JPH08168374A - 直接的細胞間伝染可能なｇＤ陰性ウシヘルペスウイルス突然変異体 - Google Patents
直接的細胞間伝染可能なｇＤ陰性ウシヘルペスウイルス突然変異体Info
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- JPH08168374A JPH08168374A JP7181986A JP18198695A JPH08168374A JP H08168374 A JPH08168374 A JP H08168374A JP 7181986 A JP7181986 A JP 7181986A JP 18198695 A JP18198695 A JP 18198695A JP H08168374 A JPH08168374 A JP H08168374A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 安全で、低ビルレンス及び高効力の、ウシヘ
ルペスウイルス防御ワクチン用免疫原ウイルスを提供す
る。 【解決手段】 直接的細胞間伝染特性を示すｇＤ陰性ウ
シヘルペスウイルス突然変異体、直接的細胞間伝染特性
をもたないウシヘルペスウイルスにこの特性を付与する
ことが可能なＤＮＡフラグメント、この突然変異体をベ
ースとするワクチン、及びウシヘルペスウイルスに対す
る動物の防御方法。直接的細胞間伝染特性を示すことを
特徴とするＤ陰性ウシヘルペスウイルス突然変異体。
ルペスウイルス防御ワクチン用免疫原ウイルスを提供す
る。 【解決手段】 直接的細胞間伝染特性を示すｇＤ陰性ウ
シヘルペスウイルス突然変異体、直接的細胞間伝染特性
をもたないウシヘルペスウイルスにこの特性を付与する
ことが可能なＤＮＡフラグメント、この突然変異体をベ
ースとするワクチン、及びウシヘルペスウイルスに対す
る動物の防御方法。直接的細胞間伝染特性を示すことを
特徴とするＤ陰性ウシヘルペスウイルス突然変異体。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は直接的細胞間伝染特
性を示すｇＤ陰性ウシヘルペスウイルス突然変異体、直
接的細胞間伝染特性をもたないウシヘルペスウイルスに
この特性を付与することが可能なＤＮＡフラグメント、
前記突然変異体をベースとするワクチン、及びウシヘル
ペスウイルスに対する動物の防御方法に関する。
性を示すｇＤ陰性ウシヘルペスウイルス突然変異体、直
接的細胞間伝染特性をもたないウシヘルペスウイルスに
この特性を付与することが可能なＤＮＡフラグメント、
前記突然変異体をベースとするワクチン、及びウシヘル
ペスウイルスに対する動物の防御方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ヘルペ
スウイルスは２本鎖ＤＮＡを含む大型ウイルスの広範な
科であり、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類及び両生類で疾
患を誘発する。
スウイルスは２本鎖ＤＮＡを含む大型ウイルスの広範な
科であり、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類及び両生類で疾
患を誘発する。
【０００３】前記２本鎖ＤＮＡは属に依存して約３０〜
３５のポリペプチドをコードする。前記ＤＮＡの分子量
範囲は、ブチナマズヘルペスウイルスの１２０ｋｂｐか
らヒトサイトメガロウイルスの２３０ｋｂｐまでと非常
に広い。ＤＮＡのＧＣ含量範囲はイヌヘルペスウイルス
の３２％からウシヘルペスウイルスの７２〜７３％まで
と更に広い。
３５のポリペプチドをコードする。前記ＤＮＡの分子量
範囲は、ブチナマズヘルペスウイルスの１２０ｋｂｐか
らヒトサイトメガロウイルスの２３０ｋｂｐまでと非常
に広い。ＤＮＡのＧＣ含量範囲はイヌヘルペスウイルス
の３２％からウシヘルペスウイルスの７２〜７３％まで
と更に広い。
【０００４】伝染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）、膿疱性伝
染性外陰膣炎（ＩＰＶ）及び伝染性亀頭包皮炎（ＩＢ
Ｐ）を誘発するウイルス物質はヘルペスウイルス、より
特定的にはαヘルペスウイルス亜科に属する（Ｒｏｉｚ
ｍａｎ，Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．， Ｋｎｉｐｅ，
Ｄ．Ｍ．（編）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ． Ｒａｖａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ： ８４１−８４７（１９９１））。
染性外陰膣炎（ＩＰＶ）及び伝染性亀頭包皮炎（ＩＢ
Ｐ）を誘発するウイルス物質はヘルペスウイルス、より
特定的にはαヘルペスウイルス亜科に属する（Ｒｏｉｚ
ｍａｎ，Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．， Ｋｎｉｐｅ，
Ｄ．Ｍ．（編）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ． Ｒａｖａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ： ８４１−８４７（１９９１））。
【０００５】上記ウイルス物質はウシヘルペスウイルス
Ｉ（Ｒｏｉｚｍａｎら； Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ
１６： ２１０−２１７（１９８７））、より最近で
はウシ科ヘルペスウイルスＩ（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｈ．，
Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ（編）Ｔｈｅ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒ
ｕｓｅｓ． Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，ｖｏｌ．２： １３５−２１４（１９８３））と
総称されている。交差中和試験でＢＨＶ−Ｉ単離物はそ
の起源がＩＢＲであるかＩＰＶ／ＩＢＰであるかに関係
なく全て単一の血清型を示す（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら；
Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｖｅｔ．４９： ２８８−２９７
（１９５９）， ＭｃＫｅｒｃｈｅｒら；Ｃａｎ．Ｊ．
Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．２３： ３２０−３２８（１９５
９））。多数の異なる単離物の制限酵素分析によると、
制限部位パターンは異なるが、パターンと単離物の起源
との間に相関は存在しないことが判明した。従って、原
因物質はいずれの場合もウシヘルペスウイルスＩである
が、ＢＨＶ−Ｉ感染部位が疾患の作用を決定するという
のが現在の通説である。
Ｉ（Ｒｏｉｚｍａｎら； Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ
１６： ２１０−２１７（１９８７））、より最近で
はウシ科ヘルペスウイルスＩ（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｈ．，
Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ（編）Ｔｈｅ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒ
ｕｓｅｓ． Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，ｖｏｌ．２： １３５−２１４（１９８３））と
総称されている。交差中和試験でＢＨＶ−Ｉ単離物はそ
の起源がＩＢＲであるかＩＰＶ／ＩＢＰであるかに関係
なく全て単一の血清型を示す（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら；
Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｖｅｔ．４９： ２８８−２９７
（１９５９）， ＭｃＫｅｒｃｈｅｒら；Ｃａｎ．Ｊ．
Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．２３： ３２０−３２８（１９５
９））。多数の異なる単離物の制限酵素分析によると、
制限部位パターンは異なるが、パターンと単離物の起源
との間に相関は存在しないことが判明した。従って、原
因物質はいずれの場合もウシヘルペスウイルスＩである
が、ＢＨＶ−Ｉ感染部位が疾患の作用を決定するという
のが現在の通説である。
【０００６】今日、αヘルペスウイルス亜科には数種の
異なるウシヘルペスウイルスタイプ、即ちタイプＩ（上
記）、ＩＩ（ウシ乳頭炎ウイルス）、ＩＶ（ウシサイト
メガロウイルス）及びＶ（ウシ脳炎ウイルス）が知られ
ている。
異なるウシヘルペスウイルスタイプ、即ちタイプＩ（上
記）、ＩＩ（ウシ乳頭炎ウイルス）、ＩＶ（ウシサイト
メガロウイルス）及びＶ（ウシ脳炎ウイルス）が知られ
ている。
【０００７】伝染性ウシ鼻気管炎は例えば、ａ）臨床徴
候の有無を問わず急性感染しており、ウイルスを放散し
