JPH08191685A - Ｖａ菌根菌の人工培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ＶＡ菌根菌が感染し得る植物の根の抽出物を
用いて、植物の生きた根を用いることなしにＶＡ菌根菌
の菌糸及び／又は胞子を培養することを特徴とするＶＡ
菌根菌の人工的培養法。 【効果】 本発明によれば、世界で初めて生きた植物
（植物根）なしにＶＡ菌根菌を人工培養することが可能
となった。従って、ＶＡ菌根菌を安価に供給することが
できると共に、雑菌に汚染されていない菌体を容易に得
ることができる。このことは、ＶＡ菌根菌の工業的利用
の可能性を広げる他、植物との共生を介してしか調べら
れなかったＶＡ菌根菌の生理的性質をも調べることがで
き、学問的にも非常に重要である。それ故、本発明は農
業や園芸業等の分野で有効に利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、農業や園芸業等の分野
で有用なＶＡ菌根菌を、植物の生きた根を用いることな
しに人工的に培養し得る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＶＡ菌根菌（Vesicular Arbuscular Myc
orrhizal fungi )は、種々の植物に感染して、共生する
ことによって、該植物の生長促進や耐病性を向上させる
ことが知られている（小川 眞著，「ＶＡ菌根とその働
き、森林立地」，第３０（２）巻，第５７〜６５頁，１
９８８年；「農業及び園芸」，第６２巻，第８号，９３
０〜９３７頁，１９８７年；「植物防疫」，第４２巻，
第５号，２５９〜２６６頁，１９８８年）。これは、Ｖ
Ａ菌根菌の菌糸が植物の根に感染することによって、菌
糸を介して土壌中のリンや微量元素の吸収が促進される
ためである。

【０００３】しかしながら、ＶＡ菌根菌は植物絶対共生
菌と言われており、同じ共生菌でも根粒菌やフランキア
のように生きた植物なしに人工培養することは、これま
で不可能であった。このため世界中でＶＡ菌根菌を単独
で培養する試みがなされてきたが、未だ生きた植物なし
に人工培養することはできなかった。ＶＡ菌根菌が生き
た植物の根を用いずに人工培養できるようになれば、Ｖ
Ａ菌根菌を安価に供給できることになる。

【０００４】これまでＶＡ菌根菌を培養する方法として
は、植物を多孔質担体などの培地上で育て、その植物の
根にＶＡ菌根菌を感染させて増殖させる方法が広く一般
に行なわれている。一方、ＶＡ菌根菌を容器内で無菌的
に培養しようという試みが行なわれており（特開平３−
８３５２２号公報）、また、その際に菌糸の増殖を補助
するためにオリゴ糖を加える技術も提案されている（特
開平４−３２０６７６号公報）。しかしながら、これら
の技術ではいずれも生きた植物根を用いており、いずれ
にしても生きた植物根を用いずにＶＡ菌根菌を培養する
ことはできなかった。

【０００５】ＶＡ菌根菌は自然界では胞子を形成し、越
冬する。この胞子は特に栄養を与えずとも生育に必要な
水分と温度，酸素の条件が整えば発芽し、菌糸を伸ば
す。この菌糸の伸長は、胞子と連続し、胞子からの栄養
物が供給される間は伸長する。しかしながら、一度菌糸
と胞子が切断されると、菌糸側の伸長は停止し、植物の
根に感染する力を失う。従って、菌糸が植物の根に感染
するためには、菌糸が胞子に連続しているか、或いは一
旦植物の根に感染し、植物から栄養物の供給を受けられ
るような態勢が必要である。

【０００６】ところで植物の組織や根の抽出物が、ＶＡ
菌根菌の胞子の発芽や発芽した菌糸の伸長を促進させる
ことについては、幾つかの報告がある。例えば、クズの
仲間の細胞を培地に加えると、スカテロスポラ・ヘテロ
ガマ（Scutellospora heterogama ）の胞子の発芽及び
菌糸の伸長が促進されたと報告されている（ CIENC PRA
T, 14(3), 1990, 308-316 ) 。また、ニンジンの根から
抽出された抽出物が胞子から発芽した菌糸の伸長を促進
したという報告（ New Phytol., 118(2), 1991, 289-29
4; Can. J. Bot., 68(6), 1990, 1260-1264; Appl. Env
iron. Microbiol., 55(9), 1989, 2320-2325）や、ニン
ジンの根から抽出されたフラボノールやフラボンがギガ
スポラ・マルガリタ（ Gigaspora margarita ）の菌糸
の伸長を促進したという報告（ J. Chem. Ecol. 19(1
0), 1993, 2317-2327 ）や、植物に含まれるフラボノイ
ド化合物のダイゼインやミリセチン，ケルセチンが、グ
ロムス・モセアエ（ Glomus moseae），グロムス・イン
トララディセス（ Glomus intraradicies ）の胞子から
発芽した菌糸を伸長させるという報告（ J. Plant Phys
iol. 141(1), 1993, 54-60）もある。

