるポリペプチド化合物は約15〜80アミノ酸を
有し、天然ポリペプチド及びその模倣類似体は約60〜75
アミノ酸、さらに普通には約65〜72アミノ酸を有し、他
方断片は一般に約15〜60アミノ酸、さらに普通には15〜
35アミノ酸の範囲にあるであろう。約68〜72アミノ酸、
さらに特定すれば、69,70又は71アミノ酸を有するポリ
ペプチドが特に興味深い。これらのポリペプチドは、他
の化合物、例えば抗原、レセプター、標識等に結合する
ことができる。

ポリペプチドは少なくとも１つの生物学的に活性な、
例えば免疫学的に又はエピトープとして活性な配列を有
し、そして１個より多くの生物学的に活性な配列を有
し、この場合このような配列が生物学的性質について天
然生成物と競争することができるであろう。

注目の組成物は酸性（陰イオン性）Ｎ−末端及び塩基
性（陽イオン性）Ｃ−末端を有し、荷電領域は６〜15ア
ミノ酸、通常６〜12アミノ酸であり、この領域は６〜８
アミノ酸のアミノ酸配列を含み、50％以上の個数、通常
60％以上の個数がイオン性アミノ酸であり、そして通常
90％以下の個数がイオン性アミノ酸である。イオン性ア
ミノ酸は塩基性、Ｋ及びR:酸性、Ｄ及びＥである。

約60以上のアミノ酸を有する組成物は、25個以上のア
ミノ酸、通常40個以上のアミノ酸、そして約70個より少
なく、一般に約65個より少ないアミノ酸により隔てられ
た複数の荷電ドメインを有するであろう。荷電ドメイン
を隔てるアミノ酸連結配列は、陰イオン性アミノ酸を越
える過剰の陽イオン性アミノ酸を有し、一般に約1.5〜
３、通常２〜１の比率を有し、化合物のpKは約6.5〜
８、の範囲、特に約7.4であろう。

前記連結配列中には２個のジスルフィド橋が存在し、
これら架僑ジスルフィドは約20〜45、通常22〜40アミノ
酸隔てられており、好ましくは約25及び39アミノ酸によ
り隔てられている。Ｎ−末端に近位の複数のシステイン
はＮ−末端末から約８〜16アミノ酸にあり、Ｃ−末端に
近位の複数のシステインはＣ−末端から約12〜45アミノ
酸、通常16〜40アミノ酸にある。

注目の組成物は一般に、ペンタペプチドＥ−Ａ−Ｅ−
Ｅ−Ｄ、さらに一般にはデカペプチドＥ−Ａ−Ｅ−Ｅ−
Ｄ−Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｃ、しばしばペンタデカペプチド
Ｅ−Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｃ−Ｌ−Ｃ−Ｖ
−Ｋ−Ｔ、そしてさらにしばしば次の式:E−Ａ−Ｅ−Ｅ
−Ｄ−Ｃ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｃ−Ｌ−Ｃ−Ｖ−Ｋ−Ｔ−Ｔ−
Ｓ−Ｑ−Ｖ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｈ−の式を有するＮ−末端の
近位に配列を有するであろう。ここで、文字は常法に従
って次の意味を有する。

Ａ−アラニンＬ−ロイシンＣ−システインＰ−プロリンＤ−アスパラギン酸Ｑ−グルタミンＥ−グルタミン酸Ｒ−アルギニンＧ−グリシンＳ−セリンＨ−ヒスチジンＴ−スレオニンＶ−バリン注目の組成物は一般に、Ｃ−末端の近位において、式
Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ｉ−Ｋ−Ｋの配列、さらに一般には式Ｋ−
Ｋ−Ｉ−Ｉ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ、そして好ましくはＰ−Ｌ
−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ｉ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｓの配列
を有するであろう。

アミノ酸の保存的置換（Conservative substitution
s）を行うことができると理解されるべきである。保存
的変化にはＤ及びE;F及びY;K及びR;G及びA;N及びG;V、
Ｉ及びＲ、等が関与する置換が含まれる。幾つかの場合
には、非保存的変化、例えばＫ又はＲとＮ又はＱとの置
換が好ましいであろう。この置換は、２−塩基性アミノ
酸プロテアーゼ開裂部位、例えばＫ−Ｒが存在する場合
に特に興味が持たれ、この場合置換はプロテアーゼ開裂
に対してこの部位を保護する。

さらに、挿入又は除去を含めることができ、この場合
通常挿入又は除去には１〜２個のアミノ酸、特に１個の
アミノ酸が関与するであろう。

注目の新規なポリペプチドは、ほとんどの場合次の構造
式： Ac_R−M_R−Ba_r を有し、ここで、 Ac_R（酸性領域）はＮ−末端領域であり、そして10〜2
0個のアミノ酸を有し、この内４〜５個が酸性アミノ酸
であって、最初の３アミノ酸の内少なくとも２個が酸性
アミノ酸であり、２個の酸性アミノ酸はタンデムに配置
されており、そして他の２個の酸性アミノ酸は中性脂肪
族アミノ酸により隔てられており;2個のcys残基が１個
の中性脂肪族アミノ酸に隔てられて存在し；このcys−
Ｘ−cysが２〜６個のアミノ酸によりＤ又はＥ−Ｘ−Ｄ
又はＥから隔てられていることを特徴とし； M_Rは中間領域であり、２〜30炭素原子の短連結基である
か又は約25〜40個のアミノ酸を有し；少なくとも10個、
一般に少なくとも20個のアミノ酸によりAc_Rのシステイ
ンから隔てられた２個のシステインを有し、これらのシ
ステインのそれがAc_R中のシステインの１つとジスルフ
ィド橋を形成しており;5〜７個の塩基性アミノ酸及び２
〜５個、通常３〜４個の酸性アミノ酸を有し； Ba_R（塩基性領域）はＣ−末端領域であって、12〜30
個のアミノ酸を有し;2対の塩基性アミノ酸を有し、それ
ぞれが２〜３個の中性脂肪族アミノ酸により引き継が
れ、極性又は非−極性、通常は非極性であり;C−末端ア
ミノ酸から10〜15アミノ酸に１個のプロリンを有するこ
とにより特徴付けられる。

好ましくは、Ac_Rは次の式：を有し、ここで、（Ｈ）はＮ−末端における水素を意図し； aa_1,3は結合、又は水素原子数２〜６個の脂肪族アミ
ノ酸、通常酸性アミノ酸もしくは２〜３個の炭素原子を
有する非極性アミノ酸であることができ； aa²は結合、又は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ
酸、通常塩基性アミノ酸、炭素原子数３〜５個の極性ア
ミノ酸、又は炭素原子数２〜３個の非極性アミノ酸であ
り； X¹は結合、又は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数
４〜６個のアミノ酸１〜２個から成るアミノ酸配列であ
り、これは脂肪族非極性又は極性アミノ酸であり； aa⁶は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数２〜４個
の非極性もしくは極性の脂肪族アミノ酸、又は酸性アミ
ノ酸であり； aa⁸は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数５〜６個
の脂肪族アミノ酸であって、通常非極性であり； aa⁹は炭素数２〜６個、通常は炭素原子数４〜６個の
脂肪族アミノ酸であり、特に極性カルボキサミド置換さ
れており又は塩基性であり； X²は結合、又は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ
酸、特に中性アミノ酸１〜２個からなるアミノ酸配列で
あり； aa¹¹は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数３〜６個
の脂肪族アミノ酸であって、これは非極性又は極性であ
ることができ； aa¹³は２〜６個、通常５〜６個の炭素原子を有する脂
肪族アミノ酸であって、特に非極性であり； X³は結合、ヒドロキシ、炭素原子数１〜３個のアルコ
キシ基、アミノ、又は１〜６、通常１〜３アミノ酸のア
ミノ酸配列であって、通常は中性脂肪族で非極性又は極
性のいずれか、特に極性であり、最初の３個のアミノ酸
は一般に中正であり、ここでX³は分子の末端であること
ができ、又はM_R、Ba_Rもしくは抗原に連結することがで
きる。

