JPH08198898A - コレステロール搬出促進物質 - Google Patents
コレステロール搬出促進物質Info
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- JPH08198898A JPH08198898A JP7012178A JP1217895A JPH08198898A JP H08198898 A JPH08198898 A JP H08198898A JP 7012178 A JP7012178 A JP 7012178A JP 1217895 A JP1217895 A JP 1217895A JP H08198898 A JPH08198898 A JP H08198898A
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】細胞のコレステロール含量を低下させる作用を
有する蛋白質の提供。 【構成】哺乳動物のＴ細胞で産生され、細胞のコレステ
ロール含量低下作用を有する蛋白質。 【効果】細胞の脱泡沫化を促進させることができるの
で、心筋梗塞など心臓病、脳梗塞など脳疾患および糸球
体硬化など腎疾患などアテローム性動脈硬化症に関連し
た諸疾患の予防、治療に有利に用いることができる。
有する蛋白質の提供。 【構成】哺乳動物のＴ細胞で産生され、細胞のコレステ
ロール含量低下作用を有する蛋白質。 【効果】細胞の脱泡沫化を促進させることができるの
で、心筋梗塞など心臓病、脳梗塞など脳疾患および糸球
体硬化など腎疾患などアテローム性動脈硬化症に関連し
た諸疾患の予防、治療に有利に用いることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞のコレステロール
含量を低下させる作用を有する蛋白質に関する。
含量を低下させる作用を有する蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】高コレステロール血症および高脂血症
は、アテローム性動脈硬化血管病変およびそれらの続発
症、例えば、冠動脈疾患（ＣＨＤ）、脳虚血、間欠性跛
行、壊疽等の発症におけるリスク因子である。アテロー
ム性動脈硬化は、血管内膜におけるマクロファージや血
管平滑筋細胞の増殖とそれら細胞へのコレステロール蓄
積といった血管病変が主である。アテローム性動脈硬化
の発症に高コレステロ−ル血症、特に低比重リポタンパ
ク（ＬＤＬ）−コレステロールが重大なリスク因子であ
ることは一般に認められている。疫学的研究から、心臓
病の発症頻度が血中コレステロール低下により減少し得
ることが明らかになった（リピドロジー（Lipidology）
第２(4)巻，第２３４頁，１９９１年）ことから、コレ
ステロール生合成の阻害剤、例えば血中脂質低下剤によ
り、アテローム性動脈硬化性血管病変を抑制しようとし
てきた。
は、アテローム性動脈硬化血管病変およびそれらの続発
症、例えば、冠動脈疾患（ＣＨＤ）、脳虚血、間欠性跛
行、壊疽等の発症におけるリスク因子である。アテロー
ム性動脈硬化は、血管内膜におけるマクロファージや血
管平滑筋細胞の増殖とそれら細胞へのコレステロール蓄
積といった血管病変が主である。アテローム性動脈硬化
の発症に高コレステロ−ル血症、特に低比重リポタンパ
ク（ＬＤＬ）−コレステロールが重大なリスク因子であ
ることは一般に認められている。疫学的研究から、心臓
病の発症頻度が血中コレステロール低下により減少し得
ることが明らかになった（リピドロジー（Lipidology）
第２(4)巻，第２３４頁，１９９１年）ことから、コレ
ステロール生合成の阻害剤、例えば血中脂質低下剤によ
り、アテローム性動脈硬化性血管病変を抑制しようとし
てきた。
【０００３】一方、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）−コ
レステロールが心臓病の発症頻度を抑制することも疫学
的に知られており、その理由として、ＨＤＬが泡沫化細
胞からコレステロールを引き抜くことが認められてい
る。ＨＤＬは血管壁に蓄積したコレステロールを除去
し、また血管壁へコレステロールを運び込む低比重リポ
タンパク（ＬＤＬ）と拮抗するといわれている。末梢細
胞からコレステロールを引き抜き肝臓に転送するＨＤＬ
の機能（コレステロール逆転送）と、ＨＤＬの抗動脈硬
化作用が関連づけられている。粥状動脈硬化病変の泡沫
細胞は、コレステロール蓄積を特徴としマクロファージ
（Ｍφ）に由来する。細胞レベルでは、ＨＤＬはＭφへ
のコレステロール蓄積を抑制する（抗泡沫化）ととも
に、蓄積コレステロールを選択的に減少させる（脱泡沫
