JPH08176190A - ペプチド誘導体と、その用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 特定の化学式を有するペプチド誘導体、この
ペプチド誘導体を有効成分として含有する抗酸化剤、お
よびこのペプチド誘導体を有効成分として含有する抗菌
剤。 【効果】 活性酸素、フリーラジカル、脂質の過酸化に
対し優れた抑制作用を有する抗酸化剤と、細菌、真菌な
どの微生物に対して優れた抗菌作用を有する抗菌剤が提
供される。これらの抗酸化剤、抗菌剤は医薬品および食
品等に使用しても極めて安全である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、ペプチド誘導体と、
その用途に関するものである。さらに詳しくは、この発
明は、医薬品、医薬部外品およびその他の製品等に使用
し得る安全なペプチド誘導体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、種々の疾患の病態にフリーラジカ
ルの関与が明らかとなってきた。人類は、生命の維持に
酸素を必要とするが、その際、生体内では絶えず活性酸
素、フリーラジカルが生成されている。いったん生じた
フリーラジカルは、膜脂質および膜蛋白質の変性を惹起
し、細胞膜を損傷させ、ＤＮＡおよび酵素の変性によ
り、種々の疾病の原因となる。特に細胞膜中の高度不飽
和脂肪酸はフリーラジカルによる攻撃を容易に受け、そ
の結果、有害な過酸化脂質を生成し、さらに細胞障害を
増強させるといわれている（現代医療、第２５巻、第１
６３ページ、１９９３年）。

【０００３】活性酸素が関係する疾病は、火傷、関節炎
等の炎症、再還流障害、抗癌剤の副作用、放射線障害、
消化性潰瘍、細菌性ショック、悪液質、自己免疫疾患等
の広範に存在する。そしてこれらの疾患の予防、治療に
は活性酸素、フリーラジカル、過酸化脂質の抑制が有効
であると考えられている（日経バイオテク編、「日経バ
イオ年鑑」、第３５０ページ、日経ＢＰ、１９９４
年）。

【０００４】一方、従来多くの抗菌剤が開発され、使用
されてきたが、感染症が消滅することはなく、その原因
や症状はなお一層複雑化してきている。特に、感染する
細菌側の薬剤耐性の増加、また宿主側ではコンプロマイ
ズド・ホストの出現によって、依然解決が難しくなって
いる。このため感染症の新しい予防法、治療法が待望さ
れている。

【０００５】その一つにラクトフェリンがある。ラクト
フェリンは、涙、唾液、乳汁等の外分泌液、好中球顆粒
中に含まれている鉄結合蛋白質であり、抗菌性、抗酸化
性、免疫調節作用等の多彩な生理活性を有することが知
られている（アーカイブズ・オブ・ディジーズ・イン・
チャイルドフッド［Archives of Disease in Childhoo
d］、第６７巻、第６５７ページ、１９９２年）。また
ラクトフェリンの分解物、ラクトフェリンに由来するペ
プチド類、これらとホモロジーを有するペプチド類にも
抗菌性、抗酸化性等の作用のあることが知られている。
例えば、ラクトフェリン分解物を有効成分とする抗菌剤
（特開平５−３２００６８号公報）、少なくとも２０個
のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−９
２９９４号公報）、１１個のアミノ酸残基からなる抗菌
性ペプチド（特開平５−７８３９２号公報）、６個のア
ミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−１４８
２９７号公報）、５個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペ
プチド（特開平５−１４８２９６号公報）、３〜６個の
アミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−１４
８２９５号公報）、ラクトフェリン類の分解物、ラクト
フェリン類の分解物から単離されるペプチド、ラクトフ
ェリン類の分解物から単離されるペプチドと同一のアミ
ノ酸配列を有する合成されたペプチドを有効成分とする
抗酸化剤（特開平６−１９９６８７号公報）等である。

【０００６】なお、ペプチドの誘導体については、それ
らが有する単純ペプチドには無い性質を利用して、多く
の目的のために研究されている。ペプチドを誘導体化す
ることによって、活性の増加、プロテアーゼに対する抵
抗性の付与、体内での持続性の増加等が計られている。
例えば、抗酸化および抗炎症活性を有する金属ペプチド
複合体（特表平５−５０３９３９号公報）、虚血性傷害
および再潅流性傷害を抑制するトリペプチドアルギナー
ル誘導体（特開平６−１９９６８２号公報）、皮膚用化
粧品として使用される第４級アンモニウム誘導ペプチド
（特開平４−８２８２２号公報）、標的細胞、ウイル
ス、ウイルス感染細胞に対して生物活性を有する両親媒
性イオンチャンネル形成ペプチドのＮ末端置換ペプチド
（ＷＯ９３／２４１３８）、生物活性を持つ、両親媒性
イオンチャンネル形成ペプチドのＣ末端置換ペプチド
（ＷＯ９２／２２３１７）等が知られている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ラクト
フェリン由来ペプチドについては、誘導体の抗酸化性、
抗菌性等の生理活性は、従来全く知られておらず、従っ
て、これらを有効成分とする抗酸化剤、抗菌剤も存在し
なかった。この発明は、以上の従来技術に鑑みてなされ
たものであり、従来の抗酸化剤、抗菌剤とは全く異な
り、ラクトフェリン由来ペプチドの誘導体を有効成分と
する安全な抗酸化剤、抗菌剤を提供することを目的とし
ている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、特定の化学式で示されるラクト
フェリン由来ペプチドの誘導体、またはこれを有効成分
として含有する抗酸化剤、および抗菌剤を提供する。以
下、この発明について詳しく説明する。