【０００７】さらに、クローバーの根の抽出物が、胞子
の発芽や菌糸の伸長を促進したという報告（ Symbiosi
s, 7(3), 1989, 243-256; Appl. Environ. Microbiol.,
53(8), 1987, 1928-1933 ）や、カンキツの根の抽出
物が、胞子発芽や菌糸伸長を促すという報告（ Mycolog
ia, 74(5), 1982, 831-835 ）もある。

【０００８】しかしながら、これらの報告は、いずれも
胞子の発芽や菌糸の伸長が促進されるという報告であ
り、ＶＡ菌根菌そのものを増殖させるという技術ではな
い。すなわち、菌糸の伸長は促進されても、植物根に感
染しない限り、いずれ菌糸は伸長が停止し、死に至る。

【０００９】以上のように、世界中でＶＡ菌根菌を単独
で培養する試みがなされてきたが、未だ生きた植物（植
物根）なしにＶＡ菌根菌を人工培養することはできなか
ったのが実情である。ＶＡ菌根菌が植物の根を用いずに
人工培養できるようになれば、ＶＡ菌根菌を安価に供給
できることになる。生きた毛状根などを使わずにＶＡ菌
根菌を単独で培養することができれば、雑菌に汚染され
ていない菌体を容易に得ることができる。このことは、
ＶＡ菌根菌の工業的利用の可能性を広げる他、植物との
共生を介してしか調べられなかったＶＡ菌根菌の生理的
性質をも調べることができ、学問的にも非常に重要であ
る。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、農業や園芸
業等の分野で有用なＶＡ菌根菌を、植物の生きた根を用
いることなしに、人工的に培養し得る方法を提供するこ
とを目的とするものである。本発明は、世界で初めてＶ
Ａ菌根菌を単独で人工培養する方法を提供しようとする
ものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、ＶＡ
菌根菌が感染し得る植物の根の抽出物を用いて、植物の
生きた根を用いることなしにＶＡ菌根菌の菌糸及び／又
は胞子を培養することを特徴とするＶＡ菌根菌の人工的
培養法を提供するものである。

【００１２】ここでＶＡ菌根菌が感染し得る植物として
は種々のものが挙げられる。具体的にはアヤメ科，イネ
科，イソマツ科，イチョウ科，ウリ科，カタバミ科，カ
ツラ科，キキョウ科，キク科，キンポウゲ科，クワ科，
ゴマノハグサ科，サクラ科，サクラソウ科，サトイモ
科，シソ科，シュウカイドウ科，スギ科，セリ科，タデ
科，ツユクサ科，ナス科，ナデシコ科，バラ科，ヒノキ
科，ヒユ科，フウロソウ科，ブドウ科，マキ科，マメ
科，ミカン科，ヤシ科，ヤマノイモ科，ユリ科，リョウ
ブ科及びリンドウ科から選ばれた一種の植物が挙げられ
る。本発明においては、これらの中でもイネ科の植物が
好ましい。

【００１３】イネ科の植物としては、カズノコグサ属，
ニクキビ属，メリケンカルカヤ属，トウモロコシ属，ジ
ュズダマ属，ウシノシッペイ属，アイアシ属，カモノハ
シ属，メガルカヤ属，ウシクサ属，オガルカヤ属，コブ
ナグサ属，ヒメアブラススキ属，モロコシ属，イタチガ
ヤ属，ウンヌケ属，アシボソ属，ワセオバナ属，オオア
ブラススキ属，ススキ属，チガヤ属，アブラススキ属，
カリマタガヤ属，ツキイゲ属，チゴザサ属，ビロードキ
ビ属，イヌビエ属，チヂミザサ属，ナルコビエ属，スズ
メノヒエ属，メヒシバ属，キビ属，ヌメリグサ属，エノ
コログサ属，チラカシバ属，ウキシバ属，トダシバ属，
ハイシバ属，シバ属，ネズミガヤ属，ネズミノオ属，オ
ヒゲシバ属，ギョウギシバ属，トリコグサ属，アゼガヤ
属，チョウセンガリヤス属，オヒシバ属，スズメガヤ
属，ウラハグサ属，ヌマガヤ属，タツノヒゲ属，タキキ
ビ属，ダンチク属，ヨシ属，ササクサ属，マコモ属，ツ
クシガヤ属，サヤヌカグサ属，ホガエリガヤ属，コメガ
ヤ属，ドジョウツナギ属，ナガハグサ属，チシマドジョ
ウツナギ属，ウシノケグサ属，ドクムギ属，コバンソウ
属，カモガヤ属，コウヤザサ属，スズメノチャヒキ属，
オオムギ属，エゾムギ属，カモジグサ属，コウボウ属，
ハルガヤ属，クサヨシ属，イブキヌカボ属，ハネガヤ
属，シラゲガヤ属，コメススキ属，ミノボロ属，カニツ
リグサ属，ミサヤマチャヒキ属，カラスムギ属，オオカ
ニツリ属，ノガリヤス属，ミノゴメ属，ヒエガエリ属，
ヌカボ属，アワガエリ属及びスズメノテッポウ属に属す
る植物が挙げられる。