化）。これらの作用にとってＭφからのコレステロール
引き抜き現象が重要である（ザ・リピッド（The Lipi
d）第１(3)巻，第７５頁，１９９０年１０月）。しかし
ながら、このＨＤＬ様作用を示す、あるいはＨＤＬ作用
を増強する物質に関する報告はない。
レステロールが心臓病の発症頻度を抑制することも疫学
的に知られており、その理由として、ＨＤＬが泡沫化細
胞からコレステロールを引き抜くことが認められてい
る。ＨＤＬは血管壁に蓄積したコレステロールを除去
し、また血管壁へコレステロールを運び込む低比重リポ
タンパク（ＬＤＬ）と拮抗するといわれている。末梢細
胞からコレステロールを引き抜き肝臓に転送するＨＤＬ
の機能（コレステロール逆転送）と、ＨＤＬの抗動脈硬
化作用が関連づけられている。粥状動脈硬化病変の泡沫
細胞は、コレステロール蓄積を特徴としマクロファージ
（Ｍφ）に由来する。細胞レベルでは、ＨＤＬはＭφへ
のコレステロール蓄積を抑制する（抗泡沫化）ととも
に、蓄積コレステロールを選択的に減少させる（脱泡沫
化）。これらの作用にとってＭφからのコレステロール
引き抜き現象が重要である（ザ・リピッド（The Lipi
d）第１(3)巻，第７５頁，１９９０年１０月）。しかし
ながら、このＨＤＬ様作用を示す、あるいはＨＤＬ作用
を増強する物質に関する報告はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ＨＤＬ様作用を示すあ
るいはＨＤＬの作用を増強する物質は、アテローム性動
脈硬化に関連する疾患の予防のみならず、治療薬として
極めて有用と考えられる。本発明は、心筋梗塞などの心
臓病、脳梗塞などの脳疾患および糸球体硬化などの腎疾
患などの動脈硬化に関連した諸疾患の治療または予防に
有用なコレステロール搬出促進物質を提供する。
るいはＨＤＬの作用を増強する物質は、アテローム性動
脈硬化に関連する疾患の予防のみならず、治療薬として
極めて有用と考えられる。本発明は、心筋梗塞などの心
臓病、脳梗塞などの脳疾患および糸球体硬化などの腎疾
患などの動脈硬化に関連した諸疾患の治療または予防に
有用なコレステロール搬出促進物質を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記事情に
鑑み鋭意研究を重ねた結果、細胞のコレステロール含量
を低下する作用を有する蛋白質を、Ｔ細胞培養液中に見
いだし、本発明を完成した。すなわち、本発明は、哺乳
動物のＴ細胞で産生され、細胞のコレステロール含量低
下作用を有する蛋白質である。本発明の蛋白質は、次の
ような特徴を有するものである。 （１）コレステロール負荷細胞のコレステロール含量を
低下させる。 （２）高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）との共培養により、
コレステロール負荷細胞のコレステロール含量を低下さ
せる。 （３）コレステロール負荷細胞へのＨＤＬの結合を増加
させる。 （４）細胞へのコレステロール蓄積を抑制する。 （５）トリプシンによって分解される。 また、本発明のもう一つの面としては、Ｔ細胞が抗動脈
硬化作用を有することを見いだした点である。
鑑み鋭意研究を重ねた結果、細胞のコレステロール含量
を低下する作用を有する蛋白質を、Ｔ細胞培養液中に見
いだし、本発明を完成した。すなわち、本発明は、哺乳
動物のＴ細胞で産生され、細胞のコレステロール含量低
下作用を有する蛋白質である。本発明の蛋白質は、次の
ような特徴を有するものである。 （１）コレステロール負荷細胞のコレステロール含量を
低下させる。 （２）高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）との共培養により、
コレステロール負荷細胞のコレステロール含量を低下さ
せる。 （３）コレステロール負荷細胞へのＨＤＬの結合を増加
させる。 （４）細胞へのコレステロール蓄積を抑制する。 （５）トリプシンによって分解される。 また、本発明のもう一つの面としては、Ｔ細胞が抗動脈
硬化作用を有することを見いだした点である。
【０００６】本発明における蛋白質の起源は特に限定さ
れない。例えば、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラッ
ト、ウサギ、犬、ネコ、牛、豚など）のＴ細胞培養液を
そのまま、または濃縮した後、塩析、限外ろ過、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲルろ過または高速液体クロ
マトグラフィーの操作を組み合わせて精製することがで
きる。本発明における細胞としては、例えばマクロファ
