JPH08196271A - 生理活性物質分泌性のハイブリッド型ゲル - Google Patents
生理活性物質分泌性のハイブリッド型ゲルInfo
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- JPH08196271A JPH08196271A JP7101475A JP10147595A JPH08196271A JP H08196271 A JPH08196271 A JP H08196271A JP 7101475 A JP7101475 A JP 7101475A JP 10147595 A JP10147595 A JP 10147595A JP H08196271 A JPH08196271 A JP H08196271A
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 生理活性物質をコードする遺伝子を組込んだ
発現ベクターを保有する生理活性物質産生細胞が、生体
由来のゲルに封入または重層されている生理活性物質分
泌性のハイブリッド型ゲル。 【効果】 この発明のハイブリッド型ゲルを用いること
により、長期間安定して薬物投与が可能となり、患者に
対する苦痛も緩和でき、しかも投与量の微調整が可能
で、従来のように野生型への変異等の危険性のあるレト
ロウイルス由来のベクターを用いることなしに、体外か
らの遺伝子制御が可能な、皮膚移植による遺伝子処方が
可能となる。
発現ベクターを保有する生理活性物質産生細胞が、生体
由来のゲルに封入または重層されている生理活性物質分
泌性のハイブリッド型ゲル。 【効果】 この発明のハイブリッド型ゲルを用いること
により、長期間安定して薬物投与が可能となり、患者に
対する苦痛も緩和でき、しかも投与量の微調整が可能
で、従来のように野生型への変異等の危険性のあるレト
ロウイルス由来のベクターを用いることなしに、体外か
らの遺伝子制御が可能な、皮膚移植による遺伝子処方が
可能となる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、生理活性物質分泌性
のハイブリッド型ゲルに関するものである。さらに詳し
くは、この発明は、生体機能の維持に必要な生理活性物
質の長期にわたる持続的な投与を必要とする種々の難治
性疾患の治療に用いる人工皮膚等の外用処方剤に有用
な、生理活性物質分泌性の新しいハイブリッド型ゲルに
関するものである。
のハイブリッド型ゲルに関するものである。さらに詳し
くは、この発明は、生体機能の維持に必要な生理活性物
質の長期にわたる持続的な投与を必要とする種々の難治
性疾患の治療に用いる人工皮膚等の外用処方剤に有用
な、生理活性物質分泌性の新しいハイブリッド型ゲルに
関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】生体の細胞が本来具備してい
る機能が、何らかの原因により消失あるいは低下するこ
とに起因した疾病の治療法としては、主に以下の３通り
が考えられる。すなわち、消失あるいは低下した機能
を、 １）薬物投与によって補う、 ２）臓器移植・組織移植・細胞移植などによって補う、 ３）遺伝子治療によって補う。
る機能が、何らかの原因により消失あるいは低下するこ
とに起因した疾病の治療法としては、主に以下の３通り
が考えられる。すなわち、消失あるいは低下した機能
を、 １）薬物投与によって補う、 ２）臓器移植・組織移植・細胞移植などによって補う、 ３）遺伝子治療によって補う。
【０００３】たとえばインスリン依存性糖尿病について
みると、このインスリン依存性糖尿病の場合、膵臓ラン
ゲルハンス島に存在するβ細胞（血糖値を負の方向に調
節する機能をもつインスリンを産生する細胞）が破壊さ
れている。従って、インスリン依存性糖尿病の患者は、
血糖値が高く、その結果、糖尿病の名の由来である尿中
の糖濃度も上昇する。血糖値が高い状態が続くと、生体
の種々の細胞の機能が傷害され、これが糖尿病の深刻な
合併症の原因となる。
みると、このインスリン依存性糖尿病の場合、膵臓ラン
ゲルハンス島に存在するβ細胞（血糖値を負の方向に調
節する機能をもつインスリンを産生する細胞）が破壊さ
れている。従って、インスリン依存性糖尿病の患者は、
血糖値が高く、その結果、糖尿病の名の由来である尿中
の糖濃度も上昇する。血糖値が高い状態が続くと、生体
の種々の細胞の機能が傷害され、これが糖尿病の深刻な
合併症の原因となる。
【０００４】このため、インスリン依存性糖尿病の治療
には、不足したインスリンを外から投与して血糖値を制
御しなければならない。インスリン依存性糖尿病患者は
生涯にわたって毎日数回のインスリン投与が必要であ
る。これは患者にとって肉体的・精神的に大きな苦痛で
あるばかりでなく、患者自身による薬物の投与には常に
誤投与による生命の危険性が内在している。
には、不足したインスリンを外から投与して血糖値を制
御しなければならない。インスリン依存性糖尿病患者は
生涯にわたって毎日数回のインスリン投与が必要であ
る。これは患者にとって肉体的・精神的に大きな苦痛で
あるばかりでなく、患者自身による薬物の投与には常に
誤投与による生命の危険性が内在している。
【０００５】そこで、このインスリンの自己投与を代替
する方法として、膵臓あるいはランゲルハンス島の移植
による治療法が実施されている（窪田敬一・出月康夫、
日本臨床、４８：１０５２，１９９０）。しかしなが
ら、これらの方法には、ドナー不足、移植した臓器また
は組織の患者による免疫的拒絶の制御の困難さ、さらに
は高度な技術を必要とする移植手術の困難さ、手術の危
険性など問題点が多い。
する方法として、膵臓あるいはランゲルハンス島の移植
による治療法が実施されている（窪田敬一・出月康夫、
日本臨床、４８：１０５２，１９９０）。しかしなが
ら、これらの方法には、ドナー不足、移植した臓器また
は組織の患者による免疫的拒絶の制御の困難さ、さらに
は高度な技術を必要とする移植手術の困難さ、手術の危
険性など問題点が多い。
【０００６】一方、１９９０年代に入ってから米国を中
心に臨床試験の行われている遺伝子治療は、以上を解決
する新しい医療技術である（N. M. SUMMERS. BIOTECHNO
LOGY１２：４２，１９９４）。これによる糖尿病の治療
方法のアイデアもすでに提唱されている（R. F. SELDEN
etal, THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE ３１７
（１７）：１０６７，１９８７）。この治療法の場合に
は、培養細胞にインスリン遺伝子を導入し、この細胞を
患者の体内に移植して、導入遺伝子が産生するインスリ
ンを持続的に体内に分泌させようとするものである。し
かし、この方法は、現在のところ移植したインスリン産
生細胞によるインスリン分泌を制御することが困難なこ
とや、一度体内に移植された細胞を回収できないなど、
多くの問題点をかかえている。また、この遺伝子治療
は、上記のインスリン依存性糖尿病や、重症免疫不全症
等の遺伝子病ばかりでなく、ガン、エイズなどの難治性
疾患の治療にも有望である先端医療技術であることが知
られており、そのための様々な試みが提案され、かつ、
実際にもこの遺伝子治療法が行われつつあるが、これら
の遺伝子治療においては、その多くのものは、レトロウ
イルス由来のベクターを用い、ウイルスの細胞感染を利
用して細胞内に遺伝子を導入するという手法が考慮され
ている。
心に臨床試験の行われている遺伝子治療は、以上を解決