前記の記号のための好ましいァミノ算は通りである。

aa¹−結合,D,E,G,A aa²−結合,G,A,K,R,S,T X¹−結合，（Ｓ又はＴ）_ａ−（V,L又はＩ）_aaは０又は
１ aa⁶−S,T,G,A,D,E aa⁸−V,L,I aa⁹−N,Q,K,R X²−（Ｇ又はＡ）_ａ（Ｄ又はＥ）_ａ−（V,L又はＩ）_ａ aa¹¹−V,L,I,M,S,T aa¹²−V,L,I X³−結合−（Ｓ又はＴ）_ｂ−（G,A,N又はＱ）_ａ−（V,
I,又はＬ）_ａ−（K,R,N,Q,H,F又はＹ）_abは０〜３の整
数。

好ましくはBa_Rは次の式：を有し、ここで、 aa^44,56は炭素原子数４〜５個の脂肪族酸性アミノ酸
又はそのアミドであり； aa^{41,42,51,53,63,64,67}は炭素原子数２〜６個、さら
に特定すれば炭素原子数５〜６個の脂肪族アミノ酸であ
って特に非極性であり； aa⁴⁵は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸、特に炭
素原子数４〜６個の非極性アミノ酸、又は塩基性アミノ
酸であり； aa⁴⁷は炭素原子数３〜５個の脂肪族アミノ酸、特にヒ
ドロキシもしくはアミド置換基を有する極性アミノ酸、
又は酸性アミノ酸であり； aa⁵⁵は炭素原子数２〜６個の中性脂肪族アミノ酸、特
に炭素原子数４〜６個の非極性の又はカルボキサミド官
能を有する炭素原子数４〜５個の極性アミノ酸； aa⁵⁷は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸、特に炭
素原子数２〜３個の非極性アミノ酸、又は塩基性アミノ
酸であり； aa⁵⁹は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数４〜６個
の脂肪族アミノ酸、通常非極性の、又は塩基性のアミノ
酸であり； aa⁶⁰は脂肪族又は芳香族アミノ酸、特に脂肪族であれ
ば炭素原子数４〜６個のアミノ酸であり； aa^64aは結合、又は炭素原子数４〜５個の脂肪族極性
アミノ酸、特にカルボキサミド置換されたアミノ酸であ
り； aa⁶⁸は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸、特に非
極性アミノ酸であり； X⁴はヒドロキシ、炭素原子数１〜３個のアルコキシ、
アミノ、又は１〜４個の、通常１〜２個のアミノ酸のア
ミノ酸配列であり、このアミノ酸は特に脂肪族アミノ
酸、さらに特定すれば極性及び酸性のアミノ酸であり、
前記置列は２〜３個の炭素原子を有する０〜１個の非極
性アミノ酸、０〜３個の酸性アミノ酸及び０〜３個のヒ
ドロキシ置換脂肪族アミノ酸を有し、ここでX⁴は分子の
末端に位置し又は抗原もしくは免疫グロブリンへの連結
である。

記号が次の定義を有する場合特に興味深い。

aa^40,56−D,E,N,Q aa^{41,42,51,53,63,64,67}−V,L又はＩ aa⁴⁷−N,Q,S,T,D,E aa⁵⁵−N,O,P,L,I,V; 特にＰ又はＬ aa^45,59−V,L,I,K,R aa⁶⁰−V,L,I,F,H,Y aa^64a−結合,N又はＱ aa⁶⁸−G,A,P,L,I,V X⁴−（G,A,D又はＥ）_ａ−（S,T,D,A,G又はＥ）_ａ−（Ｄ
又はＥ）_ｃ−（Ｔ又はＳ）_acは０〜２。

（同じ部位に２個のアミノ酸が示されている場合、その
位置にいずれのアミノ酸が存在していてもよい。）好ましくは、Mrは次の式：に含まれる少なくとも15個のアミノ酸の配列を含み、ここで、 aa²³は芳香族アミノ酸、又は炭素原子数３〜５個の脂
肪族極性アミノ酸、特にアミド置換アミノ酸であり； aa²⁴は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数５又は６
個の脂肪族非極性アミノ酸であり； aa²⁵は炭素原子数３〜５個の脂肪族極性アミノ酸、特
にアミド又はヒドロキシ置換アミノ酸であり； aa^27,29,30は炭素原子数５〜６個の脂肪族非極性アミ
ノ酸であり； aa³¹は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸であっ
て、炭素原子数２〜３個の非極性アミノ酸であるか又は
塩基性アミノ酸のいずれかであり； aa³²は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸であっ
て、炭素原子数２〜３個の非極性アミノ酸か又は塩基性
マミノ酸のいずれかであり； aa³⁴は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数３〜５個
の脂肪族アミノ酸であり、これは非極性又は極性であ
り、特にヒドロキシ置換されており； aa³⁷は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数３〜５個
の脂肪族アミノ酸であって、これは非極性又は極性であ
り、特にプロリン又はカルボキサミド置換されており； aa³⁸は炭素原子数３〜５個の脂肪族極性アミノ酸であ
って、通常アミド又はヒドロキシ置換されており； aa³⁹は炭素原子数２〜６個の脂肪族非極性アミノ酸で
あり； aa⁴⁰の炭素原子数４〜５個の脂肪族酸性アミノ酸又は
そのアミドであり； X⁵は係合、ヒドロキシ、炭素原子数１〜３個のアルコ
キシであり、ここでX⁵は配列の末端に位置し、Ba_Rにも
しくは抗原への連結である。

記号のための次の定義が特に興味深い。

aa²³−F,H,Y,N,Q aa^24,27,29,30−V,L,I aa^25,38−S,T,N,Q aa^31,32−G,A,K,R aa³⁴−P,S,T aa³⁷−P,N,Q aa³⁸−S,T,N,Q aa³⁹−G,A,P,V,L,I aa⁴⁰−D,E,N,Q アミノ酸は次のように分類される。

脂肪族中性非極性 G,A,P,V,L,I 極性 S,T,M,C,N,Q 酸性 D,E 塩基性 K,R 芳香族 F,H,Y,W 上記の式から明らかなように、生理学的活性に有意な
影響を与えることなく上記の配列中に種々の保存的置換
を行うことができる。さらに、１〜２個のアミノ酸の除
去及び挿入を用いることができる。通常、５個以下、通
常３個以下の変化（置換除去又は挿入）が上記の配列中
で行われるであろう。

