JPH08193097A - 生物忌避タンパク質及びその固定化方法 - Google Patents
生物忌避タンパク質及びその固定化方法Info
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- JPH08193097A JPH08193097A JP441795A JP441795A JPH08193097A JP H08193097 A JPH08193097 A JP H08193097A JP 441795 A JP441795 A JP 441795A JP 441795 A JP441795 A JP 441795A JP H08193097 A JPH08193097 A JP H08193097A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 イソギンチャク類に属する海生生物をホモジ
ナイズし、得られる粗抽出液を遠心分離し、該遠心分離
後の上澄液を透析し、得られる透析内液をイオン交換ク
ロマトグラフィー、次いでゲルクロマトグラフィー処理
することによって得られる、分子量が約40,000であっ
て、かつ生物忌避作用及び抗菌作用を有する生物忌避タ
ンパク質、共重合体化合物への前記生物忌避タンパク質
の固定化方法、前記生物忌避タンパク質を有効成分とし
て含む塗料及び該塗料の製造方法。 【効果】 本発明により、優れた生物忌避作用を有する
タンパク質が得られる。
ナイズし、得られる粗抽出液を遠心分離し、該遠心分離
後の上澄液を透析し、得られる透析内液をイオン交換ク
ロマトグラフィー、次いでゲルクロマトグラフィー処理
することによって得られる、分子量が約40,000であっ
て、かつ生物忌避作用及び抗菌作用を有する生物忌避タ
ンパク質、共重合体化合物への前記生物忌避タンパク質
の固定化方法、前記生物忌避タンパク質を有効成分とし
て含む塗料及び該塗料の製造方法。 【効果】 本発明により、優れた生物忌避作用を有する
タンパク質が得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、海産汚損生物等の生物
が忌避する作用及び抗菌作用を有するタンパク質、該タ
ンパク質の固定化方法及び該タンパク質を有効成分とし
て含む塗料及び該塗料の製造方法に関する。
が忌避する作用及び抗菌作用を有するタンパク質、該タ
ンパク質の固定化方法及び該タンパク質を有効成分とし
て含む塗料及び該塗料の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】フジツボ類やムラサキガイ類等は、火
力、原子力発電所の冷却水路系をはじめ、海洋の人工施
設、船舶の船底、漁網等に付着して、取水障害、施設の
劣化、航海速力の低下、又は漁業妨害等の様々な障害を
引き起こす原因となる海産汚損生物である。
力、原子力発電所の冷却水路系をはじめ、海洋の人工施
設、船舶の船底、漁網等に付着して、取水障害、施設の
劣化、航海速力の低下、又は漁業妨害等の様々な障害を
引き起こす原因となる海産汚損生物である。
【０００３】このため、これらの生物を防除するために
数多くの汚損生物防除対策が試みられてきた（海洋の付
着生物，1974, 海洋科学, Symposium-54, 海洋出版
（株）；梶原 武 編，1986, 海洋付着生物と水産増養
殖，恒星社厚生閣）。最近は、海産生物等から抽出した
生理活性物質についての研究開発がなされている（マリ
ンバイオテクノロジー研究会，1992，第一回マリンバイ
オテクノロジー研究発表講演要旨）。
数多くの汚損生物防除対策が試みられてきた（海洋の付
着生物，1974, 海洋科学, Symposium-54, 海洋出版
（株）；梶原 武 編，1986, 海洋付着生物と水産増養
殖，恒星社厚生閣）。最近は、海産生物等から抽出した
生理活性物質についての研究開発がなされている（マリ
ンバイオテクノロジー研究会，1992，第一回マリンバイ
オテクノロジー研究発表講演要旨）。
【０００４】しかし、これらの生理活性物質について
は、冷却水路や人工施設等の基盤（鉄板、コンクリート
等）にこれら生理活性物質を塗布又は固定化し、実際に
上記生物を忌避させるという技術は未だ開発されていな
い。また、重金属や有機性毒物を含む汚損生物防除物
質、（亜酸化銅，トリフェニル錫等）も開発されている
が（環境基準）、それらの使用は環境破壊の原因となる
ため好ましくない。
は、冷却水路や人工施設等の基盤（鉄板、コンクリート
等）にこれら生理活性物質を塗布又は固定化し、実際に
上記生物を忌避させるという技術は未だ開発されていな
い。また、重金属や有機性毒物を含む汚損生物防除物
質、（亜酸化銅，トリフェニル錫等）も開発されている