する新しい医療技術である（N. M. SUMMERS. BIOTECHNO
LOGY１２：４２，１９９４）。これによる糖尿病の治療
方法のアイデアもすでに提唱されている（R. F. SELDEN
etal, THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE ３１７
（１７）：１０６７，１９８７）。この治療法の場合に
は、培養細胞にインスリン遺伝子を導入し、この細胞を
患者の体内に移植して、導入遺伝子が産生するインスリ
ンを持続的に体内に分泌させようとするものである。し
かし、この方法は、現在のところ移植したインスリン産
生細胞によるインスリン分泌を制御することが困難なこ
とや、一度体内に移植された細胞を回収できないなど、
多くの問題点をかかえている。また、この遺伝子治療
は、上記のインスリン依存性糖尿病や、重症免疫不全症
等の遺伝子病ばかりでなく、ガン、エイズなどの難治性
疾患の治療にも有望である先端医療技術であることが知
られており、そのための様々な試みが提案され、かつ、
実際にもこの遺伝子治療法が行われつつあるが、これら
の遺伝子治療においては、その多くのものは、レトロウ
イルス由来のベクターを用い、ウイルスの細胞感染を利
用して細胞内に遺伝子を導入するという手法が考慮され
ている。
【０００７】しかしながら、このレトロウイルス由来の
ベクターを用いる手法においては、その遺伝子導入の効
率はウイルスの細胞への親和性に依存し、かつ、不活性
化したウイルスベクターが生体内で野生型のレトロウイ
ルスに変異する危険性を内在している。また、一般に、
従来考えられている遺伝子治療では、導入した遺伝子の
体外からの制御が困難であるという問題がある。
ベクターを用いる手法においては、その遺伝子導入の効
率はウイルスの細胞への親和性に依存し、かつ、不活性
化したウイルスベクターが生体内で野生型のレトロウイ
ルスに変異する危険性を内在している。また、一般に、
従来考えられている遺伝子治療では、導入した遺伝子の
体外からの制御が困難であるという問題がある。
【０００８】そこで、この発明は、従来の遺伝子治療法
の有効性を念頭に置きつつ、その問題を解決するために
なされたものであって、生理活性物質をコードする遺伝
子を導入した細胞を皮膚に移植して、導入遺伝子を体外
から制御可能とする新しい技術手段を提供することを目
的としている。さらに詳しくは、遺伝子を導入した生理
活性物質産生細胞をハイブリッド型ゲル（細胞組込み型
ゲル）として生体の皮膚に移植可能とすることで、従来
技術の欠点を解消することを目的としている。
の有効性を念頭に置きつつ、その問題を解決するために
なされたものであって、生理活性物質をコードする遺伝
子を導入した細胞を皮膚に移植して、導入遺伝子を体外
から制御可能とする新しい技術手段を提供することを目
的としている。さらに詳しくは、遺伝子を導入した生理
活性物質産生細胞をハイブリッド型ゲル（細胞組込み型
ゲル）として生体の皮膚に移植可能とすることで、従来
技術の欠点を解消することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、生理活性物質産生細胞と生体由
来のゲルとからなる生理活性物質分泌性のハイブリッド
型ゲルを提供する。このようなハイブリッド型ゲルにお
いては、生理活性物質産生細胞は生体由来のゲルに封入
されるか、またはゲル上に重層されるか、もしくは生理
活性物質産生細胞を封入したゲル上に重層されることを
好ましい態様とする。
を解決するものとして、生理活性物質産生細胞と生体由
来のゲルとからなる生理活性物質分泌性のハイブリッド
型ゲルを提供する。このようなハイブリッド型ゲルにお
いては、生理活性物質産生細胞は生体由来のゲルに封入
されるか、またはゲル上に重層されるか、もしくは生理
活性物質産生細胞を封入したゲル上に重層されることを
好ましい態様とする。
【００１０】またこの発明は、生理活性物質産生細胞、
皮膚細胞および生体由来のゲルからなる生理活性物質分
泌性のハイブリッド型ゲルを提供する。このようなハイ
ブリッド型ゲルにおいては、生理活性物質産生細胞を封
入した生体由来のゲル上に皮膚細胞が重層されること、
皮膚細胞を封入したゲル上に生理活性物質産生細胞が重
層されること、皮膚細胞と生理活性物質産生細胞とがゲ
ルに封入されること、もしくは皮膚細胞と生理活性物質
産生細胞とを封入したゲル上に皮膚細胞または生理活性
物質産生細胞が重層されること等を好ましい態様とす
る。
皮膚細胞および生体由来のゲルからなる生理活性物質分
泌性のハイブリッド型ゲルを提供する。このようなハイ
ブリッド型ゲルにおいては、生理活性物質産生細胞を封
入した生体由来のゲル上に皮膚細胞が重層されること、
皮膚細胞を封入したゲル上に生理活性物質産生細胞が重
層されること、皮膚細胞と生理活性物質産生細胞とがゲ
ルに封入されること、もしくは皮膚細胞と生理活性物質
産生細胞とを封入したゲル上に皮膚細胞または生理活性
物質産生細胞が重層されること等を好ましい態様とす
る。
【００１１】そして、上記態様のうち、生理活性物質産
生細胞がゲルに封入される場合には、細胞が網状体また
は多孔質膜と共にゲルに封入されていることを好ましい
態様としてもいる。さらに、この発明では、上記の生理
活性物質産生細胞が、インスリン等の生理活性物質をコ
ードする遺伝子を組込んだ発現ベクターを保有する皮膚
細胞（例えば、皮膚線維芽細胞、皮膚表皮細胞など）で
あり、その発現ベクターが、インスリンｃＤＮＡとネオ
マイシン耐性遺伝子を組み込んだプラスミド・ベクター
ｐＢＭＧ・ｎｅｏ・ｉｎｓまたは酵素フリンにより変換
可能で且つ安定性に優れたインスリンを発現する変異イ
ンスリン遺伝子を組み込んだプラスミド・ベクターｐＲ
ＩＳ・ｐｒｏｉｎｓ・Ｉｆｕｒ・IIｆｕｒ・Ｂ１０Ｄで
あること等をその態様としてもいる。
生細胞がゲルに封入される場合には、細胞が網状体また
は多孔質膜と共にゲルに封入されていることを好ましい
態様としてもいる。さらに、この発明では、上記の生理
活性物質産生細胞が、インスリン等の生理活性物質をコ
ードする遺伝子を組込んだ発現ベクターを保有する皮膚
細胞（例えば、皮膚線維芽細胞、皮膚表皮細胞など）で
あり、その発現ベクターが、インスリンｃＤＮＡとネオ
マイシン耐性遺伝子を組み込んだプラスミド・ベクター
ｐＢＭＧ・ｎｅｏ・ｉｎｓまたは酵素フリンにより変換
可能で且つ安定性に優れたインスリンを発現する変異イ
ンスリン遺伝子を組み込んだプラスミド・ベクターｐＲ
ＩＳ・ｐｒｏｉｎｓ・Ｉｆｕｒ・IIｆｕｒ・Ｂ１０Ｄで
あること等をその態様としてもいる。
【００１２】
【作用】この発明のハイブリッド型ゲルにおいては、ゲ
ル中に封入または重層された細胞が生体に必要な、ある
いは不足している生理活性物質を産生し、それらが持続
的に生体内に分泌される。また、生理活性物質産生細胞
が、メッシュ等の網状体または多孔質の高分子膜等と共
にゲルに封入されることによって、その生理活性物質産
生量が増加し、たとえば人工皮膚等の外用処方剤として
有効に利用することができる。生理活性物質を発現する
遺伝子は例えばプラスミド・ベクターによって細胞に導
入されるため、従来の遺伝子治療のようにレトロウイル
ス由来のベクターによる野生型レトロウイルスへの変異
の危険性はない。また、遺伝子導入細胞を皮膚に移植す
ることにより、導入した遺伝子の体外からの制御も容易
となる。
ル中に封入または重層された細胞が生体に必要な、ある
いは不足している生理活性物質を産生し、それらが持続
