JPH08187100A - 分泌蛋白質のｎ末端配列決定法 - Google Patents
分泌蛋白質のｎ末端配列決定法Info
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 分泌蛋白質の分泌後のＮ末端配列を簡単に決
定する方法を提供する。 【構成】 分泌蛋白質の分泌シグナル配列を含むＮ末端
ペプチドをコードするＤＮＡ断片を、マーカー蛋白質を
コードする遺伝子の上流に挿入したのち、該融合遺伝子
を動物細胞に導入して該融合蛋白質を発現させ、培養液
中に分泌された融合蛋白質を精製後、精製された融合蛋
白質のＮ末端配列を決定することによって、分泌蛋白質
の分泌後のＮ末端配列を決定する方法。 【効果】 上記の方法により、医薬として有用な分泌蛋
白質が分泌された後、どのようなＮ末端配列を有してい
るかを、該分泌蛋白質を単離精製することなく、そのｃ
ＤＮＡを用いて容易に決定することができる。
定する方法を提供する。 【構成】 分泌蛋白質の分泌シグナル配列を含むＮ末端
ペプチドをコードするＤＮＡ断片を、マーカー蛋白質を
コードする遺伝子の上流に挿入したのち、該融合遺伝子
を動物細胞に導入して該融合蛋白質を発現させ、培養液
中に分泌された融合蛋白質を精製後、精製された融合蛋
白質のＮ末端配列を決定することによって、分泌蛋白質
の分泌後のＮ末端配列を決定する方法。 【効果】 上記の方法により、医薬として有用な分泌蛋
白質が分泌された後、どのようなＮ末端配列を有してい
るかを、該分泌蛋白質を単離精製することなく、そのｃ
ＤＮＡを用いて容易に決定することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、分泌蛋白質の分泌後の
Ｎ末端配列を決定する方法に関する。この方法により、
医薬として有用な分泌蛋白質が分泌された後、どのよう
なＮ末端配列を有しているかを容易に決定することがで
きる。
Ｎ末端配列を決定する方法に関する。この方法により、
医薬として有用な分泌蛋白質が分泌された後、どのよう
なＮ末端配列を有しているかを容易に決定することがで
きる。
【０００２】
【従来の技術】細胞が生産している生理活性蛋白質は、
医薬、診断薬、バイオセンサー、バイオリアクターな
ど、産業界で広く利用されている。中でも分泌蛋白質は
医薬品として有望なものが多い。たとえば、インターフ
ェロン、エリスロポイエチン、血栓溶解剤など現在市販
されている蛋白質医薬の多くは分泌蛋白質である。
医薬、診断薬、バイオセンサー、バイオリアクターな
ど、産業界で広く利用されている。中でも分泌蛋白質は
医薬品として有望なものが多い。たとえば、インターフ
ェロン、エリスロポイエチン、血栓溶解剤など現在市販
されている蛋白質医薬の多くは分泌蛋白質である。
【０００３】分泌蛋白質はそのＮ末端にシグナル配列と
呼ばれる疎水的な約２０アミノ酸残基からなる配列を有
している。このシグナル配列の働きによって小包体中に
蛋白質が移動した後、シグナルペプチダーゼの作用によ
りシグナル配列が切断・除去される。したがって実際に
分泌された蛋白質は、シグナル配列を有していない。こ
の様な分泌蛋白質を医薬として用いる際、分泌された後
の蛋白質のＮ末端の配列を知る必要がある。従来、分泌
蛋白質のＮ末端配列を決定するためには、目的とする蛋
白質を血清中から単離するか、あるいは目的蛋白質をコ
ードしている遺伝子を動物培養細胞内で発現させ、分泌
蛋白質を単離精製した後、そのＮ末端配列を決定する方
法がとられてきた。しかし、分泌された蛋白質を大量に
単離精製して、そのＮ末端配列を決定するのは困難であ
った。
呼ばれる疎水的な約２０アミノ酸残基からなる配列を有
している。このシグナル配列の働きによって小包体中に
蛋白質が移動した後、シグナルペプチダーゼの作用によ
りシグナル配列が切断・除去される。したがって実際に
分泌された蛋白質は、シグナル配列を有していない。こ
の様な分泌蛋白質を医薬として用いる際、分泌された後
の蛋白質のＮ末端の配列を知る必要がある。従来、分泌
蛋白質のＮ末端配列を決定するためには、目的とする蛋
白質を血清中から単離するか、あるいは目的蛋白質をコ
ードしている遺伝子を動物培養細胞内で発現させ、分泌
蛋白質を単離精製した後、そのＮ末端配列を決定する方
法がとられてきた。しかし、分泌された蛋白質を大量に
単離精製して、そのＮ末端配列を決定するのは困難であ
った。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、分泌
蛋白質の分泌後のＮ末端配列を簡単に決定する方法を提
供することである。
蛋白質の分泌後のＮ末端配列を簡単に決定する方法を提
供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、任意のシグナル配列ペプチドをコードするＤＮ
Ａ断片を、マーカー蛋白質の遺伝子と融合させたのち、
動物細胞に導入すると、ＤＮＡ断片がコードする蛋白質
とマーカー蛋白質の融合蛋白質が培養液に分泌されるこ
とを見いだし、これを利用することによって、培養液中
に分泌された融合蛋白質をマーカー蛋白質の親和性を利
用して精製後、精製された融合蛋白質のＮ末端配列を決
定する方法を構築し、本発明を完成した。
の結果、任意のシグナル配列ペプチドをコードするＤＮ
Ａ断片を、マーカー蛋白質の遺伝子と融合させたのち、
動物細胞に導入すると、ＤＮＡ断片がコードする蛋白質
とマーカー蛋白質の融合蛋白質が培養液に分泌されるこ
とを見いだし、これを利用することによって、培養液中
に分泌された融合蛋白質をマーカー蛋白質の親和性を利
用して精製後、精製された融合蛋白質のＮ末端配列を決
定する方法を構築し、本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、任意の分泌蛋白質の
分泌シグナル配列を含むＮ末端ペプチドをコードするＤ
ＮＡ断片を、マーカー蛋白質をコードする遺伝子の上流
に挿入したのち、該融合遺伝子を動物細胞に導入し、次
いで該動物細胞を培養して前記ＤＮＡ断片によりコード
される蛋白質と前記マーカー蛋白質との融合蛋白質を発
現させ、培養液中に分泌された該融合蛋白質をそのマー
カー蛋白質を指標として精製後、精製された融合蛋白質
のＮ末端配列を決定することを特徴とする、分泌蛋白質
の分泌後のＮ末端配列を決定する方法を提供する。
分泌シグナル配列を含むＮ末端ペプチドをコードするＤ
ＮＡ断片を、マーカー蛋白質をコードする遺伝子の上流
に挿入したのち、該融合遺伝子を動物細胞に導入し、次
いで該動物細胞を培養して前記ＤＮＡ断片によりコード
される蛋白質と前記マーカー蛋白質との融合蛋白質を発
現させ、培養液中に分泌された該融合蛋白質をそのマー
カー蛋白質を指標として精製後、精製された融合蛋白質
のＮ末端配列を決定することを特徴とする、分泌蛋白質
の分泌後のＮ末端配列を決定する方法を提供する。
【０００７】また本発明は、大腸菌用複製オリジン、動
物細胞用複製オリジンとプロモーター、その下流に存在
するクローニング部位に挿入された任意の分泌蛋白質の
分泌シグナル配列を含むＮ末端ペプチドをコードするＤ
ＮＡ断片、その下流に、クローニング部位に挿入された
遺伝子のコーディング領域とフレームが合い、しかも分
泌された場合、それを指標として精製することが可能な
マーカー蛋白質をコードする領域を含むプラスミドベク
ターを提供する。
物細胞用複製オリジンとプロモーター、その下流に存在
するクローニング部位に挿入された任意の分泌蛋白質の