【０００９】この発明において使用するペプチド誘導体
は、公知の方法（例えば、ペプチド自動合成装置を用い
る方法）によって合成して目的とするペプチドを得る方
法、ペプチド合成装置によって合成したペプチドに、有
機合成技術によりアシル基、ポリエチレングリコール等
を付加する方法、またはラクトフェリン類を酸または酵
素を用いて加水分解し、分解物混合物から液体クロマト
グラフィー等の分離手段によって一定のアミノ酸配列を
有するペプチドを含む画分を得た後、有機合成技術を用
いてアシル基、ポリエチレングリコール等を付加する方
法等により調製することができる。

【００１０】この発明のペプチド誘導体の例としてアミ
ノ末端にアセチル基、カルボキシル末端にアミドを有す
るペプチドの製造法を示せば次のとおりである。ペプチ
ドシンセサイザー（ファルマシアLKB バイオテクノロジ
ー社製。LKB Biolynx 4170）を使用し、シェパード等
［ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー・パー
キンＩ(Journal of Chemical Society Perkin Ｉ) 、第
５３８ページ、１９８１年］による固相ペプチド合成法
に基づいて次のとおり合成する。

【００１１】Ｃ末端アミドペプチド合成用固相樹脂（カ
ルビオケム―ノバビオケム社製。NovaSyn KR 0.1meq ）
を用いて、上記ペプチドシンセサイザーの合成プログラ
ムにより脱保護基反応および縮合反応を反復してペプチ
ド鎖を延長する。すなわち、２０％ピペリジン／ジメチ
ルホルムアミド（以下DMF と記載する）によりアミノ保
護基である９−フルオレニルメトキシカルボニル（以下
Fmocと記載する）基を切断除去し、DMF で洗浄した後Fm
oc- アミノ酸活性エステル／N-ヒドロキシベンゾトリア
ゾール（以下HOBtと記載する）を反応させ、DMF で洗浄
する操作を反復する。

【００１２】縮合反応後、必要に応じてカイザーテスト
を行ないカップリングが完全であったことを確認し、次
のステップに進む。使用するアミノ酸は、Fmoc-Arg(Mt
r)-Opfp、Fmoc-Lys(Boc)-Opfp、Fmoc-Trp(Boc)-Opfp、F
moc-Gln-Opfp 、Fmoc-Met-Opfp （いずれもカルビオケ
ム―ノバビオケム社製）で０．５mmolのカートリッジを
用いる。ペプチド鎖の伸張反応が全て終了した後、２０
％ピペリジン／DMF によりFmoc基を切断し、DMF で洗浄
後１０％無水酢酸／DMF でアセチル化を行なう。カイザ
ーテストによりアセチル化が完了したことを確認し、の
ち樹脂をDMF 、tert−ペンチルアルコール、酢酸、tert
−ペンチルアルコール、DMF 、ジエチルエーテルの順に
よく洗浄し、真空乾燥する。

【００１３】上記の保護ペプチド樹脂にエタンジチオー
ル、チオアニソールを室温でアルゴン気流下攪拌した
後、氷冷下で、さらに攪拌する。これにトリフルオロ酢
酸を加え攪拌し、トリメチルシリルブロミドを加えて攪
拌する。グラスフィルターで樹脂を濾去し、濾液を手早
く減圧濃縮する。残査にあらかじめ冷却したジエチルエ
ーテルを添加し、ペプチドを白色粉末化する。遠沈管に
移して遠心分離し、上清を捨て、冷ジエチルエーテルを
新たに加えてよく攪拌し、再び遠心分離する操作を４回
反復する。ペプチド沈殿物を真空乾燥し、水に溶解して
凍結乾燥を行ない粗製ペプチドを得る。

【００１４】上記粗製ペプチドを水に溶解し、遠心分離
し、上清を０．４５mmフィルターで濾過する。この溶液
を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供し、ペプチ
ドの精製を行なう。HPLCはガリバーPU-986高圧グラジエ
ントシステム（日本分光製）を用い、カラムは逆相系の
Lichrospher100RP-18(e)250x10mm（メルク社製）を用い
る。溶離液は０．１％TFA ／水をＡ液、８０％アセトニ
トリル／Ａ液をＢ液として、Ａ液からＢ液への濃度直線
勾配により溶出する。クロマトグラムのピークはほぼ単
一であり、相当画分を分取する。分取を数回繰り返し、
これらを凍結乾燥して精製ペプチドを得る。