的に生体内に分泌される。また、生理活性物質産生細胞
が、メッシュ等の網状体または多孔質の高分子膜等と共
にゲルに封入されることによって、その生理活性物質産
生量が増加し、たとえば人工皮膚等の外用処方剤として
有効に利用することができる。生理活性物質を発現する
遺伝子は例えばプラスミド・ベクターによって細胞に導
入されるため、従来の遺伝子治療のようにレトロウイル
ス由来のベクターによる野生型レトロウイルスへの変異
の危険性はない。また、遺伝子導入細胞を皮膚に移植す
ることにより、導入した遺伝子の体外からの制御も容易
となる。
【００１３】より具体的には、以下の作用が得られる。 １）移植後は、患者の意識することなく長期間安定に薬
物を投与することが可能である。このことにより従来の
反復投与による治療が患者へ与えていた肉体的、精神的
苦痛を大きく緩和することができる。 ２）皮膚への移植およびその除去はきわめて簡単な手術
であるため、治療の経過を見ながら人工皮膚の量を随時
調節可能である。このことにより、治療に最適な条件を
見いだすことが容易になる。
物を投与することが可能である。このことにより従来の
反復投与による治療が患者へ与えていた肉体的、精神的
苦痛を大きく緩和することができる。 ２）皮膚への移植およびその除去はきわめて簡単な手術
であるため、治療の経過を見ながら人工皮膚の量を随時
調節可能である。このことにより、治療に最適な条件を
見いだすことが容易になる。
【００１４】３）生理活性物質をコードするＤＮＡ配列
を適当なプロモーターを用いて発現させ、人工皮膚移植
部位にプロモーター特異的な種々の誘導刺激（各種ホル
モン、重金属、温度など）を与えることにより、ゲル中
またはゲル上の細胞による薬物の分泌量を制御できる。
これにより、分泌量の微調整が可能である。 ４）移植細胞はゲルに封入または重層されているため、
患者の免疫的拒絶を受けにくい。したがって、一般に組
織などの移植時に汎用される免疫抑制剤の量を少なくす
ることができる。このことは、免疫抑制剤による副作用
の危険性を大きく低下させることができる。もちろん患
者自身の細胞を用いる遺伝子治療では、自家移植である
ため免疫的拒絶は問題でなくなる。
を適当なプロモーターを用いて発現させ、人工皮膚移植
部位にプロモーター特異的な種々の誘導刺激（各種ホル
モン、重金属、温度など）を与えることにより、ゲル中
またはゲル上の細胞による薬物の分泌量を制御できる。
これにより、分泌量の微調整が可能である。 ４）移植細胞はゲルに封入または重層されているため、
患者の免疫的拒絶を受けにくい。したがって、一般に組
織などの移植時に汎用される免疫抑制剤の量を少なくす
ることができる。このことは、免疫抑制剤による副作用
の危険性を大きく低下させることができる。もちろん患
者自身の細胞を用いる遺伝子治療では、自家移植である
ため免疫的拒絶は問題でなくなる。
【００１５】５）入院の必要のない簡単な手術で行える
ため、手術にともなう危険性はなく安全である。また、
皮膚への移植であるので、移植の状態が外部から常に観
察できる。必要に応じ、移植した人工皮膚の除去も可能
である。この発明においては、各種の生理活性物質産生
細胞は、そのための遺伝子を組込んだ発現ベクターを細
胞に組込んだものとして用いることができる。例えば、
インスリンを産生する細胞は、インスリンのｃＤＮＡと
ネオマイシン耐性遺伝子（選別マーカー）を組み込んだ
プラスミドベクターｐＢＭＧ・ｎｅｏ・ｉｎｓを定法に
従って動物細胞にトランスフェクトして調製することが
できる。あるいは、インスリン遺伝子が発現するプロイ
ンスリンを酵素フリンによってインスリンに変換可能
で、且つインスリンＢ鎖の第１０番目のアミノ酸置換に
より安定性に優れたインスリンを発現する変異インスリ
ン遺伝子を組み込んだプラスミドベクターｐＲＩＳ・ｐ
ｒｏｉｎｓ・Ｉｆｕｒ・IIｆｕｒ・Ｂ１０Ｄを動物細胞
にトランスフェクトしてもよい。
ため、手術にともなう危険性はなく安全である。また、
皮膚への移植であるので、移植の状態が外部から常に観
察できる。必要に応じ、移植した人工皮膚の除去も可能
である。この発明においては、各種の生理活性物質産生
細胞は、そのための遺伝子を組込んだ発現ベクターを細
胞に組込んだものとして用いることができる。例えば、
インスリンを産生する細胞は、インスリンのｃＤＮＡと
ネオマイシン耐性遺伝子（選別マーカー）を組み込んだ
プラスミドベクターｐＢＭＧ・ｎｅｏ・ｉｎｓを定法に
従って動物細胞にトランスフェクトして調製することが
できる。あるいは、インスリン遺伝子が発現するプロイ
ンスリンを酵素フリンによってインスリンに変換可能
で、且つインスリンＢ鎖の第１０番目のアミノ酸置換に
より安定性に優れたインスリンを発現する変異インスリ
ン遺伝子を組み込んだプラスミドベクターｐＲＩＳ・ｐ
ｒｏｉｎｓ・Ｉｆｕｒ・IIｆｕｒ・Ｂ１０Ｄを動物細胞
にトランスフェクトしてもよい。
【００１６】また、生理活性物質産生細胞を封入または
重層するゲルは、たとえば生体由来のコラーゲン、フィ
ブリン、アガロース等から定法に従って調製し、使用す
ることができる。たとえば、インスリン遺伝子を組込ん
だ細胞を封入したハイブリッド型ゲルを糖尿病治療用の
人工皮膚として使用する場合について説明すると、次の
ように考えることができる。
重層するゲルは、たとえば生体由来のコラーゲン、フィ
ブリン、アガロース等から定法に従って調製し、使用す
ることができる。たとえば、インスリン遺伝子を組込ん
だ細胞を封入したハイブリッド型ゲルを糖尿病治療用の
人工皮膚として使用する場合について説明すると、次の
ように考えることができる。
【００１７】（１）実験動物の体表から皮膚片を採取
し、主な構成細胞である表皮細胞と線維芽細胞を分離し
培養する。 （２）インスリン遺伝子を組み込んだ発現ベクターをこ
れらの細胞に組み込み、インスリンを分泌する細胞株を
得る。 （３）コラーゲンゲル等を用いて、これらの細胞株より
インスリン分泌能を有するハイブリッド型人工皮膚を構
築する。
し、主な構成細胞である表皮細胞と線維芽細胞を分離し
培養する。 （２）インスリン遺伝子を組み込んだ発現ベクターをこ
れらの細胞に組み込み、インスリンを分泌する細胞株を
得る。 （３）コラーゲンゲル等を用いて、これらの細胞株より
インスリン分泌能を有するハイブリッド型人工皮膚を構
築する。
【００１８】（４）インスリン分泌性のハイブリッド型
人工皮膚を移植する。 より具体的にさらに説明すると、この発明の、生理活性
物質分泌性のハイブリッド型ゲルは、たとえば、ASAGA
等の方法（H. ASAGA etal, EXPERIMENTAL CELLRESEARCH
１９３：１６７，１９９１）に準じ、以下の様にして
作製することができる。
人工皮膚を移植する。 より具体的にさらに説明すると、この発明の、生理活性
物質分泌性のハイブリッド型ゲルは、たとえば、ASAGA
等の方法（H. ASAGA etal, EXPERIMENTAL CELLRESEARCH
１９３：１６７，１９９１）に準じ、以下の様にして
作製することができる。
【００１９】すなわち、細胞培養液の４倍濃縮液、血
清、精製水、および例えばコラーゲン（０．５％溶液）
を、必要量に応じ、２．５：１：２．５：４の割合で氷
冷下で混合する。これに、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液
を滴下混合して、ｐＨ７．４に調整し、直径３５ｍｍの
疎水性のプラスチックシャーレに２ｍｌずつ分注し、た