続ける動物、及びｂ）潜伏感染しており、刺激を受ける
毎にウイルスの放散を開始する動物を介して伝播され得
る。
候の有無を問わず急性感染しており、ウイルスを放散し
続ける動物、及びｂ）潜伏感染しており、刺激を受ける
毎にウイルスの放散を開始する動物を介して伝播され得
る。
【０００８】ＩＰＶ／ＩＢＰは例えば汚染した精液、自
然交尾、雄牛又は牧夫を介して伝播される。
然交尾、雄牛又は牧夫を介して伝播される。
【０００９】ＢＨＶ−Ｉ感染の最も一般的な症状は軽度
呼吸疾患から呼吸管全体の重度感染に至るウシ鼻気管炎
である。
呼吸疾患から呼吸管全体の重度感染に至るウシ鼻気管炎
である。
【００１０】経済的観点からみても、ＩＢＲはＢＨＶ−
Ｉ感染の最も重要な症状である。
Ｉ感染の最も重要な症状である。
【００１１】ＢＨＶ−Ｉ感染の別の比較的重要な形態は
生殖器形態であり、雌牛に膿疱性外陰膣炎を誘発し、雄
牛に伝染性亀頭包皮炎を誘発する。
生殖器形態であり、雌牛に膿疱性外陰膣炎を誘発し、雄
牛に伝染性亀頭包皮炎を誘発する。
【００１２】発生頻度は低いが、前記ウイルスは流産、
結膜炎及び脳炎にも結び付けられる。
結膜炎及び脳炎にも結び付けられる。
【００１３】ＢＨＶ−Ｉは全大陸でウシに広く見られる
が、その宿主範囲は限られている。多数の野生種は血清
陽性であることが判っているが、明確な臨床徴候はウシ
にしか観察されていない。
が、その宿主範囲は限られている。多数の野生種は血清
陽性であることが判っているが、明確な臨床徴候はウシ
にしか観察されていない。
【００１４】ＩＢＲ及びＩＰＶは１世紀以上前からヨー
ロッパで知られているが、アフリカ及び動物園の野生反
芻動物は真のウイルス保有体であると思われる。
ロッパで知られているが、アフリカ及び動物園の野生反
芻動物は真のウイルス保有体であると思われる。
【００１５】動物が相互に密接に接触している（ＩＰ
Ｖ）ならば、ＩＢＲ及びＩＰＶ両者の罹病率は通常１０
０％である。
Ｖ）ならば、ＩＢＲ及びＩＰＶ両者の罹病率は通常１０
０％である。
【００１６】罹病率が＜１００％ならば、動物は抗体に
より防御される。ＩＢＲ及びＩＰＶの場合、死に至るこ
とは稀である。しかしながら、子牛がＢＨＶ−Ｉにより
誘発される脳炎の結果として死亡することは稀ではな
い。更に、数種のＢＨＶ−Ｉ株は流産を誘発することが
報告されている。
より防御される。ＩＢＲ及びＩＰＶの場合、死に至るこ
とは稀である。しかしながら、子牛がＢＨＶ−Ｉにより
誘発される脳炎の結果として死亡することは稀ではな
い。更に、数種のＢＨＶ−Ｉ株は流産を誘発することが
報告されている。
【００１７】二次細菌感染の結果、肺炎及び腸炎を生じ
る場合もある（Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ−Ｏｈｍａｎｎら；
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ １５１：９３
７−９４７（１９８５））。
る場合もある（Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ−Ｏｈｍａｎｎら；
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ １５１：９３
７−９４７（１９８５））。
【００１８】ヘルペスウイルスに対する免疫は、ａ）中
和抗体及び補体依存性溶解を誘導して遊離ウイルスを不
活化させ、ｂ）細胞毒性Ｔ細胞を誘導してウイルス感染
細胞を除去するという少なくとも２つのメカニズムに依
存する。
和抗体及び補体依存性溶解を誘導して遊離ウイルスを不
活化させ、ｂ）細胞毒性Ｔ細胞を誘導してウイルス感染
細胞を除去するという少なくとも２つのメカニズムに依
存する。
【００１９】一般に、病原性微生物及びウイルス（例え
ばウシヘルペスウイルス）による感染からウシを防御す
るには、生ワクチン、不活化ワクチン及びサブユニット
ワクチンを用いることができる。
ばウシヘルペスウイルス）による感染からウシを防御す
るには、生ワクチン、不活化ワクチン及びサブユニット
ワクチンを用いることができる。
【００２０】しかしながら、これらの型のワクチンには
多数の欠点がある。弱毒ワクチンを使用する際には、弱
毒化の不十分な病原性微生物を動物に接種する危険が常
に付随する。また、弱毒微生物はビルレント状態に復帰
して接種動物に疾患を誘発し、その結果、他の動物に病
原体を伝播する恐れがある。更に、混合生ウイルスワク
チンの場合には、抗原成分の相互作用により成分の１種
以上の力価が低下するという問題がある。
多数の欠点がある。弱毒ワクチンを使用する際には、弱
毒化の不十分な病原性微生物を動物に接種する危険が常
に付随する。また、弱毒微生物はビルレント状態に復帰
して接種動物に疾患を誘発し、その結果、他の動物に病
原体を伝播する恐れがある。更に、混合生ウイルスワク
チンの場合には、抗原成分の相互作用により成分の１種
以上の力価が低下するという問題がある。
【００２１】不活化ワクチンは一般に安全であるとみな
されるが、一般に低レベルの免疫しか誘発せず、繰り返
し免疫感作する必要がある。更に、病原体の抗原決定基
を誘導する中和が不活化処理により変化し、ワクチンの
免疫感作力価が低下する恐れがある。また、不活化ワク
チンでは細胞免疫を十分に始動することができない。
されるが、一般に低レベルの免疫しか誘発せず、繰り返
し免疫感作する必要がある。更に、病原体の抗原決定基
を誘導する中和が不活化処理により変化し、ワクチンの
免疫感作力価が低下する恐れがある。また、不活化ワク
チンでは細胞免疫を十分に始動することができない。
【００２２】サブユニットワクチンは不活化ワクチンと
同一の欠点がある上に、生物全体との差異の少ない抗原
決定基を含むので、この防御範囲は狭い。
同一の欠点がある上に、生物全体との差異の少ない抗原
決定基を含むので、この防御範囲は狭い。
【００２３】近年では、組換えＤＮＡ技術を用いて安全
な生きた突然変異体を開発できるようになった。これ
は、ビルレンス機能を有する遺伝子を故意に不活化する
ことにより実施されている。
な生きた突然変異体を開発できるようになった。これ
は、ビルレンス機能を有する遺伝子を故意に不活化する
ことにより実施されている。
【００２４】これらの組換えＤＮＡに由来する生きた改
変ウイルスはウシヘルペスウイルスに対するワクチンの
製造以外にも使用できる。このようなウイルスはウシの
他の伝染病の抗原決定基をコードする外来遺伝情報のキ
ャリヤーとしても使用できる。その結果、ウシのこれら
の伝染病に基づく弱毒ワクチンの使用に伴う潜在的危険
を回避することができる。この種の改変生キャリヤーワ
クチンは、アジュバントを必ずしも必要とすることなく
細胞及び体液免疫系の両者を潜在的に刺激し、異なる抗
原成分の負の相互干渉の危険なしに多価ワクチンを構成
することができる。
変ウイルスはウシヘルペスウイルスに対するワクチンの
製造以外にも使用できる。このようなウイルスはウシの
他の伝染病の抗原決定基をコードする外来遺伝情報のキ
ャリヤーとしても使用できる。その結果、ウシのこれら
の伝染病に基づく弱毒ワクチンの使用に伴う潜在的危険
を回避することができる。この種の改変生キャリヤーワ
クチンは、アジュバントを必ずしも必要とすることなく
細胞及び体液免疫系の両者を潜在的に刺激し、異なる抗
原成分の負の相互干渉の危険なしに多価ワクチンを構成
することができる。
【００２５】上記新世代の組換えキャリヤーワクチンは
一般にそのビルレンスに関して安全であると見なされる
としても、その使用については議論を残している。
一般にそのビルレンスに関して安全であると見なされる
としても、その使用については議論を残している。
【００２６】ａ）遺伝子改変生ワクチン及びキャリヤー
ワクチンは正常な免疫適格宿主では安全であるが、免疫
抵抗性減弱宿主の場合には安全ではなく、弱毒病原体で
あっても感染すると重症になる恐れがある。この問題の
解決方法は、単に免疫抵抗性減弱動物にワクチン接種し
ないことであると思われる。他方、選択的ワクチン接種
は不可能であり、ワクチン接種した動物により生ワクチ
ンウイルスが放散され、ワクチン接種した動物の近傍の
免疫抵抗性減弱動物を含む全動物に感染する恐れがあ
る。
ワクチンは正常な免疫適格宿主では安全であるが、免疫
抵抗性減弱宿主の場合には安全ではなく、弱毒病原体で
あっても感染すると重症になる恐れがある。この問題の
解決方法は、単に免疫抵抗性減弱動物にワクチン接種し
ないことであると思われる。他方、選択的ワクチン接種
は不可能であり、ワクチン接種した動物により生ワクチ
ンウイルスが放散され、ワクチン接種した動物の近傍の
免疫抵抗性減弱動物を含む全動物に感染する恐れがあ
る。
【００２７】ｂ）ａ）に加えて、ある種には並の病原性
のウイルスが別の種には致死性となり得ることは周知で
ある。顕著な１例は、ヘルペスウイルスのαヘルペスウ
イルス亜科の１員である仮性狂犬病ウイルスである。こ
のウイルスは成ブタに対する病原性は並であるが、例え
ばネコ、イヌ、ウマ及びヒツジでは完全に致死性であ
る。
のウイルスが別の種には致死性となり得ることは周知で
ある。顕著な１例は、ヘルペスウイルスのαヘルペスウ
イルス亜科の１員である仮性狂犬病ウイルスである。こ
のウイルスは成ブタに対する病原性は並であるが、例え
ばネコ、イヌ、ウマ及びヒツジでは完全に致死性であ
る。
【００２８】従って、ブタにより放散される改変仮性狂
犬病生ワクチンウイルスが他の動物種（例えばこのブタ
の環境に生育する飼育動物）に対しては依然として高病
