JPH08196618A - 細胞侵入性コラーゲン製剤、および人工皮膚、およびそれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】コラーゲン溶液を撹拌して泡立てることにより
得られ、１００〜１０００μmの空孔を有する。 【効果】優れた細胞侵入性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用部分野】本発明は、細胞侵入性コラーゲ
ン製剤、および人工皮膚、およびそれらの製造方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】骨組織に何らかに異常や欠損が生じた場
合、自己の他部位から採取した骨の移植が好ましいがそ
の供給が困難な場合が多く、人工物をもって代替しよう
とする発想は古くから存在した。それらの人工物にはチ
タニウム、ステンレス等の金属類、ハイドロキシアパタ
イト等のセラミックス類がある。しかし、金属類は生体
骨との直接な接合が得られず、生体骨との間隔に軟組織
が新生して介在するようになる為、長期安定性に欠け
る。また、セラミックス類は生体骨との直接的な接合が
得られるか、それ自身の物性が脆く、骨の物理的機能上
問題がある。骨の主たる成分は有機物としてコラーゲン
と、ハイドロキシアパタイトのような無機物である為、
コラーゲン製剤を利用しようとする試みがいくつかなさ
れている。

【０００３】牛の皮膚由来の凍結乾燥したアテロコラー
ゲンをγ線照射したものがコラーゲンフリース（collag
en fleece）という名称で市販されており、これを実際
に骨再構成に応用し、これを使わなかった場合と比べ、
骨欠損部の骨形成が早まったというウルリッチとゲルト
ラッド（Ulrich Joos & Gertrued Ochs）の報告がある
［Ulrich Joos & Gertrued Ochs，Biomaterials，1，23
(1980)］。また、実質的に架橋しないことを特徴とす
る、無機成分を除去した骨起源のコラーゲンの精製アテ
ロペプチド製剤から成る骨コラーゲン粉末、精製アテロ
ペプチド再構成微線維状皮膚コラーゲン、精製アテロペ
プチド再構成微線維状皮膚コラーゲンの凍結乾燥ゲル及
び、上記の混合物からなるコラーゲン製剤を用いるドナ
ルド・ジョー・ウォレスらの方法が特告平３−２６６１
６号で開示されている。

【０００４】また、皮膚などの生体組織に何らかの異常
が生じた場合、自己の他部位の組織あるいは、親族など
の免疫原生の少ない個体からの同種移植が好ましいが、
当然免疫拒絶反応の対象となるケースが多く、そのため
組織や免疫系細胞から不感作であるような、いわゆる組
織反応が低い物質を求める努力が続けられている。一
方、熱傷、外傷、手術創などの創傷部分を保護し治癒を
促進するために、患部に一時的に適用される人工皮膚と
して、従来はガーゼ、脱脂綿等が用いられていたが、こ
れらは感染防止能力が低く、かつ滲出液を吸収してしま
うため創面が乾燥固着してしまい、剥がすときに出血、
痛み、治癒阻害を伴った。また、軟膏等を併用すること
もあるが、この場合は逆に滲出液の貯留、創面の過度の
湿潤が問題となっている。