が（環境基準）、それらの使用は環境破壊の原因となる
ため好ましくない。
【０００５】そこで、環境に影響を与えず、しかもこれ
ら問題点を解決し得る効果的な生物忌避物質の開発が緊
急の課題となっている。
ら問題点を解決し得る効果的な生物忌避物質の開発が緊
急の課題となっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、環境に影響
を及ぼさず、海産汚損生物に対して有効な忌避作用を有
し、かつ、前記作用が長時間持続するタンパク質、該タ
ンパク質の固定化方法、該タンパク質を有効成分として
含む塗料及び該塗料の製造方法を提供することを目的と
する。
を及ぼさず、海産汚損生物に対して有効な忌避作用を有
し、かつ、前記作用が長時間持続するタンパク質、該タ
ンパク質の固定化方法、該タンパク質を有効成分として
含む塗料及び該塗料の製造方法を提供することを目的と
する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に基づいて鋭意研究を行った結果、イソギンチャク類に
属する海産生物から抽出した生理活性物質が海産汚損生
物などに対して有効に忌避作用及び抗菌作用を有するこ
とを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、
本発明は、イソギンチャク類に属する海生生物をホモジ
ナイズし、得られる粗抽出液を遠心分離し、該遠心分離
後の上澄液を透析し、得られる透析内液をイオン交換ク
ロマトグラフィー、次いでゲルクロマトグラフィー処理
することによって得られる、分子量が約40,000であっ
て、かつ生物忌避作用及び抗菌作用を有する生物忌避タ
ンパク質である。
に基づいて鋭意研究を行った結果、イソギンチャク類に
属する海産生物から抽出した生理活性物質が海産汚損生
物などに対して有効に忌避作用及び抗菌作用を有するこ
とを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、
本発明は、イソギンチャク類に属する海生生物をホモジ
ナイズし、得られる粗抽出液を遠心分離し、該遠心分離
後の上澄液を透析し、得られる透析内液をイオン交換ク
ロマトグラフィー、次いでゲルクロマトグラフィー処理
することによって得られる、分子量が約40,000であっ
て、かつ生物忌避作用及び抗菌作用を有する生物忌避タ
ンパク質である。
【０００８】イソギンチャク類に属する海生生物として
は、ウメボシイソギンチャク科に属する生物、例えばヨ
ロイイソギンチャク等が挙げられる。さらに、本発明
は、前記生物忌避タンパク質、式Ｉ：
は、ウメボシイソギンチャク科に属する生物、例えばヨ
ロイイソギンチャク等が挙げられる。さらに、本発明
は、前記生物忌避タンパク質、式Ｉ：
【０００９】
【化３】
【００１０】（Ｒは炭素数２〜６のアルキレン基を示
す）で表される化合物及びカルボニル基を有する共重合
化合物を反応させることを特徴とする共重合化合物への
前記タンパク質の固定化方法である。さらに、本発明
は、上記生物忌避タンパク質を有効成分として含む塗料
である。
す）で表される化合物及びカルボニル基を有する共重合
化合物を反応させることを特徴とする共重合化合物への
前記タンパク質の固定化方法である。さらに、本発明
は、上記生物忌避タンパク質を有効成分として含む塗料
である。
【００１１】なお、上記生物忌避作用において対象とな
る生物としては、フジツボ類、ムラサキガイ類等の海産
汚損生物が挙げられる。さらに、本発明は、式Ｉ：
る生物としては、フジツボ類、ムラサキガイ類等の海産
汚損生物が挙げられる。さらに、本発明は、式Ｉ：
【００１２】
【化４】
【００１３】（Ｒは前記と同じである）で表される化合
物、カルボニル基を有する共重合化合物及び前記生物忌
避タンパク質を反応させることを特徴とする上記塗料の
製造方法である。上記カルボニル基を有する共重合化合
物としては、ヒドラジン基架橋剤を含む水溶性アクリル
共重合物塗料（例えば、アクロナール：三菱化成（株）
製）等が挙げられる。
物、カルボニル基を有する共重合化合物及び前記生物忌
避タンパク質を反応させることを特徴とする上記塗料の
製造方法である。上記カルボニル基を有する共重合化合
物としては、ヒドラジン基架橋剤を含む水溶性アクリル
共重合物塗料（例えば、アクロナール：三菱化成（株）
製）等が挙げられる。
【００１４】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）本発明のタンパク質の製造 本発明のタンパク質については、以下の方法により製造
する。すなわち、イソギンチャク類に属する海生生物を
ホモジナイズして粗抽出液を得、これを遠心分離し、得