原性である可能性がある。
犬病生ワクチンウイルスが他の動物種（例えばこのブタ
の環境に生育する飼育動物）に対しては依然として高病
原性である可能性がある。
【００２９】ｃ）組換えキャリヤーウイルスを使用する
と、ウイルスの細胞又は組織向性、即ち感染細胞又は組
織の型が変化する恐れがある。これは、キャリヤーのゲ
ノムに組み込まれた外来遺伝子の種類に依存する。
と、ウイルスの細胞又は組織向性、即ち感染細胞又は組
織の型が変化する恐れがある。これは、キャリヤーのゲ
ノムに組み込まれた外来遺伝子の種類に依存する。
【００３０】ウイルスタンパク質と宿主細胞レセプター
との相互作用はウイルスの細胞又は組織向性を決定す
る。従って、組換えキャリヤーウイルスの場合のように
そのウイルス膜中に外来タンパク質を有するならば、ウ
イルスの細胞又は組織向性は変化し得る。この向性変化
は１宿主内の細胞又は組織に止まらず、宿主向性も変化
しかねない。
との相互作用はウイルスの細胞又は組織向性を決定す
る。従って、組換えキャリヤーウイルスの場合のように
そのウイルス膜中に外来タンパク質を有するならば、ウ
イルスの細胞又は組織向性は変化し得る。この向性変化
は１宿主内の細胞又は組織に止まらず、宿主向性も変化
しかねない。
【００３１】ｄ）組換え微生物及びウイルスを実地に利
用するには政治倫理的理由及び一部には科学的理由で強
い抵抗がある。
用するには政治倫理的理由及び一部には科学的理由で強
い抵抗がある。
【００３２】αヘルペスウイルス亜科の１種である仮性
狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）については、生きた改変キャ
リヤーウイルスの有利な特徴を備えながら、感染後に放
散できない組換え仮性狂犬病ウイルスを構築することに
より上記問題は解決された（国際特許出願公開第ＷＯ９
４／０１５７３、ＷＯ９４／０３５９５号）。
狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）については、生きた改変キャ
リヤーウイルスの有利な特徴を備えながら、感染後に放
散できない組換え仮性狂犬病ウイルスを構築することに
より上記問題は解決された（国際特許出願公開第ＷＯ９
４／０１５７３、ＷＯ９４／０３５９５号）。
【００３３】放散とは、子孫ウイルスが動物から環境中
に放出されることを意味する。これは排泄物を介するの
みならず、乳汁を介する場合もあるし、屠殺中に行われ
る場合もある。
に放出されることを意味する。これは排泄物を介するの
みならず、乳汁を介する場合もあるし、屠殺中に行われ
る場合もある。
【００３４】このような非放散ウイルスの構築が可能に
なったのは、感染プロセスに関与する遺伝子が発見され
たためである。ＰＲＶの場合、所謂ｇｐ５０遺伝子が細
胞感染に必須であることが判明した。従って、ｇｐ５０
陰性ウイルスは非感染性である（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ
ら； Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５９： ２１６−２２３（１９
８６））。
なったのは、感染プロセスに関与する遺伝子が発見され
たためである。ＰＲＶの場合、所謂ｇｐ５０遺伝子が細
胞感染に必須であることが判明した。従って、ｇｐ５０
陰性ウイルスは非感染性である（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ
ら； Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５９： ２１６−２２３（１９
８６））。
【００３５】ＰＲＶ ｇｐ５０をコードする遺伝子を発
現させる組換え細胞系が樹立された。この細胞系をｇｐ
５０陰性ＰＲＶのＤＮＡでトランスフェクトした。ｇｐ
５０がウイルスのエンベロープ上に存在するので、細胞
系により放散される子孫ウイルスは感染性であることが
判明した。しかしながら、遺伝的には子孫ウイルスは依
然としてｇｐ５０陰性である。
現させる組換え細胞系が樹立された。この細胞系をｇｐ
５０陰性ＰＲＶのＤＮＡでトランスフェクトした。ｇｐ
５０がウイルスのエンベロープ上に存在するので、細胞
系により放散される子孫ウイルスは感染性であることが
判明した。しかしながら、遺伝的には子孫ウイルスは依
然としてｇｐ５０陰性である。
【００３６】従って、宿主動物がこの型のウイルスに感
染すると、多数の細胞に感染し、これらの細胞中でＰＲ
Ｖの遺伝情報が発現され、場合によっては（組換えキャ
リヤー）ＰＲＶにより担持される付加的な遺伝情報も発
現される。
染すると、多数の細胞に感染し、これらの細胞中でＰＲ
Ｖの遺伝情報が発現され、場合によっては（組換えキャ
リヤー）ＰＲＶにより担持される付加的な遺伝情報も発
現される。
【００３７】他方、宿主動物で増殖した子孫ウイルスは
感染に必須であるｇｐ５０の遺伝情報をもたないため、
他の細胞に感染することができない。
感染に必須であるｇｐ５０の遺伝情報をもたないため、
他の細胞に感染することができない。
【００３８】Ｒａｕｈ，Ｉ．とＭｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅ
ｒ，Ｔ．Ｃ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６５： ５３４８−５
３５６（１９９１））及びＰｅｅｔｅｒｓら（Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ ６６： ８９４−９０５ （１９９２））参
照。
ｒ，Ｔ．Ｃ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６５： ５３４８−５
３５６（１９９１））及びＰｅｅｔｅｒｓら（Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ ６６： ８９４−９０５ （１９９２））参
照。
【００３９】同時に、直接的細胞間伝染にｇｐ５０が不
要であることは明白であった。Ｒａｕｈ、Ｐｅｅｔｅｒ
ｓ及びＨｅｆｆｎｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６７： １
５２９−１５３７（１９９３）参照。従って、細胞がｇ
ｐ５０の表現型を完備したウイルスに感染すると、この
ウイルスはこの細胞から直接的細胞間伝染により伝播す
る。このプロセスはｇｐ５０の存在を必要としない。
要であることは明白であった。Ｒａｕｈ、Ｐｅｅｔｅｒ
ｓ及びＨｅｆｆｎｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６７： １
５２９−１５３７（１９９３）参照。従って、細胞がｇ
ｐ５０の表現型を完備したウイルスに感染すると、この
ウイルスはこの細胞から直接的細胞間伝染により伝播す
る。このプロセスはｇｐ５０の存在を必要としない。
【００４０】その結果、最初に感染した細胞の周囲の多
数の細胞はＰＲＶ及びＰＲＶにより担持される付加的外
来遺伝子からの遺伝情報を発現する。
数の細胞はＰＲＶ及びＰＲＶにより担持される付加的外
来遺伝子からの遺伝情報を発現する。
【００４１】この現象は、免疫系を始動するために十分
な抗原材料を発現させる唯一の方法であるので非常に重
要である。ｇｐ５０の不在下のこの直接的細胞間伝染プ
ロセスを介さず免疫を得ようとするならば、生理的に許
容不能な高用量のウイルス粒子を投与しなければならな
い。
な抗原材料を発現させる唯一の方法であるので非常に重
要である。ｇｐ５０の不在下のこの直接的細胞間伝染プ
ロセスを介さず免疫を得ようとするならば、生理的に許
容不能な高用量のウイルス粒子を投与しなければならな
い。
【００４２】ＰＲＶ以外のヘルペスウイルスにも、ＰＲ
Ｖのｇｐ５０遺伝子とある程度相同の遺伝子を有するも
のがある。このような相同体としては、ウマヘルペスウ
イルスのｇＤ遺伝子（Ｆｌｏｗｅｒｓら，Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ １８０； １７５−１８４（１９９１））、単純
ヘルペスウイルスのｇＤ遺伝子（Ｌｉｇａｓら，Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．６２； １４８６−１４９４（１９８８））
及びウシヘルペスウイルスタイプＩのｇＤ遺伝子（Ｔｉ
ｋｏｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４； ５１３２−５１４
２（１９９０）， Ｆｅｈｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６６： ８３１−８３９（１９９２））が記載されてい
る。
Ｖのｇｐ５０遺伝子とある程度相同の遺伝子を有するも
のがある。このような相同体としては、ウマヘルペスウ
イルスのｇＤ遺伝子（Ｆｌｏｗｅｒｓら，Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ １８０； １７５−１８４（１９９１））、単純
ヘルペスウイルスのｇＤ遺伝子（Ｌｉｇａｓら，Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．６２； １４８６−１４９４（１９８８））
及びウシヘルペスウイルスタイプＩのｇＤ遺伝子（Ｔｉ
ｋｏｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４； ５１３２−５１４