【００１５】これを分析用カラム（Lichrospher100RP-1
8(e)250x4.6mm 。メルク社製）を用いてHPLC分析を行な
い、精製物が単一であることをさらに確認する。また、
精製ペプチドの構造確認は、常法のアミノ酸分析、アミ
ノ酸配列分析、元素分析、質量分析等を実施し、目的の
ペプチドが得られていることを確認する。ラクトフェリ
ン類の加水分解等で得られたペプチドにポリエチレング
リコール、アシル基等を付加する方法の例を示せば次の
とおりである。

【００１６】CH₃ (OCH₂ CH₂ )n-OH[ポリサイエンス社
製。モノメトキシポリエチレングリコール（以下mPEGと
記載する）] に無水酢酸を作用させてmPEG-COOH を得
る。これにN-ヒドロキシスクシンイミドとジシクロヘキ
シルカルボジイミドを作用させ、mPEGのN-ヒドロキシス
クシンイミドエステルを合成する。ラクトフェリン類由
来のペプチドフラグメントにmPEGスクシンイミドエステ
ルを作用させポリエチレングリコール修飾体を得る。ま
た上記と同様の方法により、CH₃ (CH ₃ )n-COOH から脂
肪酸スクシンイミドエステルを得る。これをラクトフェ
リン類由来のペプチドフラグメントに作用させアシル体
を得る。ここでポリエチレングリコールおよびアシル基
の分子量には特に制限はない。

【００１７】この発明のペプチド誘導体は、医薬品とし
てのみならず、食品、飼料、化粧品等の人または動物の
体内に取り入れられ、または体表面に適用される製品、
その他一般に活性酸素、フリーラジカル、脂質の過酸化
の抑制、細菌、真菌等の微生物の抑制、殺菌が望まれる
あらゆる製品に配合して使用することができ、さらにこ
の発明ペプチド誘導体でそれらの製品または原料素材を
処理することができる。すなわち、この発明ペプチド誘
導体は、そのまま人または動物に投与することができ、
または医薬品（例えば、各種疾患予防薬、各種疾患治療
薬、抗菌剤等）、食品（例えば、調製粉乳、経腸栄養
剤、チュウインガム等）、医薬部外品（例えば、洗口
剤、健康飲料等）、各種化粧品（例えば、クリ−ム、乳
液、日焼け防止用化粧品、皮膚老化予防化粧品等）、そ
れらの原料となる素材、その他一般に活性酸素、フリー
ラジカル、脂質の過酸化の抑制、細菌、真菌等の微生物
の抑制、殺菌が望まれるあらゆる物品に添加、配合、噴
霧、付着、被覆、含浸等を行なってもよく、またその他
一般に活性酸素・フリーラジカル、脂質の過酸化の抑
制、細菌、真菌等の微生物の抑制、殺菌が望まれるあら
ゆる物品の処理に用いることができる。なお、公知の抗
酸化剤、抗菌剤と併用することもできる。

【００１８】次に試験例を示してこの発明をさらに詳し
く説明する。 試験例１ この試験は、各種化合物の抗酸化作用を調べるために行
った。 １）試料の調製 次に示す８種類の試料を調製した。 試料１：ウシラクトフェリンの酵素分解から参考例記載
の方法により調製した配列番号４に記載のペプチド 試料２：アミノ末端がアセチル化し、カルボキシル末端
がアミド化し、実施例１記載の方法により調製した次の
化１のペプチド誘導体

【００１９】

【化１】

【００２０】試料３：アミノ末端に炭素鎖数１８のアシ
ル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例
２記載の方法により調製した次の化２のペプチド誘導体

【００２１】

【化２】

【００２２】試料４：アミノ末端に炭素鎖数１６のアシ
ル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例
３記載の方法により調製した次の化３のペプチド誘導体

【００２３】

【化３】

【００２４】試料５：アミノ末端に炭素鎖数１４のアシ
ル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例
４記載の方法により調製した次の化４のペプチド誘導体

【００２５】

【化４】

【００２６】試料６：アミノ末端に炭素鎖数１０のアシ
ル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例
５記載の方法により調製した次の化５のペプチド誘導体

【００２７】

【化５】

【００２８】試料７：アミノ末端に炭素鎖数６のアシル
基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例６
記載の方法により調製した次の化６のペプチド誘導体

【００２９】

【化６】

【００３０】試料８：アミノ末端がアセチル化し、カル
ボキシル末端にポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと
記載する）が結合し、実施例７記載の方法により調製し
た次の化７のペプチド誘導体