られる上澄液をセルロースチューブ等を用いて透析す
る。次いで、得られる透析内液をイオン交換クロマトグ
ラフィー、次いでゲルクロマトグラフィー処理を行っ
て、活性の認められた分画を本発明のタンパク質として
得る。
する。すなわち、イソギンチャク類に属する海生生物を
ホモジナイズして粗抽出液を得、これを遠心分離し、得
られる上澄液をセルロースチューブ等を用いて透析す
る。次いで、得られる透析内液をイオン交換クロマトグ
ラフィー、次いでゲルクロマトグラフィー処理を行っ
て、活性の認められた分画を本発明のタンパク質として
得る。
【００１５】用いる海生生物としては、イソギンチャク
類に属するものであれば特に限定されず、例えば、ウメ
ボシイソギンチャク科のヨロイイソギンチャク等が挙げ
られる。試料（ヨロイイソギンチャク）のホモジナイズ
は、例えば、以下の方法により行う。
類に属するものであれば特に限定されず、例えば、ウメ
ボシイソギンチャク科のヨロイイソギンチャク等が挙げ
られる。試料（ヨロイイソギンチャク）のホモジナイズ
は、例えば、以下の方法により行う。
【００１６】体壁に付着した不純物（砂，海藻類等）を
除去したイソギンチャクのサンプル30ｇあたり、0.15Ｍ
のNaCl、５mＭのEDTA及び0.1mＭのPMSF（フェニルメタ
ンスルホニルフルオリド）を含む緩衝液（pH7.0) 300ml
を添加し、ホモジナイザー（東京理科製）を用いて組織
を破壊し、褐色の粗抽出液を得る。そして、該粗抽出液
を氷冷下で30分程放置して以下の精製に使用する。
除去したイソギンチャクのサンプル30ｇあたり、0.15Ｍ
のNaCl、５mＭのEDTA及び0.1mＭのPMSF（フェニルメタ
ンスルホニルフルオリド）を含む緩衝液（pH7.0) 300ml
を添加し、ホモジナイザー（東京理科製）を用いて組織
を破壊し、褐色の粗抽出液を得る。そして、該粗抽出液
を氷冷下で30分程放置して以下の精製に使用する。
【００１７】遠心分離は、試料溶液内の固形物質（細胞
破砕物）を除くことができる程度の条件で行い、通常
は、10,000×ｇで20分間遠心する。透析については、通
常の透析方法に従って行うことができる。例えば、透析
膜（セルロースチューブ：VISKASE 製セルロースチュー
ブ等）に試料を入れ、試料中に含まれる無機塩類等の低
分子物質を除くのに必要な条件を備えた十分な量の緩衝
液、例えば、0.15ＭのNaCl、0.5mＭのEDTAを含む緩衝液
（pH6.9 ；３L）に入れ、５℃で約24時間透析する。こ
れを必要に応じて３〜４回繰り返し、10mＭのTris (pH
8.0)で安定化させる。
破砕物）を除くことができる程度の条件で行い、通常
は、10,000×ｇで20分間遠心する。透析については、通
常の透析方法に従って行うことができる。例えば、透析
膜（セルロースチューブ：VISKASE 製セルロースチュー
ブ等）に試料を入れ、試料中に含まれる無機塩類等の低
分子物質を除くのに必要な条件を備えた十分な量の緩衝
液、例えば、0.15ＭのNaCl、0.5mＭのEDTAを含む緩衝液
（pH6.9 ；３L）に入れ、５℃で約24時間透析する。こ
れを必要に応じて３〜４回繰り返し、10mＭのTris (pH
8.0)で安定化させる。
【００１８】このようにして得られた透析内液をイオン
交換クロマトグラフィー、次いでゲルクロマトグラフィ
ーにより精製する。各クロマトグラフィーの使用機器、
試薬等は、通常市販されたものを用いることができる。
イオン交換クロマトグラフィーに使用するイオン交換体
としてはDEAEトヨパール（東ソー社製）、Ｑセファロー
ス（ファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、ゲル
クロマトグラフィーに使用される機器としては、排出限
界分子量3,000 〜70,000のプレパックカラム（ファルマ
シアバイオテク社製）等が挙げられ、抽出溶液として
は、10mM Tris及びNaCl（０〜0.1M ）を用いる（pH8.
0）。
交換クロマトグラフィー、次いでゲルクロマトグラフィ
ーにより精製する。各クロマトグラフィーの使用機器、
試薬等は、通常市販されたものを用いることができる。
イオン交換クロマトグラフィーに使用するイオン交換体
としてはDEAEトヨパール（東ソー社製）、Ｑセファロー
ス（ファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、ゲル
クロマトグラフィーに使用される機器としては、排出限
界分子量3,000 〜70,000のプレパックカラム（ファルマ
シアバイオテク社製）等が挙げられ、抽出溶液として
は、10mM Tris及びNaCl（０〜0.1M ）を用いる（pH8.