【００１４】これらイネ科の植物のいずれであってもよ
いが、本発明ではトウモロコシ属（トウモロコシ），モ
ロコシ属（モロコシガヤなど），ススキ属（ススキ，カ
リヤスなど），チガヤ属（チガヤなど），イヌビエ属
（イヌビエなど），スズメノヒエ属（スズメノヒエ，ア
メリカスズメノヒエなど），メヒシバ属（メヒシバ，コ
メヒシバなど），キビ属（ヌカキビなど），エノコログ
サ属（イヌアワ，エノコログサなど），シバ属（シバ，
コウライシバなど），カモジグサ属（カモジグサな
ど），カラスムギ属（カラスムギなど），スズメノテッ
ポウ属（セトガヤ，スズメノテッポウなど）に属する植
物が好ましい。より好ましくはスズメノヒエ属に属する
植物（スズメノヒエ，アメリカスズメノヒエ，キシュウ
スズメノヒエ，サワスズメノヒエ，シマスズメノヒエ，
タチスズメノヒエ，ナガバスズメノヒエ，スズメノコビ
エなど）であり、特にアメリカスズメノヒエ（バヒアグ
ラス），スズメノヒエが好ましい。なお、これら植物を
使用するにあたっては、ＶＡ菌根菌を増殖させる物質
（抽出物中の有効成分）がより蓄積する生育期から生育
終了期のものを選定することがより好ましい。また、こ
れら植物としては、一種のみでなく、二種以上のものを
併用することもできる。

【００１５】本発明の方法は、上記した如きＶＡ菌根菌
が感染し得る植物の根の抽出物を用いて、植物の生きた
根を用いることなしにＶＡ菌根菌を培養することを特徴
とするものである。ＶＡ菌根菌が感染し得る植物の根の
抽出物は、上記した如きＶＡ菌根菌が感染し得る植物の
根から抽出されたものであって、その成分は必ずしも明
らかではないが、ＶＡ菌根菌が感染し得る植物の根か
ら、水溶性有機溶媒で溶出されたものである。ここで水
溶性有機溶媒としては、メタノール，エタノール，プロ
パノール，ｉ−プロパノール，ブタノール，ｉ−ブタノ
ール，ｔ−ブタノール，アセトン，メチルエチルケトン
及びこれらの混合物から選ばれた一種のものが挙げら
れ、特にメタノールが最適である。

【００１６】本発明においては、上記した如き水溶性有
機溶媒であって、水を含有するもの、すなわち含水水溶
性有機溶媒を用いることがより好ましい。このような含
水水溶性有機溶媒における水分の含有率は、使用する水
溶性有機溶媒の種類により異なり一義的に決定すること
は困難であるが、通常、５〜９５重量％程度である。こ
こで水分を含まない水溶性有機溶媒を抽出溶媒とした場
合には、抽出率が低くなり、また、水分の含有率があま
りに高過ぎると、抽出率が低下する他、不純物が多くな
るおそれがある。

【００１７】なお、抽出溶媒のｐＨは特にこだわらない
が、抽出後、ｐＨが著しく低かったり、或いは高かった
りすると、ＶＡ菌根菌の増殖培地のｐＨを変化させるた
め、抽出後のｐＨが４〜９の範囲となるものを使用する
ことが好ましい。また、抽出温度は、通常の抽出温度範
囲でよく、−２０℃〜１００℃の範囲である。このよう
にして得られる抽出物は、オートクレーブ中で１２０℃
に加熱し、培地を殺菌しても分解しない安定な物質であ
る。さらに、抽出時間は、溶媒の種類，含水率，温度に
もよるが、高温では数分、低温では１時間から数日あれ
ば抽出することができる。

【００１８】本発明の方法で用いる抽出物はこのように
して得られたものであり、これをそのまま、或いは蒸発
乾固することにより水溶性有機溶媒を除去し、好ましく
はオートクレーブ等を用いてさらに滅菌処理して、ＶＡ
菌根菌の菌糸や胞子を培養するための人工培地（又は人
工培地の一部）として使用することができる。本発明に
おいては、さらにこのような溶媒抽出物を分画して得ら
れる水溶性有機溶媒−水溶出画分のうち、水分含量が５
％以上の含水水溶性有機溶媒に溶出する成分（溶出物）
を、ＶＡ菌根菌の菌糸や胞子を培養するための人工培地
として用いることができる。この場合には、溶媒抽出物
を分画せずにそのまま用いる場合よりも、イオン交換樹
脂，活性炭，シリカゲルクロマト，逆相シリカゲルクロ
マト，分子篩，有機溶媒分画などの手法により精製する
方が、不純物や阻害物質が少なくなるため、より好まし
い。ここで水分含量が５％未満の含水水溶性有機溶媒に
溶出する成分（溶出物）、例えば１００％メタノール溶
出物を用いた場合には、ＶＡ菌根菌の菌糸等の生長が充
分でない。なお、分画するにあたっては、溶媒抽出物を
エバポレーター等を用いて濃縮し、得られた濃縮物をフ
ラッシュクロマトグラフ等を用いて分画すればよい。こ
のようにして得られる水分含量が５％以上の含水水溶性
有機溶媒に溶出する成分（溶出物）を、蒸発乾固するこ
とにより水溶性有機溶媒を除去し、好ましくはオートク
レーブ等を用いてさらに滅菌処理した後、これをＶＡ菌
根菌培養のための人工培地として用いればよい。なお、
培地を形成するために、上記抽出物や溶出物に、必要に
応じてムラシゲ・スクーグ培地（ＭＳ培地）の成分や寒
天を加えてもよい。