【０００５】これらに代わるものとして、ポリウレタン
フィルム、シリコーン性ガーゼ、シリコーンゴム製及び
ベロア状の表面を有するナイロン、テフロンなどの合成
繊維シート等の人工材料被覆材や、凍結乾燥豚皮、キチ
ン不織布、コラーゲン不織布、ポリロイシン膜などの生
体由来材料が知られている。ポリウレタンを代表とする
合成高分子をより高透過性化させる方向の研究などはそ
の一例である。しかし、人工材料は、患部との密着性、
生体適合性、固着防止効果等で問題があり、一方生体由
来材料では、抗原性、創面での融解、感染、滲出液によ
る劣化がみられる。また、コラーゲン処理されたナイロ
ンメッシュとシリコーン膜からなる被覆材が開発され、
創面の密着性、適度な水分透過を有するが、創面への固
着が強く、創面の治癒を遅らせるという欠点があった。
また、これとは全く正反対に、免疫反応を引き起こす前
に速やかに物質が組織と同化してしまうことにより器官
としての機能を付与するという考え方がある。その素材
として生体由来材料であるコラーゲン等を選択し、線維
芽細胞を早期に侵入させて、結合組織を構築させ目的の
組織に覆わせて免疫反応を免れる考え方で、後者の方が
より理想に近い形である。 しかし、コラーゲンをスポ
ンジ状に加工したものでは、ムコ多糖含有コラーゲン膜
などがあるが、生体内での強度を保つために強度な化学
架橋を行っているが、このために異物性が高くなり治癒
を遅らせ、かつ強度的に弱いために手術的な操作性が悪
かった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】再線維化したアテロコ
ラーゲンは、例えば異種の動物であってもコラーゲンの
免疫活性決定基とでも言うべきテロペプタイド部分が切
断・除去されている為、ヒトの骨組織に対する親和性は
大きいと考えられる。しかしながら、コラーゲン分子間
に架橋を付加しないと、生体内でコラゲナーゼで容易に
分解吸収されるばかりか、ゲルを凍結乾燥したものを、
３７℃生理食塩水に浸漬しておくだけでも数時間以内に
溶解することがわかっている。かかるコラーゲン製剤を
骨再構成に応用しようとしても生体内安定性がないた
め、初期の目的が達成できない。

【０００７】一方γ線を照射したり、ヘキサメチレンジ
イソシアネートやグルタルアルデヒド等の薬品で処理す
ると、コラーゲン分子間に架橋が導入され、物性やコラ
ゲナーゼ耐性が強化できる。例えば凍結乾燥コラーゲン
製剤をヘキサメチレンジイソシアネートで架橋すると、
コラゲナーゼ溶液（１００unit/ml）に３７℃で７日間
浸漬しても形態に変化が見られない。ところが、かかる
強固な架橋を導入すると生体内に埋植した場合、コラー
ゲンに対する異物反応のみが強くあらわれ、貪食細胞に
よる貪食が認められるようになる。つまり、物性やコラ
ゲナーゼ耐性の強度と、組織・細胞に対する親和性とい
う生物学的性能向上が困難な相反する事象であり、一定
期間そこに存在し異物反応がないまま骨再構成を導くコ
ラーゲン製剤は従来求め得られなかった。そこで、本発
明は、コラゲナーゼ耐性が強化され、かつ異物反応を招
かず、骨に対する生体適合性の高い、細胞侵入性骨修復
用コラーゲン製剤を提供することを目的とする。

【０００８】前述のように、非架橋型のコラーゲンスポ
ンジの人工皮膚では、細胞や血管の侵入による自己組織
化の速度が問題となるが、化学架橋型のコラーゲンスポ
ンジの人工皮膚では細胞侵入のための適度な孔径のスポ
ンジ構造とその構造の使用時の圧迫に対する維持が問題
となっている。例えば、生分解性ポリエステルを分散さ
せたことによりスポンジ構造を維持させたり、凍結乾燥
時の温度を変えることによりスポンジ孔径を制御して細
胞侵入性を高めようとしているが、異物性の増加や材料
自体に亀裂が生じるなどの問題が起こっている。このた
め、細胞や血管侵入のための適度な空孔がスポンジ内に
存在すれば、細胞や血管が侵入して、自己組織化が早ま
り、早期に分層植皮を移植するのに良好な母床になるこ
とも可能となる。

【０００９】

【課題を解決するために手段】上記の目的は下記の構成
を有する細胞侵入性コラーゲン製剤、および人工皮膚お
よびそれらの製造方法によって達成される。 （１）多数の空孔が存在するスポンジ状のコラーゲンマ
トリックスからなり、前記空孔の直径が１００〜１００
０μmであることを特徴とする細胞侵入性コラーゲン製
剤。 （２）前記コラーゲンマトリックスに存在する空孔が非
対称性構造を有することを特徴とする上記（１）に記載
の細胞侵入性コラーゲン製剤。