だちに３７℃の恒温器に移る。数分以内にコラーゲンは
固化しゲルを作製することができる。生理活性物質産生
細胞はコラーゲンを固化させる直前に上記の混合液に混
合させることによりゲル内に封入できる。
清、精製水、および例えばコラーゲン（０．５％溶液）
を、必要量に応じ、２．５：１：２．５：４の割合で氷
冷下で混合する。これに、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液
を滴下混合して、ｐＨ７．４に調整し、直径３５ｍｍの
疎水性のプラスチックシャーレに２ｍｌずつ分注し、た
だちに３７℃の恒温器に移る。数分以内にコラーゲンは
固化しゲルを作製することができる。生理活性物質産生
細胞はコラーゲンを固化させる直前に上記の混合液に混
合させることによりゲル内に封入できる。
【００２０】また、網状体や多孔質膜を共存させる場合
には、これらを生理活性物質産生細胞と共に上記の混合
液に混合させればよい。なお、培養液、血清およびコラ
ーゲンは市販品を利用することもできる。皮膚への移植
を容易にするために、コラーゲンゲルに適当な強度を持
たせることも有効である。ゲルの適度な強度は、例えば
BELLらの方法（E. BELL etal, PROCEEDINGS OF THE NAT
IONAL ACADEMY OF SCIENCES ７６（３）：１２７４，
１９７９）に従い、上記ゲル内に適当数の皮膚由来線維
芽細胞を混ぜることによって得ることができる。線維芽
細胞によるゲルの収縮作用により、結果としてゲルに適
当な強度を持たせることができる。皮膚由来線維芽細胞
は、たとえば移植片初代培養法（R.I. Freshrey, Cultu
re of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc.,New York, 1
987) に準じて、患者より採取した少量の皮膚より培養
して得ることが可能である。
には、これらを生理活性物質産生細胞と共に上記の混合
液に混合させればよい。なお、培養液、血清およびコラ
ーゲンは市販品を利用することもできる。皮膚への移植
を容易にするために、コラーゲンゲルに適当な強度を持
たせることも有効である。ゲルの適度な強度は、例えば
BELLらの方法（E. BELL etal, PROCEEDINGS OF THE NAT
IONAL ACADEMY OF SCIENCES ７６（３）：１２７４，
１９７９）に従い、上記ゲル内に適当数の皮膚由来線維
芽細胞を混ぜることによって得ることができる。線維芽
細胞によるゲルの収縮作用により、結果としてゲルに適
当な強度を持たせることができる。皮膚由来線維芽細胞
は、たとえば移植片初代培養法（R.I. Freshrey, Cultu
re of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc.,New York, 1
987) に準じて、患者より採取した少量の皮膚より培養
して得ることが可能である。
【００２１】ゲルの移植皮膚面への良好な活着状態を得
るために、皮膚への移植以前にゲル上にあらかじめ皮膚
由来表皮細胞を重層培養しておくことも有効である。ゲ
ルに重層する皮膚由来表皮細胞は、たとえばGREEN 等の
方法（H. GREEN, etal, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL
ACADEMY OF SCIENCES ７６：５６６５，１９７９）に準
じて、線維芽細胞と同様に患者自身の皮膚より培養して
得ることが可能である。
るために、皮膚への移植以前にゲル上にあらかじめ皮膚
由来表皮細胞を重層培養しておくことも有効である。ゲ
ルに重層する皮膚由来表皮細胞は、たとえばGREEN 等の
方法（H. GREEN, etal, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL
ACADEMY OF SCIENCES ７６：５６６５，１９７９）に準
じて、線維芽細胞と同様に患者自身の皮膚より培養して
得ることが可能である。
【００２２】なお、この発明では、表皮細胞を重層しな
い状態でゲルを皮下に移植した場合にも有効であること
は言うまでもない。具体的には様々な態様が可能であ
る。以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発明につい
て説明する。もちろん、この発明は、以下の例によって
限定されるものではない。
い状態でゲルを皮下に移植した場合にも有効であること
は言うまでもない。具体的には様々な態様が可能であ
る。以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発明につい
て説明する。もちろん、この発明は、以下の例によって
限定されるものではない。
【００２３】
実施例１ この発明のハイブリッド型ゲル（以下、単にゲルと記載
することがある）を作成し、その薬物投与法および糖尿
病治療への応用における効果を、下記に示す試験管内実
験および糖尿病モデル動物の系を用いて評価した。試験管内試験 プロインスリン産生細胞を封入または重層したゲルを培
養し、培養液中に分泌されるプロインスリンを測定し
た。 １）使用細胞 以下の細胞株３種を用いた。
することがある）を作成し、その薬物投与法および糖尿
病治療への応用における効果を、下記に示す試験管内実
験および糖尿病モデル動物の系を用いて評価した。試験管内試験 プロインスリン産生細胞を封入または重層したゲルを培
養し、培養液中に分泌されるプロインスリンを測定し
た。 １）使用細胞 以下の細胞株３種を用いた。
【００２４】マウス胎仔由来線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ
３） インスリン遺伝子を組み込んだラット皮膚由来線維芽
細胞（ＲＳＦｉｎｓ） インスリン遺伝子を組み込んだラット皮膚由来表皮細
胞（ＲＳＫｉｎｓ） ＲＳＦｉｎｓおよびＲＳＫｉｎｓ細胞はラット皮膚より
初代培養によって得た線維芽細胞（ＲＳＦ）および表皮
細胞（ＲＦＫ）にインスリン遺伝子（G. I. BELL et a
l, NATURE ２８４，（６）：２６，１９８０）を組み
込んで作製した。インスリン遺伝子の線維芽細胞および
表皮細胞への組み込みは、ヒトインスリンｃＤＮＡを組
み込んであるプラスミド系発現ベクターｐＢＭＧ・ｎｅ
ｏ・ｉｎｓ（Y. KAWAKAMI et al, DIABETES ４１：９５
６，１９９２）を用いて、CHENとOKAYAMA （C. CHEN an
d OKAYAMA, MOLECURAR AND CELLULAR BIOLOGY ７
（８）：２７４５，１９８７）に準じて行った。その
後、ベクターの組み込まれた細胞を４００μｇ／ｍｌ濃
度のＧ４１８を含む培養液で選択的に増加させた。
３） インスリン遺伝子を組み込んだラット皮膚由来線維芽
細胞（ＲＳＦｉｎｓ） インスリン遺伝子を組み込んだラット皮膚由来表皮細
胞（ＲＳＫｉｎｓ） ＲＳＦｉｎｓおよびＲＳＫｉｎｓ細胞はラット皮膚より
初代培養によって得た線維芽細胞（ＲＳＦ）および表皮
細胞（ＲＦＫ）にインスリン遺伝子（G. I. BELL et a
l, NATURE ２８４，（６）：２６，１９８０）を組み
込んで作製した。インスリン遺伝子の線維芽細胞および
表皮細胞への組み込みは、ヒトインスリンｃＤＮＡを組
み込んであるプラスミド系発現ベクターｐＢＭＧ・ｎｅ