【００１９】以上の如くして得られる抽出物からなる培
地や溶出物からなる培地、さらに必要に応じてこれらに
無機塩類、ショ糖，オリゴ糖などの炭素源を加えた液体
培地や、さらに寒天等を加えた固体培地を用いて、ＶＡ
菌根菌の菌糸や胞子を培養すればよい。培養条件は通常
の条件でよく、温度は１０〜４５℃、好気条件下で培養
すればよい。人工培養の方法は、溶媒抽出物或いは上
記した如き特定の溶出物を蒸留水に懸濁し、滅菌処理し
た後、無菌的にＶＡ菌根菌の菌糸や胞子を接種し、培養
すればよいし、或いはＭＳ培地などの培地に、例えば
ＭＳ３培地に、溶媒抽出物或いは上記した如き特定の溶
出物を添加し、滅菌処理した後、ＶＡ菌根菌の菌糸や胞
子を接種し、培養すればよい。なお、上記の如き培養に
は、通常、培養に用いられている各種の栄養溶液を使用
することができ、またその濃度も特に制限はなく、通常
使用されている範囲内で良い。

【００２０】ここでＶＡ菌根菌は、土壌中に存在する接
合菌の一種であり、その菌糸が様々な植物の根について
菌根を形成し、両者が共生することが知られている。こ
のＶＡ菌根菌は、植物と共生し、これに感染した植物の
生長を促進したり、耐病性を向上させる働きがあること
が知られている。本発明の方法により人工培養し得るＶ
Ａ菌根菌としては、種々のものがあり、例えばギガスポ
ラ ( Gigaspora )属, グロムス（ Glomus ) 属，アカウ
ロスポラ（ Acaulospora )属, エントロフォスポラ（ E
ntrophospora )属, スクレロシスティス（ Sclerocysti
s ) 属, スカテロスポラ（ Scutellospora )属などに属
する微生物が挙げられる。

【００２１】これらＶＡ菌根菌の具体例を示すと、ギガ
スポラ ( Gigaspora )属に属するものとしては例えば、
ギガスポラ・ラミスポロホラ（ Gigaspora ramisporop
hora），ギガスポラ・アルビダ（ Gigaspora albida
）, ギガスポラ・マルガリタ（ Gigaspora margarita
），ギガスポラ・ギガンティア（ Gigaspora gigante
a ），ギガスポラ・ローゼア（ Gigaspora rosea )
，ギガスポラ・ヘテロガマ（ Gigaspora heterogama
)などを挙げることができる。なお、ギガスポラ・ラミ
スポロホラ（ Gigaspora ramisporophora ）は、米国
バージニア大学にあるＶＡ菌根菌の保存機関ＩＮＶＡＭ
にＪＡ１０１として登録，保存されている。また、日本
では本菌は、工業技術院生命工学工業技術研究所におい
て受託を拒否された。

【００２２】また、グロムス（ Glomus ) 属に属するも
のとしては例えば、グロムス・モセアエ（ Glomus moss
eae ），グロムス・ファシキュレータム（ Glomus fas
ciculatum ），グロムス・カレドニウム（ Glomus cal
edonium ），グロムス・イントララディセス（ Glomus
intraradicies ），グロムス・マニホティス（ Glomu
s manihotis )などを挙げることができる。この他、ス
カテロスポラ・グレガリア（ Scutellospora gregaria
），アカウロスポラ・ラエビス（ Acaulospora laev
is ）, エントロフォスポラ・インフレケンス（ Entro
phospora infrequens ），スクレロシスティス・ダッ
シ（Sclerocystis dussii ）などを挙げることができ
る。

【００２３】本発明の方法により人工培養し得るＶＡ菌
根菌としては、これらの中でもギガスポラ ( Gigaspora
)属，グロムス（ Glomus ) 属に属する微生物が好まし
い。