【００１０】（３）前記コラーゲンマトリックスが線維
化アテロコラーゲンとヘリックス含量が０〜８０％の変
性アテロコラーゲンの混合物であることを特徴とする上
記（１）乃至（２）に記載の細胞侵入性コラーゲン製
剤。 （４）上記（１）〜（３）に記載の細胞侵入性コラーゲ
ン製剤からなる骨修復材。 （５）原料コラーゲン溶液を泡立て、−４０℃以下で凍
結乾燥させた後、低圧下、高温で処理することを特徴と
する上記（１）乃至（３）に記載の細胞侵入性コラーゲ
ン製剤の製造方法。 （６）創傷部接触層とその上に積層された支持層から構
成され、前記創傷部接触層が多数の空孔が存在するスポ
ンジ状のコラーゲンマトリックスからなり、前記空孔の
直径が１００〜１０００μmであることを特徴とする人
工皮膚。

【００１１】（７）前記コラーゲンマトリックスに存在
する空孔が非対称性構造を有することを特徴とする上記
（６）に記載の人工皮膚。 （８）前記コラーゲンマトリックスが線維化アテロコラ
ーゲンとヘリックス含量が０〜８０％の変性アテロコラ
ーゲンの混合物であることを特徴とする上記（６）乃至
（７）に記載の人工皮膚。 （９）原料コラーゲン溶液を泡立て、上面が開口し下面
が平底である容器に流し込み、−４０℃以下で凍結乾燥
させ、多数の空孔が存在し前記容器上面側を上面、下面
側を下面とするスポンジ状のコラーゲンマトリックスを
得て、前記コラーゲンマトリックスの上面に水分透過性
物質の薄膜を積層し、低圧下、高温で処理することを特
徴とする上記（６）乃至（８）に記載の人工皮膚の製造
方法。

【００１２】本発明においてコラーゲンマトリックス
は、多数の空孔を有するスポンジ状の構造を有し、その
空孔の直径は１００〜１０００μmであり、より好まし
くは２００〜５００μmである。また、スポンジ状の構
造は非対称性構造を成していることが好ましい。本発明
において非対称性構造とは、本発明の範囲内において空
孔の直径が大きいものと小さいものとが各々群を成して
構成されていることを示す。具体的には、骨欠損部や皮
膚の創傷面などの生体組織と接触する側の面側に比較的
直径の大きい空孔が存在し、その対面側に比較的直径の
小さい空孔が存在することを示す。

【００１３】本発明において空孔の形状は何ら限定され
るものではなく、また、連通孔であっても良い。連通孔
に場合の非対称性構造とは、生体組織と接触する側の面
側の直径が大きく対面側に近づくにつれてテーパー状に
直径が小さくなることを示す。

【００１４】本発明において原料となるコラーゲンは何
ら限定されないが、特に好ましくは線維化アテロコラー
ゲンとヘリックス含量が０〜８０％の変性アテロコラー
ゲンの混合物が良い。また変性コラーゲンを混合するこ
とにより初期の細胞侵入性をより高めることができると
共に非特異的なコラーゲンの負栄養性石灰沈着も防止で
きる。

【００１５】本発明においてコラーゲンマトリックス
は、３０〜８０％の架橋度を有し、より好ましくは４０
〜７０％の架橋度を有する。低い架橋度であるとコラゲ
ナーゼで容易に分解吸収され、また高い強固な架橋を導
入すると生体内に埋植した場合、コラーゲンに対する異
物反応のみが強くあらわれるため、３０〜８０％、より
好ましくは４０〜７０％の架橋度がよい。このようにし
て得られたコラーゲンマトリックスは、３７℃生食中に
浸漬しても一部溶解するが、残りの部分は溶解せずスポ
ンジ構造を維持する。