この発明において使用するために特に興味あるのは次の
配列：を有する化合物又はその類似体、特に、およそそれらの
該当する位置に４個のシステイン、及びＣ−末端又はそ
の近位に12個のアミノ酸、特にＣ−末端に近位に10個の
アミノ酸、そしてさらに特定すればＣ−末端に近位に８
個のアミノ酸（４個の塩基性及び４個の中性脂肪族アミ
ノ酸を含む）を含有する類似体又は断片である。上記の
組成物の類似体は通常約80％以上、さらに普通には約85
％以上、そして好ましくは約90％以上の、上記配列又は
上記配列の部分中と同じアミノ酸を有する。

この発明において使用される天然ポリペプチド組成物
は、鋭敏なバイオアッセイにより確立されるように、高
純度で得ることができる。天然ポリペプチド組成物は、
約20重量％未満、さらに普通には約10重量％未満、そし
て好ましくは約５重量％未満の、該組成物中に存在する
主成分以外のポリペプチドを含むであろう。この汚染ポ
リペプチドは血小板と関連する。

この発明のポリペプチド組成物は種々の生理学的活性
を有する。この発明の組成物はイン−ビトロ及びイン−
ビボにおいて腫瘍の増殖を阻害するために使用すること
ができる。この組成物はまた、pp60srcのオートホスホ
リレーションを刺激するために使用することができる。
従って、この組成物はpp60src酵素の基質として機能す
ることができ、そしてポリペプチドのチロシン位置（残
基60）においてリン酸化され得る。さらに、オンコスタ
チン−Ａにより処理された場合、腫瘍細胞は52kD蛋白質
を放出するように誘導され得る。さらに、オンコスタチ
ン−Ａ又は類似体、それらの断片、又は競争的免疫学的
性質を有するサブ−配列（断片）を含有する融合蛋白質
は、モノクローナル抗体の製造のために使用され得、あ
るいは、オンコスタチン−Ａもしくは免疫学的に競争的
な化合物又はオンコスタチン−Ａのための細胞表面レセ
プターの存在を検出するための診断測定における試薬と
して機能し得る。

この発明の化合物は、腫瘍阻害のために高い活性を有
する。この組成物はイン−ビドロ又はイン−ビボにおい
て、新生物細胞の増殖速度を低下せしめるために使用す
ることができる。このポリペプチド組成物は、1ngレベ
ルにおいて約20％以上の、腫瘍細胞増殖の、特に、肺、
乳房、皮膚等の癌及び肉腫の阻害をもたらすことができ
る。好ましくは、このポリペプチド組成物は、実験の部
に記載されているコロニー阻害試験に従えば、約40％以
上、そしてさらに好ましくは約50％以上の腫瘍細胞増殖
の阻害をもたらすであろう。

この発明の組成物は、新形成（neoplasia）を有する
ことが疑われる宿主に投与されることにより、イン−ビ
ボにおいて使用され得る。この組成物は、増殖の速度を
低下せしめるため新生物部位、例えば黒色腫に適用され
得る。適用の方法は、腫瘍の部位、この組成物の剤形、
投与量レベル等に依存して、注射、カテーテルにより導
入、直接適用等を包含する。投与量は、それが全身的か
局所的かに依存して変化し、投与量濃度は一般に約0.1
μｇ〜1000μg/kgであり、そして霊長類を含む大形哺乳
動物のための全投与量は、治療投与当り約0.01〜10mgで
ある。

オンコスタチン−Ａ及びその同類物を包含するオンコ
スタチン−Ａ様物質（同類物とは、オンコスタチン−Ａ
の少なくとも１つの生理学的性質を有し、そしてオンコ
スタチン−Ａのアミノ酸配列と実質的に同じ少なくとも
１つのアミノ酸配列を含有する化合物であり、ここで同
類物はオンコスタチン−Ａより多くの又は少ない数のア
ミノ酸を有する）は、生理学的に許容される担体、例え
ばリン酸緩衝化塩溶液、蒸留水、賦形剤又はこれらに類
するもの中に製剤化することができ、又はそのまま使用
することができる。

オンコスタチン−Ａ及びその同類物は、新生物細胞の
存在を検出するために間接的に使用することができる。
細胞が約１〜500ng/ml活性剤、好ましくは約50〜350ng/
mlの活性剤の濃度にかけられる場合、その新生物細胞に
よって52kD蛋白質（p52）が分泌される。従って、外部
媒体、例えば栄養培地、血液、尿、又は他の生理学的液
体へのp52の分泌を検出することによって新生物細胞の
存在を検出することができる。従ってオンコスタチン−
Ａは宿主の状態及び新生物状態の存在を監視するために
使用され得る。オンコスタチン−Ａは、監視手術におけ
る瘍腫の存非、新生物のレベル等を診断するために使用
され得る。オンコスタチン−Ａはp52の分泌の誘導をも
たらすために十分な量において、イン−ビドロ又はイン
−ビボにおいて（培地又は宿主に）投与されるであろ
う。次に、系に関連する液が、親生物細胞の存在の指標
としてp52の存在について監視されるであろう。

オンコスタチン−Ａ様物質はまた、それ自体により、
しかし好ましくは他のリンホカイン、例えばインターフ
ェロン、さらに特定すればγ−インターフェロンと組み
合わせて免疫系を刺激するために使用され得る。すなわ
ち、オンコスタチン−Ａ様物質は他のポリペプチドと配
合され、そして免疫系を刺激するために免疫抑制さえた
宿主に投与され得る。γ−インターフェロンは、単球及
びマクロファージ、並びに他の組織、例えば内皮及び線
維芽細胞において、I_aの発現を誘導することが知られて
いる。オンコスタチン−Ａ様物質はI_a発現を誘導しそし
てγ−インターフェロンI_a誘導を刺激してγ−インター
フェロンの所与の投与量効果を増強する。オンコスタチ
ン−Ａ様物質の量は一般に媒体中に約１〜200、好まし
くは約２〜70ng/mlの範囲の濃度をもたらすように使用
される。γ−インターフェロンの量はその使用につい
て、リンホカインが一般に約0.5〜200ng/mlの範囲であ
るように、常法通りであろう。約1.5倍以上、通常約２
倍以上の発現の増強がオンコスタチン−Ａ様物質によ
り、それがそれ自体として又は他のリンホカインと組合
わせて使用された場合に、達成される。前記のように投
与が行われ得る。

オンコスタチン−Ａ様物質はまた、キナーゼ、特にpp
60srcと組合わせて、該酵素の基質異性を変えるために
使用することができる。特に、該酵素を少量のオンコス
タチン−Ａ様物質と、特に約0.05〜50μg/mlの濃度にお
いて接触せしめることにより、キナーゼ活性が増強さ
れ、これにはリン酸化される観察されるアミノ酸の変化
が含まれ、特にトリプシンがリン酸化されるほかにセリ
ンもリン酸化される。こうして、pp60src又は類似のキ
ナーゼとの組合わせが、チロシン及びセリンの両者の増
強された比率でのリン酸化をもたらすことにより、チロ
シン及びセリンアミノ酸を有するポリペプチドを修飾す
るために使用され得る。