ｏ・ｉｎｓ（Y. KAWAKAMI et al, DIABETES ４１：９５
６，１９９２）を用いて、CHENとOKAYAMA （C. CHEN an
d OKAYAMA, MOLECURAR AND CELLULAR BIOLOGY ７
（８）：２７４５，１９８７）に準じて行った。その
後、ベクターの組み込まれた細胞を４００μｇ／ｍｌ濃
度のＧ４１８を含む培養液で選択的に増加させた。
【００２５】これらの細胞は、インスリンへの変換酵素
を持たないため、インスリンの前駆物質であるプロイン
スリンを分泌する。ただし、プロインスリンもインスリ
ン作用がある（S.N. Davis et al., Journal of Clinic
al Endocrinologuy and Metabolism, 75 (5): 1282-128
8, 1992 ）。 ２）培養液 ＲＳＦｉｎｓ用には、ダルベッコ改変イーグル最小培地
（ギブコ）に牛胎仔血清（ハイクロン）を１０％の割合
で添加して用いた（培養液Ａ）。
を持たないため、インスリンの前駆物質であるプロイン
スリンを分泌する。ただし、プロインスリンもインスリ
ン作用がある（S.N. Davis et al., Journal of Clinic
al Endocrinologuy and Metabolism, 75 (5): 1282-128
8, 1992 ）。 ２）培養液 ＲＳＦｉｎｓ用には、ダルベッコ改変イーグル最小培地
（ギブコ）に牛胎仔血清（ハイクロン）を１０％の割合
で添加して用いた（培養液Ａ）。
【００２６】ＲＳＫｉｎｓ用には、ダルベッコ改変イー
グル最小培地とＭＣＤＢ１５２培地（極東）を７：３の
割合で混合したものに、ハイドロコルチゾン（０．４μ
ｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフ
ェリン（５μｇ／ｍｌ）、トリヨードチロニン（２ｎ
Ｍ）、コレラトキシン（０．１ｎＭ）、アデニン（１０
０μＭ）および牛胎仔血清（１０％）を添加して用いた
（培養液Ｂ）。
グル最小培地とＭＣＤＢ１５２培地（極東）を７：３の
割合で混合したものに、ハイドロコルチゾン（０．４μ
ｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフ
ェリン（５μｇ／ｍｌ）、トリヨードチロニン（２ｎ
Ｍ）、コレラトキシン（０．１ｎＭ）、アデニン（１０
０μＭ）および牛胎仔血清（１０％）を添加して用いた
（培養液Ｂ）。
【００２７】細胞をゲルに封入および重層の後は、培養
液Ａを用いてハイブリッド型ゲルを培養した。 ３）試験方法 ５０万個のＲＳＦｉｎｓ細胞をゲルに封入あるいは重層
して、ゲルＡおよびゲルＢを得た。一方、５０万個のＲ
ＦＫｉｎｓ細胞をゲルに封入あるいは重層して、ゲルＣ
およびゲルＤを得た。ゲルＣおよびゲルＤ中には同時に
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を封入して収縮能を付与した。このゲ
ルの構成を要約したものが表１である。これらを、３７
℃で培養した。１日後、培養液２ｍｌを加えて培養を継
続し、その後、２日ごとに新しい培地と交換した。交換
した培養液は、凍結保存しておき、必要に応じて融解
し、培養液中のプロインスリン濃度を測定した。プロイ
ンスリン濃度は、ＥＩＡキット（三光純薬）を用いて、
免疫応答性インスリン（Immunoreactive Insurin：以
下、ＩＲＩと記載することがある）の値として測定し
た。
液Ａを用いてハイブリッド型ゲルを培養した。 ３）試験方法 ５０万個のＲＳＦｉｎｓ細胞をゲルに封入あるいは重層
して、ゲルＡおよびゲルＢを得た。一方、５０万個のＲ
ＦＫｉｎｓ細胞をゲルに封入あるいは重層して、ゲルＣ
およびゲルＤを得た。ゲルＣおよびゲルＤ中には同時に
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を封入して収縮能を付与した。このゲ
ルの構成を要約したものが表１である。これらを、３７
℃で培養した。１日後、培養液２ｍｌを加えて培養を継
続し、その後、２日ごとに新しい培地と交換した。交換
した培養液は、凍結保存しておき、必要に応じて融解
し、培養液中のプロインスリン濃度を測定した。プロイ
ンスリン濃度は、ＥＩＡキット（三光純薬）を用いて、
免疫応答性インスリン（Immunoreactive Insurin：以
下、ＩＲＩと記載することがある）の値として測定し
た。
【００２８】
【表１】
【００２９】４）試験結果 試験結果を表２に示した。ゲル内に封入あるいはゲル上
に重層したいずれの細胞株からも、培養２５日間にわた
って安定した量のプロインスリンを培地中に分泌した。
従って、このゲルを皮膚に移植することにより、プロイ
ンスリンを体内に投与することが可能となる。
に重層したいずれの細胞株からも、培養２５日間にわた
って安定した量のプロインスリンを培地中に分泌した。
従って、このゲルを皮膚に移植することにより、プロイ
ンスリンを体内に投与することが可能となる。
【００３０】
【表２】
【００３１】動物試験１ プロインスリン産生細胞を封入または重層したハイブリ
ッド型ゲルを糖尿病モデル動物へ移植して、その治療効
果を血糖値を測定することによって評価した。 １）実験動物 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（５週令雄）に対し、２００
ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（シグマ）を４日間に
わたり腹腔内へ合計３回反復投与することにより糖尿病
状態を誘導し、７週令において使用した。 ２）使用細胞 ラット皮膚由来の細胞株３種を用いた。
ッド型ゲルを糖尿病モデル動物へ移植して、その治療効
果を血糖値を測定することによって評価した。 １）実験動物 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（５週令雄）に対し、２００
ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（シグマ）を４日間に
わたり腹腔内へ合計３回反復投与することにより糖尿病
状態を誘導し、７週令において使用した。 ２）使用細胞 ラット皮膚由来の細胞株３種を用いた。
【００３２】ＲＳＦ ＲＳＦｉｎｓ ＲＳＫｉｎｓ ３）ゲルの作製方法 ５０万個のＲＳＦｉｎｓ細胞をコラーゲンゲルに封入
し、これに同数のＲＳＫｉｎｓ細胞を重層してゲルＥを
得た。一方、５０万個のＲＳＦ細胞をコラーゲンゲルに
封入し、これに同数のＲＳＫｉｎｓ細胞を重層してゲル
Ｆを得た。これらのゲルの構成は、表３に要約した。こ
れらのゲルを、３７℃で６日培養の後、移植に用いた。
この時点でのゲルのプロインスリン産生量は、ゲルＥお
よびゲルＦ、それぞれ４８４μｌＵ／日／ゲルおよび４
０４μｌＵ／日／ゲルであった。
し、これに同数のＲＳＫｉｎｓ細胞を重層してゲルＥを
得た。一方、５０万個のＲＳＦ細胞をコラーゲンゲルに
封入し、これに同数のＲＳＫｉｎｓ細胞を重層してゲル
Ｆを得た。これらのゲルの構成は、表３に要約した。こ
れらのゲルを、３７℃で６日培養の後、移植に用いた。
この時点でのゲルのプロインスリン産生量は、ゲルＥお
よびゲルＦ、それぞれ４８４μｌＵ／日／ゲルおよび４
０４μｌＵ／日／ゲルであった。
【００３３】
【表３】
【００３４】４）試験方法 上記糖尿病モデル２個体（ＩＤ番号３および４）の背中
の皮膚を、それぞれ約２５ｍｍ平方および約２００ｍｍ