0）。
【００１９】以上のようにして分画されたタンパク質に
ついて、フジツボ類、ムラサキガイ類に対する忌避作用
を指標としたバイオアッセイを行い、活性の得られた分
画を本発明の精製タンパク質として得る。バイオアッセ
イ方法は、以下の通りである。径17mm、深さ15mm、容量
２mlのマルチウェル（培養孔24個；ファルコン社製）に
各濃度に調製した分画溶液を満たし、ノープリウス幼生
を投入後、経時的にその活動、生死状態を観察し、計数
を行う。
ついて、フジツボ類、ムラサキガイ類に対する忌避作用
を指標としたバイオアッセイを行い、活性の得られた分
画を本発明の精製タンパク質として得る。バイオアッセ
イ方法は、以下の通りである。径17mm、深さ15mm、容量
２mlのマルチウェル（培養孔24個；ファルコン社製）に
各濃度に調製した分画溶液を満たし、ノープリウス幼生
を投入後、経時的にその活動、生死状態を観察し、計数
を行う。
【００２０】ノープリウス幼生遊泳行動は、以下の５段
階に分けられる（図１参照）。 Ｉ：活発に遊泳し、容器の底に着くことはない。 II：容器の底に着くことはあっても、再び遊泳するか、
動き回る。 III：容器の底に着いたままであるが、他の個体が接触
すると動き回る。 IV：容器の底に着いたままで、付属肢がたまに動く（他
の個体が接触しても動き回らない）。
階に分けられる（図１参照）。 Ｉ：活発に遊泳し、容器の底に着くことはない。 II：容器の底に着くことはあっても、再び遊泳するか、
動き回る。 III：容器の底に着いたままであるが、他の個体が接触
すると動き回る。 IV：容器の底に着いたままで、付属肢がたまに動く（他
の個体が接触しても動き回らない）。
【００２１】Ｖ：完全に動きが停止する（死亡個体には
原生動物が発生する）。 効果の判定は、遊泳能力を失い、マルチウェルの底に停
止した上記III〜Ｖの状態（Immobilized Condition:遊
泳行動阻害・停止状態）の個体を、倒立実体顕微鏡下で
経時的に算定し、投入総個体数に対する百分率（指数）
を算出する。該指数をＩＭＩ（Immobilized Index)と定
義し、効果判定の指標とする。
原生動物が発生する）。 効果の判定は、遊泳能力を失い、マルチウェルの底に停
止した上記III〜Ｖの状態（Immobilized Condition:遊
泳行動阻害・停止状態）の個体を、倒立実体顕微鏡下で
経時的に算定し、投入総個体数に対する百分率（指数）
を算出する。該指数をＩＭＩ（Immobilized Index)と定
義し、効果判定の指標とする。
【００２２】本発明のタンパク質の理化学的性質のう
ち、分子量については、分子量既知マーカーを用いたゲ
ルクロマトグラフィーの検量線あるいは電気泳動等によ
り測定する。 （２）タンパク質の固定化方法 次に、本発明のタンパク質の固定化方法について説明す
る。
ち、分子量については、分子量既知マーカーを用いたゲ
ルクロマトグラフィーの検量線あるいは電気泳動等によ
り測定する。 （２）タンパク質の固定化方法 次に、本発明のタンパク質の固定化方法について説明す
る。
【００２３】本発明のタンパク質は、塗料等に混合して
使用することが可能である。但し、本発明のタンパク質
は単に混合しただけではタンパク質が均一に混ざらな
い、忌避効果を発揮するだけの物質量に達しない、タン
パク質が流出する等の点で好ましくない。そこで、上記
タンパク質を担体に固定化する方法について鋭意研究し
た結果、上記タンパク質と塗料の主成分である共重合体
化合物とを式Ｉ：
使用することが可能である。但し、本発明のタンパク質
は単に混合しただけではタンパク質が均一に混ざらな
い、忌避効果を発揮するだけの物質量に達しない、タン
パク質が流出する等の点で好ましくない。そこで、上記
タンパク質を担体に固定化する方法について鋭意研究し
た結果、上記タンパク質と塗料の主成分である共重合体
化合物とを式Ｉ：
【００２４】
【化５】
【００２５】（Ｒは炭素数２〜６のアルキレン基を示
す）で表される化合物（架橋剤）を介して結合させるこ
とにより、上記タンパク質が共重合体上に固定され、し
かも上記タンパク質の活性が保持されることがわかっ
た。このように共重合体化合物上に固定化された上記タ
ンパク質の構造は、図２に示すとおり、式Ｉ：
す）で表される化合物（架橋剤）を介して結合させるこ
とにより、上記タンパク質が共重合体上に固定され、し
かも上記タンパク質の活性が保持されることがわかっ
た。このように共重合体化合物上に固定化された上記タ
ンパク質の構造は、図２に示すとおり、式Ｉ：
【００２６】
【化６】
【００２７】（Ｒは前記と同じである）で表される化合
物が有する２個のヒドラジド基のうちの、一方のヒドラ
ジド基に上記タンパク質が結合し、他方のヒドラジド基
に共重合体化合物が結合したもの（ヒドラジド基がタン
パク質及び共重合化合物のカルボニル基と常温で架橋構
造を作る）と推定される。尚、図２において、Ｒ１及び
Ｒ２はペプチド結合におけるアミノ酸側鎖を示す。 （３）次に、本発明のタンパク質を有効成分として含む
塗料及びその製法について説明する。
物が有する２個のヒドラジド基のうちの、一方のヒドラ