この発明のオンコスタチン−Ａ様物質はまた、ハプテ
ン又は抗原として、例えば免疫原性相乗剤、例えば抗粒
子又はこれらに類するものと連結されたハプテンとし
て、モノクローナル抗体又はポルクロール血清の製造の
ために使用され得る。これらの抗体は広範囲に、特に診
断目的に使用することができる。該抗体はそれ自体によ
り、又はオンコスタチン−Ａ様物質として、オンコスタ
チン−Ａ、及びオンコスタチン−Ａに対する抗体を包含
するオンコスタチン−Ａレセプターの検出のための試薬
として使用することができる。

注目の分析対象を決定するために種々の処方及び技法
を用いることができる。これらの技法は、酵素、放射性
核種、螢光剤、化学発光剤、酵素基質、酵素阻害剤、粒
子、及びこれらに類するものを含む種々の標識を用い
る。これらの方法は分離段階を含む（不均一）か又は分
離段階を含まない（均一）ことができる。標識はオンコ
スタチン−Ａ様物質又はオンコスタチン−Ａ様物質に対
する抗体（抗−オンコスタチン−Ａ）に共有結合される
か、又は抗−オンコスタチン−Ａ、例えば抗−オンコス
タチン−ＡのFcに向けられた抗体に結合される。全体抗
原、又はFab、Ｆ（ab）′_２′、F_V、もしくはこれらに
類するものを包含するその断片を使用することができ
る。この発明において使用され得る種々の診断技法を記
載する多数の米国特許が発行されている。これらの特許
の少数の例は米国特許No.3,766,162、No.3,791,932、N
o.3,817,837、No.3,996,345、及びNo.4,233,402であ
る。特定のタイプの測定法にはRIA、EIA、EMIT、ELIS
A、SLFIA、FIAが包含され、これらのすべては商業的に
適用されており、そしてそのための試薬が他の分析対象
のために入手可能である。キットにおいて種々の試薬を
用いることができ、この場合、測定の感度を最適化する
ように試薬の種類及びそれらの相対量が選択される。

抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル血清
の調製に依存して常法において調製することができる。
各場合において、適当な宿主に注目の１又は複数のエピ
トープ部位を有する免疫原が注射され、通常はこれに続
いて１又は複数の追加免疫注射が行われるであろう。ポ
リクローナル抗血清のためには宿主が採血され、そして
グロブリン画分が単離される。この免疫グロブリン画分
はアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製
することができる。モノクローナル抗体のためには、宿
主が前記のように免疫感作されるが、しかしこの場合に
は通常脾臓が摘出され、そして適切な融合パートナーと
融合せしめられるであろう。所望の抗体を発現するハイ
ブリドーマの選択の後、このハイブリドーマを限界稀釈
にかけ、そして次に選択及びクローニングを行い、そし
てさらに特徴付ける。

この発明は抗体は、天然に存在する任意のタイプ、例
えばIgA、IgD、IgE、EgG及びIgM、特にIgM、そしてIgG
の種々のサブタイプ、すなわちIgG1、２、３又は４であ
ることができる。

生ずるモノクローナル抗体は、オンコスタチン−Ａタ
イプの物質にコンホーメーションの類似性を有するであ
ろう抗−イデオタイプ抗体の製造のための免疫原として
使用され得る。次にこれらは、種々の用途において、オ
ンコスタチン−Ａタイプの物質のための代替約試薬とし
て使用され得る。

オンコスタチン−Ａは、約0.3Mエタノール性塩酸によ
る血小板の抽出により得ることができる。分解に対する
阻害剤として、フェニルメチルスルホニルフルオリド及
びアプロチニンも導入することができ、前者は抽出組成
物の約１〜10重量％のレベルにおいて、そして後者は抽
出組成物の約0.1〜1TIU/mg（TIU…トリプシン阻害ユニ
ット）のレベルにおいて導入される。水性水酸化アンモ
ニウムを用いてpHを約５に上げた後、小量の酢酸アンモ
ニウムを加え、そして遠心分離又は他の便利な手段によ
り溶液を清澄にする。

次に、冷エタノール（95％）及びエーテルを次次に用
いて蛋白質を沈澱せしめ、該沈澱を厚め、そして約3,00
0Mr以下のカットオフを有する透析膜を用いて0.1〜0.5M
酢酸に対して透析する。残渣を凍結乾燥し、1M酢酸中に
再懸濁し、清澄にし、そして次にバイオゲルＰ−10を用
いるゲル透過クロマトグラフィーによりさらに精製する
ために用意する。精製物を約1Mの酢酸により溶出しそし
て種種の画分を適当な測定技法、例えば腫瘍増殖阻害を
用いて監視する。

増殖阻害活性を有す画分を凍結乾燥し、トリフルオロ
酢酸希水溶液（pH2〜３）に再懸濁し、清澄にし、そし
て次に高圧液体クロマトグラフ上でクロマトグラフ処理
し、この場合シリカ充填物は約16〜20個の炭素原子、例
えば18個の炭素原子の長脂肪族鎖の被膜を有する。カラ
ムは希トリフルオロ酢酸（0.02〜0.1％）で平衡化し、
そして生成物は、希（0.01〜0.1％、通常約0.04〜0.05
％）トリフルオロ酢酸中60％アセトニトリルまでアセト
ニトリルグラジエントにより溶出する。比較的ゆるやか
な流速、一般に周囲温度において約0.5〜1ml/分が用い
られる。画分は前記のバイオアッセイ又は他のバイオア
ッセイにより測定することができる。さらに精製するた
め、カラムから得られた生成物は高圧ゲル排除クロマト
グラフィーを用いて精製することができる。

ノバパック（Novapak）C₁₈逆相液体クロマトグラフィ
ーにより分離されたオンコスタチン−Ａ活性の主ピーク
を凍結乾燥し、そして0.1％トリフルオロ酢酸を含有す
る40％アセトニトリル100μｌ中に再懸濁する。サンプ
ルをヒドロキシル化ポリエーテルゲルカラム（ビオラド
TSK−250）中に注入し、そして0.1％トリフルオロ酢酸
中に40％アセトニトリルを含有する移動相により溶出す
る。各画分のアリコートを凍結乾燥し、そしてオンコス
タチン−Ａ活性について試験する。腫瘍細胞阻害活性が
主ペプチドピーク（R_f−0.9）と共に同時溶出し、これ
はまた、このクロマトグラフ系に目安を付するために使
用された6,000Mrインシュリンマーカーのそれに分子量
において対応する。

カラムから得られた生成物をSDS−PAGEを用いて電気
泳動することができる。約6,000〜8,000の分子量におけ
るバンドを単離する。このバンドは、哺乳類新生物細胞
に対する強い増殖阻害活性を有することが示される。

天然源からのオンコスタチン−Ａの単離又は固体単体
上での該ポリペプチドもしくはその類似物の合成の代り
に、オンコスタチン−ＡはハイブリドDNA技法により調
製することができる。オンコスタチン−Ａの製造遺伝子
は、アミノ酸配列に基いて調製されたプローブを用いて
宿主細胞ゲノムから得ることができる。このプローブ
（適切に冗長にあろう）を用いてゲノムライブラリーを
調査し、ハイブリダイズする断片を単離し、そして該断
片のサイズを小さくし、そして制限地図の作製及び配列
決定により特徴付ける。