【００１６】本発明においての架橋処理は、特に限定さ
れるものではなく架橋度を上記範囲内に調整できるもの
であれば良い。しかしながら、γ線や薬品で架橋処理し
たコラーゲンマトリックスが一様に貪食細胞浸潤等の異
物反応を招いてしまうのに対し、熱脱水架橋処理された
コラーゲンマトリックスは、未分化間葉系細胞や骨芽細
胞、毛細血管の侵入が観察されるが、異物反応は認めら
れず、生体適合性が高いことから、熱脱水架橋が最も好
ましい。これらの架橋処理を行うことにより、動物の骨
欠損部や皮膚の創傷面、それ以外の軟組織や硬組織に埋
植しても少なくとも４週間はそこに存在し続けることが
できる。

【００１７】本発明における架橋度とは、次の方法で測
定したものをいう。コラーゲンマトリックスを０.５mM
ＨＣｌ中で４℃、１５〜１６時間撹拌後、３０００rpm
で１５分間遠心分離を行ない上清と残査に分ける。この
時の上清をＡとする。次に、残査に８Ｍ尿素を加え、６
０℃で３０分間の加熱を行ない、３０００rpmで１５分
間遠心分離し、残査と上清に分ける。この時点の上清を
Ｂ、残査をＣとする。ついで、ＡとＢの液中の蛋白質濃
度を測定し、それに各々の体積を掛けたものをＷ_A,Ｗ_B
とする。また、Ｃの重量をＷ_Cとする。

【００１８】そして、架橋度（％）＝［（Ｗ_B＋Ｗ_C)／
（Ｗ_A＋Ｗ_B＋Ｗ_C)］×１００、とする。

【００１９】次に、本発明のコラーゲンマトリックスの
製造方法を示す。まずコラーゲン溶液を調製する。これ
を２分して一方はそのまま放置し、他方はこのコラーゲ
ン溶液を４０℃以上で加熱処理などにより変性させるこ
とにより、変性コラーゲンとする。３６℃に保ちなが
ら、ワーリングブレンダーでホモジナイズして泡立て
る。放置した溶液をリン酸緩衝液で３７℃で線維化さ
せ、所定の濃度の濃縮した後、泡立てた変性コラーゲン
溶液と混合して、所定の上面が開口している容器に流し
込み、凍結乾燥を行い本発明のコラーゲンマトリックス
を作製する。この際、コラーゲンマトリックス中におい
て径の大きな空孔が容器に接触する側（下面）に、径の
小さな空孔が容器の開口している側（上面）に形成され
る。

【００２０】また製造する際に、変性コラーゲンの濃度
が１％以下では、線維化コラーゲンと混合すると、泡立
っていた変性コラーゲンが消えてしまうため、変性コラ
ーゲンは１〜２％の濃度が好ましい。また、泡立ての温
度は２０〜４０℃が好ましく、より好ましくは３０〜３
７℃である。

【００２１】また、本発明においてはコラーゲンマトリ
ックスに生理活性物質を配合しても良い。生理活性物質
は創傷面の治癒促進を目的とし、特に限定しないが、へ
パリンが挙げられ、他には血小板由来増殖因子（ＰＤＧ
Ｆ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、内皮細胞増殖因
子（ＥＣＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧ
Ｆ−β）などが挙げられる。

【００２２】次に、本発明の人工皮膚は、支持層と上記
のコラーゲンマトリックスの２層構造からなる。本発明
の人工皮膚を創面に使用することにより、滲出液の流出
が多くなり膜が浮いてしまい、治癒を遅らせる可能性が
ある。このため、空孔がマトリックス中に存在すること
により、創傷面への密着性を向上させることができる。

【００２３】支持層としては、特に限定されないがその
材料としては、シリコーン、ポリウレタン、ポリオレフ
ィン、スチレン−ブタジエンブロックポリマー、ポリテ
トラフルオロエチレンなどが挙げられ、厚さは５０〜５
００μm、好ましくは１００〜２００μm、水蒸気透過率
は５００〜５０００ｇ/ｍ²・２４ｈ、好ましくは７００
〜２０００ｇ/ｍ²・２４ｈである。