ジド基に上記タンパク質が結合し、他方のヒドラジド基
に共重合体化合物が結合したもの（ヒドラジド基がタン
パク質及び共重合化合物のカルボニル基と常温で架橋構
造を作る）と推定される。尚、図２において、Ｒ１及び
Ｒ２はペプチド結合におけるアミノ酸側鎖を示す。 （３）次に、本発明のタンパク質を有効成分として含む
塗料及びその製法について説明する。
【００２８】上記タンパク質、カルボニル基を有する共
重合体化合物及び式Ｉで示されるヒドラジン化合物を常
温で均一になるように混合し、上記タンパク質を含む塗
料を得る。上記塗料としては、特に共重合体化合物及び
ヒドラジン化合物を含む水性塗料が好ましい。塗料成分
の共重合体化合物としては、例えばアクリル酸等が挙げ
られる。
重合体化合物及び式Ｉで示されるヒドラジン化合物を常
温で均一になるように混合し、上記タンパク質を含む塗
料を得る。上記塗料としては、特に共重合体化合物及び
ヒドラジン化合物を含む水性塗料が好ましい。塗料成分
の共重合体化合物としては、例えばアクリル酸等が挙げ
られる。
【００２９】本発明のタンパク質と水溶性塗料との混合
比は、タンパク質水溶液１mlに対して塗料１ml以上であ
るが、塗料中からタンパク質が溶出しない範囲としてタ
ンパク質と塗料との比率が３mg/ml 以上であるのが好ま
しい。また、式Ｉの化合物の使用量は、基盤１cm2 当た
りタンパク質６〜34μg、塗料1.5ml である。固定化の
反応条件は、常温で均一になるように混合し、塗布後水
分を揮発させることによって結合反応を進行させ、少な
くとも24時間以上乾燥させることが望ましい。
比は、タンパク質水溶液１mlに対して塗料１ml以上であ
るが、塗料中からタンパク質が溶出しない範囲としてタ
ンパク質と塗料との比率が３mg/ml 以上であるのが好ま
しい。また、式Ｉの化合物の使用量は、基盤１cm2 当た
りタンパク質６〜34μg、塗料1.5ml である。固定化の
反応条件は、常温で均一になるように混合し、塗布後水
分を揮発させることによって結合反応を進行させ、少な
くとも24時間以上乾燥させることが望ましい。
【００３０】本発明の塗料は、陶器、プラスチック板、
コンクリート等に塗布し、約24時間常温で乾燥させる
と、その基盤（壁面）に固定されるので、海水や淡水中
に浸漬しても長期間（３〜６カ月）剥離したり劣化した
りすることはない。尚、本発明の塗料は、上記プラスチ
ック板、コンクリート等の基盤に直接塗布できるほか、
裏面に接着剤が塗布されたフィルムの表面に本発明の塗
料を塗布しておき、目的とする壁面の大きさや材質に応
じて使い分ける（貼り分ける）ことも可能である。
コンクリート等に塗布し、約24時間常温で乾燥させる
と、その基盤（壁面）に固定されるので、海水や淡水中
に浸漬しても長期間（３〜６カ月）剥離したり劣化した
りすることはない。尚、本発明の塗料は、上記プラスチ
ック板、コンクリート等の基盤に直接塗布できるほか、
裏面に接着剤が塗布されたフィルムの表面に本発明の塗
料を塗布しておき、目的とする壁面の大きさや材質に応
じて使い分ける（貼り分ける）ことも可能である。
【００３１】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。 〔実施例１〕 タンパク質の精製 神奈川県城ヶ島の岩礁より入手したヨロイイソギンチャ
ク(Anthopleura japonica VERRILL)の表皮に付着してい
る細砂、海藻等を取り除き、湿重量30ｇを、0.15M NaC
l、５mM EDTA 及び0.1mM PMSFを含む緩衝液300 ml（pH
7.0）に入れ、ホモジナイザー（東京理科製）を用いて
ホモジナイズした。得られるホモジナイズ懸濁液を氷冷
下で30分放置し、粗抽出液を得た。次に、該抽出液を1
0,000×ｇで20分、遠心分離を行った（５℃）。遠心後
上澄液を採取し、以下のように透析を行った。セルロー
スチューブ（VISKASE 製）の透析膜に上澄液を入れ、0.
15M NaCl、５mM EDTA を含む緩衝液３L （pH 6.9）に対
して５℃で24時間透析した。これを溶液が着色しなくな
るまで３〜４回繰り返し、10mＭのTris (pH8.0)で安定
化させ、以下に行うクロマトグラフ処理のサンプルを得
た。
明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。 〔実施例１〕 タンパク質の精製 神奈川県城ヶ島の岩礁より入手したヨロイイソギンチャ
ク(Anthopleura japonica VERRILL)の表皮に付着してい
る細砂、海藻等を取り除き、湿重量30ｇを、0.15M NaC
l、５mM EDTA 及び0.1mM PMSFを含む緩衝液300 ml（pH
7.0）に入れ、ホモジナイザー（東京理科製）を用いて
ホモジナイズした。得られるホモジナイズ懸濁液を氷冷
下で30分放置し、粗抽出液を得た。次に、該抽出液を1
0,000×ｇで20分、遠心分離を行った（５℃）。遠心後
上澄液を採取し、以下のように透析を行った。セルロー
スチューブ（VISKASE 製）の透析膜に上澄液を入れ、0.