他の方法として、同様にしてゲノムライブラリーにつ
いてDNAを調査し、そして完全な又は部分的な構造遺伝
子が単離されればこれらを使用することができ、後者は
欠失したコドンを補充するためのアダプターを用いるこ
とによって使用する。

便利には、合成遺伝子を合成することができる。合成
遺伝子を用いることにより実質的な柔軟性が達成され、
宿主に好ましいコドンを用いそしてユニーク又はまれな
制限部位を導入することができる。制限部位は、欠失、
トランジション、トランスバーション、挿入等を導入し
て遺伝子の種々の部分を変形する場合に一定の程度の柔
軟性を加える。ヘテロデュプレックス形成を妨害しない
でハイブリダイジェーション連結媒体中に混合すること
ができる単鎖オーバーラップ断片を用いるストラテジー
を工夫する。次に、生じた２本遺伝子をクローン化しそ
して精製することができる。例示的配列を実験の部に示
す。

好ましくは、挿入に際して適切な方向を保証するため
に遺伝子の末端は異る。この遺伝子は発現のために適切
な発現ベクターに挿入することができる。原核生物及び
真核性物、例えば菌類、例えば酵母、哺乳動物細胞、例
えばマスウ細胞、霊長類細胞等における発現のために多
数のベクターが使用可能である。複数系はプラスミド、
ウイルス又は染色体に由来することができる。代表的な
複数系はColEl、ラムダ、RSF1010、２μｍプラスミド、
SV40、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス等を包含す
る。

エピゾーム性維持が望ましい場合（組み込みが必要な
場合には複数系は必要でない）には少なくとも１つの複
数系のほかに、目的遺伝子を含有する宿主の選択を可能
にするマーカーが通常存在するであろう。このマーカー
は通常殺生物耐性をもたらし、例えば抗生物質もしくは
重金属、又は補完、栄養要求宿主への原栄養性をもたら
すであろう。

構造遺伝子は、通常、ポリリンカー（多数の制限部位
を有する配列）への挿入により、発現宿主により認識さ
れる転写及び翻訳開始及び終止制御領域間に位置するで
あろう。転写開始領域の適切な選択により、転写は構成
的であり又は誘導的である。多数のプロモーター領域、
例えばE.コリ（E.coli）trp及びlacプロモーター、ラム
ダP_L及びP_Rプロモーター、酵母解糖系酵素プロモータ
ー、SV40及びアデノウイルス初期及び後期プロモータ
ー、並びにこれらに類するのが単離され、そして有用で
あることが示されている。

さらに、分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコ
ードする５′−配列を構造遺伝子に与えることにより融
合遺伝子を調製することができる。記載されている代表
面な分泌リーダーには、ペニシリナーゼの分泌リーダ
ー、α−ファクター、免疫グロブリン、Ｔ−細胞レセプ
ター、外層膜蛋白質、及びこれらに類似するものが包含
される。適切なリーディングフレームへの融合により、
成熟オンコスタチン−Ａ又は類似物が培地中に分泌され
得る。

構造遺伝子及び発現の制御をもたらすフランキング領
域を含有する造成物を、便利な手段、例えば、リン酸カ
ルシウム沈澱したDNAを用いるトランスフォーメーショ
ン、トランスフェクション、トランスグクション、接
合、マイクロインジェクション等により、発現宿主に導
入することができる。次に、宿主を適切な栄養培地中で
高密度に増殖せしめることができる。プロモーターが誘
導性である場合、許容状態、例えば温度変化、代謝生成
物もしくは栄養の枯渇もしくは過剰、又はこれらに類す
るものを用いることができる。

生成物が宿主中に保持される場合、細胞を収得し、溶
解し、そして抽出、沈澱、クロマトグラフィー、電気泳
動等により生成物を単離しそして精製する。生成物が分
泌される場合、栄養培地を厚め、そして常法、例えばア
フィニティークロマトグラフィーにより生成物を単離す
ることができる。

構造遺伝子配列は、発現のために使用されるほか、デ
ュプレックスする配列のバイブリダイゼーション及び検
出のためのプローブとして使用することができる。例え
ば、宿主細胞中のmRNAの存在及び量を検出することがで
きる。

次の例は限定的にではなく例示的に与えられる。

実験略号:DMEM…ドゥルベコの改良イーグル培地;PBS…リ
ン酸緩衝化塩溶液;P/S…ペニシルン／ストレプトマイシ
ン（各0.57mg/ml）;FCS…ウシ胎児血清;SDS−PAGE…ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動。

オンコスタチン−Ａの精製ヒト−血小板からの酸−エタノール抽出新詳な、又は凍結され室温で解凍された血小板（湿重
量50g）を２倍容量の:375mlエタノール（95％）,7.5ml
濃HCl,33mgフェニルメチルスルホニルフルオリド及び1m
lのアプロチニン（23TIU/ml;ウシ肺由来…シグマケミカ
ル社A6012）に再懸濁した。この混合物を４℃にて一夜
撹拌し、ベックマンタイプ19ローター中で8k rpmにて30
分間遠心分離し、そして上清を取り出した。この上清の
pHを濃水酸化アンモニウムにより4.0に調整し、そして
このpHを1:10稀釈の濃水酸化アンモニウムを用いて5.2
に上げた。0.1の上清当り1mlの2M酢酸アンモニウム
（pH5.2）を加えた後、この溶液をタイプ19ローター中
で8k rpmにて30分間遠心分離した。上清を除去し、２倍
容量の冷95％エタノールを加え、次に４倍容量の冷ジエ
チルエーテルを加え、そしてこの混合物を０℃にて一夜
放置した。タイプ19ローター中で8k rpmにて30分間遠心
分離することにより沈澱を集め、そしてペレットを約10
〜20mlの1M酢酸に懸濁した。酢酸分散体を、スペクトラ
ポール（Spectrapor）透析膜（＃３）チューブ（カット
オフ3,500Mr）（アマーシャム・サイエンティフィック
・プロダクツ）中で、５ずつ２回交換の0.2M酢酸に対
して十分に透析した。抽出物を透析し、7.5mlの1M酢酸
中に再懸濁し、次に30k rpmにて遠心分離した。

ゲル透過クロマトグラフィービオゲルＰ−10（200〜400メッシュ；ビオ・ラド・ラ
ブス）を1M酢酸中で一夜膨潤せしめ、十分に脱気し、そ
して次に100×2.5cmのシリコン処理されたガラスカラム
に注入し、そして1M酢酸により一夜平衡化せしめた。

29gのヒト血小板からの酸−エタノール可溶化ペプチ
ド（50〜70mgの蛋白質）を7.5mlの1M酢酸に溶解し、そ
して上記のカラムに適用した。画分（3.5ml）を集め、
そしてアリコートを凍結乾燥し、そしてA549ヒド肺癌細
胞への５−¹²⁵I−ヨウド−２′−デオキシウリジンの導
入の阻害について試験した。

逆相高圧液体クロマトグラフィー上記のカラムからの腫瘍増殖阻害活性のピークを含む
画分（蛋白質200ng）を凍結乾燥し、そして0.05％（v/
v）のトリフルオロ酢酸中に再懸濁した。次に、カラム
を、23℃にて0.8ml/分の流速において、0.045％のトリ
フルオロ酢酸中アセトニトリルの0.60％直線グラジエン
トにより溶出した。各画分のアリコートを凍結乾燥し、
そして上記のようにして３回測定した。