２（１９９０）， Ｆｅｈｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６６： ８３１−８３９（１９９２））が記載されてい
る。
【００４３】これらの文献から明らかなように、仮性狂
犬病ｇｐ５０遺伝子産物は直接的細胞間伝染に必須では
ないという点で異例である。
犬病ｇｐ５０遺伝子産物は直接的細胞間伝染に必須では
ないという点で異例である。
【００４４】単純ヘルペスウイルス及びウシヘルペスウ
イルスＩのｇＤ遺伝子はいずれも（ＰＲＶの場合と同様
に）感染に必要不可欠であるのみならず、直接的細胞間
伝染にも必要不可欠である（Ｌｉｇａｓ（ＨＳＶ）及び
Ｆｅｈｌｅｒ（ＢＨＶ）参照）。
イルスＩのｇＤ遺伝子はいずれも（ＰＲＶの場合と同様
に）感染に必要不可欠であるのみならず、直接的細胞間
伝染にも必要不可欠である（Ｌｉｇａｓ（ＨＳＶ）及び
Ｆｅｈｌｅｒ（ＢＨＶ）参照）。
【００４５】従って、ウシヘルペスウイルスｇＤ陰性突
然変異体は直接的細胞間伝染を示さない。このため、Ｐ
ＲＶではｇｐ５０を欠失させることにより直接的細胞間
伝染が可能であり、それによって十分なレベルの抗原を
産生することが可能な非感染性ワクチンウイルスを構築
するアプローチがとられたが、ウシヘルペスウイルスに
はこのアプローチをとることができない。
然変異体は直接的細胞間伝染を示さない。このため、Ｐ
ＲＶではｇｐ５０を欠失させることにより直接的細胞間
伝染が可能であり、それによって十分なレベルの抗原を
産生することが可能な非感染性ワクチンウイルスを構築
するアプローチがとられたが、ウシヘルペスウイルスに
はこのアプローチをとることができない。
【００４６】
【課題を解決するための手段】驚くべきことに、直接的
細胞間伝染特性を示すｇＤ陰性ウシヘルペスウイルス突
然変異体を獲得できることが茲に知見された。以下の文
中ではこの突然変異体をｃｔｃｓ+突然変異体とも呼称
する。
細胞間伝染特性を示すｇＤ陰性ウシヘルペスウイルス突
然変異体を獲得できることが茲に知見された。以下の文
中ではこの突然変異体をｃｔｃｓ+突然変異体とも呼称
する。
【００４７】この点において、この突然変異体は標準ｇ
Ｄ陰性ウシヘルペスウイルスと相違する。この突然変異
体は直接的細胞間伝染能を有するので、ウイルスが非感
染性であるにも拘わらずその遺伝情報は最初に感染した
各細胞の周囲の多数の細胞で発現される。従って、宿主
に投与するウイルス粒子数を医薬的に許容可能なレベル
内に維持しながら、免疫応答を誘発するために十分高い
抗原レベルに達することができる。
Ｄ陰性ウシヘルペスウイルスと相違する。この突然変異
体は直接的細胞間伝染能を有するので、ウイルスが非感
染性であるにも拘わらずその遺伝情報は最初に感染した
各細胞の周囲の多数の細胞で発現される。従って、宿主
に投与するウイルス粒子数を医薬的に許容可能なレベル
内に維持しながら、免疫応答を誘発するために十分高い
抗原レベルに達することができる。
【００４８】
【発明の実施の形態】当然のことながら、本発明により
直接的細胞間伝染特性を示すウシヘルペスウイルスを構
築するためには、ｇＤ遺伝子を含む全ウシヘルペスウイ
ルスを使用することができる。
直接的細胞間伝染特性を示すウシヘルペスウイルスを構
築するためには、ｇＤ遺伝子を含む全ウシヘルペスウイ
ルスを使用することができる。
【００４９】本発明の好適態様では、ｇＤ陰性ウシヘル
ペスウイルスタイプＩ突然変異体を使用する。
ペスウイルスタイプＩ突然変異体を使用する。
【００５０】本発明のｇＤ陰性ウシヘルペスウイルス突
然変異体は、ｇＤ陰性ウシヘルペスウイルスのＤＮＡと
８．５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグ
メントを含むＤＮＡとの同時トランスフェクションによ
り獲得することができ、後者ＤＮＡはこのＤＮＡで形質
転換されかつ、仏国、パリ、２５，Ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏ
ｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ＣＥ
ＤＥＸ １５に所在のパスツール研究所のＣｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣ
Ｍ）に受託番号Ｉ−１４４６で寄託されている大腸菌か
ら単離可能である。
然変異体は、ｇＤ陰性ウシヘルペスウイルスのＤＮＡと
８．５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグ
メントを含むＤＮＡとの同時トランスフェクションによ
り獲得することができ、後者ＤＮＡはこのＤＮＡで形質
転換されかつ、仏国、パリ、２５，Ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏ
ｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ＣＥ
ＤＥＸ １５に所在のパスツール研究所のＣｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣ
Ｍ）に受託番号Ｉ−１４４６で寄託されている大腸菌か
ら単離可能である。
【００５１】上記ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメ
ントは突然変異を有するｇＨ遺伝子を含む。この突然変
異ｇＨ遺伝子は本発明の突然変異体の驚くべき特徴を提
供する。ｇＨ遺伝子の位置を図１に示す。
ントは突然変異を有するｇＨ遺伝子を含む。この突然変
異ｇＨ遺伝子は本発明の突然変異体の驚くべき特徴を提
供する。ｇＨ遺伝子の位置を図１に示す。
【００５２】当然のことながら、直接的細胞間伝染特性
を付与することが可能な前記８．５ｋｂｐ ＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメントの全サブフラグメン
トも本発明の一部を構成する。
を付与することが可能な前記８．５ｋｂｐ ＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメントの全サブフラグメン
トも本発明の一部を構成する。
【００５３】適切な宿主細胞の同時トランスフェクショ
ン後、相同組換えにより本発明のウシヘルペスウイルス
突然変異体が得られる。この突然変異体は直接的細胞間
伝染が可能であるため（標準ｇＤ陰性ウシヘルペスウイ
ルスとは対照的に）プラーク形成性であり、従って容易
に選択可能である。
ン後、相同組換えにより本発明のウシヘルペスウイルス
突然変異体が得られる。この突然変異体は直接的細胞間
伝染が可能であるため（標準ｇＤ陰性ウシヘルペスウイ
ルスとは対照的に）プラーク形成性であり、従って容易
に選択可能である。
【００５４】言うまでもなく、まず最初に野生型ウシヘ
ルペスウイルスＩと８．５ｋｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂｇ
ｌＩＩ制限フラグメントを含むＤＮＡで同時トランスフ
ェクションを実施した後、ｇＤ遺伝子を改変してｇＤ陰
性突然変異体を得ることも可能である。
ルペスウイルスＩと８．５ｋｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂｇ
ｌＩＩ制限フラグメントを含むＤＮＡで同時トランスフ
ェクションを実施した後、ｇＤ遺伝子を改変してｇＤ陰
性突然変異体を得ることも可能である。
【００５５】本発明は更に、ｇＤが補充されている（ｃ
ｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈｇＤ）ウシヘルペス
ウイルス突然変異体にも関する。上述の通り、直接的細
胞間伝染能を有するにも拘わらず、全ｇＤ陰性ウシαヘ
ルペスウイルス突然変異体は非感染性である。
ｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈｇＤ）ウシヘルペス
ウイルス突然変異体にも関する。上述の通り、直接的細
胞間伝染能を有するにも拘わらず、全ｇＤ陰性ウシαヘ
ルペスウイルス突然変異体は非感染性である。
【００５６】ところで、例えばワクチン接種の目的で
は、単一感染サイクルのみ可能な突然変異体を有するこ
とが非常に望ましい。本発明の突然変異体を感染性にす
るためには、ｇＤ補充性細胞（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉ
ｎｇ ｆｏｒ ｇＤ）に突然変異ウイルスのＤＮＡをト
ランスフェクトすれば十分である。このような細胞では
子孫ウイルスはｇＤの表現型を補充されるので感染性で
ある。このようなｇＤ補充細胞はＦｅｈｌｅｒら（Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．６６： ８３１−８３９（１９９２））に
より記載されている。これらの細胞の上清から単離され
たウイルスは表現型はｇＤ陽性であるが遺伝子型はｇＤ
陰性であるので、単一感染サイクルのみで宿主細胞に感
染することが可能である。
は、単一感染サイクルのみ可能な突然変異体を有するこ
とが非常に望ましい。本発明の突然変異体を感染性にす
るためには、ｇＤ補充性細胞（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉ
ｎｇ ｆｏｒ ｇＤ）に突然変異ウイルスのＤＮＡをト