【００２４】また、本発明の人工皮膚は、支持層の中に
上記の支持層と同じ材料あるいは異なる材料からなる繊
維状の補強材で補強することにより、外部からの圧迫に
よるコラーゲンマトリックスの変形や創面からの剥離を
防ぎ、スポンジ構造の変形による細胞侵入性の低下が防
止できる。また、使用時に適度な剛性を持たせることに
より、貼付するときのヨレや剥がれを防止できる。更
に、膜内に繊維が存在する事により、創面固定時の縫合
がしやすく、創面からの剥がれなどを少なくできる。ま
た更に、移植して一定期間たった後、上部の支持層を剥
がし、自家の分層植皮を行うことにより、より良い分層
植皮の生着と治癒が得られる。

【００２５】次に、本発明の人工皮膚の製造方法を示
す。（１）まずコラーゲン溶液を調製する。これを２分
して一方はそのまま放置し、他方はこのコラーゲン溶液
を４０℃以上で加熱処理などにより変性させることによ
り、変性コラーゲンとする。３６℃に保ちながら、ワー
リングブレンダーでホモジナイズして泡立てる。放置し
た溶液をリン酸緩衝液で３７℃で繊維化させ、所定の濃
度の濃縮した後、泡立てた変性コラーゲン溶液と混合し
て、所定の上面が開口している容器に流し込み、凍結乾
燥を行い本発明のコラーゲンマトリックスを作製する。
この際、コラーゲンマトリックス中において径の大きな
空孔が容器に接触する側（下面）に、径の小さな空孔が
容器の開口している側（上面）に形成される。

【００２６】（２）次にテフロン製の基板上にシリコー
ン等の水分透過性物質の溶液を延展して製膜し、該膜が
未だ粘着性を有する状態において、上記のコラーゲンマ
トリックス層をその上方の面が該膜に付着するように載
置し、乾燥し、さらに必要に応じて熱処理を施し、該膜
を硬化させて、支持層の上方の面に水分透過調節膜を付
着させる。（３）最後に基板上よりこの複合膜を剥離
し、真空下で熱脱水架橋を施すと所望の人工皮膚を得る
ことができる。

【００２７】

【実施例】以下、実施例を示し本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２８】（実施例１）コラーゲンスポンジの作製 熱変性アテロコラーゲンの調整 アテロコラーゲン（高研株式会社製）を４℃下でｐＨ３
の塩酸溶液に溶解し、０.２〜０.３％の溶液に調整す
る。この溶液を０.２μmのフィルターで濾過滅菌し、凍
結乾燥した。得られたアテロコラーゲン粉末をＲＯ水で
膨潤させた後、６０℃の恒温槽中で３０分以上変性させ
た。更に、熱変性したアテロコラーゲンを３６℃の恒温
槽中で２時間浸漬した後、ワーリングブレンダーでホモ
ジナイズして泡立てると、クリーム状の熱変性アテロコ
ラーゲン溶液が得られた。

【００２９】線維化アテロコラーゲン溶液の調整 アテロコラーゲンをｐＨ３の塩酸溶液に溶解し、０.２
〜０.３％の溶液に調整する。この溶液を０.２μmのフ
ィルターで濾過滅菌しｐＨ７.４のリン酸緩衝液を加え
て、最終リン酸濃度が３０mMリン酸ナトリウム、１００
mM塩化ナトリウムであり、コラーゲン濃度が０．２５％
となるように調整した。この溶液を３７℃で３時間以上
放置し、コラーゲンを線維状態にした。線維は遠心分離
機により約２〜４％程度に濃縮した。

【００３０】ヘパリン・線維化アテロコラーゲン溶液
の調整 上記と同様な方法で０.２５％のアテロコラーゲン溶
液を調整した。生理活性物質としてコラーゲン量に対し
て、０.２５％となるようにヘパリンを添加した。この
溶液を３７℃で３時間以上放置し、コラーゲンを線維状
態にした。線維は遠心分離機により約２〜４％程度に濃
縮した。

【００３１】線維化アテロコラーゲン−熱変性アテロ
コラーゲン 上記で調製した線維化アテロコラーゲン溶液と上記
で調製したクリーム状の１.５％熱変性アテロコラーゲ
ン溶液を混合し、充分に混ぜ合わせた。この時クリーム
状の泡は混合しても消えていなかった。この溶液を、下
面に底を有し上面が開口するプラスチック製シャーレに
流し込み、−４０℃で急速凍結した後、乾燥を行ない、
径の大きな空孔が下面に、径の小さな空孔が上面に形成
されコラーゲンスポンジを作製した。