分泌シグナル配列を含むＮ末端ペプチドをコードするＤ
ＮＡ断片、その下流に、クローニング部位に挿入された
遺伝子のコーディング領域とフレームが合い、しかも分
泌された場合、それを指標として精製することが可能な
マーカー蛋白質をコードする領域を含むプラスミドベク
ターを提供する。
【０００８】さらに本発明は、上記プラスミドベクター
を動物細胞に導入し、分泌蛋白質とマーカー蛋白質との
融合蛋白質を発現させ、分泌された該融合蛋白質を精製
後、精製された融合蛋白質のＮ末端配列を決定すること
を特徴とする、分泌蛋白質の分泌後のＮ末端配列を決定
する方法を提供する。
を動物細胞に導入し、分泌蛋白質とマーカー蛋白質との
融合蛋白質を発現させ、分泌された該融合蛋白質を精製
後、精製された融合蛋白質のＮ末端配列を決定すること
を特徴とする、分泌蛋白質の分泌後のＮ末端配列を決定
する方法を提供する。
【０００９】本発明は、動物細胞用プロモーター、任意
の分泌蛋白質のシグナル配列ペプチドをコードするＤＮ
Ａ断片、マーカー蛋白質をコードする遺伝子を含むベク
ター（図１）を作製し、これを動物細胞に導入してやれ
ば、マーカー蛋白質のＮ末端に任意のシグナル配列ペプ
チドが付加した融合蛋白質が細胞内で合成され、目的分
泌蛋白質のＮ末端ペプチドとマーカー蛋白質の融合蛋白
質が分泌されてくることを見いだしたことに基づいてい
る。
の分泌蛋白質のシグナル配列ペプチドをコードするＤＮ
Ａ断片、マーカー蛋白質をコードする遺伝子を含むベク
ター（図１）を作製し、これを動物細胞に導入してやれ
ば、マーカー蛋白質のＮ末端に任意のシグナル配列ペプ
チドが付加した融合蛋白質が細胞内で合成され、目的分
泌蛋白質のＮ末端ペプチドとマーカー蛋白質の融合蛋白
質が分泌されてくることを見いだしたことに基づいてい
る。
【００１０】本発明は、次の３つの工程からなる。 工程１ 目的とする蛋白質のＮ末端ペプチドをコードす
るＤＮＡ断片を、マーカー蛋白質をコードする遺伝子領
域を含む動物細胞用発現ベクターに組換える。 工程２ 得られたベクターを動物細胞に導入して、融合
蛋白質を培養液中に分泌生産させる。 工程３ 培養液中に分泌された融合蛋白質を単離精製
し、単離した融合蛋白質のＮ末端配列を、アミノ酸シー
ケンシングにより決定する。
るＤＮＡ断片を、マーカー蛋白質をコードする遺伝子領
域を含む動物細胞用発現ベクターに組換える。 工程２ 得られたベクターを動物細胞に導入して、融合
蛋白質を培養液中に分泌生産させる。 工程３ 培養液中に分泌された融合蛋白質を単離精製
し、単離した融合蛋白質のＮ末端配列を、アミノ酸シー
ケンシングにより決定する。
【００１１】工程１ 目的とする蛋白質のＮ末端ペプチドをコードするＤＮＡ
断片を、動物細胞用発現ベクターに組換えるには、常法
を用いる。すなわち、動物細胞用プロモーター、クロー
ニング部位（制限酵素切断部位）、マーカー蛋白質をコ
ードする遺伝子が直列に接続されたベクターを用い、こ
の中のクローニング部位に目的とするＤＮＡ断片を挿入
する（図２、方法１）。目的とする蛋白質をコードする
ｃＤＮＡがすでに動物細胞用発現ベクターに組換えられ
ている場合には、シグナル配列の下流に存在する適当な
制限酵素部位に、マーカー蛋白質をコードする遺伝子を
挿入してもよい（図２、方法２）。
断片を、動物細胞用発現ベクターに組換えるには、常法
を用いる。すなわち、動物細胞用プロモーター、クロー
ニング部位（制限酵素切断部位）、マーカー蛋白質をコ
ードする遺伝子が直列に接続されたベクターを用い、こ
の中のクローニング部位に目的とするＤＮＡ断片を挿入
する（図２、方法１）。目的とする蛋白質をコードする
ｃＤＮＡがすでに動物細胞用発現ベクターに組換えられ
ている場合には、シグナル配列の下流に存在する適当な
制限酵素部位に、マーカー蛋白質をコードする遺伝子を
挿入してもよい（図２、方法２）。
【００１２】本発明で用いる動物細胞用発現ベクター
は、大腸菌用複製オリジン、動物細胞用複製オリジンと
プロモーター、その下流に存在するクローニング部位、
その下流に、クローニング部位に挿入された遺伝子のコ
ーディング領域とフレームが合い、しかも分泌された場
合、その単離精製が可能なマーカー蛋白質をコードする
領域を含むプラスミドベクターである。
は、大腸菌用複製オリジン、動物細胞用複製オリジンと
プロモーター、その下流に存在するクローニング部位、
その下流に、クローニング部位に挿入された遺伝子のコ
ーディング領域とフレームが合い、しかも分泌された場
合、その単離精製が可能なマーカー蛋白質をコードする
領域を含むプラスミドベクターである。
【００１３】マーカー蛋白質としては、シグナル配列を
付加してやれば分泌でき、かつ分泌されたマーカー蛋白
質の検出および単離精製が容易なものが望ましい。たと
えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター
（ウロキナーゼ）、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー、血液凝固因子などのプロテアーゼ類、βーガラクト
シダーゼ等の酵素類、プロテインA、抗体等の蛋白質結
合因子類などがあげられる。マーカー蛋白質が本来分泌
蛋白質である場合には、これらの蛋白質由来のシグナル
配列ペプチドを除去したものを用いる。
付加してやれば分泌でき、かつ分泌されたマーカー蛋白
質の検出および単離精製が容易なものが望ましい。たと
えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター
（ウロキナーゼ）、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー、血液凝固因子などのプロテアーゼ類、βーガラクト
シダーゼ等の酵素類、プロテインA、抗体等の蛋白質結
合因子類などがあげられる。マーカー蛋白質が本来分泌
蛋白質である場合には、これらの蛋白質由来のシグナル
配列ペプチドを除去したものを用いる。
【００１４】図３に、本発明で使用したベクターｐＳＳ
Ｄ１の構造を示す。ｐＳＳＤ１は、ＳＶ４０の複製オリ
ジンと初期プロモーター、１６Ｓスプライシング部位、
シーケンシング用ユニバーサルプライマー部位（Ｕ）、
Ｔ７プロモーター、ＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＶ部位、ウロ
キナーゼの翻訳領域（１３７番目のＰｒｏから４１１番
目のＬｅｕまでを含む）、ＳＶ４０のポリ（Ａ）付加シ
グナル、ｐＵＣ系ベクターの複製オリジン、β−ラクタ
マーゼ遺伝子、ｆ１ファージのオリジンを含んでいる。
本ベクターを用いれば、一本鎖ファージＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａのアンチセンス鎖を含む）を容易に調製でき、ユニバ
ーサルプライマーを用いて、クローン化されたＤＮＡ断
片の塩基配列を容易に決定することができる。
Ｄ１の構造を示す。ｐＳＳＤ１は、ＳＶ４０の複製オリ
ジンと初期プロモーター、１６Ｓスプライシング部位、
シーケンシング用ユニバーサルプライマー部位（Ｕ）、
Ｔ７プロモーター、ＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＶ部位、ウロ
キナーゼの翻訳領域（１３７番目のＰｒｏから４１１番
目のＬｅｕまでを含む）、ＳＶ４０のポリ（Ａ）付加シ
グナル、ｐＵＣ系ベクターの複製オリジン、β−ラクタ
マーゼ遺伝子、ｆ１ファージのオリジンを含んでいる。