ランスフェクトすれば十分である。このような細胞では
子孫ウイルスはｇＤの表現型を補充されるので感染性で
ある。このようなｇＤ補充細胞はＦｅｈｌｅｒら（Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．６６： ８３１−８３９（１９９２））に
より記載されている。これらの細胞の上清から単離され
たウイルスは表現型はｇＤ陽性であるが遺伝子型はｇＤ
陰性であるので、単一感染サイクルのみで宿主細胞に感
染することが可能である。
【００５７】あるいは、ワクチンが細胞会合形態、例え
ば感染細胞の懸濁液として前記ヘルペスウイルスを含む
ならば、補充細胞系で増殖させる必要なしに本発明のワ
クチンの製造に生きたｇＤ陰性ウシヘルペスウイルスを
使用することができる。
ば感染細胞の懸濁液として前記ヘルペスウイルスを含む
ならば、補充細胞系で増殖させる必要なしに本発明のワ
クチンの製造に生きたｇＤ陰性ウシヘルペスウイルスを
使用することができる。
【００５８】ｇＤの不在下でウイルスの複製型分子を含
む複製細胞系を維持することが可能である。この細胞系
を同一又は適合可能な細胞系の無ウイルス細胞と混合す
ると、細胞間接触により培養中の全細胞に感染し、表現
型及び遺伝子型の両面でｇＤ相同体を含まないウイルス
及びウイルス含有細胞を付随的に増殖させることができ
る。
む複製細胞系を維持することが可能である。この細胞系
を同一又は適合可能な細胞系の無ウイルス細胞と混合す
ると、細胞間接触により培養中の全細胞に感染し、表現
型及び遺伝子型の両面でｇＤ相同体を含まないウイルス
及びウイルス含有細胞を付随的に増殖させることができ
る。
【００５９】言うまでもなく、本発明のウシヘルペスウ
イルスは付加的な欠失、挿入、点突然変異又は他の遺伝
子改変を含み得る。これらの改変は例えばチミジンキナ
ーゼ遺伝子、糖タンパク質ｇＩ遺伝子又は糖タンパク質
ｇＥ遺伝子の欠失であり得る。
イルスは付加的な欠失、挿入、点突然変異又は他の遺伝
子改変を含み得る。これらの改変は例えばチミジンキナ
ーゼ遺伝子、糖タンパク質ｇＩ遺伝子又は糖タンパク質
ｇＥ遺伝子の欠失であり得る。
【００６０】組換えＤＮＡ技術により、外来遺伝情報
（異種ＤＮＡ）を本発明のｇＤ陰性ウシヘルペスウイル
ス突然変異体のゲノムに挿入することができ、こうする
ことにより、ＢＨＶをこの情報のキャリヤーウイルスと
して使用することができる。
（異種ＤＮＡ）を本発明のｇＤ陰性ウシヘルペスウイル
ス突然変異体のゲノムに挿入することができ、こうする
ことにより、ＢＨＶをこの情報のキャリヤーウイルスと
して使用することができる。
【００６１】本発明の目的の１つは組換えキャリヤーウ
イルスを提供することである。
イルスを提供することである。
【００６２】従って、好ましくは本発明のＢＨＶ突然変
異体は異種ＤＮＡ配列を有する挿入を含む。
異体は異種ＤＮＡ配列を有する挿入を含む。
【００６３】挿入遺伝子が発現に適切な配列を有するな
らば、挿入遺伝情報はウイルスの遺伝情報と共に発現さ
れる。
らば、挿入遺伝情報はウイルスの遺伝情報と共に発現さ
れる。
【００６４】従って、より好適な形態の本発明のＢＨＶ
突然変異体では、異種ＤＮＡ配列は前記ＢＨＶ突然変異
体に感染した細胞中における前記異種ＤＮＡ配列の発現
を調節するプロモーターの制御下にある。
突然変異体では、異種ＤＮＡ配列は前記ＢＨＶ突然変異
体に感染した細胞中における前記異種ＤＮＡ配列の発現
を調節するプロモーターの制御下にある。
【００６５】最適形態では、異種ＤＮＡ配列はウシ病原
体の抗原をコードする。
体の抗原をコードする。
【００６６】この抗原は有利にはウシロタウイルス、ウ
シウイルス性下痢ウイルス、３型パラインフルエンザウ
イルス、ウシパラミクソウイルス、口蹄疫ウイルス、ウ
シコロナウイルス、ウシ呼吸シンシチウムウイルス及び
パスツレラ・ヘモリチカから構成される群に由来する。
シウイルス性下痢ウイルス、３型パラインフルエンザウ
イルス、ウシパラミクソウイルス、口蹄疫ウイルス、ウ
シコロナウイルス、ウシ呼吸シンシチウムウイルス及び
パスツレラ・ヘモリチカから構成される群に由来する。
【００６７】本発明は更に、本発明のｇＤ陰性ウシヘル
ペスウイルス突然変異体を含む、ウシヘルペスウイルス
感染に対するウシの防御用ワクチンに関する。
ペスウイルス突然変異体を含む、ウシヘルペスウイルス
感染に対するウシの防御用ワクチンに関する。
【００６８】好ましくは、このワクチンは本発明のウイ
ルス以外に、別のウシ病原体の抗原の遺伝情報を含む。
ルス以外に、別のウシ病原体の抗原の遺伝情報を含む。
【００６９】生ワクチンを製造するためには、本発明の
ＢＨＶ突然変異体を感受性細胞上で増殖させる。
ＢＨＶ突然変異体を感受性細胞上で増殖させる。
【００７０】例えばウシ起源の細胞培養で増殖させる。
この細胞培養はｇＤ補充細胞培養であり得る。
この細胞培養はｇＤ補充細胞培養であり得る。
【００７１】組織又は細胞培養液及び／又は細胞を集め
ることにより、こうして増殖させたウイルスを回収する
ことができる。生ワクチンは懸濁液の形態で製造しても
よいし、凍結乾燥してもよい。
ることにより、こうして増殖させたウイルスを回収する
ことができる。生ワクチンは懸濁液の形態で製造しても
よいし、凍結乾燥してもよい。
【００７２】免疫原的に有効な量の組換えＢＨＶ−Ｉ以
外に、ワクチンは医薬的に許容可能なキャリヤー又は希
釈剤を含有し得る。
外に、ワクチンは医薬的に許容可能なキャリヤー又は希
釈剤を含有し得る。
【００７３】本発明で有用な医薬的に許容可能なキャリ
ヤー又は希釈剤の例としては、ＳＰＧＡ、炭水化物（例
えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、
グルコース、デキストラン）、タンパク質（例えばアル
ブミン又はカゼイン）、タンパク質含有物質（例えばウ
シ血清又は脱脂粉乳等）及び緩衝剤（例えばリン酸緩衝
液）が挙げられる。
ヤー又は希釈剤の例としては、ＳＰＧＡ、炭水化物（例
えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、
グルコース、デキストラン）、タンパク質（例えばアル
ブミン又はカゼイン）、タンパク質含有物質（例えばウ
シ血清又は脱脂粉乳等）及び緩衝剤（例えばリン酸緩衝
液）が挙げられる。
【００７４】任意に、アジュバント活性を有する１種以
上の化合物をワクチンに添加してもよい。適切なアジュ
バントは例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウ
ム、酸化アルミニウム、（例えばＢａｙｏｌ Ｆ［登録
商標］及びＭａｒｃｏｌ ５２［登録商標］の）油エマ
ルジョン、サポニン又はビタミンＥ可溶化質である。
上の化合物をワクチンに添加してもよい。適切なアジュ
バントは例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウ
ム、酸化アルミニウム、（例えばＢａｙｏｌ Ｆ［登録
商標］及びＭａｒｃｏｌ ５２［登録商標］の）油エマ
ルジョン、サポニン又はビタミンＥ可溶化質である。
【００７５】本発明は更に、本発明のワクチンを動物に
投与することからなる、ウシヘルペスウイルス突然変異
体に対する動物の防御方法も提供する。
投与することからなる、ウシヘルペスウイルス突然変異
体に対する動物の防御方法も提供する。
【００７６】当然のことながら、ワクチンが本発明のウ
イルスと共に別のウシ病原体の抗原の遺伝情報を含む場
合には、上記方法は前記別のウシ病原体に対する防御も
提供する。
イルスと共に別のウシ病原体の抗原の遺伝情報を含む場
合には、上記方法は前記別のウシ病原体に対する防御も
提供する。
【００７７】動物に投与するには、本発明のＢＨＶ突然
変異体を特に鼻腔内、皮内、皮下又は筋肉内に投与す
る。
変異体を特に鼻腔内、皮内、皮下又は筋肉内に投与す
る。
【００７８】有用な有効投与量は年齢、体重、投与方法
及びワクチン接種により防御すべき病原体の型により異
なる。適切な用量は例えば動物１匹当たり約１０3〜１
０7ｐｆｕである。
及びワクチン接種により防御すべき病原体の型により異
なる。適切な用量は例えば動物１匹当たり約１０3〜１
０7ｐｆｕである。
【００７９】本発明のＢＨＶ突然変異体を使用して不活
化ワクチンを製造することもできる。
化ワクチンを製造することもできる。
【００８０】本発明は更に、８．５ｋｂｐ ＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメントにも係り、該フラグ
メントは該フラグメントを含むＤＮＡで形質転換した大
腸菌から単離可能であり、仏国、パリに所在のパスツー
ル研究所のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ
ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に受託番号Ｉ−１４４６で
寄託されている。
ＩＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメントにも係り、該フラグ
メントは該フラグメントを含むＤＮＡで形質転換した大
腸菌から単離可能であり、仏国、パリに所在のパスツー
ル研究所のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ
ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に受託番号Ｉ−１４４６で