15M NaCl、５mM EDTA を含む緩衝液３L （pH 6.9）に対
して５℃で24時間透析した。これを溶液が着色しなくな
るまで３〜４回繰り返し、10mＭのTris (pH8.0)で安定
化させ、以下に行うクロマトグラフ処理のサンプルを得
た。
【００３２】10mM Tris で浸潤させた陰イオン交換体
（DEAEトヨパール; 東ソー社製) にサンプルをアプライ
し、抽出液として10mM Tris及びNaCl（０〜0.1M ）を用
い（pH8.0）、濃度勾配法(NaCl を０〜0.1M まで変化)
によってイオン交換クロマトグラフィーに掛けた（カラ
ム径２cm，高さ60cm）。その結果、１つのピークが得ら
れ（図３）、この分画をファルマシアバイオテク製Hi-L
oad 16/60 Superdex75（分子量3,000 〜70,000）を用い
て、150mM 酢酸アンモニウムにより流速2.0ml/分の条件
で溶出を行い、分子量40,000のピーク（peak A) 及び5,
000 以下のピーク(peak B)を得た（図４）。得られた各
分画のフジツボノープリウス幼生を用いたバイオアッセ
イを行った結果、各分画で忌避効果が認められた（図
５，「●」及び「○」印）。 〔実施例２〕 タンパク質の固定化方法 本研究で得られた忌避物質は水溶性タンパク質であるた
め、立体構造を壊さないで表面に保持する方法として、
化学結合による連結が考えられる。そこで、３種類のペ
イントのうち、水溶性エマルジョン塗料を選定し、混合
・塗布・溶出実験を行った。その結果、タンパク質と水
溶性エマルジョン塗料は均一に混合でき、素焼き板、プ
ラスチック、ビニール樹脂等の基盤に塗布することが可
能であることがわかった。
（DEAEトヨパール; 東ソー社製) にサンプルをアプライ
し、抽出液として10mM Tris及びNaCl（０〜0.1M ）を用
い（pH8.0）、濃度勾配法(NaCl を０〜0.1M まで変化)
によってイオン交換クロマトグラフィーに掛けた（カラ
ム径２cm，高さ60cm）。その結果、１つのピークが得ら
れ（図３）、この分画をファルマシアバイオテク製Hi-L
oad 16/60 Superdex75（分子量3,000 〜70,000）を用い
て、150mM 酢酸アンモニウムにより流速2.0ml/分の条件
で溶出を行い、分子量40,000のピーク（peak A) 及び5,
000 以下のピーク(peak B)を得た（図４）。得られた各
分画のフジツボノープリウス幼生を用いたバイオアッセ
イを行った結果、各分画で忌避効果が認められた（図
５，「●」及び「○」印）。 〔実施例２〕 タンパク質の固定化方法 本研究で得られた忌避物質は水溶性タンパク質であるた
め、立体構造を壊さないで表面に保持する方法として、
化学結合による連結が考えられる。そこで、３種類のペ
イントのうち、水溶性エマルジョン塗料を選定し、混合
・塗布・溶出実験を行った。その結果、タンパク質と水
溶性エマルジョン塗料は均一に混合でき、素焼き板、プ
ラスチック、ビニール樹脂等の基盤に塗布することが可
能であることがわかった。
【００３３】〔実施例３〕 タンパク質を含む塗料、そ
の製造方法及びその生物忌避効果実施例１で調製された
タンパク質１mgに対し、水溶性塗料（水溶性エマルジョ
ン塗料：三菱油化社製）を0.3 ml以下となるように混合
比率の異なる混合液を調製した（タンパク質１mlに対
し、塗料0.5 ml〜４ml）。本発明のタンパク質は水溶性
のものであり、タンパク質はペプチド結合により構成さ
れている。選択した塗料は水溶性エマルジョンで、常温
で水分の蒸発とともに、分散している共重合物にカルボ
ニル−ヒドラジド基による架橋構造を作るヒドラジン誘
導体が加えられたものである。従って、この塗料とタン
パク質を混合し、基盤に塗布した場合、水分の蒸発とと
もにタンパク質のペプチド結合のカルボニル基と塗料の
ヒドラジド基が化学的に結合し、被膜を作る。
の製造方法及びその生物忌避効果実施例１で調製された
タンパク質１mgに対し、水溶性塗料（水溶性エマルジョ
ン塗料：三菱油化社製）を0.3 ml以下となるように混合
比率の異なる混合液を調製した（タンパク質１mlに対
し、塗料0.5 ml〜４ml）。本発明のタンパク質は水溶性
のものであり、タンパク質はペプチド結合により構成さ
れている。選択した塗料は水溶性エマルジョンで、常温
で水分の蒸発とともに、分散している共重合物にカルボ
ニル−ヒドラジド基による架橋構造を作るヒドラジン誘
導体が加えられたものである。従って、この塗料とタン
パク質を混合し、基盤に塗布した場合、水分の蒸発とと
もにタンパク質のペプチド結合のカルボニル基と塗料の
ヒドラジド基が化学的に結合し、被膜を作る。
【００３４】このようにして得られた混合比率の異なる
上記本発明のタンパク質を混合した塗料（本発明のタン
パク質／水溶性塗料＝0.５〜４，図６参照）を、素焼き
板（35cm2 ）に0.2 〜1.23mg塗布し、24時間室温で放置
した。次に、各素焼き板を東京湾沿岸に約１週間浸漬
し、フジツボ類の付着状況を試験した。尚、フジツボ類
の付着状況については、１混合比率あたり２〜３枚の素
焼き板群を用いた。また、対照区として、本発明のタン
パク質を含まない塗料及び素焼き板そのものを用いた。
上記本発明のタンパク質を混合した塗料（本発明のタン
パク質／水溶性塗料＝0.５〜４，図６参照）を、素焼き