本ベクターを用いれば、一本鎖ファージＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａのアンチセンス鎖を含む）を容易に調製でき、ユニバ
ーサルプライマーを用いて、クローン化されたＤＮＡ断
片の塩基配列を容易に決定することができる。
【００１５】分泌蛋白質としては、血液やリンパ液など
の細胞外液の構成成分、サイトカイン、細胞外マトリッ
クスなどが例示できる。なお、膜蛋白質も分泌シグナル
配列を有するので、本発明の分泌蛋白質の範疇にはい
る。膜蛋白質としては、レセプター、トランスポータ
ー、イオンチャンネルなどが例示できる。
の細胞外液の構成成分、サイトカイン、細胞外マトリッ
クスなどが例示できる。なお、膜蛋白質も分泌シグナル
配列を有するので、本発明の分泌蛋白質の範疇にはい
る。膜蛋白質としては、レセプター、トランスポータ
ー、イオンチャンネルなどが例示できる。
【００１６】分泌蛋白質のＮ末端をコードするＤＮＡ断
片は、ゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、合成ＤＮＡいずれで
もかまわない。ゲノムやｃＤＮＡの場合、適当な制限酵
素による切断片を用いても良いし、適当なプライマーを
用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により調製し
たＤＮＡ断片を用いてもよい。もし、ＤＮＡ断片中に開
始コドンから始まるオープンリーディングフレームが存
在し、マーカー蛋白質をコードする遺伝子とフレームが
合っていると、これらの融合蛋白質を発現できるベクタ
ーが出来上がる。
片は、ゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、合成ＤＮＡいずれで
もかまわない。ゲノムやｃＤＮＡの場合、適当な制限酵
素による切断片を用いても良いし、適当なプライマーを
用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により調製し
たＤＮＡ断片を用いてもよい。もし、ＤＮＡ断片中に開
始コドンから始まるオープンリーディングフレームが存
在し、マーカー蛋白質をコードする遺伝子とフレームが
合っていると、これらの融合蛋白質を発現できるベクタ
ーが出来上がる。
【００１７】工程２ 工程１で作製したベクターで大腸菌を形質転換したの
ち、単一コロニー化し、各々から調製したプラスミド、
一本鎖ＤＮＡ、あるいは一本鎖ファージを用いて、動物
細胞のトランスフェクションを行なう。
ち、単一コロニー化し、各々から調製したプラスミド、
一本鎖ＤＮＡ、あるいは一本鎖ファージを用いて、動物
細胞のトランスフェクションを行なう。
【００１８】発現ベクターを動物細胞に導入するには、
リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポ
ソーム法、エレクトロポレーション法等を用いることが
出来る（例えば実験医学別冊「遺伝子工学ハンドブッ
ク」、羊土社、１９９１、参照）。あるいは、一本鎖フ
ァージを調製した後、これを用いてトランスフェクショ
ンを行なえば、より容易に遺伝子を動物細胞に導入する
ことができる［Ｍ．Ｙｏｋｏｙａｍａ−Ｋｏｂａｙａｓ
ｈｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋａｔｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９２：９３５−９
３９（１９９３）］。
リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポ
ソーム法、エレクトロポレーション法等を用いることが
出来る（例えば実験医学別冊「遺伝子工学ハンドブッ
ク」、羊土社、１９９１、参照）。あるいは、一本鎖フ
ァージを調製した後、これを用いてトランスフェクショ
ンを行なえば、より容易に遺伝子を動物細胞に導入する
ことができる［Ｍ．Ｙｏｋｏｙａｍａ−Ｋｏｂａｙａｓ
ｈｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋａｔｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９２：９３５−９
３９（１９９３）］。
【００１９】動物細胞としては、ベクターに組み込まれ
た複製オリジンやプロモーターが働くものであればいか
なるものでもかまわない。本発明のベクターを用いる場
合、ＣＯＳ７、ＣＨＯ細胞等が例示できる。該分泌蛋白
質が実際分泌されている細胞を用いることもできる。
た複製オリジンやプロモーターが働くものであればいか
なるものでもかまわない。本発明のベクターを用いる場
合、ＣＯＳ７、ＣＨＯ細胞等が例示できる。該分泌蛋白
質が実際分泌されている細胞を用いることもできる。
【００２０】発現ベクターを導入した動物細胞を適当な
条件下で培養した後、培養上澄を調製する。この中にマ
ーカー蛋白質が分泌されているかどうかは、用いたマー
カー蛋白質の検出法を用いて調べる。酵素の場合には、
対応する酵素活性検出法を用いる。マーカー蛋白質に対
する抗体がある場合には、これを用いて酵素免疫アッセ
イを行なえばよい。実施例で用いた場合に分泌されるウ
ロキナーゼは、人工基質ペプチドを用いる方法やフィブ
リンプレート法により検出できる。大量のサンプルを手
軽に、しかも微量のサンプルで検出できるという点で、
実施例に例示したフィブリンプレート法が適している。
条件下で培養した後、培養上澄を調製する。この中にマ
ーカー蛋白質が分泌されているかどうかは、用いたマー
カー蛋白質の検出法を用いて調べる。酵素の場合には、
対応する酵素活性検出法を用いる。マーカー蛋白質に対
する抗体がある場合には、これを用いて酵素免疫アッセ
イを行なえばよい。実施例で用いた場合に分泌されるウ
ロキナーゼは、人工基質ペプチドを用いる方法やフィブ
リンプレート法により検出できる。大量のサンプルを手
軽に、しかも微量のサンプルで検出できるという点で、
実施例に例示したフィブリンプレート法が適している。
【００２１】工程３ もしマーカー蛋白質が培養液中に検出された場合には、
目的蛋白質のＮ末端ペプチドとマーカー蛋白質の融合蛋
白質が分泌されていることになる。したがって、大量ス
ケールで培養後、アフィニティークロマトグラフィー、
すなわちマーカー蛋白質に対して特異的に結合する物質
を固定化したゲル担体を詰めたカラムに培養液を通すこ
とにより、該融合蛋白質を容易に単離精製することがで
きる。単離精製された融合蛋白質のＮ末端の決定は、ア
ミノ酸シーケンサーを用いて容易に行なうことができ
る。
目的蛋白質のＮ末端ペプチドとマーカー蛋白質の融合蛋
白質が分泌されていることになる。したがって、大量ス
ケールで培養後、アフィニティークロマトグラフィー、
すなわちマーカー蛋白質に対して特異的に結合する物質
を固定化したゲル担体を詰めたカラムに培養液を通すこ
とにより、該融合蛋白質を容易に単離精製することがで
きる。単離精製された融合蛋白質のＮ末端の決定は、ア
ミノ酸シーケンサーを用いて容易に行なうことができ
る。
【００２２】
【実施例】次に実施例により発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２３】ＤＮＡの組換えに関する基本的な操作およ