寄託されている。
【００８１】
【実施例】実施例１ 細胞及びウイルス増殖条件 ：ウイルスの増殖のためにＭ
ａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎細胞（ＭＤＢＫ）を使用し
た。（間接的細胞間伝染可能な）ｇＤ陰性突然変異体の
増殖には、Ｆｅｈｌｅｒ（Ｆｅｈｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６６： ８３１−８３９（１９９２））による補
充細胞系を使用した。同様にＭＤＢＫ起源のこの細胞系
にｇＤのＢＨＶ−Ｉ遺伝子を挿入し、構成的に発現させ
た。
ａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎細胞（ＭＤＢＫ）を使用し
た。（間接的細胞間伝染可能な）ｇＤ陰性突然変異体の
増殖には、Ｆｅｈｌｅｒ（Ｆｅｈｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６６： ８３１−８３９（１９９２））による補
充細胞系を使用した。同様にＭＤＢＫ起源のこの細胞系
にｇＤのＢＨＶ−Ｉ遺伝子を挿入し、構成的に発現させ
た。
【００８２】ｇＤ遺伝子の代わりにｌａｃＺ遺伝子を担
持するｇＤ陰性ＢＨＶ−Ｉ突然変異体もＦｅｈｌｅｒ
（前出）による標準分子生物学的方法に従って調製し
た。
持するｇＤ陰性ＢＨＶ−Ｉ突然変異体もＦｅｈｌｅｒ
（前出）による標準分子生物学的方法に従って調製し
た。
【００８３】５％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ
／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及
びＬ−グルタミン（０．３５ｍｇ／ｍｌ）を補充したダ
ルベッコの最終必須培地（ＤＭＥＭ）で細胞を成長させ
た。
／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及
びＬ−グルタミン（０．３５ｍｇ／ｍｌ）を補充したダ
ルベッコの最終必須培地（ＤＭＥＭ）で細胞を成長させ
た。
【００８４】常法に従ってこれらの細胞でウイルスを増
殖させた。
殖させた。
【００８５】ｃｔｃｓ +特性を有するｇＤ陰性ＢＨＶ−
Ｉ突然変異体の構築：特異的ｃｔｃｓ+特性を有するＢ
ＨＶ−Ｉウイルスは、ＢＨＶ−ＩウイルスＤＮＡと特定
の８．５ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラ
グメントとで適切な宿主細胞を同時トランスフェクトす
ることにより得られる。この特定のフラグメントはこの
フラグメントで形質転換され、かつ仏国、パリに所在の
パスツール研究所のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ
−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に受託番号Ｉ−１
４４６で寄託されている大腸菌から単離することができ
る。
Ｉ突然変異体の構築：特異的ｃｔｃｓ+特性を有するＢ
ＨＶ−Ｉウイルスは、ＢＨＶ−ＩウイルスＤＮＡと特定
の８．５ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラ
グメントとで適切な宿主細胞を同時トランスフェクトす
ることにより得られる。この特定のフラグメントはこの
フラグメントで形質転換され、かつ仏国、パリに所在の
パスツール研究所のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ
−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に受託番号Ｉ−１
４４６で寄託されている大腸菌から単離することができ
る。
【００８６】適切な宿主細胞は例えばＭＤＢＫ細胞であ
る。
る。
【００８７】ＤＮＡの同時トランスフェクションは、例
えばＭａｎｉａｔｉｓ（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら，“Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ； ａ ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，（１９８２）ＩＳＢＮ ０
−８７９６９−１３６−０”）に記載されているような
常法に従って実施される。
えばＭａｎｉａｔｉｓ（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら，“Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ； ａ ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，（１９８２）ＩＳＢＮ ０
−８７９６９−１３６−０”）に記載されているような
常法に従って実施される。
【００８８】ウイルスＤＮＡをｇＤ-ｌａｃＺ+ＢＨＶ−
Ｉ突然変異体から単離する場合には、ｌａｃＺ遺伝子産
物の色素産生基質であるＸ−ｇａｌの存在下でｃｔｃｓ
+特性を有する組換えウイルスをスクリーニングしなけ
ればならない。
Ｉ突然変異体から単離する場合には、ｌａｃＺ遺伝子産
物の色素産生基質であるＸ−ｇａｌの存在下でｃｔｃｓ
+特性を有する組換えウイルスをスクリーニングしなけ
ればならない。
【００８９】組換えウイルスを含む細胞は、３日以上後
に大きい青色プラークを形成する能力により容易に認識
される（これに対して非組換えウイルスを含む形質転換
細胞は青色単細胞としてのみ検出される）。
に大きい青色プラークを形成する能力により容易に認識
される（これに対して非組換えウイルスを含む形質転換
細胞は青色単細胞としてのみ検出される）。
【００９０】ハイブリダイゼーション実験：本発明のｃ
ｔｃｓ+突然変異体が確かにｇＤ陰性であることを立証
するために、以下のハイブリダイゼーション実験を実施
した。
ｔｃｓ+突然変異体が確かにｇＤ陰性であることを立証
するために、以下のハイブリダイゼーション実験を実施
した。
【００９１】ｗｔＢＨＶ−Ｉ、ｇＤ-ｌａｃＺ+ＢＨＶ−
Ｉ及びｇＤ-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ+ＢＨＶ−ＩからのＤＮ
ＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル上で分離
した。分離後、ニトロセルロースに移した。次いでニト
ロセルロースフィルターをｇＤ特異的プロープ、ｇＩ特
異的プロープ及びｌａｃＺ特異的プロープとハイブリダ
イズさせた。
Ｉ及びｇＤ-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ+ＢＨＶ−ＩからのＤＮ
ＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル上で分離
した。分離後、ニトロセルロースに移した。次いでニト
ロセルロースフィルターをｇＤ特異的プロープ、ｇＩ特
異的プロープ及びｌａｃＺ特異的プロープとハイブリダ
イズさせた。
【００９２】ｗｔＢＨＶ−Ｉ ＤＮＡは野生型ＢＨＶ−
Ｉウイルスから得、ｇＤ-ｌａｃＺ+ＢＨＶ−Ｉ ＤＮＡ
はｇＤ遺伝子をｌａｃＺ遺伝子で置き換えたｇＤ陰性Ｂ
ＨＶ−Ｉ突然変異体から得た。ｇＤ-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ
+ＢＨＶ−Ｉ ＤＮＡは、直接的細胞間伝染特性を有す
る本発明のｇＤ陰性ＢＨＶ−Ｉ突然変異体から得た。
Ｉウイルスから得、ｇＤ-ｌａｃＺ+ＢＨＶ−Ｉ ＤＮＡ
はｇＤ遺伝子をｌａｃＺ遺伝子で置き換えたｇＤ陰性Ｂ
ＨＶ−Ｉ突然変異体から得た。ｇＤ-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ
+ＢＨＶ−Ｉ ＤＮＡは、直接的細胞間伝染特性を有す
る本発明のｇＤ陰性ＢＨＶ−Ｉ突然変異体から得た。
【００９３】結果：（ｇＤ特異的プロープとハイブリダ
イズさせた）図２ａのレーン１、２及び３から明らかな
ように、野生型ＢＨＶ−Ｉウイルス（レーン１）のみが
ｇＤ遺伝子を有する。ｇＤ-ｌａｃＺ+ＢＨＶ−Ｉ ＤＮ
ＡとｇＤ-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ+ＢＨＶ−Ｉ ＤＮＡはい
ずれもｇＤ遺伝子又はそのフラグメントをもたない。
イズさせた）図２ａのレーン１、２及び３から明らかな
ように、野生型ＢＨＶ−Ｉウイルス（レーン１）のみが
ｇＤ遺伝子を有する。ｇＤ-ｌａｃＺ+ＢＨＶ−Ｉ ＤＮ
ＡとｇＤ-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ+ＢＨＶ−Ｉ ＤＮＡはい
ずれもｇＤ遺伝子又はそのフラグメントをもたない。
【００９４】これは、驚くべき直接的細胞間伝染特性が
ｇＤ遺伝子に起因しないことを示す。
ｇＤ遺伝子に起因しないことを示す。
【００９５】図２ｂでは、同一ＤＮＡを全３種のＤＮＡ
に存在する遺伝子であるｇＩ−ＤＮＡとハイブリダイズ
させた。この実験から明らかなように、レーンａ２及び
ａ３でハイブリダイズしなかったのは、これらのレーン
にＤＮＡが存在しなかったためではなく、実際にｇＤ遺
伝子を欠失しているためである。
に存在する遺伝子であるｇＩ−ＤＮＡとハイブリダイズ
させた。この実験から明らかなように、レーンａ２及び