【００３１】

【化７】

【００３２】２）試験方法 グッテリッジの方法［アナリティカル・バイオケミスト
リー（Analytical Biochemistry ）、第８２巻、第７６
ページ、１９７７年］を、次に記載するように一部変更
し、各試料の抗酸化効果を試験した。ナス型フラスコ
に、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）２
０ｍｌ、卵黄リン脂質（ナカライテスク社製）１００ｍ
ｇ、およびグラスビーズを添加し、窒素で置換し、３７
℃でボルテックスにより５分間撹拌した。４℃で１時間
保持した後、上清をリポソーム溶液として使用した。

【００３３】０．５ｍｌのリポソーム溶液を１０ｍｌ容
プラスチック・チューブに分注し、７倍濃度の試料溶液
を１００μｌ、１１２μＭのＦｅＮＨ₄ （ＳＯ₄ ）₂ ・
１２Ｈ₂ Ｏ（ナカライテスク社製）を５０μｌ、５３２
μＭのアスコルビン酸（ナカライテスク社製）５０μｌ
を添加し、５秒間撹拌する。チューブにキャップをし
て、３７℃で１時間インキュベートする。２．９ＭのＨ
Ｃｌに溶解した１％亜ヒ酸ナトリウム（和光純薬社製）
を３ｍｌ加え、混合して、４０００ｒｐｍで１５分間遠
心する。清浄な溶液部分を３ｍｌ取り、０．０５ＭのＮ
ａＯＨに溶解した１％チオバルビツール酸（ナカライテ
スク社製）を１ｍｌ加えて、沸騰水中で１５分間加熱す
る。冷却後、０．４５μＭフィルター（アドバンテック
社製）で濾過する。５３２ｎｍで濾液の吸光度を測定
し、リポソームリン脂質の過酸化度を求めた。なお、試
料溶液の代わりに蒸留水を１００μｌ添加したものを対
照とした。

【００３４】試料の酸化抑制率（％）を次式により計算
した。 酸化抑制率＝［（対照の吸光度−試料の吸光度）／対照
の吸光度］×１００ ３）試験結果 この試験の結果は表１に示すとおりである。表１から明
らかなように、１００μｇ／ｍｌの濃度において、試料
２から試料８は、試料１より強い酸化抑制効果を示し
た。また、試料３から試料７は１０μｇ／ｍｌ、試料３
から試料６は１μｇ／ｍｌの低濃度においても酸化抑制
作用を示した。なお、ペプチド誘導体の種類を変更して
同様の試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。

【００３５】

【表１】

【００３６】試験例２ この試験は、各種化合物の抗菌作用を調べるために行っ
た。 １）試料の調製 次に示す８種の試料を調製した。 試料１：試験例１の試料１と同一のもの 試料２：カルボキシル末端がアミド化し、実施例８記載
の方法により調製した次の化８のペプチド誘導体

【００３７】

【化８】

【００３８】試料３：アミノ末端にアセチル基が結合
し、カルボキシル末端がアミド化し、かつ全てのアミノ
酸がＤ体であり、実施例９記載の方法により調製した次
の化９のペプチド誘導体

【００３９】

【化９】

【００４０】 試料４：試験例１の試料３と同一のもの 試料５：試験例１の試料４と同一のもの 試料６：試験例１の試料５と同一のもの 試料７：試験例１の試料６と同一のもの 試料８：試験例１の試料７と同一のもの ２）試験方法 滅菌した１％バクト・ペプトン（ディフコ社製）に上記
試料を、最終濃度２００、１００、５０、２５、１２、
６および３μｇ／ｍｌで添加し、対数増殖期のEscheric
hia coli O111 またはEscherichia coli IID-861を培地
中菌数１０⁶ 細胞／ｍｌの割合で添加し、３７℃で１７
時間培養した。菌の増殖が肉眼的に全く認められない最
小濃度をその試料の最小発育阻止濃度（以下ＭＩＣと記
載する）とした。 ３）試験結果 この試験の結果は表２に示すとおりである。表２から明
らかなように、試料２から試料８は、試料１と同等か、
または２分の１以下のＭＩＣを示し、強い抗菌効果が認
められた。なお、ペプチド誘導体の種類を変更して同様
の試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。

【００４１】

【表２】

【００４２】試験例３ この試験は、各種化合物のプロテアーゼに対する抵抗性
を調べるために行った。１）試料の調製 次に示す３種の試料を調製した。 試料１：試験例１の試料１と同一のもの 試料２：カルボキシル末端がアミド化し、アミノ末端か
ら２残基目のアミノ酸がＤ体であって、他のアミノ酸が
全てＬ体であり、実施例１０記載の方法により調製した
次の化１０のペプチド誘導体