【００２４】本発明の方法によれば、ＶＡ菌根菌が感染
し得る植物の根の抽出物を用いることにより、生きた植
物（植物根）を用いることなく、このようなＶＡ菌根菌
の菌糸及び／又は胞子を用いるだけで、人工的にＶＡ菌
根菌を培養することができる。用いるＶＡ菌根菌は、菌
糸のみや胞子のみであってもよいし、或いは菌糸と胞子
の混合物であってもよい。また、毛状根を添加すること
もできるが、特に必須ではない。ＶＡ菌根菌胞子を集め
る方法としては、自然界から篩を用いて集める方法（鈴
木達彦，ＶＡ菌根に関する諸問題５、農業および園芸，
第６２巻，第３号，ｐ２８〜３３，１９８７年）や遠心
分離による方法（特開昭６３−３０９１７８号公報）が
知られている。また、栄養薄膜培養法（特開昭５５−１
１８３９０号公報）や器官培養した根を使用する方法
（特公昭６２−４９０３７号公報）等により無菌的にＶ
Ａ菌根菌を増殖させ、胞子を形成させる方法もあるが、
収集方法に特に制限はない。一方、ＶＡ菌根菌接種物と
されたものを用いる場合には、その起源は特に制限はな
く、市販品を用いることもできる。雑菌が混入している
条件下で集められた菌糸や胞子を接種源として用いる場
合には、クロラミンＴなどを用いて表面殺菌してから用
いることが望ましい。さらに、他のＶＡ菌根菌が混じり
合わないようにするため、胞子は単胞子を接種する方が
好ましい。

【００２５】本発明の方法によれば、ＶＡ菌根菌が感染
し得る植物の根の抽出物を用いて、ＶＡ菌根菌の菌糸及
び／又は胞子を培養することにより、植物の生きた根を
用いることなしに、初めてＶＡ菌根菌を人工的に培養す
ることが可能となった。

【００２６】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ ７月から９月の生育期間中に採取したバヒアグラス根を
蒸留水で洗浄した後、以下のようにして抽出・精製を行
なった。すなわち、このバヒアグラス根を８０％メタノ
ール中に入れ、一昼夜浸漬した後、東洋濾紙No.5C で濾
過した。このようにしてＶＡ菌根菌促進物質等を抽出し
た後、この抽出液（濾液）をエバポレーターを用いて濃
縮した。得られた濃縮液を、 chromatorex ODS DM1020T
（直径20mm, 長さ25cm）を装備したフラッシュクロマト
グラフ（富士シリシア化学製）を用いて精製し、５種の
メタノール溶出液（０％メタノール溶出物、１０％メタ
ノール溶出物、２５％メタノール溶出物、５０％メタノ
ール溶出物、１００％メタノール溶出物）を分離した。
これらの溶出液（０．４〜６ｇ根相当）を蒸発乾固し、
それぞれ１．４％の寒天を含む１０ｍｌの液体（蒸留
水）を加えて溶解した後、１２０℃にて１５分間オート
クレーブで滅菌して、ＶＡ菌根菌人工培養のための培地
とした。

【００２７】この培地をシャーレ（直径７ｃｍ）に無菌
的に移し、クリーン・ベンチ上において、このシャーレ
上に消毒したＶＡ菌根菌〔ギガスポラ・ラミスポロホラ
（ Gigaspora ramisporophora ）；なお、本菌は、米
国バージニア大学にあるＶＡ菌根菌の保存機関ＩＮＶＡ
ＭにＪＡ１０１として登録，保存されている。また、本
菌は、工業技術院生命工学工業技術研究所において受託
を拒否された。〕の胞子を置き、３０℃の暗黒下にて培
養した。なお、ＶＡ菌根菌の胞子の消毒は、この胞子を
含む水溶液１０ｍｌ中に、抗生物質（５％クロラミンＴ
と０．０４％ストレプトマイシン）を数滴落とし、１５
分間処理する方法により行なった。また、対照区とし
て、寒天のみを培地とした区についても同様にして培養
を行なった。

【００２８】培養を開始してから３週間後、菌糸の伸長
をＣＣＤカメラ付の実体顕微鏡及びパーソナルコンピュ
ーターによる画像処理法によって測定した。結果を第１
表及び図１に示す。なお、第１表中におけるＶＡ菌根菌
菌糸の長さの欄は、平均値±標準誤差を示した。また、
図１は、ＣＣＤカメラ付の実体顕微鏡及びパーソナルコ
ンピューターによる画像処理法によって測定した各区に
おけるバヒアグラス根抽出物とＶＡ菌根菌菌糸の生長状
態を示す図面である。図１において、ａは対照区、ｂは
０％メタノール溶出区、ｃは１０％メタノール溶出区、
ｄは２５％メタノール溶出区、ｅは５０％メタノール溶
出区、ｆは１００％メタノール溶出区を示している。

【００２９】

【表１】

【００３０】第１表及び図１によれば、対照区と比べ
て、２５％メタノール溶出区では、ＶＡ菌根菌の菌糸の
伸長が著しく促進されることが分かる。また、１００％
のメタノール溶出区においては、ＶＡ菌根菌の菌糸が伸
長しないことが分かる。