ａ３でハイブリダイズしなかったのは、これらのレーン
にＤＮＡが存在しなかったためではなく、実際にｇＤ遺
伝子を欠失しているためである。
【００９６】図２ｃでは、同一ＤＮＡをｌａｃＺ−ＤＮ
Ａとハイブリダイズさせた。この実験の結果から明らか
なように、ｇＤ-ｌａｃＺ+ＢＨＶ−Ｉ ＤＮＡ及びｇＤ
-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ+ＢＨＶ−Ｉ ＤＮＡはいずれも予
想通りそのｌａｃＺ+特性を維持した。
Ａとハイブリダイズさせた。この実験の結果から明らか
なように、ｇＤ-ｌａｃＺ+ＢＨＶ−Ｉ ＤＮＡ及びｇＤ
-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ+ＢＨＶ−Ｉ ＤＮＡはいずれも予
想通りそのｌａｃＺ+特性を維持した。
【００９７】免疫沈降実験：ＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョン試験に加えて、ｇＤ-ｌａｃＺ+ＢＨＶ−Ｉウイルス
及びｇＤ-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ+ＢＨＶ−Ｉウイルスのｇ
Ｄ陰性を調べる免疫試験を実施した。
ョン試験に加えて、ｇＤ-ｌａｃＺ+ＢＨＶ−Ｉウイルス
及びｇＤ-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ+ＢＨＶ−Ｉウイルスのｇ
Ｄ陰性を調べる免疫試験を実施した。
【００９８】ＢＨＶ−Ｉ（図３、レーン１）、ｇＤ-ｌ
ａｃＺ+ＢＨＶ−Ｉ（レーン２）及びｇＤ-ｌａｃＺ+ｃ
ｔｃｓ+ＢＨＶ−Ｉ（レーン３）に感染させた35Ｓ標識
細胞からの免疫沈降タンパク質のＰＡＧＥ−ゲルを調製
し、ブロットした。抗ｇＢ（ブロットａ）、抗ｇＣ（ブ
ロットｂ）及び抗ｇＤ（ブロットｃ）モノクローナル抗
体を使用して、これらのブロットを免疫アッセイで使用
した。
ａｃＺ+ＢＨＶ−Ｉ（レーン２）及びｇＤ-ｌａｃＺ+ｃ
ｔｃｓ+ＢＨＶ−Ｉ（レーン３）に感染させた35Ｓ標識
細胞からの免疫沈降タンパク質のＰＡＧＥ−ゲルを調製
し、ブロットした。抗ｇＢ（ブロットａ）、抗ｇＣ（ブ
ロットｂ）及び抗ｇＤ（ブロットｃ）モノクローナル抗
体を使用して、これらのブロットを免疫アッセイで使用
した。
【００９９】結果：ｇＢ及びｇＣに対する抗体は全ブロ
ットで反応性であるが、ｇＤに対する抗体はｗｔＢＨＶ
−Ｉを含むレーン１のみで反応性である。これらの結果
は、ハイブリダイゼーション実験の結果を裏付けるもの
である。
ットで反応性であるが、ｇＤに対する抗体はｗｔＢＨＶ
−Ｉを含むレーン１のみで反応性である。これらの結果
は、ハイブリダイゼーション実験の結果を裏付けるもの
である。
【０１００】直接的細胞間伝染特性の確認 本発明のｇＤ陰性ウシヘルペスウイルス突然変異体が実
際に直接的細胞間伝染可能であるか否かを調べるため
に、以下の実験を実施した。
際に直接的細胞間伝染可能であるか否かを調べるため
に、以下の実験を実施した。
【０１０１】ａ）直接的細胞間伝染（ｃｔｃｓ+）突然
変異体を含む培養物からの上清及び死滅細胞（凍結／融
解後に音波処理により死滅）をｇＤ補充細胞及び非補充
細胞と同時培養した（図４参照）。図４の上段中央（ｕ
−ｍ）の写真は、本発明のｇＤ陰性ＢＨＶ−Ｉ ｃｔｃ
ｓ+突然変異体によるプラーク形成（暗細胞）を示す。
上段左（ｕ−ｌ）及び上段右（ｕ−ｒ）の写真はｇＤ補
充細胞及び非補充細胞とｕ−ｍからの上清及び死滅細胞
との同時培養を示す。
変異体を含む培養物からの上清及び死滅細胞（凍結／融
解後に音波処理により死滅）をｇＤ補充細胞及び非補充
細胞と同時培養した（図４参照）。図４の上段中央（ｕ
−ｍ）の写真は、本発明のｇＤ陰性ＢＨＶ−Ｉ ｃｔｃ
ｓ+突然変異体によるプラーク形成（暗細胞）を示す。
上段左（ｕ−ｌ）及び上段右（ｕ−ｒ）の写真はｇＤ補
充細胞及び非補充細胞とｕ−ｍからの上清及び死滅細胞
との同時培養を示す。
【０１０２】結果：ｇＤ補充細胞及び非補充細胞のいず
れでもプラーク形成を観察することはできない。死滅細
胞はウイルスの直接的細胞間伝染では沈降することがで
きない。ウイルス粒子はｇＤの欠失により非感染性であ
るため、溶解細胞からの遊離ウイルス粒子を含む上清も
プラークを形成しない。
れでもプラーク形成を観察することはできない。死滅細
胞はウイルスの直接的細胞間伝染では沈降することがで
きない。ウイルス粒子はｇＤの欠失により非感染性であ
るため、溶解細胞からの遊離ウイルス粒子を含む上清も
プラークを形成しない。
【０１０３】従って、この実験は直接的細胞間伝染が本
発明のｇＤ陰性ｃｔｃｓ+突然変異体の伝染手段である
ことを立証するものである。
発明のｇＤ陰性ｃｔｃｓ+突然変異体の伝染手段である
ことを立証するものである。
【０１０４】ｂ）本発明の直接的細胞間伝染（ｃｔｃｓ
+）突然変異体を含む培養物からの生存細胞を非補充細
胞と同時培養した。
+）突然変異体を含む培養物からの生存細胞を非補充細
胞と同時培養した。
【０１０５】このために、図４の写真ｕ−ｍからの細胞
の懸濁液を調製し、非補充細胞の培養物に播種した。
の懸濁液を調製し、非補充細胞の培養物に播種した。
【０１０６】結果：下段中央（ｌ−ｍ）の写真はこの同
時培養の結果を示し、非補充細胞の層上に広がった生存
細胞は、直接的細胞間伝染により、非補充細胞にプラー
ク形成をもたらした。これは、本発明のｃｔｃｓ+突然
変異体を含む細胞が突然変異体の直接的細胞間伝染特性
により実際にプラーク形成が可能であることを立証する
ものである。
時培養の結果を示し、非補充細胞の層上に広がった生存
細胞は、直接的細胞間伝染により、非補充細胞にプラー
ク形成をもたらした。これは、本発明のｃｔｃｓ+突然
変異体を含む細胞が突然変異体の直接的細胞間伝染特性
により実際にプラーク形成が可能であることを立証する
ものである。
【０１０７】ｃ）図４の写真ｌ−ｍ（ｂに記載）のプラ
ークからの生存細胞をｇＤ補充細胞及び非補充細胞と同
時培養した。
ークからの生存細胞をｇＤ補充細胞及び非補充細胞と同
時培養した。
【０１０８】結果：下段左の写真は、ｇＤ補充細胞とｃ
ｔｃｓ+突然変異体（図４ｌ−ｍ）を含む生存細胞子孫
を同時培養すると、大きいプラークが形成されることを
示す。これは、直接的細胞間伝染を介してｃｔｃｓ+突
然変異体を獲得した補充細胞から生じる２つのプロセ
ス、即ちこれらの細胞から隣接細胞への直接的細胞間伝
染と、他の細胞に感染し得る感染性粒子の放出という２
つのプロセスの結果である。
ｔｃｓ+突然変異体（図４ｌ−ｍ）を含む生存細胞子孫
を同時培養すると、大きいプラークが形成されることを
示す。これは、直接的細胞間伝染を介してｃｔｃｓ+突
然変異体を獲得した補充細胞から生じる２つのプロセ
ス、即ちこれらの細胞から隣接細胞への直接的細胞間伝
染と、他の細胞に感染し得る感染性粒子の放出という２
つのプロセスの結果である。
【０１０９】下段右の写真は、非補充細胞とｃｔｃｓ+
突然変異体（図４ｌ−ｍ）を含む生存細胞子孫の同時培
養を示す。予想通り、この場合も直接的細胞間伝染の結
果として新しいプラークが形成された。
突然変異体（図４ｌ−ｍ）を含む生存細胞子孫の同時培
養を示す。予想通り、この場合も直接的細胞間伝染の結
果として新しいプラークが形成された。
【０１１０】実施例２ 本発明のｇＤ陰性ウシヘルペスウイルス突然変異体の安
全性、ビルレンス及び効力に関する動物実験 ｇＤ陰性突然変異体の安全性、低ビルレンス及び高効
力、並びに無放散性を試験する動物実験を開始した。
全性、ビルレンス及び効力に関する動物実験 ｇＤ陰性突然変異体の安全性、低ビルレンス及び高効
力、並びに無放散性を試験する動物実験を開始した。
【０１１１】ｇＤ陰性突然変異体を野生型ＢＨＶと比較
し、病原作用を非感染動物と比較した。
し、病原作用を非感染動物と比較した。
【０１１２】用量は、５．３10ｌｏｇＴＣＩＤ50及び
４．０10ｌｏｇＴＣＩＤ50の２種の異なるウイルス力価
とした。下表に示すウイルスを使用した。
４．０10ｌｏｇＴＣＩＤ50の２種の異なるウイルス力価
とした。下表に示すウイルスを使用した。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】＊鼻腔内、筋肉内及び静脈内の各経路で２
ｍｌ。
ｍｌ。
【図１】ＢＨＶのゲノム地図上のｇＨ遺伝子の位置を示
す。
す。
【図２】ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル上で
サイズ分離し、ニトロセルロースに転写した後にｗｔＢ
ＨＶ−Ｉ（レーン１）、ｇＤ-ｌａｃＺ+ＢＨＶ−Ｉ（レ
ーン２）及びｇＤ-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ+ＢＨＶ−Ｉ（レ
ーン３）からのＤＮＡを、ｇＤ特異的プローブ（ａ）、
ｇＩ特異的プローブ（ｂ）及びｌａｃＺ特異的プローブ
（ｃ）とハイブリダイズさせた結果を示す。
サイズ分離し、ニトロセルロースに転写した後にｗｔＢ
ＨＶ−Ｉ（レーン１）、ｇＤ-ｌａｃＺ+ＢＨＶ−Ｉ（レ
ーン２）及びｇＤ-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ+ＢＨＶ−Ｉ（レ
ーン３）からのＤＮＡを、ｇＤ特異的プローブ（ａ）、
ｇＩ特異的プローブ（ｂ）及びｌａｃＺ特異的プローブ
（ｃ）とハイブリダイズさせた結果を示す。
【図３】ｗｔＢＨＶ−Ｉ（レーン１）、ｇＤ-ｌａｃＺ+