板（35cm2 ）に0.2 〜1.23mg塗布し、24時間室温で放置
した。次に、各素焼き板を東京湾沿岸に約１週間浸漬
し、フジツボ類の付着状況を試験した。尚、フジツボ類
の付着状況については、１混合比率あたり２〜３枚の素
焼き板群を用いた。また、対照区として、本発明のタン
パク質を含まない塗料及び素焼き板そのものを用いた。
【００３５】結果を図６に示す。図６より、対照区(con
t.) と比較して、本発明の塗料を塗布した群では、フジ
ツボ類の付着数が減少した。 〔実施例４〕 本発明の塗料の野外浸漬試験 本発明の塗料（忌避物質）を素焼き板（35cm2 ）に0.2
〜1.23mg塗布し、磯子及び八景島小路の潮間帯位置に、
51〜96日間浸漬した。試験には、対照区として、塗料を
塗布しないケース（コントロール）及び本発明のタンパ
ク質を含まない従来の塗料を塗布したケース（エマルジ
ョン塗料）を設けた。付着状況の判定は藻類が基盤を覆
う比率（被度％）によった。
t.) と比較して、本発明の塗料を塗布した群では、フジ
ツボ類の付着数が減少した。 〔実施例４〕 本発明の塗料の野外浸漬試験 本発明の塗料（忌避物質）を素焼き板（35cm2 ）に0.2
〜1.23mg塗布し、磯子及び八景島小路の潮間帯位置に、
51〜96日間浸漬した。試験には、対照区として、塗料を
塗布しないケース（コントロール）及び本発明のタンパ
ク質を含まない従来の塗料を塗布したケース（エマルジ
ョン塗料）を設けた。付着状況の判定は藻類が基盤を覆
う比率（被度％）によった。
【００３６】結果を図７に示す。図７より、本発明の塗
料（忌避物質１，２，３）を塗布したケースでの藻類の
被度は20％以下で、対照区（無塗布：100 ％）に比べて
少なく、本発明の塗料による藻類の付着抑制効果が認め
られた。 〔参考例１〕本発明のタンパク質（忌避物質；0.1 〜10
mg/l) を用いて、ヒメダカ、スジエビ、ムラサキガイ等
に対するＴＬｍ試験（Median Tolerance Limit; 汚濁物
質の毒作用を示す一つの標準値で、50％致死濃度を測定
する試験）を行った。
料（忌避物質１，２，３）を塗布したケースでの藻類の
被度は20％以下で、対照区（無塗布：100 ％）に比べて
少なく、本発明の塗料による藻類の付着抑制効果が認め
られた。 〔参考例１〕本発明のタンパク質（忌避物質；0.1 〜10
mg/l) を用いて、ヒメダカ、スジエビ、ムラサキガイ等
に対するＴＬｍ試験（Median Tolerance Limit; 汚濁物
質の毒作用を示す一つの標準値で、50％致死濃度を測定
する試験）を行った。
【００３７】その結果、本発明のタンパク質濃度が0.1
〜10mg/lの範囲では死亡個体はみられず、本発明のタン
パク質は生物に対する毒性を有さない環境に優しいもの
であることがわかった（表１）。
〜10mg/lの範囲では死亡個体はみられず、本発明のタン
パク質は生物に対する毒性を有さない環境に優しいもの
であることがわかった（表１）。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【発明の効果】本発明により、優れた生物忌避作用を有
するタンパク質、その固定化法及び該タンパク質を有効
成分として含む塗料並びに該塗料の製造方法を提供する
ことができる。本発明の塗料は毒性が少ないため、環境
破壊を伴うことなく上記の優れた海産汚損生物忌避作
用、抗菌作用を有する。
するタンパク質、その固定化法及び該タンパク質を有効
成分として含む塗料並びに該塗料の製造方法を提供する
ことができる。本発明の塗料は毒性が少ないため、環境
破壊を伴うことなく上記の優れた海産汚損生物忌避作
用、抗菌作用を有する。
【図１】ノープリウス幼生の遊泳行動を示す図である。
【図２】タンパク質、共重合化合物及びヒドラジン化合
物の結合状態を示す図である。
物の結合状態を示す図である。
【図３】イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図
である。
である。
【図４】ゲルクロマトグラフィーの結果を示す図であ
る。
る。
【図５】フジツボノープリウス幼生を用いたバイオアッ
セイの結果を示す図である。
セイの結果を示す図である。
【図６】本発明の塗料の野外浸漬試験における生物忌避
作用の結果を示す図である。
作用の結果を示す図である。
【図７】野外浸漬試験の生物忌避作用における生物の形
態を示す写真である。
態を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松崎 加奈恵 東京都大田区蒲田５丁目38番３号 朝日ビ ル７Ｆ 千代田デイムス・アンド・ムーア 株式会社 (72)発明者 青山 郁子 東京都大田区蒲田５丁目38番３号 朝日ビ ル７Ｆ 千代田デイムス・アンド・ムーア 株式会社 (72)発明者 小川 数也 東京都杉並区高円寺南２−24−23 中井研 究室
Claims (6)
- 【請求項１】 イソギンチャク類に属する海生生物をホ
モジナイズし、得られる粗抽出液を遠心分離し、該遠心
分離後の上澄液を透析し、得られる透析内液をイオン交
換クロマトグラフィー、次いでゲルクロマトグラフィー
処理することによって得られる、分子量が約40,000であ
って、かつ生物忌避作用及び抗菌作用を有する生物忌避
タンパク質。 - 【請求項２】 イソギンチャク類に属する海生生物がウ
メボシイソギンチャク科に属する生物である請求項１記