【００３１】実施例２ 上記実施例１において得られたバヒアグラス根からの８
０％メタノール抽出物のフラッシュクロマトグラフィー
による２５％メタノール溶出物（以下、バヒアグラス根
抽出物の２５％メタノール溶出物と称する。）につい
て、菌糸の伸長作用を、糸状菌の培養に広く用いられて
いるポテトデキストロース（ＰＤＡ）培地を用いて調べ
た。すなわち、実施例１と同様の方法により得られたバ
ヒアグラス根抽出物の２５％メタノール溶出物を蒸発乾
固し、１．４％の寒天を含む液体培地（蒸留水）を加え
て分散，溶解した後、１２１℃にて１５分間オートクレ
ーブで殺菌し、シャーレに移して、ＶＡ菌根菌人工培養
のための平板培地を作った。

【００３２】一方、１リットル中にポテト浸出液末４．
０ｇ、ブドウ糖２０．０ｇ、寒天１５．０ｇを溶かし、
１２１℃にて１５分間殺菌し、１０ｍｌずつシャーレに
移し、平板培地を作った。なお、ブドウ糖のみ、１／
４、１／２０に減らした培地も同様に作成した。

【００３３】これらの培地に、消毒したＶＡ菌根菌〔ギ
ガスポラ・ラミスポロホラ（ Gigaspora ramisporopho
ra ）〕の胞子を置き、３０℃の暗黒下にて２週間培養
し、菌糸の伸長を実施例１と同様にして測定した。な
お、ＶＡ菌根菌の胞子の消毒は実施例１と同様にして行
なった。さらに、対照区として、寒天のみを培地とした
区についても同様にして培養し、測定を行なった。結果
を第２表に示す。その結果、ＰＤＡ培地では菌糸の伸長
は殆ど進まず、パヒアグラス根抽出物の２５％メタノー
ル溶出物を加えた培地（本発明区）では、著しい菌糸の
伸長が起こった。なお、第２表中におけるＶＡ菌根菌菌
糸の長さの欄は、平均値±標準誤差を示した。

【００３４】

【表２】

【００３５】 実施例３（ＶＡ菌根菌の菌糸を用いての純粋培養実験） ＶＡ菌根菌の菌糸を用いて純粋培養を行なった。すなわ
ち、予め寒天のみの培地で生長させたＶＡ菌根菌〔ギガ
スポラ・ラミスポロホラ（ Gigaspora ramisporophora
）〕からの菌糸をクリーン・ベンチ上において、直径
７ｍｍのコルクボーラーで寒天ごと打抜き、採取した
（寒天ディスクの調製）。一方、実施例１と同様の方法
により得られたバヒアグラス根抽出物の２５％メタノー
ル溶出物（０．４ｇ根相当）を蒸発乾固した固形物を
１．４％の寒天を含む液体培地（蒸留水）１０ｍｌに懸
濁し、１２１℃にて１５分間滅菌処理した後、シャーレ
に移してＶＡ菌根菌人工培養のための平板培地を作っ
た。この平板培地の上に、上記のようにして得られた菌
糸のみを含む寒天ディスクを置き、３０℃の暗黒下で培
養した。また、対照区として、寒天のみを培地とした区
についても同様にして培養を行なった。

【００３６】培養を開始してから６０日後、寒天ディス
クからの菌糸の広がりを実体顕微鏡下で調査した。結果
を第３表に示す。なお、第３表中におけるＶＡ菌根菌の
培養菌叢（Ｒ）の長さは、第２図に示すところを測定
し、その長さは、平均値±標準誤差を示した。その結
果、対照区では、寒天ディスクからの菌糸の伸長は観察
されなかったが、バヒアグラス根抽出物の２５％メタノ
ール溶出物（液）を加えた区では、図３に示すように寒
天ディスクからの菌糸の伸長が著しかった。なお、図３
中、矢印で示したところが、ＶＡ菌根菌菌糸を含む寒天
ディスクである。

【００３７】

【表３】

【００３８】 実施例４（ＶＡ菌根菌の菌糸を用いての純粋培養実験） 完全人工培養した菌糸が、植物に感染し、根の中に菌根
を形成できることを調べた。実施例１と同様の方法によ
り得られたバヒアグラス根抽出物の２５％メタノール溶
出物（０．８ｇ根相当）を蒸発乾固した固形物に、１．
４％の寒天を含む液体（蒸留水）２０ｍｌを添加して溶
解し、この液を２００ｍｌ容のガラスビンに入れ、１２
１℃にて１５分間オートクレーブにて滅菌処理した。一
方、予め寒天のみの培地で生長させたＶＡ菌根菌〔ギガ
スポラ・ラミスポロホラ（ Gigaspora ramisporophora
）〕からの菌糸をクリーン・ベンチ上において、直径
７ｍｍのコルクボーラーで寒天ごと打抜き、採取した
（寒天ディスクの調製）。上記ガラスビンの底に寒天培
地が固化した後、この寒天培地上の中心部に、採取した
菌糸のみを含む寒天ディスクを置いた。このようなガラ
スビンを２個用意し、一方には寒天ディスクから２ｍｍ
離れた位置に、消毒したネギの種子を置き、もう一方に
は消毒したバヒアグラスの種子を置いた。このガラスビ
ンの口を綿栓で閉じ、２６℃の光条件下で１ヶ月間培養
した後、各植物根のＶＡ菌根菌の形成状態を染色して観
察した。その結果、図４（バヒアグラス根）と図５（ネ
ギ根）に示すように、菌糸が根に侵入し、樹枝状体が観
察され、菌糸から増殖したＶＡ菌根菌が植物の根に感染
し、共生関係を結ぶことが確認された。