ＢＨＶ−Ｉ（レーン２）及びｇＤ-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ+
ＢＨＶ−Ｉ（レーン３）に感染させた35Ｓ標識細胞を抗
ｇＢ抗体（ａ）、抗ｇＣ抗体（ｂ）及び抗ｇＤ抗体
（ｃ）と共にインキュベーション後に得た免疫沈降タン
パク質のＰＡＧＥ−ゲル電気泳動。
ＢＨＶ−Ｉ（レーン２）及びｇＤ-ｌａｃＺ+ｃｔｃｓ+
ＢＨＶ−Ｉ（レーン３）に感染させた35Ｓ標識細胞を抗
ｇＢ抗体（ａ）、抗ｇＣ抗体（ｂ）及び抗ｇＤ抗体
（ｃ）と共にインキュベーション後に得た免疫沈降タン
パク質のＰＡＧＥ−ゲル電気泳動。
【図４】上段中央写真（ｕ−ｍ）：本発明のｇＤ陰性Ｂ
ＨＶ−Ｉ ｃｔｃｓ+突然変異体によるプラーク形成
（暗細胞）。上段左及び上段右写真（ｕ−ｌ及びｕ−
ｒ）：ｇＤ補充（ｕ−ｌ）及び非補充（ｕ−ｒ）細胞と
ｕ−ｍから得た上清及び死滅細胞との同時培養。 下段中央写真（ｌ−ｍ）：本発明のｇＤ陰性ＢＨＶ−Ｉ
ｃｔｃｓ+突然変異体を含む細胞培養（写真ｕ−ｍ）
の生存細胞子孫と非補充細胞との同時培養。 下段左及び下段右写真：ｇＤ補充（ｌ−ｌ）及び非補充
（ｌ−ｒ）細胞とｌ−ｍからの生存細胞の同時培養。
ＨＶ−Ｉ ｃｔｃｓ+突然変異体によるプラーク形成
（暗細胞）。上段左及び上段右写真（ｕ−ｌ及びｕ−
ｒ）：ｇＤ補充（ｕ−ｌ）及び非補充（ｕ−ｒ）細胞と
ｕ−ｍから得た上清及び死滅細胞との同時培養。 下段中央写真（ｌ−ｍ）：本発明のｇＤ陰性ＢＨＶ−Ｉ
ｃｔｃｓ+突然変異体を含む細胞培養（写真ｕ−ｍ）
の生存細胞子孫と非補充細胞との同時培養。 下段左及び下段右写真：ｇＤ補充（ｌ−ｌ）及び非補充
（ｌ−ｒ）細胞とｌ−ｍからの生存細胞の同時培養。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年１１月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル上で
サイズ分離し、ニトロセルロースに転写した後にｗｔＢ
ＨＶ−Ｉ（レーン１）、ｇＤ−１ａｃＺ＋ＢＨＶ−Ｉ
（レーン２）及びｇＤ−１ａｃＺ＋ｃｔｃｓ＋ＢＨＶ−
１（レーン３）からのＤＮＡを、ｇＤ特異的プローブ
（ａ）、ｇＩ特異的プローブ（ｂ）及び１ａｃＺ特異的
プローブ（ｃ）とハイブリダイズさせた結果を示す電気
泳動写真。
サイズ分離し、ニトロセルロースに転写した後にｗｔＢ
ＨＶ−Ｉ（レーン１）、ｇＤ−１ａｃＺ＋ＢＨＶ−Ｉ
（レーン２）及びｇＤ−１ａｃＺ＋ｃｔｃｓ＋ＢＨＶ−
１（レーン３）からのＤＮＡを、ｇＤ特異的プローブ
（ａ）、ｇＩ特異的プローブ（ｂ）及び１ａｃＺ特異的
プローブ（ｃ）とハイブリダイズさせた結果を示す電気
泳動写真。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】上段中央写真（ｕ−ｍ）：本発明のｇＤ陰性Ｂ
ＨＶ−Ｉ ｃｔｃｓ＋突然変異体によるプラーク形成
（暗細胞）を示した生物の形態写真。上段左及び上段右
写真（ｕ−ｌ及びｕ−ｒ）：ｇＤ補充（ｕ−ｌ）及び非
補充（ｕ−ｒ）細胞とｕ−ｍから得た上清及び死滅細胞
との同時培養。 下段中央写真（ｌ−ｍ）：本発明のｇＤ陰性ＢＨＶ−Ｉ
ｃｔｃｓ＋突然変異体を含む細胞培養（写真ｕ−ｍ）
の生存細胞子孫と非補充細胞との同時培養。 下段左及び上段右写真：ｇ−Ｄ補充（ｌ−ｌ）及び非補
充（ｌ−ｒ）細胞とｌ−ｍからの生存細胞の同時培養。
ＨＶ−Ｉ ｃｔｃｓ＋突然変異体によるプラーク形成
（暗細胞）を示した生物の形態写真。上段左及び上段右
写真（ｕ−ｌ及びｕ−ｒ）：ｇＤ補充（ｕ−ｌ）及び非
補充（ｕ−ｒ）細胞とｕ−ｍから得た上清及び死滅細胞
との同時培養。 下段中央写真（ｌ−ｍ）：本発明のｇＤ陰性ＢＨＶ−Ｉ
ｃｔｃｓ＋突然変異体を含む細胞培養（写真ｕ−ｍ）
の生存細胞子孫と非補充細胞との同時培養。 下段左及び上段右写真：ｇ−Ｄ補充（ｌ−ｌ）及び非補
充（ｌ−ｒ）細胞とｌ−ｍからの生存細胞の同時培養。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 // Ｃ１２Ｎ 5/10
Claims (9)
- 【請求項１】 直接的細胞間伝染特性を示すことを特徴
とするｇＤ陰性ウシヘルペスウイルス突然変異体。 - 【請求項２】 タイプＩ血清型を有する請求項１に記載
の突然変異体。 - 【請求項３】 そのＤＮＡで形質転換され、かつ仏国、
パリに所在のパスツール研究所のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ
Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に受
託番号Ｉ−１４４６で寄託されている大腸菌から単離可
能である８．５ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ制
限フラグメント又は直接的細胞間伝染特性を付与するこ
とが可能なそのサブフラグメントを含むＤＮＡと、ｇＤ
陰性ウシヘルペスウイルスのＤＮＡとの同時トランスフ
ェクションにより獲得可能な、請求項１又は２に記載の
突然変異体。 - 【請求項４】 ｇＤが補充されていることを特徴とする
請求項１から３のいずれか一項に記載の突然変異体。 - 【請求項５】 異種ＤＮＡ配列を有する挿入を含むこと
を特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の突
然変異体。 - 【請求項６】 請求項１から５のいずれか一項に記載の
ウシヘルペスウイルス突然変異体を含む、ウシヘルペス
ウイルス感染に対するウシの防御用ワクチン。 - 【請求項７】 他のウシ病原体の抗原を更に含む請求項
６に記載のワクチン。 - 【請求項８】 請求項６又は７に記載のワクチンを投与
することからなる、ウシヘルペスウイルス感染に対する
動物の防御方法。 - 【請求項９】 そのフラグメントを含むＤＮＡで形質転
換されかつ仏国、パリに所在のパスツール研究所のＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅＣｕｌｔ
ｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ
（ＣＮＣＭ）に受託番号Ｉ−１４４６で寄託されている
大腸菌から単離可能である８．５ｋｂｐＨｉｎｄＩＩＩ
−ＢｇｌＩＩ制限フラグメント。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94202081 | 1994-07-18 | ||
| NL94202081.9 | 1994-07-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08168374A true JPH08168374A (ja) | 1996-07-02 |
Family
ID=8217045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7181986A Pending JPH08168374A (ja) | 1994-07-18 | 1995-07-18 | 直接的細胞間伝染可能なｇＤ陰性ウシヘルペスウイルス突然変異体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5686076A (ja) |
| EP (1) | EP0693551A1 (ja) |
| JP (1) | JPH08168374A (ja) |
| CA (1) | CA2154030A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002008390A2 (en) * | 2000-07-21 | 2002-01-31 | Akzo Nobel N.V. | Bovine wasting syndrome vaccine |
| CN108977413B (zh) * | 2017-06-05 | 2021-02-23 | 华中农业大学 | 一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW289731B (ja) | 1992-07-09 | 1996-11-01 | Akzo Nv | |
| EP0606437B1 (en) | 1992-07-30 | 2005-02-02 | Akzo Nobel N.V. | Non-shedding live herpesvirus vaccine |
-
1995
- 1995-07-14 EP EP95201937A patent/EP0693551A1/en not_active Withdrawn
- 1995-07-17 CA CA002154030A patent/CA2154030A1/en not_active Abandoned
- 1995-07-18 US US08/503,781 patent/US5686076A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-18 JP JP7181986A patent/JPH08168374A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5686076A (en) | 1997-11-11 |
| EP0693551A1 (en) | 1996-01-24 |
| CA2154030A1 (en) | 1996-01-19 |
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