平方の範囲で除去した。ここに作製後６日間培養したゲ
ル（Ｅ、Ｆ）を同一面積（ゲル重量として、それぞれ２
４ｍｇ湿重および１９１ｍｇ湿重）移植した。移植後は
２日ごとに約２０μｌの血液を尾部より採取し血糖値を
測定した。対照動物２個体（ＩＤ番号１および２）は非
移植糖尿病モデルを用いた。血糖値の測定はグルコース
ＣＩＩテスト（和光純薬）を用いて行った。 ５）試験結果 試験結果を表４に示した。ゲル移植群では対照群で見ら
れたような血糖値の持続的な上昇は抑えられ、かつ血糖
値の低下傾向が観察された。
の皮膚を、それぞれ約２５ｍｍ平方および約２００ｍｍ
平方の範囲で除去した。ここに作製後６日間培養したゲ
ル（Ｅ、Ｆ）を同一面積（ゲル重量として、それぞれ２
４ｍｇ湿重および１９１ｍｇ湿重）移植した。移植後は
２日ごとに約２０μｌの血液を尾部より採取し血糖値を
測定した。対照動物２個体（ＩＤ番号１および２）は非
移植糖尿病モデルを用いた。血糖値の測定はグルコース
ＣＩＩテスト（和光純薬）を用いて行った。 ５）試験結果 試験結果を表４に示した。ゲル移植群では対照群で見ら
れたような血糖値の持続的な上昇は抑えられ、かつ血糖
値の低下傾向が観察された。
【００３５】
【表４】
【００３６】動物実験２ プロインスリン産生細胞を封入したハイブリッド型ゲル
を糖尿病モデル動物へ移植して、その治療効果を血糖値
および体重を測定することによって評価した。 １）実験動物 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（７週令雄）に対し、２００
ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（シグマ）を２日間に
わたり腹腔内に連続投与することにより糖尿病状態を誘
導して試験に用いた。ゲルの移植はストレプトゾトシン
投与終了２日後に行った。 ２）使用細胞 ラット皮膚由来の細胞株３種を用いた。
を糖尿病モデル動物へ移植して、その治療効果を血糖値
および体重を測定することによって評価した。 １）実験動物 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（７週令雄）に対し、２００
ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（シグマ）を２日間に
わたり腹腔内に連続投与することにより糖尿病状態を誘
導して試験に用いた。ゲルの移植はストレプトゾトシン
投与終了２日後に行った。 ２）使用細胞 ラット皮膚由来の細胞株３種を用いた。
【００３７】ＲＳＦ ＲＳＦｉｎｓ ＲＳＫ ３）ゲルの作製方法 １００万個のＲＳＦｉｎｓ細胞をコラーゲンゲルに封入
し、これに同数のＲＳＫ細胞を重層してゲルＭを得た。
一方、１００万個のＲＳＦ細胞をコラーゲンゲルに封入
し、これに同数のＲＳＫｉｎｓ細胞を重層してゲルＮを
得た。これらのゲルの構成は、表５に要約した。これら
のゲルを、３７℃で７日培養の後、移植に用いた。この
時点でのゲルのプロインスリン産生量は、ゲルＭおよび
ゲルＮ、それぞれ３００．８μｌＵ／時間／ゲルおよび
１．５μｌＵ／時間／ゲルであった。
し、これに同数のＲＳＫ細胞を重層してゲルＭを得た。
一方、１００万個のＲＳＦ細胞をコラーゲンゲルに封入
し、これに同数のＲＳＫｉｎｓ細胞を重層してゲルＮを
得た。これらのゲルの構成は、表５に要約した。これら
のゲルを、３７℃で７日培養の後、移植に用いた。この
時点でのゲルのプロインスリン産生量は、ゲルＭおよび
ゲルＮ、それぞれ３００．８μｌＵ／時間／ゲルおよび
１．５μｌＵ／時間／ゲルであった。
【００３８】
【表５】
【００３９】４）試験方法 上記糖尿病モデル６個体のうち３個体については、右腹
側部の皮膚を直径８〜１０ｍｍの円形に除去し、ここに
作製後７日間培養したゲルＭを１個体につき１個当て移
植した。移植後は２日ごとに約５μｌの血液を尾部より
採取し血糖値を測定した。体重も約２日ごとに測定し
た。糖尿病モデル動物６個体のうち残る３個体について
は、対照動物としてゲルＮを同様に移植した。血糖値の
測定はグルテストＥ（三和化学）を用いて行った。 ５）試験結果 試験結果を表６に示した。ゲルＭ移植群では対照群で見
られたような血糖値の上昇を抑制する傾向が認められ、
特に移植後１３日目において顕著であった。また、ゲル
Ｍ移植群では対照群で見られたような体重減少を抑制す
る傾向が観察期間を通じて常に観察された。
側部の皮膚を直径８〜１０ｍｍの円形に除去し、ここに
作製後７日間培養したゲルＭを１個体につき１個当て移
植した。移植後は２日ごとに約５μｌの血液を尾部より
採取し血糖値を測定した。体重も約２日ごとに測定し
た。糖尿病モデル動物６個体のうち残る３個体について
は、対照動物としてゲルＮを同様に移植した。血糖値の
測定はグルテストＥ（三和化学）を用いて行った。 ５）試験結果 試験結果を表６に示した。ゲルＭ移植群では対照群で見
られたような血糖値の上昇を抑制する傾向が認められ、
特に移植後１３日目において顕著であった。また、ゲル
Ｍ移植群では対照群で見られたような体重減少を抑制す
る傾向が観察期間を通じて常に観察された。
【００４０】
【表６】
【００４１】実施例２ この発明の別のハイブリッド型ゲルを作成し、その効果
を、下記に示す試験管内実験および糖尿病モデル動物の
系を用いて評価した。試験管内実験１ フリンにより変換可能で、且つ安定性に優れたインスリ
ンをコードする変異インスリン遺伝子を導入したインス
リン産生細胞を封入したゲルを培養し、培養液中に分泌
されるＩＲＩ値を測定した。 １）使用細胞 ラット皮膚由来の細胞株２種を用いた。
を、下記に示す試験管内実験および糖尿病モデル動物の
系を用いて評価した。試験管内実験１ フリンにより変換可能で、且つ安定性に優れたインスリ
ンをコードする変異インスリン遺伝子を導入したインス
リン産生細胞を封入したゲルを培養し、培養液中に分泌
されるＩＲＩ値を測定した。 １）使用細胞 ラット皮膚由来の細胞株２種を用いた。
【００４２】フリンで変換可能な変異インスリン遺伝
子を導入したラット皮膚由来繊維芽細胞（ＲＳＦｉｎｓ
ｆｕｒ） ＲＳＫ ＲＳＦｉｎｓｆｕｒ細胞は、ラット皮膚より初代培養に
より得た繊維芽細胞（ＲＳＦ）に、フリンによる変異
（プロインスリン鎖の２か所切断によるインスリン化）
が可能な変異インスリン遺伝子（D.J.GROSKREUTZ et a
l, The Jounal ofBiological Chemistry, 269 (8), 624
1, 1994 ）を導入して作成した。ＲＳＦへのこのような
遺伝子導入は、上記の変異インスリン遺伝子を組み込ん
だプラスミド系発現ベクターｐＲＩＳ・ｐｒｏｉｎｓ・
Ｉｆｕｒ・IIｆｕｒ・Ｂ１０Ｄを用いて、上記CHEN-OKA
YAMAの方法に準じて行った。その後、ベクターの組み込
まれた細胞を６００μｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８を含む培
養液で選択的に増加させた。
子を導入したラット皮膚由来繊維芽細胞（ＲＳＦｉｎｓ
ｆｕｒ） ＲＳＫ ＲＳＦｉｎｓｆｕｒ細胞は、ラット皮膚より初代培養に
より得た繊維芽細胞（ＲＳＦ）に、フリンによる変異
（プロインスリン鎖の２か所切断によるインスリン化）
が可能な変異インスリン遺伝子（D.J.GROSKREUTZ et a
l, The Jounal ofBiological Chemistry, 269 (8), 624
1, 1994 ）を導入して作成した。ＲＳＦへのこのような