次に、阻害活性を含有する画分を0.1％トリフルオロ
酢酸を含有する40％アセトニトリル中に溶解し、そして
ヒドロキシル化ポリエーテルゲルカラム（ビオ・ラド・
TSK−250）に適用し、そして0.1％トリフルオロ酢酸中4
0％アセトニトリルの移動相により溶出した。画分を集
め、凍結乾燥し、そして増殖阻害活性について３回測定
した。活性はインシュリンマーカーが溶出する画分中に
溶出し、そして６〜8kDの分子量に対応する。

次に、最も高い活性を有する画分を、SDS−PAGEを用
いて次のようにして電気泳動した。

逆相HPLC精製段階からの主たるオンコスタチン−Ａ活
性に相当するペプチドを凍結乾燥し、12.5mMTris−ClpH
6.7、４％SDS、10％β−メルカプトエタノール、20％グ
リセリン及び0.01％ブロムフェノールブルーを含有する
サンプル調製緩衝液0.03ml中に再懸濁しそして沸騰せし
めた（２分間）。このサンプルを、0.1％SDSを含有する
pH8.8の17〜27％ポリアクリルアミドグラジエントスラ
ブゲル上に注加された５％ポリアクリルアミド重層ゲル
上に負荷した。サンプルが重層ゲルを通って移動するま
で10ミリアンペアにて、そして染料フロントがゲルの底
に移動するまで20ミリアンペアにて、ゲルの泳動を行っ
た。ゲルを固定し、そして0.2％クーマシーブルー、50
％メタノール及び９％酢酸の溶液中で一夜染色した。脱
染色の後、ホッファー（Hoffer）デンシトメーターを用
いてクーマシー陽性バンドの位置を決定した。マーカー
はインシュリン（6,000Mr）、トリプシノーゲン（24,50
0Mr）、RNアーゼ（13,700Mr）、及びアプロチニン（6,5
00Mr）を包含した。主ペプチドは、これらの電気泳動条
件下で6,500Mrアプロチニン標準と共に泳動した。

使用された測定法は次の通りであった。２日目の朝
に、Nunc 96ウエルプレート（Kamstruprej 90.DK−4,00
0,Roskilde,デンマーク）中にA 549細胞（ヒト肺癌）が
生じた。これらの細胞は30より少ない場合継代された。
周囲のウエルを除くすべてのウエルに45,000細胞/50μl
/ウエル（10％FCS,P/S,グルタミンを含むDMEMml当り９
×10⁴細胞）を導入した。周囲のウエルには50μｌのPBS
を入れ、そしてプレート全体を37℃にてインキュベート
した。午後、10％FCS,P/S,グルタミンを含むDMEM中に試
験サンプルを再懸濁し３連試験を行った。各試験ウエル
に50μｌを与え、他方、対照ウエルには50μl DMEMを与
えて、プレートを37℃にて３日間インキュベートした。
４日目に、¹²⁵I−ヨード−２′−デオキシウリジン（4
Ci/mg−0.5m Ci/ml）の溶液（１μl/アイソトープ/10％
FCS、P/S、グルタミンを含むDMEMml）50mlを加え、そ
してプレートを37℃にて一夜インキュベートした。５日
目に、培地をウエルから吸引し、PBSで１回洗浄し、100
μｌのメタノールを加え、このメタノールを10分間放置
し、次にメタノールを吸引した。次に、ウエルに、1M水
酸化ナトリウム200μｌを加え、プレートを37℃にて30
分間インキュベートし、そして次にタイターテックプラ
グ（Titertek plug）（フロー・ラブス）により1M水酸
化ナトリウムを取り出した。次に、このプラグをガンマ
ーカウンター中で放射能について計数した。

上記のようにして調製されたオンコスタチンＡの有効
性に証明するため、次の試験を行った。この試験を軟寒
天コロニー阻害を称する。使用される材料は、％寒天
〔3.75gノーベル寒天（ディフコ）〕、125mlのWheston
ビン中でオートクレーブされた蒸留水75ml、10％FCSを
含むDMEM、100Uペニシリイン、1000ストレプトマイシ
ン、200mMグルタミン、及びヒト黒色腫細胞（A375）で
ある。

試験されるべき材料を12×75mmの無菌試験管中で凍結
乾燥する。DMEMを用いて５％寒天の1:10稀釈物を作りそ
して水浴中で46℃に加熱する。６−ウエル培養プレート
（35×14mm）の各ウエルに0.5％寒天溶液1mlをピペット
注入することにより基層を調製する。この層を、それが
硬化するまで、室温にて放置する。トリプシン処理する
ことによりSA₆細胞を調製し、そして細胞数を計数す
る。細胞を１×10⁴細胞/mlの最終濃度に稀釈し、そして
0.35mlの細胞を各試験サンプル管に加える。

10本の試験サンプル管のそれぞれに0.750mlの0.5％寒
天溶液をピペット注入し、混合物をゆっくり回転させ、
そして試験サンプル管の内容物（試験サンプル、細胞、
寒天）を基層上に注加し、そして寒天が硬化するまで約
20分間室温に放置する。次に、プレートを、５％二酸化
炭素を伴う37℃の過湿室中に貯蔵する。

試験材料の力価に依存して３日後10日まで、コロニー
増殖の阻寒についてプレートを点検する。コロニーの数
を、無作為な８個の低培率顕微鏡視野中で計数する。プ
レートが５日以上にわたって保持されるべき場合には、
さらに1mlの0.3％の寒天溶液の層を試験サンプル層上に
重層することにより試験サンプル層の乾燥を防止する。

種々の濃度の精製されたオンコスタチン−Ａを用いな
がら、上記の方法を使用した。下記の表はその結果を示
し、示されているオンコスタチン−Ａの量は、試験管に
導入された凍結乾燥された量である。結果は、最大阻害
％として報告されている。

上記結果から、この発明のポリペプチドが細胞増殖の
有効な阻害剤であることが明らかである。黒腫細胞を用
いて観察されたこと結果に基いて、細50％の阻害をもた
らすために約1ngで十分である。従って、この化合物
は、新生物細胞増殖を包含する細胞増殖の阻害におい
て、広範囲の用途を有する。例えば、この化合物はま
た、次の表に示されるように、種々の培養されたヒト腫
瘍細胞を阻害するが、正常な非新生物性ヒト包皮線維芽
細胞を阻害しない。

無胸腺マウスにおけるヒト癌細胞の増殖に対するオンコ
スタチン−Ａの効果若い（８〜10週齢）の無胸腺マウスに、100μｌのリ
ン酸緩衝化塩溶液（PBS）中に懸濁された５×10⁶個のヒ
ト肺癌細胞（A549）を鼠径部の皮下に注射した。接種の
７日後、直径2.5〜3.0mmの触知可能な腫瘍が発生した。
この集団から腫瘍担持マウスを無作為的に選択し、そし
て７日目に、前記のようにしてヒト血小板から均一に精
製したオンコスタチン−A0.30μｇを含有する50μｌのP
BSを、腫瘍部位上の皮下に注射した。オンコスタチン−
Ａを含まないPBSの腫瘍担持対照マウスへの注射は腫瘍
の増殖に効果を与えなかった。次に、腫瘍担持マウス
に、A549細胞の注射後の後11日及び16日目に、50μｌの
PBS中同量のオンコスタチン−Ａを注射した。オンコス
タチン−Ａのこれらの投与は、301/2″ｇ針を用いて、
腫瘍塊中に直接注射した。キャリパーにより水平寸法及
び垂直寸法の両者について腫瘍を測定することにより、
示された日に腫瘍の大きさをモニターした；（ａ）縦座
標に示す腫瘍サイズはこれら２つの寸法の積を示す。結
果を第１図に示す。