【００３２】ヘパリン・線維化アテロコラーゲン−熱
変性アテロコラーゲン 上記で調製したヘパリン・熱変性アテロコラーゲン溶
液と上記で調製したクリーム状の１.５％熱変性アテ
ロコラーゲン溶液を混合し、充分に混ぜ合わせた。この
時クリーム状の泡は混合しても消えていなかった。この
溶液を、下面に底を有し上面が開口するプラスチック製
シャーレに流し込み、−４０℃で急速凍結した後、乾燥
を行ない、径の大きな空孔が下面に、径の小さな空孔が
コラーゲンスポンジを作製した。

【００３３】（実施例２）細胞侵入性コラーゲン製剤の
作製（１） 実施例１−にて作製したコラーゲンマトリックスを
０.０５トール(Torr)以下、１１０℃で３時間熱脱水架
橋を施し、本発明の細胞侵入性コラーゲン製剤を得た。
この時の架橋度は５２％であった。

【００３４】得られた細胞侵入性コラーゲン製剤をラッ
トの頭蓋頭頂骨上に埋植して骨の再構成を評価した。動
物は約７００ｇのSprague-Dawlay（ＳＤ）系雄性ラット
を用いた。ペントバルビタールを３３mg/kgＢ.Ｗ腹腔内
投与して麻酔した後、腹立に固定した。開頭し結合組織
を剥離し、骨面を露出させた。骨膜を除去し頭蓋骨を研
磨することにより骨欠損創を作製した。細胞侵入性コラ
ーゲン製剤は実施例の他に比較例を使用した。埋植後、
４週間目に剖検に供し、頭蓋骨を摘出しホルマリン固定
した。２〜３mm位の厚みに切り出した後、ギ酸−ホルマ
リン水溶液にて脱灰を行なった脱灰完了後に充分水洗
し、埋植した細胞侵入性コラーゲン製剤及び周辺骨組織
を病理組織学的に評価した。その結果を表１に示す。

【００３５】（実施例３）細胞侵入性コラーゲン製剤の
作製（２） 実施例１−にて作製したコラーゲンマトリックスを
０.０５トール(Torr)以下、１１０℃で３時間熱脱水架
橋を施し、本発明の細胞侵入性コラーゲン製剤を得た。
この時の架橋度は６５％であった。得られた細胞侵入性
コラーゲン製剤を、実施例２と同様に頭蓋頭頂骨埋入法
により埋植した細胞侵入性コラーゲン製剤及び周辺骨組
織を病理組織学的に評価した。その結果を表１に示す。

【００３６】（比較例１）実施例１−と同様の方法で
線維化アテロコラーゲンを得た。ワーリングブレンダー
でホモジナイズさせない以外は実施例１−と同様の方
法で熱変性アテロコラーゲンを得て、線維化アテロコラ
ーゲンの１５％となるように線維化アテロコラーゲンに
加え、線維化アテロコラーゲン−熱変性アテロコラーゲ
ンの混合物を得た。下面に底を有し上面が開口するプラ
スチック製シャーレに流し込み、−４０℃で急速凍結し
コラーゲンスポンジを得た後、該コラーゲンスポンジを
乾燥させ、０.０５Torr以下、１１０℃で１時間熱脱水
架橋を施し細胞侵入性コラーゲン製剤を得た。この時の
架橋度は１４％であった。

【００３７】得られた細胞侵入性コラーゲン製剤は、実
施例２と同様に頭蓋頭頂骨埋入法により埋植した細胞侵
入性コラーゲン製剤及び周辺骨組織を病理組織学的に評
価された。その結果を表１に示す。