【００３９】実施例５ 畑より集めたダイズ，ハコベ，タデ，ツユクサ，カタバ
ミ，シソ，スベリヒユ，トウモロコシ，ソルガムの根を
水道水にて洗浄し、土を除去した。それぞれの根の余分
な水分を濾紙で除去した後、５ｇを秤量し、１リットル
容の分液ロートに入れた。この分液ロートに水１５重量
部、メタノール４５重量部、エタノール４０重量部の混
合溶媒２００ｍｌを加え、密栓後、２４時間振とう抽出
した。その後、固形分が入らないように口紙で濾過しな
がら、１リットル容のナス型フラスコに入れ、蒸発乾固
した。次いで、ｎ−ヘキサンを１００ｍｌ加え、２４時
間放置し、その後、静かに上澄みのヘキサンを捨て、脂
質画分を除去した。さらに、酢酸エチル１００ｍｌを加
え、１時間静置した後、上澄みの酢酸エチルを捨てた。
次に、ナス型フラスコをエバポレーターにて吸引し、溶
媒を完全に除去した。溶媒を除去した後、１００ｍｌの
蒸留水を加え、固形物を水に分散させた。この溶解液を
口紙で濾過した後、濾液を三角フラスコに移し、１．４
ｇの寒天を加え、１２１℃にて１５分間殺菌した。その
後、この培地をシャーレ８枚に分注し、平板培地を作成
した。

【００４０】一方、ＶＡ菌根菌としてグロムス・エスピ
ー Ｒ−１０（ＡＴＣＣ ７４３１１）の胞子を１０ｍ
ｌの滅菌水に懸濁し、５％クロラミンＴと０．０４％ス
トレプトマイシンを数滴落とし、１５分間処理した。そ
の後、この胞子を滅菌水で洗浄し、１．４％の水寒天培
地１０枚に広げ、３０℃で２０日間暗黒条件下で培養し
た。２０日後に雑菌の混入していないシャーレ４枚につ
いて伸長した菌糸を、７ｍｍのコルクボーラーで打ち抜
いた。この胞子を含まない菌糸を用いて、グロムス・エ
スピー Ｒ−１０の人工培養を行なった。すなわち、先
に用意した種々の植物の根の抽出物を含んだシャーレを
各５枚用意し、中心部にコルクボーラーで打ち抜いた菌
糸を置き、２５℃で４０日間暗黒培養した。その後、伸
長した菌糸の長さについて、５枚のプレートの平均値を
求めた。結果を第４表に示した。

【００４１】

【表４】

【００４２】

【発明の効果】本発明によれば、世界で初めて生きた植
物（植物根）なしにＶＡ菌根菌を人工培養することが可
能となった。従って、本発明によれば、ＶＡ菌根菌を安
価に供給することができると共に、雑菌に汚染されてい
ない菌体を容易に得ることができる。このことは、ＶＡ
菌根菌の工業的利用の可能性を広げる他、植物との共生
を介してしか調べられなかったＶＡ菌根菌の生理的性質
をも調べることができ、学問的にも非常に重要である。
それ故、本発明は農業や園芸業等の分野で有効に利用す
ることができる。

【００４３】なお、本発明の各種態様を示すと以下の通
りである。 （１）．ＶＡ菌根菌が感染し得る植物の根の抽出物を用
いて、植物の生きた根を用いることなしにＶＡ菌根菌の
菌糸及び／又は胞子を培養することを特徴とするＶＡ菌
根菌の人工的培養法。

【００４４】（２）．ＶＡ菌根菌が感染し得る植物が、
アヤメ科，イネ科，イソマツ科，イチョウ科，ウリ科，
カタバミ科，カツラ科，キキョウ科，キク科，キンポウ
ゲ科，クワ科，ゴマノハグサ科，サクラ科，サクラソウ
科，サトイモ科，シソ科，シュウカイドウ科，スギ科，
セリ科，タデ科，ツユクサ科，ナス科，ナデシコ科，バ
ラ科，ヒノキ科，ヒユ科，フウロソウ科，ブドウ科，マ
キ科，マメ科，ミカン科，ヤシ科，ヤマノイモ科，ユリ
科，リョウブ科及びリンドウ科から選ばれた一種の植物
である、前記（１）記載の方法。