【００４３】

【化１０】

【００４４】試料３：試験例２の試料３と同一のもの ２）試験方法 ペプチド誘導体のトリプシンによる処理 １００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．
１）に、試料およびトリプシン（タイプＩＸ。シグマ社
製）を、それぞれ最終濃度９００および５０μｇ／ｍｌ
の割合で添加し、３７℃で１時間インキュベートし、８
０℃で１０分間熱処理することでトリプシンを失活させ
た。 白癬菌産生プロテアーゼの誘導 Trichophyton mentagrophytes TIMM-1189 を培地［２％
ケラチン粉末、１．２％イースト・カーボン・ベイス
（ディフコ社製）、０．００５％イノシトール、０．０
０１％チアミンおよび０．００１％ピリドキシンからな
る］で、２７℃、１０日間、振とう培養し、ウシアルブ
ミンを基質としてプロテアーゼが誘導されていることを
確認し、のちフィルター濾過し、白癬菌産生プロテアー
ゼ液とした。ペプチド誘導体の白癬菌産生プロテアー
ゼ液による処理 ２分の１に希釈した白癬菌産生プロテアーゼ液に、試料
を最終濃度５００μｇ／ｍｌの割合で添加し、３７℃で
１時間インキュベートし、８０℃で１０分間熱処理し、
白癬菌産生プロテアーゼを失活させた。 プロテアーゼで処理したペプチド誘導体の抗菌活性の
測定 プロテアーゼで処理したペプチド誘導体のEscherichia
coli O111 に対する抗菌性を、試験例２と同一の方法に
より測定した。 ３）試験結果 この試験の結果は表３に示すとおりである。表３から明
らかなように、試料１はトリプシンおよび白癬菌産生プ
ロテアーゼによって完全に失活したが、試料２は活性が
若干残り、また試料３は、プロテアーゼ処理後でも活性
が完全に保持されていた。なお、ペプチド誘導体の種類
を変更して同様の試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得
られた。

【００４５】

【表３】

【００４６】試験例４ この試験は、各種ペプチド誘導体の急性毒性を調べるた
めに行った。 １）使用動物 ６週齢のＣＤ（ＳＤ）系のラット（日本ＳＬＣから購
入）の両性を用い、雄および雌を無作為にそれぞれ４群
（１群５匹）に分けて使用した。 ２）試験方法 体重１ｋｇ当たり１０００および２０００ｍｇの割合で
実施例１と同一の方法を反復して製造したペプチド誘導
体を注射用水（大塚製薬社製）に溶解し、体重１００ｇ
当たり４ｍｌの割合で金属製玉付き針を用いて単回強制
経口投与し、急性毒性を試験した。 ３）試験結果 このペプチド誘導体を１０００ｍｇ／ｋｇ体重および２
０００ｍｇ／ｋｇ体重の割合で投与した群に死亡例は認
められなかった。従って、このペプチド誘導体のＬＤ５
０は、２０００ｍｇ／ｋｇ体重以上であり、毒性は極め
て低いことが判明した。なお、他のペプチド誘導体につ
いても同様の試験を行ったがほぼ同様の結果が得られ
た。 参考例 市販の牛ラクトフェリン（シグマ社製）５０ｍｇを精製
水０．９ｍｌに溶解し、０．１Ｎの塩酸でｐＨを２．５
に調整し、のち市販の豚ペプシン（シグマ社製）１ｍｇ
を添加し、３７℃で６時間加水分解した。次いで０．１
Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整し、８０℃
で１０分間加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、１
５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、透明な上清を
得た。この上清１００μｌをＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０
Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィ−
にかけ、０．８ｍｌ／分の流速で試料注入後１０分間
０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む２０％ア
セトニトリルで溶出し、のち３０分間０．０５％ＴＦＡ
を含む２０〜６０％のアセトニトリルのグラジエントで
溶出し、２４〜２５分の間に溶出する画分を集め、真空
乾燥した。この乾燥物を２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で精製水
に溶解し、再度ＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー社
製）を用いた高速液体クロマトグラフィ−にかけ、０．
８ｍｌ／分の流速で試料注入後１０分間０．０５％ＴＦ
Ａを含む２４％アセトニトリルで溶出し、のち３０分間
０．０５％ＴＦＡを含む２４〜３２％のアセトニトリル
のグラジエントで溶出し、３３．５〜３５．５分の間に
溶出する画分を集めた。上記の操作を２５回反復し、真
空乾燥し、ペプチド約１．５ｍｇを得た。

【００４７】上記のラクトフェリン由来ペプチドを６Ｎ
塩酸で加水分解し、アミノ酸分析計を用いて常法により
アミノ酸組成を分析した。同一の試料を気相シ−クェン
サ−（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて２
５回のエドマン分解を行ない、２５個のアミノ酸残基の
配列を決定した。またＤＴＮＢ（５，５−ジチオ−ビス
（２−ニトロベンゾイック・アシド））を用いたジスル
フィド結合分析法［アナリティカル・バイオケミストリ
−（Analytical Biochemistry ）、第６７巻、第４９３
ページ、１９７５年］によりジスルフィド結合が存在す
ることを確認した。