【００３８】（比較例２）実施例１−と同様の方法で
線維化アテロコラーゲンを得て、実施例１−と同様の
方法で熱変性アテロコラーゲンを得て、線維化アテロコ
ラーゲンの１５％となるように線維化アテロコラーゲン
に加え、線維化アテロコラーゲン−熱変性アテロコラー
ゲンの混合物を得た。下面に底を有し上面が開口するプ
ラスチック製シャーレに流し込み、−４０℃で急速凍結
しコラーゲンスポンジを得た後、該コラーゲンスポンジ
を乾燥させ、０.０５Torr以下、１１０℃で２４時間熱
脱水架橋を施し細胞侵入性コラーゲン製剤を得た。この
時の架橋度は８５％であった。

【００３９】得られた細胞侵入性コラーゲン製剤は、実
施例１と同様に頭蓋頭頂骨埋入法により埋植した細胞侵
入性コラーゲン製剤及び周辺骨組織を病理組織学的に評
価された。その結果を表１に示す。

【００４０】

【表１】

【００４１】実施例１及び２の細胞侵入性コラーゲン製
剤では著明な骨の再構成が認められたが、比較例２の細
胞侵入性コラーゲン製剤では炎症性細胞の浸潤が、比較
例１の細胞侵入性コラーゲン製剤ではコラーゲンの消失
が著明に認められ、骨の再構成は認められなかった。

【００４２】（実施例４）人工皮膚の作製（１） メディカルグレード サイラスティクＴｙｐｅＡシリコ
ーン（ダウ・コーニング社製）をヘキサンで６７％とな
るように希釈し、溶解する。この溶液をテフロン板上に
流延し、精密被覆用具（アプリケーター）で３００μm
に伸ばし、この上に実施例１−で得られたコラーゲン
スポンジをのせて接着した。この複合化膜は６０℃，３
時間以上で硬化させた。最後に、０.０５Torr以下、１
１０℃以上で３時間以上熱処理を施し、本発明の人工皮
膚を得た。

【００４３】次に、得られた人工皮膚をラット背部全層
欠損層へ貼付し、線維芽細胞の侵入性を評価した。Ｈａ
ｒｔｌｅｙ系モルモット（８週令）をネンブタール麻酔
下で剃毛し、イソジンを消毒した背部に皮下皮筋を残し
た２cm角の全層欠損層を作製し、止血した後、人工皮膚
を貼付した。シリコーン層辺縁を縫合糸で１６ヶ所結糸
固定した。その上にメロリン（Ｓ＆Ｎ社製）をのせ、エ
ラスチンテープで圧迫固定した。移植７、１０、１４日
目で経時的に観察し、病理組織学的に評価した。その結
果を表２に示した。

【００４４】（実施例５）人工皮膚の作製（２） 実施例４で得られたシリコーン膜上に実施例１−及び
比較例１で得られたコラーゲンスポンジをのせて接着
し、以下実施例４と同様の処理を行い、本発明の人工皮
膚を得た。得られた人工皮膚は、実施例４と同様にラッ
ト背部全層欠損層への貼付方法により試料への線維芽細
胞の侵入性を病理組織学的に評価した。その結果を表２
に示す。

【００４５】（比較例３）実施例４で得られたシリコー
ン膜上に比較例１で得られたコラーゲンスポンジをのせ
て接着し、以下実施例４と同様の処理を行い、比較とし
ての人工皮膚を得た。得られた人工皮膚は、実施例４と
同様にラット背部全層欠損層への貼付方法により試料へ
の線維芽細胞の侵入性を病理組織学的に評価した。その
結果を表２に示す。

【００４６】（実施例６）人工皮膚の作製（３） 上記で得られたシリコーン・ヘキサン溶液をテフロン板
上に流延し、アプリケーターで３００μmに伸ばし、こ
の上にポリエステル製織布（繊維厚１００μm、目付け
７０g/cm²）をのせ、さらにその上に実施例１−で得
られたコラーゲンスポンジをのせて接着した。以下実施
例４と同様の処理を行い、本発明の人工皮膚を得た。得
られた人工皮膚は、実施例４と同様にラット背部全層欠
損層への貼付方法により試料への線維芽細胞の侵入性を
病理組織学的に評価した。その結果を表２に示す。