オンコスタチン−Ａにより処理されたヒト肺癌細胞によ
る52,000Mrポリペプチドの特異的放出ヒト肺癌細胞（A549）をオンコスタチン−Ａ（200ng/
ml培養物）で処理し、そして細胞培養上清中に放出され
るポリペプチドに対する効果を決定した。処理された培
養物及び対照培養物（オンコスタチン−Ａ無し）を、０
時〔オンコスタチン−Ａ又は培地のみ（対照）添加〕に
おいて³⁵S−メチオニン（５μCi/ml S.A.−800Ci/mmo
l）によりパルスした。12時間後の培養上清を取り出
し、そしてまず低速（1,500×ｇにて15分間）にて、次
に高速（30,000×ｇにて１時間）にて清澄にした。清澄
にされた上清からトリクロロ酢酸（TCA）によりペプチ
ドを沈澱せしめ、次に12.5％アクリルアミドスラブゲル
上でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけた。

ゲルのラジオオートグラフィーはオンコスタチン−Ａ
により処理されたA549細胞からの上清中に³⁵S−メチオ
ニンでラベルされたポリペプチドが存在することを示
し、他方、未処理癌細胞は最小量のこの蛋白質を分泌し
た（オンコスタチン−Ａ処理後、少なくとも10倍の増加
が見られた）。処理された培養物と対照培養物との間に
他の質的又は量的差異は見られなかった。

オンコスタチン−Ａによるpp60srcオートホスホリレー
ションの刺激 pp60srcを、Erickson等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1
979）76:6260−6264;Erickson等、Cold Spring Harbor
Symp.Quant.Biol.（1979）44:902−917に記載されてい
るようにして、イムノアフィニティークロマトグラフィ
ーより精製した。５μｌの精製された酵素（約0.47p mo
le）を100ngの精製された均一なオンコスタチン−Ａ
と、20mM ATP、5mM MgCl、10mM Tris−Cl（pH7.2）を含
む30μｌの最終反応容積中で30℃にて30分間インキュベ
ートした。２倍量のサンプル緩衝液を添加することによ
って反応を停止し、そしてLaemmeli,U.K.,Nature（197
0）227:680−685に記載されているようにしてSDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分析した。スラブゲル
のオートラジオグラフィーは、pp60srcのオートホスホ
リレーションにおける10倍の刺激を明らかに示した。sr
c酵素において、ホスホリレーションの増加はチロシン
残基に限定されず、セリン位置にも見出された。

マクロファージIa抗原発現に対するオンコスタチンの効
果 Wehi−３は、ガンマーインターフェロン（γ−IFN）
によりH2クラスII抗原を発現するように誘導され得るマ
ウスマクロファージ細胞系である。この誘導の特徴は幾
つかの研究室により研究され、そして正常なマクロファ
ージ誘導の正確な再現であることが示されている。

これらの細胞を少量のγ−IFNの存在下又は非存在下
で、血小板オンコスタチン−Ａの幾つかの濃度を用いて
増殖せしめた。γ−IFNの存在下又は非存在下のいずれ
において、オンコスタチン−Ａは、FACS上での直接免疫
螢光により測定した場合、クラスII抗原の量依存的増強
を示した。オンコスタチン−Ａの効果の程度は、用いら
れた濃度（〜２−70ng/ml）においておよそ２倍であっ
た。

オンコスタチン−Ａに対して得意的なモノクローナル
及びポリクローナル抗体の製造細菌リポポリサッカライドへのオンコスタチン−Ａの交
差リンクオンコスタチン−Ａを細菌リポポリサッカライドに交
差リンクさせる方法は、Primi及びCazenave,J.Immunol.
（1982）129（３）:1124−1129により開発された方法の
変法である。

10ngのオンコスタチン−Ａ及び12.5ngの細菌リポポリ
サッカライド（LPS;シグマ＃Ｌ−263）を蒸留水により5
00μｌの容量に稀釈した。PBS中2.5％のグルタルアルデ
ヒド50μｌを加え、そしてこの混合物を室温にて30分間
インキュベートした。PBS中2Mグリシン50μｌを加え、
そして室温にて１時間インキュベートすることにより反
応を停止した。オンコスタチン−A:LPS接合体を10mlの
混合されたリンパ球条件調節された媒体で稀釈し、そし
てフィルターをイン−ビトロ免疫感作において使用する
ために殺菌した。

オンコスタチンとLPSとの接合体によるBalb/C脾細胞の
イン−ビトロ免疫感作 Reading,Immunol.Meth.（1982）53:261−269により記
載された方法の変法を用いて非免疫脾細胞をイン−ビト
ロ免疫感作した。

２％ラビット血清を含有するDMEM中で同数のBalb/c及
びC57ブラックマウス胸腺細胞を４×10⁶細胞/mlにて48
時間培養することにより、混合されたリンパ球条件調節
（MLC）媒体を調製した。この媒体を集め、そして−20
℃にて貯蔵した。

チオグリコレート処理されたBalb/cマウスを無菌PBS
でフラッシュすることにより腹腔滲細胞（PEC）を集め
た。PEC細胞を、１マウス相当の脾細胞、及び10ngのオ
ンコスタチン−Ａ−LPS接合体を含有するMLC媒体10mlと
共に培養においた。細胞を７日間培養した。

モノクローナル抗体の製造免疫脾細胞を集め、そして1:1の比率においてSP2/0骨
髄腫細胞と融合せしめることによりオンコスタチン−Ａ
特異的モノクローナル抗体を合成するハイブリドーマを
調製した。エンザイムリンクドイムノアッセイ（ELIS
A）によりオンコスタチン−Ａ抗体の生産についてハイ
ブリドーマを試験した。限界稀釈法により陽性ハイブリ
ドーマを２回クローン化した。クローンを展開し、免疫
グロブリンクラスについて試験し、そして腹水生産のた
めにBalb/cマウスに注射した。

40個の陽性ハイブリドーマクローンをまず展開し、そ
して抗−オンコスタチン−Ａ活性について再試験した。
７個の最も反応性のクローンを使用してBalb/cマウス中
に腹水を生産した。残りの展開しそして凍結した。腹水
をELISAにおいてオンコスタチン−Ａ、オンコスタチン
−Ａペプチド−KLH接合体及びBSAに対する特異性につい
て試験した。

腹水は、オンコスタチン−Ａ、及びより少ない程度
に、１〜3000の希釈率におけるオンコスタチン−Ａペプ
チドの両者と反応した。免疫グロブリンを、Russo等、A
nal.Biochem.（1983）65:269−271により記載されてい
るカプリル酸沈澱法により精製した。免疫グロブリンの
パラゴン分析及びオークテルロニー分析は、すべての免
疫グロブリンがタイプIgMであることを示した。