遺伝子導入は、上記の変異インスリン遺伝子を組み込ん
だプラスミド系発現ベクターｐＲＩＳ・ｐｒｏｉｎｓ・
Ｉｆｕｒ・IIｆｕｒ・Ｂ１０Ｄを用いて、上記CHEN-OKA
YAMAの方法に準じて行った。その後、ベクターの組み込
まれた細胞を６００μｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８を含む培
養液で選択的に増加させた。
【００４３】これらの細胞から３２株のクローンを分離
し、最もＩＲＩ値の高い細胞を選択した。この株ＲＳＦ
ｉｎｓｆｕｒは、１００万個の細胞あたり２４．５μＩ
Ｕ／時間の免疫応答性インスリンを培養液中に分泌し
た。この細胞は、変異インスリンへの変異酵素フリンを
同時に発現するため、インスリンの前駆物質であるプロ
インスリンは、細胞の有するフリン活性に依存してイン
スリンに変換される。
し、最もＩＲＩ値の高い細胞を選択した。この株ＲＳＦ
ｉｎｓｆｕｒは、１００万個の細胞あたり２４．５μＩ
Ｕ／時間の免疫応答性インスリンを培養液中に分泌し
た。この細胞は、変異インスリンへの変異酵素フリンを
同時に発現するため、インスリンの前駆物質であるプロ
インスリンは、細胞の有するフリン活性に依存してイン
スリンに変換される。
【００４４】また、抗フリン・モノクローナル抗体（ジ
ェネンティック）および抗インスリン・ウサギ血清（オ
ースロラル・バイオロジカル）を用い、ＲＳＦｉｎｓｆ
ｕｒ細胞に対する免疫組織学的な検討も行った。結果は
表７に示したとおりであり、この細胞はインスリンおよ
びフリンを産生していることが免疫組織学的にも確認さ
れた。
ェネンティック）および抗インスリン・ウサギ血清（オ
ースロラル・バイオロジカル）を用い、ＲＳＦｉｎｓｆ
ｕｒ細胞に対する免疫組織学的な検討も行った。結果は
表７に示したとおりであり、この細胞はインスリンおよ
びフリンを産生していることが免疫組織学的にも確認さ
れた。
【００４５】
【表７】
【００４６】２）培養液 ＲＳＦｉｎｓｆｕｒ細胞用には、実施例１の培養液Ａ
を、またＲＳＫ細胞用に１実施例１の培養液Ｂを用い
た。細胞をゲルに封入および重層後は培養液Ａを用いて
培養した。 ３）試験方法 ３００万個のＲＳＦｉｎｓｆｕｒ細胞をゲルに封入し、
さらにその上に３００万個のＲＳＫ細胞を重層してゲル
Ｇを得た。このゲルＧの構成を要約したものが表８であ
る。このゲルＧを３７℃で６ｍｌの培養液中で培養し
た。培養液は２日毎に新しいものと交換した。培養後８
日目のゲルを培養液で３回洗浄し、新しい培養液と交換
したのち８時間培養し、培養液中のＩＲＩ値をインスリ
ンＥＩＡキット（三光純薬）を用いて測定した。
を、またＲＳＫ細胞用に１実施例１の培養液Ｂを用い
た。細胞をゲルに封入および重層後は培養液Ａを用いて
培養した。 ３）試験方法 ３００万個のＲＳＦｉｎｓｆｕｒ細胞をゲルに封入し、
さらにその上に３００万個のＲＳＫ細胞を重層してゲル
Ｇを得た。このゲルＧの構成を要約したものが表８であ
る。このゲルＧを３７℃で６ｍｌの培養液中で培養し
た。培養液は２日毎に新しいものと交換した。培養後８
日目のゲルを培養液で３回洗浄し、新しい培養液と交換
したのち８時間培養し、培養液中のＩＲＩ値をインスリ
ンＥＩＡキット（三光純薬）を用いて測定した。
【００４７】
【表８】
【００４８】４）試験結果 この試験の結果、ゲルＧは、８時間にわたり２５．２μ
ＩＵのＩＲＩを分泌していることが確認された。すなわ
ち、このゲルＧは長時間にわたり安定したインスリンの
分泌を示すため、これを皮膚へ移植することによって、
インスリンを体内へ投与することが可能となる。試験管内実験２ フリンにより変換可能で、且つ安定性に優れたインスリ
ンをコードする変異インスリン遺伝子を導入したインス
リン産生細胞を封入したゲルにおいて、ゲルからのイン
スリン分泌を高める方法を検討した。 １）使用細胞 上記の試験管内実験１と同様の細胞を使用した。 ２）培養液 上記の試験管内実験１と同様の培養液を同様に使用し
た。 ３）試験方法 １００万個のＲＳＦｉｎｓｆｕｒ細胞をゲルに封入し、
さらにその上に１００万個のＲＳＫ細胞を重層してゲル
Ｈを得た。一方、１００万個のＲＳＦｉｎｓｆｕｒ細胞
をゲルに封入する際に、直径１５ｃｍおよび２５ｃｍの
円形に裁断したポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュ
（日本レダリー、デキソンメッシュ、スタイル２）を存
在させ、さらにその上に１００万個のＲＳＫ細胞を重層
して、それぞれゲルＩおよびＪを得た。これらのゲルの
構成は表９に示したとおりである。
ＩＵのＩＲＩを分泌していることが確認された。すなわ
ち、このゲルＧは長時間にわたり安定したインスリンの
分泌を示すため、これを皮膚へ移植することによって、
インスリンを体内へ投与することが可能となる。試験管内実験２ フリンにより変換可能で、且つ安定性に優れたインスリ
ンをコードする変異インスリン遺伝子を導入したインス
リン産生細胞を封入したゲルにおいて、ゲルからのイン
スリン分泌を高める方法を検討した。 １）使用細胞 上記の試験管内実験１と同様の細胞を使用した。 ２）培養液 上記の試験管内実験１と同様の培養液を同様に使用し
た。 ３）試験方法 １００万個のＲＳＦｉｎｓｆｕｒ細胞をゲルに封入し、
さらにその上に１００万個のＲＳＫ細胞を重層してゲル
Ｈを得た。一方、１００万個のＲＳＦｉｎｓｆｕｒ細胞
をゲルに封入する際に、直径１５ｃｍおよび２５ｃｍの
円形に裁断したポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュ
（日本レダリー、デキソンメッシュ、スタイル２）を存
在させ、さらにその上に１００万個のＲＳＫ細胞を重層
して、それぞれゲルＩおよびＪを得た。これらのゲルの
構成は表９に示したとおりである。
【００４９】
【表９】
【００５０】これらのゲルを３７℃で２ｍｌの培養液中
で培養した。培養液は１〜２日毎に新しいものと交換し
た。培養後８日目の各ゲルを培養液で３回洗浄し、新し
い培養液と交換したのち８時間培養し、経時的に少量
（５０μｌ）の培養液を採取し、培養液中のＩＲＩ値を
インスリンＥＩＡキット（三光純薬）を用いて測定し
た。 ４）試験結果 この試験の結果は表１０に示したとおりである。メッシ
ュと共に細胞を封入し、重層したゲルＩおよびＪは、細
胞のみを封入、重層したゲルＨに比較してインスリン分
泌量が有意に多く、このことからゲル中にメッシュ（網
状体）を共存させることが細胞のインスリン分泌量を増
加させるのに有効であることが確認された。
で培養した。培養液は１〜２日毎に新しいものと交換し
た。培養後８日目の各ゲルを培養液で３回洗浄し、新し
い培養液と交換したのち８時間培養し、経時的に少量
（５０μｌ）の培養液を採取し、培養液中のＩＲＩ値を
インスリンＥＩＡキット（三光純薬）を用いて測定し
た。 ４）試験結果 この試験の結果は表１０に示したとおりである。メッシ
ュと共に細胞を封入し、重層したゲルＩおよびＪは、細
胞のみを封入、重層したゲルＨに比較してインスリン分
泌量が有意に多く、このことからゲル中にメッシュ（網
状体）を共存させることが細胞のインスリン分泌量を増
加させるのに有効であることが確認された。
【００５１】
【表１０】
【００５２】動物実験 インスリン産生細胞を封入したゲルを糖尿病モデル動物
へ移植し、動物の体重および血糖値を測定することによ
りゲルの移植効果を検討した。 １）実験動物 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（７週齢雄）に対し、２００