び酵素反応は、文献（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ. Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、１９８９）に従った。制限酵素および
各種修飾酵素は特に記載の無い場合宝酒造社製のものを
用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付
属の説明書に従った。
び酵素反応は、文献（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ. Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、１９８９）に従った。制限酵素および
各種修飾酵素は特に記載の無い場合宝酒造社製のものを
用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付
属の説明書に従った。
【００２４】シグナル配列クローニング用ベクターの作
製 プラスミドｐＵＣ１９（ファルマシア社）１０μｇを１
００単位のＳｃａＩ、ついで１００単位のＰｓｔＩで消
化した後、０.８％アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲ
ルからオリジンを含む大きい断片を単離精製した。プラ
スミドｐＫＡ１（特開平４−１１７２９２に記載）１０
μｇを１００単位のＳｃａＩ、ついで１００単位のＰｓ
ｔＩで消化した後、０.８％アガロースゲル電気泳動に
かけ、ゲルからｆ１オリジンを含む小さい断片を単離精
製した。両者の断片をライゲーション後、大腸菌ＨＢ１
０１の形質転換を行なった。形質転換体から単離したプ
ラスミド１０μｇを１００単位のＰｖｕＩＩ、ついで１
００単位のＰｓｔＩで消化した後、０.８％アガロース
ゲル電気泳動にかけ、ゲルからオリジンを含む大きい断
片を単離精製した。
製 プラスミドｐＵＣ１９（ファルマシア社）１０μｇを１
００単位のＳｃａＩ、ついで１００単位のＰｓｔＩで消
化した後、０.８％アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲ
ルからオリジンを含む大きい断片を単離精製した。プラ
スミドｐＫＡ１（特開平４−１１７２９２に記載）１０
μｇを１００単位のＳｃａＩ、ついで１００単位のＰｓ
ｔＩで消化した後、０.８％アガロースゲル電気泳動に
かけ、ゲルからｆ１オリジンを含む小さい断片を単離精
製した。両者の断片をライゲーション後、大腸菌ＨＢ１
０１の形質転換を行なった。形質転換体から単離したプ
ラスミド１０μｇを１００単位のＰｖｕＩＩ、ついで１
００単位のＰｓｔＩで消化した後、０.８％アガロース
ゲル電気泳動にかけ、ゲルからオリジンを含む大きい断
片を単離精製した。
【００２５】プラスミドｐＫＡ１（特開平４−１１７２
９２に記載）１０μｇを１００単位のＡｃｃＩで消化し
た後、クレノウ断片処理によって平滑末端化し、ついで
１００単位のＰｓｔＩで消化した後、０.８％アガロー
スゲル電気泳動にかけ、ゲルからＳＶ４０オリジンを含
む小さい断片を単離精製した。両者の断片をライゲーシ
ョン後、大腸菌ＨＢ１０１の形質転換を行なった。形質
転換体からプラスミドを単離し、制限酵素地図から目的
とするプラスミドｐＫＡ１Ｕであることを確認した。す
なわち、ｐＫＡ１Ｕは、ｐＫＡ１が有していたｐＢＲ３
２２由来のオリジンを、ｐＵＣ由来のオリジンに置き換
えたものである。
９２に記載）１０μｇを１００単位のＡｃｃＩで消化し
た後、クレノウ断片処理によって平滑末端化し、ついで
１００単位のＰｓｔＩで消化した後、０.８％アガロー
スゲル電気泳動にかけ、ゲルからＳＶ４０オリジンを含
む小さい断片を単離精製した。両者の断片をライゲーシ
ョン後、大腸菌ＨＢ１０１の形質転換を行なった。形質
転換体からプラスミドを単離し、制限酵素地図から目的
とするプラスミドｐＫＡ１Ｕであることを確認した。す
なわち、ｐＫＡ１Ｕは、ｐＫＡ１が有していたｐＢＲ３
２２由来のオリジンを、ｐＵＣ由来のオリジンに置き換
えたものである。
【００２６】ｐＫＡ１Ｕ １μｇをＢｓｔＸＩ１０単位
で消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによりその末端を平
滑化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりリン酸化ＢｇｌＩＩ
リンカーを接続した。このものをＢｇｌＩＩ２０単位で
消化後、Ｔ４リガーゼにより環化し、ｐＫＡ１ＵＢを構
築した。ｐＫＡ１ＵＢ１μｇを、２０単位のＥｃｏＲ
Ｖ、２０単位のＫｐｎＩで消化した後、大腸菌Ｃ７５由
来アルカリフォスファターゼにより末端のリン酸基を除
去した。
で消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによりその末端を平
滑化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりリン酸化ＢｇｌＩＩ
リンカーを接続した。このものをＢｇｌＩＩ２０単位で
消化後、Ｔ４リガーゼにより環化し、ｐＫＡ１ＵＢを構
築した。ｐＫＡ１ＵＢ１μｇを、２０単位のＥｃｏＲ
Ｖ、２０単位のＫｐｎＩで消化した後、大腸菌Ｃ７５由
来アルカリフォスファターゼにより末端のリン酸基を除
去した。
【００２７】ヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−１０
８０のｃＤＮＡライブラリー（特開平４−１１７２９２
に記載）から任意に選択したクローンの塩基配列決定の
結果、ウロキナーゼの完全長ｃＤＮＡを含むクローンｐ
ＫＡ１−ＵＰＡが得られた。
８０のｃＤＮＡライブラリー（特開平４−１１７２９２
に記載）から任意に選択したクローンの塩基配列決定の
結果、ウロキナーゼの完全長ｃＤＮＡを含むクローンｐ
ＫＡ１−ＵＰＡが得られた。
【００２８】ヒトウロキナーゼ活性ドメインのＮ末端
（１３７番目のＰｒｏから１４２番目のＧｌｕ）に相当
するｃＤＮＡの配列及びウロキナーゼ３’非翻訳領域の
配列を有する次の２種類の合成ＤＮＡオリゴマーをＤＮ
Ａ合成機（アプライドバイオシステム社）を用いて合成
した。 SSD1 5'-GGCGATATCCCTCCTCTCCTCCAGAAG-3' SSD2 5'-CGCGGTACCAGCAAGAAAGCGGGTGG-3'
（１３７番目のＰｒｏから１４２番目のＧｌｕ）に相当
するｃＤＮＡの配列及びウロキナーゼ３’非翻訳領域の
配列を有する次の２種類の合成ＤＮＡオリゴマーをＤＮ
Ａ合成機（アプライドバイオシステム社）を用いて合成
した。 SSD1 5'-GGCGATATCCCTCCTCTCCTCCAGAAG-3' SSD2 5'-CGCGGTACCAGCAAGAAAGCGGGTGG-3'
【００２９】これらの合成オリゴマーをプライマーとし
てＰＣＲ反応を行ない、ウロキナーゼ活性ドメインｃＤ
ＮＡ を増幅した。すなわち、ｐＫＡ１−ＵＰＡのＰｓ
ｔＩ消化物より単離した１．２ｋｂｐの断片１ｎｇを鋳
型に、各々１．８ナノモルのＳＳＤ１およびＳＳＤ２を
プライマーとして３０サイクルのＰＣＲ反応を行なっ
た。ＰＣＲ 生成物を４０単位のＥｃｏＲＶおよび３０
単位のＫｐｎＩにより消化後、０．７％アガロースゲル
電気泳動にかけ、約８６０ｂｐの断片を単離した。これ
らの断片を前項のベクター断片に４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結し、ｐＳＳＤ１を構築した。