【００４８】その結果、このペプチドは、２５個のアミ
ノ酸残基からなり、３番目と２０番目のシステイン残基
がジスルフィド結合し、３番目のシステイン残基からＮ
−末端側に２個のアミノ酸残基が、２０番目のシステイ
ン残基からＣ−末端側に５個のアミノ酸が、それぞれ結
合した配列番号４に記載のアミノ酸配列を有しているこ
とが確認された。

【００４９】次に実施例を示してこの発明をさらに詳細
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定さ
れるものではない。

【００５０】

【実施例】

実施例１ ペプチドシンセサイザー（ファルマシアLKB バイオテク
ノロジー社製。LKB Biolynx 4170）を使用し、シェパー
ド等の方法［ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエテ
ィー・パーキンＩ(Journal of Chemical Society Perki
n Ｉ) 、第５３８ページ、１９８１年］による固相ペプ
チド合成法に基づいて、ペプチド誘導体を次のようにし
て合成した。

【００５１】Ｃ末端アミドペプチド合成用固相樹脂（カ
ルビオケム―ノバビオケム社製。 NovaSyn KR 0.1meq）
１ｇを用いて、上記ペプチドシンセサイザーの合成プロ
グラムにより脱保護基反応及び縮合反応を繰り返してペ
プチド鎖を延長した。すなわち、２０％ DMFによりアミ
ノ保護基であるFmoc基を切断除去し、DMF で洗浄し、の
ち Fmoc-アミノ酸活性エステル／N-ヒドロキシベンゾト
リアゾール（以下HOBtと記載する）各０．５mmolを反応
させ、DMF で洗浄する操作を反復した。縮合反応後、必
要に応じてカイザーテストを行ないカップリングが完全
であったことを確認し、次のステップに進んだ。使用し
たアミノ酸は、Fmoc-Lys(Boc)-Opfp、Fmoc-Trp(Boc)-Op
fp、Fmoc-Gln-Opfp およびFmoc-Met-Opfp （いずれもカ
ルビオケム―ノバビオケム社製）で０．５mmolのカート
リッジを用いた。ペプチド鎖の伸張反応が全て終了した
後、２０％ピペリジン／DMF によりFmoc基を切断し、DM
Fで洗浄後１０％無水酢酸／DMF でアセチル化を行なっ
た。カイザーテストによりアセチル化が完了したことを
確認した後、樹脂をDMF 、tert−ペンチルアルコール、
酢酸、tert−ペンチルアルコール、DMF 、ジエチルエー
テルの順によく洗浄し、真空乾燥した。

【００５２】上記の保護ペプチド樹脂５７１mgにエタン
ジチオール１．０ml、m-クレゾール２００μl 、チオア
ニソール２．４mlを室温、アルゴン気流下１５分間攪拌
し、のち氷冷下でさらに１０分間攪拌した。これにトリ
フルオロ酢酸１５mlを添加して１０分間攪拌し、トリメ
チルシリルブロミド２．６mlを加えて５０分間攪拌し
た。グラスフィルターで樹脂を濾去し、濾液を手早く減
圧濃縮した。残査に予め冷却したジエチルエーテルを加
えてペプチドを白色粉末化した。遠沈管に移し、遠心分
離（２５００rpm 、５分間）し、上清を廃棄し、冷ジエ
チルエーテルを新たに加えてよく攪拌し、再び遠心分離
する操作を４回反復した。ペプチド沈殿物を真空乾燥
し、水に溶解して凍結乾燥を行ない粗製ペプチド６２．
５mgを得た。

【００５３】上記粗製ペプチドを水に溶解し、遠心分離
（１５０００rpm 、５分間）を行ない、上清を０．４５
mmフィルターで濾過し、この溶液を高速液体クロマトグ
ラフィー（HPLC）に供し、ペプチドの精製を行なった。
HPLCはガリバーPU-986高圧グラジエントシステム（日本
分光製）を用い、カラムは逆相系の市販カラム（メルク
社製。Lichrospher100RP-18(e)250x10mm）を用いた。溶
離液は０．１％TFA ／水をＡ液、８０％アセトニトリル
／Ａ液をＢ液として、Ａ液からＢ液への濃度直線勾配に
より溶出した。クロマトグラムはほぼ単一のピークと認
められ、相当する画分を分取した。この分取操作を数回
反復し、凍結乾燥し、精製ペプチド２８．５mgを得た。

【００５４】これを分析用カラム（メルク社製。Lichro
spher100RP-18(e)250x4.6mm ）によりHPLC分析を行な
い、精製物が単一であることをさらに確認した。また、
精製ペプチドの構造確認は、常法のアミノ酸分析、アミ
ノ酸配列分析、元素分析、質量分析等を実施し、目的と
する次の化１１に示すペプチド誘導体が得られているこ
とを確認した。