ｍｇ／Ｋｇのストレプトゾトシン（シグマ）を２日間に
わたり腹腔内に合計２回反復投与し、高血糖状態を誘導
した。動物が高血糖を示したことを確認したのち、実験
に使用した。 ２）使用細胞 ラット皮膚由来の次の細胞株３種を用いた ＲＳＦ ＲＳＦｉｎｓｆｕｒ ＲＳＫ ３）ゲル（人工皮膚）の作成方法 ３００万個のＲＳＦｉｎｓｆｕｒ細胞をコラーゲンゲル
に封入し、これに同数のＲＳＫ細胞を重層してゲルＫを
得た。一方、３００万個のＲＳＦ細胞を同様に封入し、
これに同数のＲＳＫ細胞を重層してゲルＬを得た。これ
らゲルＫ、Ｌの構成は表１１に要約したとおりである。
へ移植し、動物の体重および血糖値を測定することによ
りゲルの移植効果を検討した。 １）実験動物 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（７週齢雄）に対し、２００
ｍｇ／Ｋｇのストレプトゾトシン（シグマ）を２日間に
わたり腹腔内に合計２回反復投与し、高血糖状態を誘導
した。動物が高血糖を示したことを確認したのち、実験
に使用した。 ２）使用細胞 ラット皮膚由来の次の細胞株３種を用いた ＲＳＦ ＲＳＦｉｎｓｆｕｒ ＲＳＫ ３）ゲル（人工皮膚）の作成方法 ３００万個のＲＳＦｉｎｓｆｕｒ細胞をコラーゲンゲル
に封入し、これに同数のＲＳＫ細胞を重層してゲルＫを
得た。一方、３００万個のＲＳＦ細胞を同様に封入し、
これに同数のＲＳＫ細胞を重層してゲルＬを得た。これ
らゲルＫ、Ｌの構成は表１１に要約したとおりである。
【００５３】
【表１１】
【００５４】４）試験方法 上記の糖尿病モデル動物の背中の皮膚を、それぞれ直径
約１１ｍｍの円形の範囲で除去し、作成後８日間培養し
て直径約１０ｍｍに収縮したゲルＫを動物の皮膚除去部
に移植した。対照動物には、遺伝子を導入していない細
胞を封入したゲルＬを同様に移植した。移植後は、約２
日ごとに体重を測定するとともに、約５μｌの血液を尾
部より採取し、グルテストＥ（三和化学）を用いて血糖
値を測定した。 ５）試験結果 この試験の結果は表１２に示したとおりである。対照群
（ゲルＬ移植群）では体重の減少や血糖値上昇が認めら
れたのに対し、変異インスリン遺伝子導入細胞を封入し
たゲルＫ移植動物の群では体重の増加ならびに血糖値の
低下傾向が認められ、糖尿病症状の改善が確認された。
約１１ｍｍの円形の範囲で除去し、作成後８日間培養し
て直径約１０ｍｍに収縮したゲルＫを動物の皮膚除去部
に移植した。対照動物には、遺伝子を導入していない細
胞を封入したゲルＬを同様に移植した。移植後は、約２
日ごとに体重を測定するとともに、約５μｌの血液を尾
部より採取し、グルテストＥ（三和化学）を用いて血糖
値を測定した。 ５）試験結果 この試験の結果は表１２に示したとおりである。対照群
（ゲルＬ移植群）では体重の減少や血糖値上昇が認めら
れたのに対し、変異インスリン遺伝子導入細胞を封入し
たゲルＫ移植動物の群では体重の増加ならびに血糖値の
低下傾向が認められ、糖尿病症状の改善が確認された。
【００５５】
【表１２】
【００５６】
【発明の効果】以上、詳しく説明した通り、この発明に
より、長期間安定して薬物投与が可能となり、患者に対
する苦痛も緩和でき、しかも投与量の微調整が可能で、
従来のように野生型への変異等の危険性のあるレトロウ
イルス由来のベクターを用いることなしに、体外からの
遺伝子制御が可能な、皮膚移植による遺伝子処方が可能
となる。
より、長期間安定して薬物投与が可能となり、患者に対
する苦痛も緩和でき、しかも投与量の微調整が可能で、
従来のように野生型への変異等の危険性のあるレトロウ
イルス由来のベクターを用いることなしに、体外からの
遺伝子制御が可能な、皮膚移植による遺伝子処方が可能
となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｌ 27/00 Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/09 // Ａ６１Ｋ 35/36 35/39 ＡＤＰ
Claims (16)
- 【請求項１】 生理活性物質産生細胞と生体由来のゲル
とからなる生理活性物質分泌性のハイブリッド型ゲル。 - 【請求項２】 生理活性物質産生細胞が、生体由来のゲ
ルに封入にされている請求項１のハイブリッド型ゲル。 - 【請求項３】 生理活性物質産生細胞が、生体由来のゲ
ル上に重層されている請求項１のハイブリッド型ゲル。 - 【請求項４】 生理活性物質産生細胞を封入した生体由
来にゲル上に、生理活性物質産生細胞が重層されている
請求項１のハイブリッド型ゲル。 - 【請求項５】 生理活性物質産生細胞、皮膚細胞および
生体由来のゲルからなる生理活性物質分泌性のハイブリ
ッド型ゲル。 - 【請求項６】 生理活性物質産生細胞を封入した生体由
来のゲル上に皮膚細胞が重層されている請求項５のハイ
ブリッド型ゲル。 - 【請求項７】 皮膚細胞を封入した生体由来のゲル上に
生理活性物質産生細胞が重層されている請求項５のハイ
ブリッド型ゲル。 - 【請求項８】 皮膚細胞および生理活性物質産生細胞
が、生体由来のゲルに封入されている請求項５のハイブ
リッド型ゲル。 - 【請求項９】 皮膚細胞および生理活性物質産生細胞を
封入した生体由来のゲル上に、皮膚細胞または生理活性
物質産生細胞が重層されている請求項５のハイブリッド
型ゲル。 - 【請求項１０】 生理活性物質産生細胞が、網状体また
は多孔質膜と共に生体由来のゲルに封入されている請求
項２、４、６、８または９のハイブリッド型ゲル。 - 【請求項１１】 生体由来のゲルに封入する皮膚細胞
が、皮膚線維芽細胞であり、生体由来のゲルに重層する
皮膚細胞が皮膚表皮細胞である請求項５から９のいずれ
かのハイブリッド型ゲル。 - 【請求項１２】 生理活性物質産生細胞が、生理活性物
質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを保有
する培養細胞である請求項１から１０のいずれかのハイ
ブリッド型ゲル。 - 【請求項１３】 生理活性物質産生細胞が、インスリン
をコードする遺伝子を組込んだ発現ベクターを保有する
皮膚線維芽細胞または皮膚表皮細胞である請求項１２の
ハイブリッド型ゲル。 - 【請求項１４】 発現ベクターが、プラスミド・ベクタ
ーｐＢＭＧ・ｎｅｏ・ｉｎｓである請求項１３のハイブ
リッド型ゲル。 - 【請求項１５】 発現ベクターが、プラスミド・ベクタ
ーｐＲＩＳ・ｐｒｏｉｎｓ・Ｉｆｕｒ・IIｆｕｒ・Ｂ１
０Ｄである請求項１３のハイブリッド型ゲル。 - 【請求項１６】 請求項１から１５のいずれかのハイブ
リッド型ゲルを主成分とする外用処方剤。
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|---|---|---|---|
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| JP28848794 | 1994-11-22 | ||
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- 1995-04-25 JP JP07101475A patent/JP3091113B2/ja not_active Expired - Fee Related
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