てＰＣＲ反応を行ない、ウロキナーゼ活性ドメインｃＤ
ＮＡ を増幅した。すなわち、ｐＫＡ１−ＵＰＡのＰｓ
ｔＩ消化物より単離した１．２ｋｂｐの断片１ｎｇを鋳
型に、各々１．８ナノモルのＳＳＤ１およびＳＳＤ２を
プライマーとして３０サイクルのＰＣＲ反応を行なっ
た。ＰＣＲ 生成物を４０単位のＥｃｏＲＶおよび３０
単位のＫｐｎＩにより消化後、０．７％アガロースゲル
電気泳動にかけ、約８６０ｂｐの断片を単離した。これ
らの断片を前項のベクター断片に４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結し、ｐＳＳＤ１を構築した。
【００３０】腫瘍壊死因子由来シグナル配列ペプチド／
ウロキナーゼ融合蛋白質の発現ベクター構築 ｐＳＳＤ１ １μｇを１０単位のＥｃｏＲＶで完全に消
化した後、２単位のＥｃｏＲＩで３７℃、４５秒間の部
分消化を行ない、大腸菌Ｃ７５アルカリフォスファター
ゼにより末端リン酸基を除去した。
ウロキナーゼ融合蛋白質の発現ベクター構築 ｐＳＳＤ１ １μｇを１０単位のＥｃｏＲＶで完全に消
化した後、２単位のＥｃｏＲＩで３７℃、４５秒間の部
分消化を行ない、大腸菌Ｃ７５アルカリフォスファター
ゼにより末端リン酸基を除去した。
【００３１】ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）完全長ｃ
ＤＮＡを含むプラスミドｐＫＡ１−ＴＮＦ（特開平４−
１１７２９２に記載）1μｇ のＢａｌＩおよびＥｃｏＲ
Ｉ消化物を１．５％ アガロースゲル電気泳動にかけ、
約５００ｂｐのｃＤＮＡ断片をゲルより単離した。この
断片とベクター断片のＴ４ＤＮＡリガーゼ反応物を用い
て大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換
体の有するプラスミドを解析し、ウロキナーゼｃＤＮＡ
中の２ヵ所のＥｃｏＲＩ部位が無傷であり、かつウロキ
ナーゼｃＤＮＡ５’側上流にＴＮＦｃＤＮＡ 断片が挿
入されているものを選択し、ｐＳＳＤ１−ＴＮＦとした
（図４）。
ＤＮＡを含むプラスミドｐＫＡ１−ＴＮＦ（特開平４−
１１７２９２に記載）1μｇ のＢａｌＩおよびＥｃｏＲ
Ｉ消化物を１．５％ アガロースゲル電気泳動にかけ、
約５００ｂｐのｃＤＮＡ断片をゲルより単離した。この
断片とベクター断片のＴ４ＤＮＡリガーゼ反応物を用い
て大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換
体の有するプラスミドを解析し、ウロキナーゼｃＤＮＡ
中の２ヵ所のＥｃｏＲＩ部位が無傷であり、かつウロキ
ナーゼｃＤＮＡ５’側上流にＴＮＦｃＤＮＡ 断片が挿
入されているものを選択し、ｐＳＳＤ１−ＴＮＦとした
（図４）。
【００３２】形質転換用サンプルは以下のように調製し
た。プラスミドｐＳＳＤ１−ＴＮＦを有する大腸菌ＪＭ
１０９形質転換株のグリセロールストックから滅菌つま
ようじで少量を採取し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン
含有２ｘＹＴ２ｍｌに植菌した。３７℃で１時間３０分
培養後、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７懸濁液５０μｌ
を加え、さらに１６時間培養した。この培養液につい
て１５、０００回転、５分間の遠心を２回繰返し、大腸
菌体を完全に除去した上澄を得た。この上澄１．２ｍｌ
に対して２０％ポリエチレングリコール、２．５ＭＮａ
Ｃｌ溶液０．３ｍｌを添加し充分に混合し、室温にて１
０分間静置後、１５、０００回転、１０分間の遠心を行
ない、沈澱を回収した。得られた沈澱を１２０μｌのト
リス−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液を
形質転換に用いた。
た。プラスミドｐＳＳＤ１−ＴＮＦを有する大腸菌ＪＭ
１０９形質転換株のグリセロールストックから滅菌つま
ようじで少量を採取し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン
含有２ｘＹＴ２ｍｌに植菌した。３７℃で１時間３０分
培養後、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７懸濁液５０μｌ
を加え、さらに１６時間培養した。この培養液につい
て１５、０００回転、５分間の遠心を２回繰返し、大腸
菌体を完全に除去した上澄を得た。この上澄１．２ｍｌ
に対して２０％ポリエチレングリコール、２．５ＭＮａ
Ｃｌ溶液０．３ｍｌを添加し充分に混合し、室温にて１
０分間静置後、１５、０００回転、１０分間の遠心を行
ない、沈澱を回収した。得られた沈澱を１２０μｌのト
リス−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液を
形質転換に用いた。
【００３３】ＣＯＳ７細胞のトランスフェクションおよ
び培養上澄の調製 サル腎臓由来培養細胞ＣＯＳ７は、１０％ウシ胎児血清
を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５
％ＣＯ2存在下、３７℃で培養した。２ｘ１０6個のＣＯ
Ｓ７細胞を培養ボトル（ヌンク社、培養面積１７５平方
ｃｍ）に撒き、３７℃で２０〜２２時間培養した。培地
除去後、リン酸緩衝液で細胞表面を洗浄し、さらに５０
ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）を含むＤＭＥＭ（ＴＤＭ
ＥＭ）で再度洗浄した。前項に述べたファージ懸濁液２
０μｌを０．４ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥデキストラン含有Ｔ
ＤＭＥＭ１５ｍｌに混合し、この液をＣＯＳ７細胞に加
え、５％ＣＯ2存在下、３７℃で培養した。３時間後、
１０ｍＭクロロキンを１５０μｌ添加し、さらに２時間
培養した。この液を除去し、ＴＤＭＥＭで細胞表面を洗
浄後、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ４０ｍｌを加
え、５％ＣＯ2存在下、３７℃で２日間培養した。培養
液を除去し、リン酸緩衝液１０ｍｌで細胞表面を洗浄し
た。この洗浄は２回繰返した。この後、血清を含まない
ＤＭＥＭ４０ｍｌを加え、さらに３日間培養した。培地
を回収し、遠心（５、０００ｒｐｍ、１０分、４℃）お
よびろ過（３ＭＭろ紙）により浮遊細胞などを除去し
た。この培養上澄に、塩化ナトリウムを終濃度０．５Ｍ
となるように加えた。
び培養上澄の調製 サル腎臓由来培養細胞ＣＯＳ７は、１０％ウシ胎児血清
を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５
％ＣＯ2存在下、３７℃で培養した。２ｘ１０6個のＣＯ
Ｓ７細胞を培養ボトル（ヌンク社、培養面積１７５平方
ｃｍ）に撒き、３７℃で２０〜２２時間培養した。培地
除去後、リン酸緩衝液で細胞表面を洗浄し、さらに５０
ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）を含むＤＭＥＭ（ＴＤＭ
ＥＭ）で再度洗浄した。前項に述べたファージ懸濁液２
０μｌを０．４ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥデキストラン含有Ｔ
ＤＭＥＭ１５ｍｌに混合し、この液をＣＯＳ７細胞に加
え、５％ＣＯ2存在下、３７℃で培養した。３時間後、