オンコスタチン−ＡについてのELISA測定オンコスタチン−Ａを0.1M酢酸中に稀釈し、そして10
ng/ウエルを96ウエルダイナテックイムロンプレートに
ピペット注入した。溶液を室温にて一夜乾燥した。PBS
中2.5％BSA、2.5％ウシ胎児血清（FCS）と共にウエルを
37℃にて１時間インキュベートすることによりプレート
をブロックした。次にこのプレートをPBS中2.5％FCSで
２回洗浄した。次にハイブリドーマ培地、免疫グロブリ
ン又は抗血清を適当な稀釈に添加した。次にこのプレー
トを37℃にて２時間インキュベートし、そしてPBS中2.5
％FCSにより３回洗浄した。製造者の指示に従ってベク
ターラズスのアビジン−ビオチン−HRP ELISA試薬を使
用した。各段階の間にウエルをPBS中2.5％FCSにより洗
浄した。４μｌの30％過酸化水素/10ml溶液を含有する
0.1Mクエン酸ナトリウム溶液中0.4mg/mlオルト−フェニ
レンジアミンにより陽性ウエルを可視化した。室温にて
30分間反応を継続せしめた。50μｌの1.4NH₂/SO₄/ウエ
ルを添加することにより反応を停止した。

ポリクローナル抗−オンコスタチン抗血清の製造 Balb/cマウスをニトロセルロース固定化オンコスタチ
ン−Ａにより免疫感作した。この免疫感作法の目的は宿
主によるポリペプチドの急速な排除を回避することであ
る。こうして、非常に少量のオンコスタチン−Ａにより
免疫感作を行うことができる。

0.1M酢酸中オンコスタチン−Ａの溶液をニトロセルロ
ース（シュライヒェル＆シュエル,0.45μｍ）の小片に
付着せしめ、そして放置乾燥した。最初の免疫のため
に、ニトロセルロース片を３匹のBalb/cマウスの腹腔に
入れた（0.375ng/マウス）。（マウスにさらに0.1mlの
完全フロインドアジュバントの腹腔内注射した。マウス
を２週間の間隔で２回、オンコスタチンを固定したニト
ロセルロースにより追加免疫感作した。追加免疫のため
には、ニトロセルロースを切断し、0.1mlの水及び0.1ml
の不完全フロインドアジュバントと共にホモジナイズ
し、そして皮下注射した（0.125ng/マウス）。マウス血
清を前記のELISA測定によりオンコスタチン−Ａに対す
る特異性について試験し、第２段階の試薬としてホース
ラディッシュパーオキシダーゼ接合プロテインＡを使用
した。特異性を示すため、血清をオンコスタチン−Ａペ
プチド−KLH接合体及びブロックされたプレートに対し
て試験した。

常法に従って、次の配列を調製した。

この配列はE.コリ中で使用するために画計され、そし
てコード配列の修飾を容易にするために多数の制限酵素
認識部位が考案された。単鎖オーバーラップ配列を調製
し、アニーリング媒体中で一緒にし、そして連結して、
オンコスタチン−Ａが単離され得る融合蛋白質を調製す
るためにリーディングフェーズを合わせて発現ベクター
中に挿入するために適当な末端を有する完全な遺伝子を
得た。単鎖セグメントとT4ポリヌクレオチドリガーゼに
より５′−リン酸化し、そして各セグメント200p mole
を30μｌの反応容量（30mM ATP,10mM DTT,10mM MgCl₂,1
μg/mlスペルミジン、100mM Tris−HCl,pH7.8,及びT 4
DNA リガーゼ）中で一緒にすることによりアニールす
る。ds DNAをBss H II及びBam H Iで消化し、そして７
％天然ポリアクリルアミドゲル上で精製する。

プラスミドptrpED5−１〔Hallewell及びEntage,Gene
（1980）９:27;Tacon等,Mol.Gen.Genet.（1980）177:42
7〕をエンドヌクレアーゼBss H II及びBam H Iで消化
し、そしてtrpD遺伝子を欠きそして切断されたtrpE遺伝
子を有する実質的に十分な長さの断片を調製用ゲル電気
泳動により単離する。

オンコスタチン−Ａ遺伝子を線状化されたptrpEP5−
１プラスミドに連結してプラスミドptrp（Onc−Ａ）を
得、そして連結混合物を用いてE.コリHB101細胞を形質
転換する。アンピシリン耐性による形質転換体を選択
し、そしてプラスミドを制限エンドヌクレアーゼ消化に
より分析する。形質転換体をLuriaブロス中で37℃にて
約10⁸細胞/mlに増殖せしめ、そして３−インドール酢酸
（IAA）を約1mMに加え、そして増殖を約１時間継続す
る。アリコート（1ml）をエッペンドルフ遠心管中で数
秒間遠心分離し、そしてペレットを5mg/mlのシアノゲン
ブロヒドを含有する７％蟻酸500μｌ中に懸濁する。室
温にて24時間置いた後、アリコートを水中に10倍に稀釈
し、そして稀釈されたサンプルをオンコスタチン−Ａに
ついて測定する。オンコスタチン−Ａは中間メチオニン
を有さずＮ−末端メチオニンを有するため、融合蛋白質
の開裂が天然オンコスタチン−Ａと同じアミノ酸配列を
有するオンコスタチン−Ａをもたらす。

上記の結果から、この発明の化合物が広範囲の用途を
有することが明らかである。特に、この化合物を新生物
状態の診断及び治療において使用することができる。医
療において、この化合物は腫瘍細胞増殖の緩慢化をもた
らすことができ、そのため腫瘍細胞の破壊のための他の
態様の治療と組み合わせて使用することができる。診療
のためには、この発明の化合物はp52の生産を誘導し、
その結果この化合物を宿主に投与した際に増強されるp5
2レベルが腫瘍細胞の存在の指標であることが見出され
る。このことは、新生物状態の治療中に腫瘍細胞の除去
が成功したか又は転移が生じたかを決定するために非常
に重要であり得る。この発明の化合物はまた、オンコス
タチン−Ａ又はオンコスタチン−Ａレセプターの存在に
ついての診断測定における試験として使用され得る。

前記の発明が明確な理解のために説明及び例により幾
分詳細に記載されたが、添付された請求の範囲の範囲内
において幾らかの変化及び変法を実施することができる
ことが明らかであろう。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 7/02 8318−4Ｈ 14/47 8318−4Ｈ 16/18 8318−4ＨＣ１２Ｎ 15/02 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次のアミノ酸配列（Ｉ）：（式中、ＸはAsp又はAsnである）を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列（Ｉ）に
おいて少なくとも次のアミノ酸配列（II）:Lys Lys Ile
Ile Lys Lys Leu Leuを含んで成るペプチド断片を有効
成分とする腫瘍細胞増殖阻害剤。
【請求項２】前記有効成分が、次のアミノ酸配列（II
I）：（式中、ＸはAsp又はAsnである）中の15個のアミノ酸の配列を含んで成るペプチド断片で
ある、請求項１に記載の腫瘍細胞増殖阻害剤。
【請求項３】前記有効成分が、前記アミノ酸配列（Ｉ）
中の60個のアミノ酸の配列を含んで成るペプチド断片で
ある、請求項１に記載の腫瘍細胞増殖阻害剤。