【００４５】（３）．ＶＡ菌根菌が感染し得る植物が、
イネ科作物である、前記（１）記載の方法。

【００４６】（４）．イネ科作物が、スズメノヒエ属に
属する植物である、前記（３）記載の方法。

【００４７】（５）．スズメノヒエ属に属するイネ科作
物が、バヒアグラスである、前記（４）記載の方法。

【００４８】（６）．抽出物が、ＶＡ菌根菌が感染し得
る植物の根から、水溶性有機溶媒で抽出されたものであ
る、前記（１）記載の方法。

【００４９】（７）．ＶＡ菌根菌が感染し得る植物が、
イネ科作物である、前記（６）記載の方法。

【００５０】（８）．水溶性有機溶媒が、メタノール，
エタノール，プロパノール，ｉ−プロパノール，ブタノ
ール，ｉ−ブタノール，ｔ−ブタノール，アセトン，メ
チルエチルケトン及びこれらの混合物から選ばれた一種
のものである、前記（６）記載の方法。

【００５１】（９）．ＶＡ菌根菌が感染し得る植物が、
イネ科作物であり、かつ、水溶性有機溶媒が、メタノー
ル，エタノール，プロパノール，ｉ−プロパノール，ブ
タノール，ｉ−ブタノール，ｔ−ブタノール，アセト
ン，メチルエチルケトン及びこれらの混合物から選ばれ
た一種のものである、前記（６）記載の方法。

【００５２】（１０）．ＶＡ菌根菌が感染し得る植物の
根から、水溶性有機溶媒で抽出された抽出物のうち、水
分含量が５％以上の水溶性有機溶媒に溶出する成分を用
いることを特徴とする、前記（１）記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１において測定した各区におけ
るバヒアグラス根抽出物とＶＡ菌根菌菌糸の生長状態を
示す図面である。

【図２】図２は、実施例３において調べたＶＡ菌根菌の
培養菌叢（Ｒ）の長さの測定箇所を示す説明図である。

【図３】図３は、実施例３におけるＶＡ菌根菌の培養菌
叢を示す顕微鏡写真（１５０倍）である。

【図４】図４は、実施例４におけるバヒアグラス根のＶ
Ａ菌根菌の形成状態を示す顕微鏡写真（１５０倍）であ
る。

【図５】図５は、実施例４におけるネギ根のＶＡ菌根菌
の形成状態を示す顕微鏡写真（１５０倍）である。

【符合の説明】

ａ 対照区 ｂ ０％メタノール溶出区 ｃ １０％メタノール溶出区 ｄ ２５％メタノール溶出区 ｅ ５０％メタノール溶出区 ｆ １００％メタノール溶出区 Ｒ ＶＡ菌根菌の培養菌叢の長さの測定箇所

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年５月１７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＶＡ菌根菌が感染し得る植物の根の抽出
   物を用いて、植物の生きた根を用いることなしにＶＡ菌
   根菌の菌糸及び／又は胞子を培養することを特徴とする
   ＶＡ菌根菌の人工的培養法。
2. 【請求項２】 ＶＡ菌根菌が感染し得る植物が、アヤメ
   科，イネ科，イソマツ科，イチョウ科，ウリ科，カタバ
   ミ科，カツラ科，キキョウ科，キク科，キンポウゲ科，
   クワ科，ゴマノハグサ科，サクラ科，サクラソウ科，サ
   トイモ科，シソ科，シュウカイドウ科，スギ科，セリ
   科，タデ科，ツユクサ科，ナス科，ナデシコ科，バラ
   科，ヒノキ科，ヒユ科，フウロソウ科，ブドウ科，マキ
   科，マメ科，ミカン科，ヤシ科，ヤマノイモ科，ユリ
   科，リョウブ科及びリンドウ科から選ばれた一種の植物
   である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 ＶＡ菌根菌が感染し得る植物が、イネ科
   作物である請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 イネ科作物が、スズメノヒエ属に属する
   植物である請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 スズメノヒエ属に属するイネ科作物が、
   バヒアグラスである請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 抽出物が、ＶＡ菌根菌が感染し得る植物
   の根から、水溶性有機溶媒で抽出されたものである請求
   項１記載の方法。
7. 【請求項７】 ＶＡ菌根菌が感染し得る植物が、イネ科
   作物である請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 水溶性有機溶媒が、メタノール，エタノ
   ール，プロパノール，ｉ−プロパノール，ブタノール，
   ｉ−ブタノール，ｔ−ブタノール，アセトン，メチルエ
   チルケトン及びこれらの混合物から選ばれた一種のもの
   である請求項６記載の方法。
9. 【請求項９】 ＶＡ菌根菌が感染し得る植物が、イネ科
   作物であり、かつ、水溶性有機溶媒が、メタノール，エ
   タノール，プロパノール，ｉ−プロパノール，ブタノー
   ル，ｉ−ブタノール，ｔ−ブタノール，アセトン，メチ
   ルエチルケトン及びこれらの混合物から選ばれた一種の
   ものである請求項６記載の方法。
10. 【請求項１０】 ＶＡ菌根菌が感染し得る植物の根か
    ら、水溶性有機溶媒で抽出された抽出物のうち、水分含
    量が５％以上の水溶性有機溶媒に溶出する成分を用いる
    ことを特徴とする請求項１記載の方法。