載の生物忌避タンパク質。 - 【請求項３】 ウメボシイソギンチャク科に属する生物
がヨロイイソギンチャクである請求項２記載の生物忌避
タンパク質。 - 【請求項４】 請求項１乃至３のいずれかに記載の生物
忌避タンパク質、式Ｉ： 【化１】 （Ｒは炭素数２〜６のアルキレン基を示す）で表される
化合物及びカルボニル基を有する共重合体化合物を反応
させることを特徴とする共重合体化合物への前記生物忌
避タンパク質の固定化方法。 - 【請求項５】 請求項１乃至３のいずれかに記載の生物
忌避タンパク質を有効成分として含む塗料。 - 【請求項６】 式Ｉ： 【化２】 （Ｒは前記と同じである）で表される化合物、カルボニ
ル基を有する共重合化合物及び請求項１乃至３のいずれ
かに記載の生物忌避タンパク質を反応させることを特徴
とする請求項５記載の塗料の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP441795A JPH08193097A (ja) | 1995-01-13 | 1995-01-13 | 生物忌避タンパク質及びその固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP441795A JPH08193097A (ja) | 1995-01-13 | 1995-01-13 | 生物忌避タンパク質及びその固定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08193097A true JPH08193097A (ja) | 1996-07-30 |
Family
ID=11583720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP441795A Pending JPH08193097A (ja) | 1995-01-13 | 1995-01-13 | 生物忌避タンパク質及びその固定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08193097A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006335891A (ja) * | 2005-06-02 | 2006-12-14 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 水性防汚塗料組成物 |
| JP2010540431A (ja) * | 2007-09-20 | 2010-12-24 | テル ハショメール メディカル リサーチ インフラストラクチャ アンド サービシーズ リミテッド | 細胞接着の予防のための水生生物起源の組成物、及びこれを使用する方法 |
-
1995
- 1995-01-13 JP JP441795A patent/JPH08193097A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006335891A (ja) * | 2005-06-02 | 2006-12-14 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 水性防汚塗料組成物 |
| JP2010540431A (ja) * | 2007-09-20 | 2010-12-24 | テル ハショメール メディカル リサーチ インフラストラクチャ アンド サービシーズ リミテッド | 細胞接着の予防のための水生生物起源の組成物、及びこれを使用する方法 |
| US20110119774A1 (en) * | 2007-09-20 | 2011-05-19 | Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And S | Compositions of aquatic origin for prevention of cell adhesion and methods of using same |
| JP2014074077A (ja) * | 2007-09-20 | 2014-04-24 | Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd | 細胞接着の予防のための水生生物起源の組成物、及びこれを使用する方法 |
| AU2008300156B2 (en) * | 2007-09-20 | 2014-10-30 | Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd | Compositions of aquatic origin for prevention of cell adhesion and methods of using same |
| US9737571B2 (en) * | 2007-09-20 | 2017-08-22 | Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. | Compositions of aquatic origin for prevention of cell adhesion and methods of using same |
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