【００５５】

【化１１】

【００５６】実施例２ 実施例１と同様の操作を行なったが、アシル基導入方法
としてスクシンイミドエステルを用いる方法により、ペ
プチド誘導体を次のとおり合成した。ステアリン酸
［（CH₃ (CH ₂ ) ₁₆COOH］２．８ｇをジクロロメタンに
溶解させ、これにＮ−ヒドロキシスクシンイミド１．２
ｇのDMF 溶液とジシクロヘキシルカルボジイミド２．３
ｇのジクロロメタン溶液を加え室温で５時間攪拌した。
反応進行を薄層クロマトグラフィーにてモニターし、完
全に反応が終了したことを確認した。副生成物のジシク
ロヘキシルウレアを濾去し、減圧濃縮し、残査にジエチ
ルエーテルを加え遠沈管に移し遠心分離（２５００rpm
、５分間）を行なった。上清を捨て新たにジエチルエ
ーテルを加え良く攪拌し遠心分離の操作を２回繰り返し
た。グラスロートで濾取し真空乾燥しステアリン酸スク
シンイミドエステルを２．０ｇ得た。ペプチドシンセサ
イザーで合成した保護ペプチド樹脂（Ｎ端アミノ基フリ
ー、０．１mmolスケール）にステアリン酸スクシンイミ
ドエステル３８２mgのDMF 溶液を加え室温で５時間反応
させた。カイザーテストで完全にアシル化されているこ
とを確認した。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は１．
１３ｇであった。脱保護・脱樹脂後の粗製ペプチドの収
量は１８１mgであり、次の化１２に示す精製したペプチ
ド誘導体約９８mgを得た。

【００５７】

【化１２】

【００５８】実施例３ 実施例１と同様の操作を行なったが、アシル基導入方法
は縮合剤を用い、次のとおり行なった。パルミチン酸
（CH₃ (CH ₂ ) ₁₄COOH）１５４mg、HBTU[2-(1H-benzotr
iazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorop
hosphate] ２２８mg、HOBt９２mgをDMF に溶解し、DIEA
( ジイソプロピルエチルアミン）１０５μl を加えた混
合溶液をペプチドシンセサイザーで合成した保護ペプチ
ド樹脂（Ｎ端アミノ基フリー、６０μmol スケール）に
加え、室温で１時間攪拌し、のちカイザーテストで完全
にアシル化されていることを確認した。アシル化保護ペ
プチド樹脂の収量は４７６mg、脱保護・脱樹脂後の粗製
ペプチドの収量は１０３mgであり、次の化１３に示す精
製したペプチド誘導体約４６mgを得た。

【００５９】

【化１３】

【００６０】実施例４ 実施例３と同様の操作を行なった。アシル化保護ペプチ
ド樹脂の収量は４４４mg、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプ
チドの収量は９２mgであり、次の化１４に示す精製した
ペプチド誘導体約４７mgを得た。

【００６１】

【化１４】

【００６２】実施例５ 実施例３と同様の操作を行なった。アシル化保護ペプチ
ド樹脂の収量は４９３mg、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプ
チドの収量は１０１mgであり、次の化１５に示す精製し
たペプチド誘導体約５３mgを得た。

【００６３】

【化１５】

【００６４】実施例６ 実施例３と同様の操作を行なった。アシル化保護ペプチ
ド樹脂の収量は４９３mg、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプ
チドの収量は１０５mgであり、次の化１６に示す精製し
たペプチド誘導体約５７mgを得た。

【００６５】

【化１６】

【００６６】実施例７ 実施例１と同様の操作を行なった。ただし、固相樹脂は
TantaGel-NH₂ ［島津製作所社製、ポリエチレングリコ
ール（以下ＰＥＧと記載する）―スペーサー部分分子
量：３０００）を用いた。保護ペプチド樹脂の収量は４
８４mgであり、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量
は３１１mgであり、次の化１７に示す精製したペプチド
誘導体約１３２mgを得た。

【００６７】

【化１７】

【００６８】実施例８ 実施例１と同様の操作を行なった。保護ペプチド樹脂の
収量は５６２mgであり、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチ
ドの収量は６２mgであり、次の化１８に示す精製したペ
プチド誘導体約２９mgを得た。

【００６９】

【化１８】

【００７０】実施例９ 実施例１と同様の操作を行なった。ただし、ペプチド結
合形成反応はHBTU/HOBt 縮合剤を用いる方法を採用し
た。従って、ペプチドシンセサイザーのアミノ酸導入は
マニュアルで行なった。アミノ酸は、Fmoc-D-Arg(Mtr)-
OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-D
-Gln-OH およびFmoc-D-Met-OH （いずれも渡辺化学工業
社製）を用いた。保護ペプチド樹脂の収量は５０２mgで
あり、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は５７mg
であり、次の化１９に示す精製したペプチド誘導体約３
２mgを得た。