１０ｍＭクロロキンを１５０μｌ添加し、さらに２時間
培養した。この液を除去し、ＴＤＭＥＭで細胞表面を洗
浄後、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ４０ｍｌを加
え、５％ＣＯ2存在下、３７℃で２日間培養した。培養
液を除去し、リン酸緩衝液１０ｍｌで細胞表面を洗浄し
た。この洗浄は２回繰返した。この後、血清を含まない
ＤＭＥＭ４０ｍｌを加え、さらに３日間培養した。培地
を回収し、遠心（５、０００ｒｐｍ、１０分、４℃）お
よびろ過（３ＭＭろ紙）により浮遊細胞などを除去し
た。この培養上澄に、塩化ナトリウムを終濃度０．５Ｍ
となるように加えた。
【００３４】培養上澄のアッセイ ２％ウシフィブリノーゲン（マイルス社）、０．５％ア
ガロース、１ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌに１０単位のヒトトロン
ビン（持田製薬）を加え、直径９ｃｍ のプレート中で
固化させ、フィブリンプレートを調製した。トランスフ
ェクションしたＣＯＳ７細胞の培養上澄１０μｌをフィ
ブリンプレートに載せ、３７℃、１５時間インキュベー
トした。その結果、溶解円の形成が観測され、ウロキナ
ーゼ融合蛋白質の分泌が観測された。
ガロース、１ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌに１０単位のヒトトロン
ビン（持田製薬）を加え、直径９ｃｍ のプレート中で
固化させ、フィブリンプレートを調製した。トランスフ
ェクションしたＣＯＳ７細胞の培養上澄１０μｌをフィ
ブリンプレートに載せ、３７℃、１５時間インキュベー
トした。その結果、溶解円の形成が観測され、ウロキナ
ーゼ融合蛋白質の分泌が観測された。
【００３５】ウロキナーゼ抗体固定化カラムの調製 臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社）
０．５ｇに１ｍＭ塩酸を加え、室温、１５分間膨潤さ
せ、体積１．５ｍｌのゲルを得た。このゲルを、グラス
フィルターＧ４上で、１ｍＭ塩酸で洗浄し、さらにカッ
プリング緩衝液Ａ（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ
８．５、０．５Ｍ塩化ナトリウム）で洗浄した。このゲ
ルに、カップリング緩衝液Ａ５ｍｌに溶解したヒト低分
子ウロキナーゼ抗体（ヤギ由来、ｂｉｏｐｏｏｌ社）５
ｍｇを加え、４℃、１６時間反応させた。上澄を除去し
た後、このゲルにブロッキング緩衝液（１Ｍグリシン、
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０）４ｍｌを加
え、室温にて４時間、反応させた。上澄を除去した後、
ゲルをカップリング緩衝液Ａおよびカップリング緩衝液
Ｂ（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、０．５Ｍ塩
化ナトリウム）で、交互に４回洗浄した。さらに０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．
５で洗浄し、カラム（エコノカラム、直径１ｃｍ、Ｂｉ
ｏＲａｄ社）に充填し、４℃に保存した。
０．５ｇに１ｍＭ塩酸を加え、室温、１５分間膨潤さ
せ、体積１．５ｍｌのゲルを得た。このゲルを、グラス
フィルターＧ４上で、１ｍＭ塩酸で洗浄し、さらにカッ
プリング緩衝液Ａ（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ
８．５、０．５Ｍ塩化ナトリウム）で洗浄した。このゲ
ルに、カップリング緩衝液Ａ５ｍｌに溶解したヒト低分
子ウロキナーゼ抗体（ヤギ由来、ｂｉｏｐｏｏｌ社）５
ｍｇを加え、４℃、１６時間反応させた。上澄を除去し
た後、このゲルにブロッキング緩衝液（１Ｍグリシン、
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０）４ｍｌを加
え、室温にて４時間、反応させた。上澄を除去した後、
ゲルをカップリング緩衝液Ａおよびカップリング緩衝液
Ｂ（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、０．５Ｍ塩
化ナトリウム）で、交互に４回洗浄した。さらに０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．
５で洗浄し、カラム（エコノカラム、直径１ｃｍ、Ｂｉ
ｏＲａｄ社）に充填し、４℃に保存した。
【００３６】融合蛋白質の単離精製 前項に述べた低分子ウロキナーゼ抗体固定化カラムに、
カラム体積の１０倍量以上の０．５Ｍ塩化ナトリウム含
有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を流し、平衡化
を行なった。このカラムに培養ボトル４本分のＣＯＳ７
細胞培養上澄をかけ、培養上澄中の融合蛋白質をカラム
に吸着させた。この後、０．５Ｍ塩化ナトリウム含有２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を流し、流出液の２
８０ｎｍの吸収がバックグラウンド程度に低下するまで
洗浄した。次に２．５Ｍチオシアン酸カリウムを含む２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を流し、その流出液
を０．５ｍｌずつ分画した。各分画のウロキナーゼ活性
をフィブリンプレート法により測定した。
カラム体積の１０倍量以上の０．５Ｍ塩化ナトリウム含
有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を流し、平衡化
を行なった。このカラムに培養ボトル４本分のＣＯＳ７
細胞培養上澄をかけ、培養上澄中の融合蛋白質をカラム
に吸着させた。この後、０．５Ｍ塩化ナトリウム含有２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を流し、流出液の２
８０ｎｍの吸収がバックグラウンド程度に低下するまで
洗浄した。次に２．５Ｍチオシアン酸カリウムを含む２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を流し、その流出液
を０．５ｍｌずつ分画した。各分画のウロキナーゼ活性
をフィブリンプレート法により測定した。
【００３７】融合蛋白質のＮ末端配列決定 ウロキナーゼ活性の検出された分画をひとつにまとめ、
これを１ｍｌづつ０．２Ｍ炭酸アンモニウムで平衡化し
たＮＡＰ１０カラム（ファルマシア社）にかけ、１．５
ｍｌの０．２Ｍ炭酸アンモニウムで溶出した。得られた
溶出液をまとめ、スピードバックにより数十μｌ程度ま
で濃縮した。この濃縮液をアミノ酸シーケンサー（ＡＢ
Ｉ、モデル４７７Ａ）で解析し、そのＮ末端配列を決定
した。その結果、得られた融合蛋白質のＮ末端配列は、
Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓと解読された。
この配列は、ホルボールエステルで刺激したＨＬ−６０
細胞の培養上澄から精製されたＴＮＦ−αのＮ末端配列
［Ｂ．Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：２３４５−２３５４（１９
８５）］と完全に一致した。
これを１ｍｌづつ０．２Ｍ炭酸アンモニウムで平衡化し