【００４７】

【表２】

【００４８】

【発明の効果】以上詳述したように本発明の製造方法に
より細胞侵入性コラーゲン製剤と人工皮膚を得ることが
できる。細胞侵入性コラーゲン製剤は、それを構成する
コラーゲンスポンジに１００〜１０００μmの空孔が存
在することから優れた細胞侵入性を有する。また、コラ
ーゲンの架橋度を３０〜８０％にすることにより、優れ
た物理的強度を有する。したがって、細胞侵入性コラー
ゲン製剤は骨修復材などの生体組織欠損部の補填剤とし
て用いることができ、骨修復材として用いる場合、骨再
構成を導く未分化間葉系細胞や骨芽細胞、毛細血管の侵
入を招き、骨再構成を達成することができる。また、変
性アテロコラーゲンを混合することにより、初期の細胞
侵入性をより高め、かつヘパリンを添加することによ
り、血管侵入を促進することにより、結果的に骨再構成
を高めることができる。

【００４９】本発明の人工皮膚は、支持層と、１００〜
１０００μmの空孔が存在するコラーゲンスポンジから
なり優れた細胞侵入性を有する。また、コラーゲンの架
橋度を３０〜８０％にすることにより、優れた物理的強
度を有する。したがって、本発明の人工皮膚は、創傷、
熱傷、褥創等により組織が損傷を受けた場合に、損傷面
に適用され、創面を保護し、疼痛を緩和し、細菌の感染
を防止し、また早期に線維芽細胞、毛細血管が侵入し、
真皮様組織を構築するため創傷の治癒が促進される。更
に、移植して一定期間たった後、上部の支持層を剥が
し、自家の分層植皮を行うことにより、より良い分層植
皮の生着と治癒が得られる。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】多数の空孔が存在するスポンジ状のコラー
   ゲンマトリックスからなり、前記空孔の直径が１００〜
   １０００μmであることを特徴とする細胞侵入性コラー
   ゲン製剤。
2. 【請求項２】前記コラーゲンマトリックスに存在する空
   孔が非対称性構造を有することを特徴とする請求項１に
   記載の細胞侵入性コラーゲン製剤。
3. 【請求項３】前記コラーゲンマトリックスが線維化アテ
   ロコラーゲンとヘリックス含量が０〜８０％の変性アテ
   ロコラーゲンの混合物であることを特徴とする請求項１
   乃至２に記載の細胞侵入性コラーゲン製剤。
4. 【請求項４】請求項１乃至３記載の細胞侵入性コラーゲ
   ン製剤からなる骨修復材。
5. 【請求項５】原料コラーゲン溶液を泡立て凍結乾燥させ
   た後、低圧下、高温で処理することを特徴とする請求項
   １乃至３に記載の細胞侵入性コラーゲン製剤の製造方
   法。
6. 【請求項６】創傷部接触層とその上に積層された支持層
   から構成され、前記創傷部接触層が多数の空孔が存在す
   るスポンジ状のコラーゲンマトリックスからなり、前記
   空孔の直径が１００〜１０００μmであることを特徴と
   する人工皮膚。
7. 【請求項７】前記コラーゲンマトリックスに存在する空
   孔が非対称性構造を有することを特徴とする請求項６に
   記載の人工皮膚。
8. 【請求項８】前記コラーゲンマトリックスが線維化アテ
   ロコラーゲンとヘリックス含量が０〜８０％の変性アテ
   ロコラーゲンの混合物であることを特徴とする請求項６
   乃至７に記載の人工皮膚。
9. 【請求項９】原料コラーゲン溶液を泡立て、上面が開口
   し下面が平底である容器に流し込み凍結乾燥させ、多数
   の空孔が存在し前記容器上面側を上面、下面側を下面と
   するスポンジ状のコラーゲンマトリックスを得て、前記
   コラーゲンマトリックスの上面に水分透過性物質の薄膜
   を積層し、低圧下、高温で処理することを特徴とする請
   求項６乃至８に記載の人工皮膚の製造方法。