【００７１】

【化１９】

【００７２】実施例１０ 実施例１と同様の操作を行なった。ただし、Ｎ端から２
番目のアミノ酸Arg の導入はＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ縮合剤
を用いる実施例９と同様の方法で行なった。アミノ酸
は、Fmoc-Arg(Mtr)-Opfp、Fmoc-Trp(Boc)-Opfp、Fmoc-G
ln-Opfp （いずれもカルビオケム−ノボビオケム社
製）、Ｎ端から２番目のアミノ酸としてFmoc-D-Arg(Mt
r)-OH（渡辺化学工業社製）を用いた。保護ペプチド樹
脂の収量は１８８mgであり、脱保護、脱樹脂後の粗製ペ
プチドの収量は１４mgであり、次の化２０に示す精製し
たペプチド誘導体約８mgを得た。

【００７３】

【化２０】

【００７４】実施例１１ 常法により次の組成の錠剤を製造した。 乳糖 ７９．４５（％） 実施例２のペプチド誘導体 ０．５５ ステアリン酸マグネシウム ２０．００ 実施例１２ 常法により次の組成の注射剤を製造した。

【００７５】 実施例９のペプチド誘導体 １．２０（％） 界面活性剤 ８．００ 生理食塩水 ９０．８０ 実施例１３ 常法により次の組成のチュ−インガムを製造した。

【００７６】 ガムベ−ス ２５．００（％） 炭酸カルシウム ２．００ 香料 １．００ 実施例１のペプチド誘導体 ０．１０ ソルビト−ル粉末 ７１．９０ 実施例１４ 常法により次の組成のハンドローションを製造した。

【００７７】 カーボワックス１５００ ９．００（％） アルコール ４．００ プロピレングリコール ４７．００ 香料 ０．５０ 実施例７のペプチド誘導体 ０．４０ 蒸留水 ３９．１０

【００７８】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、活性酸素、フリーラジカル、脂質の過酸化に対
し優れた抑制作用を有する抗酸化剤と、細菌、真菌など
の微生物に対して優れた抗菌作用を有する抗菌剤が提供
される。これらの抗酸化剤、抗菌剤は医薬品および食品
等に使用しても極めて安全である。

【００７９】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：２ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：３ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe 20 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＺ ＡＥＤ Ｃ０７Ｋ 14/79 Ｃ０９Ｋ 15/22 (72)発明者 高瀬 光徳 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者 ウェイン ベラミー 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者 箸本 弘一 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 若林 裕之 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者 松本 宏志 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 中村 浩彦 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社栄養科学研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の一般式ａ）、ｂ）またはｃ） ａ）Ｒ₁ −Ｘ ｂ）Ｘ−Ｒ₂ ｃ）Ｒ₁ −Ｘ−Ｒ₂ （前記化学式においてＲ₁ は、アセチル基、アシル基ま
   たはポリエチレングリコールを示し、Ｘは、Ｄ体または
   Ｌ体のアミノ酸からなる配列番号１ないし配列番号３の
   いずれかに記載のアミノ酸配列を有するペプチドであ
   り、Ｒ₂ は、アミノ基、アシル基またはポリエチレング
   リコールを示す）で示されるペプチド誘導体。
2. 【請求項２】 次の一般式ａ）、ｂ）またはｃ） ａ）Ｒ₁ −Ｘ ｂ）Ｘ−Ｒ₂ ｃ）Ｒ₁ −Ｘ−Ｒ₂ （前記化学式においてＲ₁ は、アセチル基、アシル基ま
   たはポリエチレングリコールのいずれかを示し、Ｘは、
   Ｄ体またはＬ体のアミノ酸からなる配列番号１ないし配
   列番号３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するペプ
   チドであり、Ｒ₂は、アミノ基、アシル基またはポリエ
   チレングリコールを示す）で示されるペプチド誘導体を
   有効成分として含有する抗酸化剤。
3. 【請求項３】 ペプチド誘導体が、少なくとも１μｇ／
   ｍｌ含有されている請求項２の抗酸化剤。
4. 【請求項４】 次の一般式ａ）、ｂ）またはｃ） ａ）Ｒ₁ −Ｘ ｂ）Ｘ−Ｒ₂ ｃ）Ｒ₁ −Ｘ−Ｒ₂ （前記化学式においてＲ₁ は、アセチル基、アシル基ま
   たはポリエチレングリコールのいずれかを示し、Ｘは、
   Ｄ体またはＬ体のアミノ酸からなる配列番号１ないし配
   列番号３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するペプ
   チドであり、Ｒ₂は、アミノ基、アシル基またはポリエ
   チレングリコールのいずれかを示す）で示されるペプチ
   ド誘導体を有効成分として含有する抗菌剤。
5. 【請求項５】 ペプチド誘導体が、少なくとも１μｇ／
   ｍｌ含有されている請求項４の抗菌剤。