たＮＡＰ１０カラム（ファルマシア社）にかけ、１．５
ｍｌの０．２Ｍ炭酸アンモニウムで溶出した。得られた
溶出液をまとめ、スピードバックにより数十μｌ程度ま
で濃縮した。この濃縮液をアミノ酸シーケンサー（ＡＢ
Ｉ、モデル４７７Ａ）で解析し、そのＮ末端配列を決定
した。その結果、得られた融合蛋白質のＮ末端配列は、
Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓと解読された。
この配列は、ホルボールエステルで刺激したＨＬ−６０
細胞の培養上澄から精製されたＴＮＦ−αのＮ末端配列
［Ｂ．Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：２３４５−２３５４（１９
８５）］と完全に一致した。
【００３８】プラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ター１成熟蛋白質のＮ末端配列決定 （１）融合蛋白質発現ベクターの構築 プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡ
Ｉ１）の完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＡ１−Ｐ
ＡＩ１［Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ１５０：２
４３−２５０（１９９４）］１μｇ のＨｉｎｄＩＩＩ
およびＳｔｕＩ消化物を１．５％ アガロースゲル電気
泳動にかけ、約９００ｂｐのｃＤＮＡ断片をゲルより単
離した。この断片をｐＳＳＤ１のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅｃ
ｏＲＶ断片と連結した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応物を
用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質
転換体が有するプラスミドを解析し、ウロキナーゼプロ
テアーゼドメインｃＤＮＡ５’側上流にＰＡＩ１ｃＤＮ
Ａ 断片が挿入されているものを選択し、ｐＳＳＤ１−
ＰＡＩ１とした。
ター１成熟蛋白質のＮ末端配列決定 （１）融合蛋白質発現ベクターの構築 プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡ
Ｉ１）の完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＡ１−Ｐ
ＡＩ１［Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ１５０：２
４３−２５０（１９９４）］１μｇ のＨｉｎｄＩＩＩ
およびＳｔｕＩ消化物を１．５％ アガロースゲル電気
泳動にかけ、約９００ｂｐのｃＤＮＡ断片をゲルより単
離した。この断片をｐＳＳＤ１のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅｃ
ｏＲＶ断片と連結した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応物を
用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質
転換体が有するプラスミドを解析し、ウロキナーゼプロ
テアーゼドメインｃＤＮＡ５’側上流にＰＡＩ１ｃＤＮ
Ａ 断片が挿入されているものを選択し、ｐＳＳＤ１−
ＰＡＩ１とした。
【００３９】（２）融合蛋白質の発現 ｐＳＳＤ１−ＰＡＩ１を有するｆ１ファージ粒子を上記
の方法に従ってＣＯＳ７細胞に導入し、融合蛋白質を発
現させた。３日間培養後、培地を回収し、５０００ｒｐ
ｍ、５分間の遠心により培養上澄を得た。
の方法に従ってＣＯＳ７細胞に導入し、融合蛋白質を発
現させた。３日間培養後、培地を回収し、５０００ｒｐ
ｍ、５分間の遠心により培養上澄を得た。
【００４０】（３）融合蛋白質の部分精製 上述した低分子ウロキナーゼ抗体固定化カラムに、カラ
ム体積の１０倍量以上の１Ｍ塩化ナトリウム、０．０１
％Ｔｗｅｅｎ８０含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）を流し、平衡化を行なった。このカラムに培養ボト
ル４本分のＣＯＳ７細胞培養上澄をかけ、培養上澄中の
融合蛋白質をカラムに吸着させた。この後、１Ｍ塩化ナ
トリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０含有２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ８．０）を流し、流出液の２８０ｎｍの
吸収がバックグラウンド程度に低下するまで洗浄した。
次に１Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０含
有０．３％アンモニア水（ｐＨ１１．５）を流し、その
流出液を２ｍｌずつ分画し、分画後直ちに酢酸を添加
し、ｐＨを中性付近に調整した。各分画のウロキナーゼ
活性をフィブリンプレート法により測定した。
ム体積の１０倍量以上の１Ｍ塩化ナトリウム、０．０１
％Ｔｗｅｅｎ８０含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）を流し、平衡化を行なった。このカラムに培養ボト
ル４本分のＣＯＳ７細胞培養上澄をかけ、培養上澄中の
融合蛋白質をカラムに吸着させた。この後、１Ｍ塩化ナ
トリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０含有２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ８．０）を流し、流出液の２８０ｎｍの
吸収がバックグラウンド程度に低下するまで洗浄した。
次に１Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０含
有０．３％アンモニア水（ｐＨ１１．５）を流し、その
流出液を２ｍｌずつ分画し、分画後直ちに酢酸を添加
し、ｐＨを中性付近に調整した。各分画のウロキナーゼ
活性をフィブリンプレート法により測定した。
【００４１】（４）融合蛋白質のＮ末端アミノ酸配列決
定 活性の検出された分画をひとつにまとめ、これを遠心型
濃縮装置（セントリコン-10）により０．１ｍｌ程度ま
で濃縮した。この濃縮液にトリクロロ酢酸を終濃度１０
％となるように加え、蛋白質の沈澱物を得た。この沈澱
物を、電気泳動用サンプルバッファー（６０ｍＭトリス
塩酸、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、
０．０２５％ブロムフェノールブルー、１４ｍＭメルカ
プトエタノール）に溶解後、ＳＤＳーポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけた。泳動終了後、ゲルをトランス
ファーバッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシ
ン、１５％メタノール）中に２０分間浸した。セミドラ
イブロッティング装置（ザルトリウス社製）を用い、カ
ソードバッファー（２５ｍＭトリス、４０ｍＭεーアミ
ノカプロン酸、２０％メタノール、ｐＨ９．４）に浸し
た濾紙３枚、ゲル、メタノールおよびトランスファーバ
ッファーに浸したＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）、ア
ノードバッファー＃２（２５ｍＭトリス、１０％メタノ
ール、ｐＨ１０．４）に浸した濾紙２枚、アノードバッ
ファー＃１（０．３Ｍトリス、１０％メタノール、ｐＨ
１０．４）に浸した濾紙１枚の順に重ね、８０ｍＡ、２
時間通電し、ブロッティングを行なった。ブロッティン
グ後のＰＶＤＦ膜を蒸留水で洗浄し、染色液（０．２％
クーマシーブリリアントブルー、４５％メタノール）で
５分間染色し、９０％メタノールで脱色後、乾燥した。
この膜から、目的とする融合蛋白質に該当するバンドを
切取り、アミノ酸シーケンサーによる解析に供した。そ
の結果、融合蛋白質のＮ末端にＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの配列が確認された。この配列はＰＡ
Ｉ１の仮想シグナル切断部位からの配列に一致してい
た。
定 活性の検出された分画をひとつにまとめ、これを遠心型
濃縮装置（セントリコン-10）により０．１ｍｌ程度ま
で濃縮した。この濃縮液にトリクロロ酢酸を終濃度１０
％となるように加え、蛋白質の沈澱物を得た。この沈澱
物を、電気泳動用サンプルバッファー（６０ｍＭトリス
塩酸、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、
０．０２５％ブロムフェノールブルー、１４ｍＭメルカ
プトエタノール）に溶解後、ＳＤＳーポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけた。泳動終了後、ゲルをトランス
ファーバッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシ
ン、１５％メタノール）中に２０分間浸した。セミドラ
イブロッティング装置（ザルトリウス社製）を用い、カ
ソードバッファー（２５ｍＭトリス、４０ｍＭεーアミ
ノカプロン酸、２０％メタノール、ｐＨ９．４）に浸し
た濾紙３枚、ゲル、メタノールおよびトランスファーバ
ッファーに浸したＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）、ア
ノードバッファー＃２（２５ｍＭトリス、１０％メタノ
ール、ｐＨ１０．４）に浸した濾紙２枚、アノードバッ
ファー＃１（０．３Ｍトリス、１０％メタノール、ｐＨ
１０．４）に浸した濾紙１枚の順に重ね、８０ｍＡ、２
時間通電し、ブロッティングを行なった。ブロッティン
グ後のＰＶＤＦ膜を蒸留水で洗浄し、染色液（０．２％
クーマシーブリリアントブルー、４５％メタノール）で
５分間染色し、９０％メタノールで脱色後、乾燥した。
この膜から、目的とする融合蛋白質に該当するバンドを
切取り、アミノ酸シーケンサーによる解析に供した。そ
の結果、融合蛋白質のＮ末端にＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの配列が確認された。この配列はＰＡ
Ｉ１の仮想シグナル切断部位からの配列に一致してい
た。
【発明の効果】本発明により、医薬として有用な分泌蛋
白質が分泌された後、どのようなＮ末端配列を有してい
るかを、該分泌蛋白質を単離精製することなく、該分泌
蛋白質をコードしているｃＤＮＡを用いて容易に決定す
ることができる。
白質が分泌された後、どのようなＮ末端配列を有してい
るかを、該分泌蛋白質を単離精製することなく、該分泌
蛋白質をコードしているｃＤＮＡを用いて容易に決定す
ることができる。
【図１】 融合遺伝子の構造を示す図である。
【図２】 融合遺伝子を作製する工程を示す図である。
【図３】 ｐＳＳＤ１の構造を示す図である。
【図４】 ＴＮＦ−αシグナル配列ペプチド／ウロキナ
ーゼ融合蛋白質ｃＤＮＡの構造を示す図である。
ーゼ融合蛋白質ｃＤＮＡの構造を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/68
Claims (4)
- 【請求項１】 任意の分泌蛋白質の分泌シグナル配列を
含むＮ末端ペプチドをコードするＤＮＡ断片を、マーカ
ー蛋白質をコードする遺伝子の上流に挿入したのち、該
融合遺伝子を動物細胞に導入し、次いで該動物細胞を培
養して前記ＤＮＡ断片によりコードされる蛋白質と前記
マーカー蛋白質との融合蛋白質を発現させ、培養液中に
分泌された該融合蛋白質をそのマーカー蛋白質を指標と
して精製後、精製された融合蛋白質のＮ末端配列を決定
することを特徴とする、分泌蛋白質の分泌後のＮ末端配
列を決定する方法。 - 【請求項２】 マーカー蛋白質がウロキナーゼである請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 大腸菌用複製オリジン、動物細胞用複製
オリジンとプロモーター、その下流に存在するクローニ
ング部位に挿入された任意の分泌蛋白質の分泌シグナル
配列を含むＮ末端ペプチドをコードするＤＮＡ断片、そ
の下流に、クローニング部位に挿入された遺伝子のコー
ディング領域とフレームが合い、しかも分泌された場
合、それを指標として精製することが可能なマーカー蛋
白質をコードする領域を含むプラスミドベクター。 - 【請求項４】 請求項３記載のプラスミドベクターを動
物細胞に導入し、分泌蛋白質の分泌シグナル配列を含む
Ｎ末端ペプチドとマーカー蛋白質との融合蛋白質を発現
させ、分泌された該融合蛋白質を精製後、精製された融
合蛋白質のＮ末端配列を決定することを特徴とする、分
泌蛋白質の分泌後のＮ末端配列を決定する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25180095A JP3698464B2 (ja) | 1994-10-07 | 1995-09-05 | 分泌蛋白質のｎ末端配列決定法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-270689 | 1994-10-07 | ||
| JP27068994 | 1994-10-07 | ||
| JP25180095A JP3698464B2 (ja) | 1994-10-07 | 1995-09-05 | 分泌蛋白質のｎ末端配列決定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08187100A true JPH08187100A (ja) | 1996-07-23 |
| JP3698464B2 JP3698464B2 (ja) | 2005-09-21 |
Family
ID=26540357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25180095A Expired - Fee Related JP3698464B2 (ja) | 1994-10-07 | 1995-09-05 | 分泌蛋白質のｎ末端配列決定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3698464B2 (ja) |
-
1995
- 1995-09-05 JP JP25180095A patent/JP3698464B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3698464B2 (ja) | 2005-09-21 |
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