ージが挙げられる。本発明におけるＨＤＬとしては、例
えばＨＤＬ2、ＨＤＬ3が挙げられる。本発明の蛋白質
は、ＨＤＬ様作用を示し、またはＨＤＬの作用を増強す
ることができるので、細胞のコレステロール含量を低下
させることができる。したがって、コレステロールが負
荷され、コレステロールが余剰となった細胞に作用し
て、細胞のコレステロール含量を低下させるコレステロ
ール搬出促進物質として有用である。
れない。例えば、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラッ
ト、ウサギ、犬、ネコ、牛、豚など）のＴ細胞培養液を
そのまま、または濃縮した後、塩析、限外ろ過、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲルろ過または高速液体クロ
マトグラフィーの操作を組み合わせて精製することがで
きる。本発明における細胞としては、例えばマクロファ
ージが挙げられる。本発明におけるＨＤＬとしては、例
えばＨＤＬ2、ＨＤＬ3が挙げられる。本発明の蛋白質
は、ＨＤＬ様作用を示し、またはＨＤＬの作用を増強す
ることができるので、細胞のコレステロール含量を低下
させることができる。したがって、コレステロールが負
荷され、コレステロールが余剰となった細胞に作用し
て、細胞のコレステロール含量を低下させるコレステロ
ール搬出促進物質として有用である。
【０００７】本発明の蛋白質は、心筋梗塞など心臓病、
脳梗塞など脳疾患および糸球体硬化など腎疾患などアテ
ローム性動脈硬化症に関連した諸疾患の予防のみなら
ず、治療に安全に用いることができる。さらに可能な用
途として、過増殖性の皮膚および血管の疾患並びに腫瘍
の治療、および感染症の予防・治療が挙げられる。本発
明の蛋白質は、動脈硬化巣に直接作用することが期待で
きるので、既知のコレステロール合成阻害薬などとは異
なり、コレステロール供給を減少しないので安全性が高
い。本発明の蛋白質が有する特性は、実施例に記載の方
法などにより確認することができる。
脳梗塞など脳疾患および糸球体硬化など腎疾患などアテ
ローム性動脈硬化症に関連した諸疾患の予防のみなら
ず、治療に安全に用いることができる。さらに可能な用
途として、過増殖性の皮膚および血管の疾患並びに腫瘍
の治療、および感染症の予防・治療が挙げられる。本発
明の蛋白質は、動脈硬化巣に直接作用することが期待で
きるので、既知のコレステロール合成阻害薬などとは異
なり、コレステロール供給を減少しないので安全性が高
い。本発明の蛋白質が有する特性は、実施例に記載の方
法などにより確認することができる。
【０００８】
【実施例】以下に、実施例を示して、本発明を具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されることはない。 実施例１ ヒト細胞における本発明物質の作用特性 （１）リポタンパクおよびリポタンパク欠乏血清（ＬＰ
ＤＳ）の調製 健常人ボランティアの血漿から低比重リポタンパク（Ｌ
ＤＬ：ｄ＝１．０１９−１．０６３ｇ／ｍｌ）および高
比重リポタンパク（ＨＤＬ3：ｄ＝１．１２５−１．２
１ｇ／ｍｌ）をＨａｖｅｌらの方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．１９５５，３４：１３４５−１３５３）で
超遠心により分離した。ＬＰＤＳはフィブリンを取り除
いた後超遠心した際の最下層画分（ｄ＞１．２５）から
得た。
説明するが、本発明はこれらに限定されることはない。 実施例１ ヒト細胞における本発明物質の作用特性 （１）リポタンパクおよびリポタンパク欠乏血清（ＬＰ
ＤＳ）の調製 健常人ボランティアの血漿から低比重リポタンパク（Ｌ
ＤＬ：ｄ＝１．０１９−１．０６３ｇ／ｍｌ）および高
比重リポタンパク（ＨＤＬ3：ｄ＝１．１２５−１．２
１ｇ／ｍｌ）をＨａｖｅｌらの方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．１９５５，３４：１３４５−１３５３）で
超遠心により分離した。ＬＰＤＳはフィブリンを取り除
いた後超遠心した際の最下層画分（ｄ＞１．２５）から
得た。
【０００９】（２）マクロファージの調製 絶食下の健常人ボランティアからヘパリンナトリウム
（最終１０Ｕ／ＭＬ）を抗凝固剤として静脈血を採取
し、Ｂｏｙｕｍらの密度勾配遠心法（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９６８，２１（ｓｕｐｐ
ｌ）：７７−９９）によりヒト単核球を分離した。混合
単核球細胞層を氷冷ＰＢＳに懸濁して２回洗浄した。そ
の細胞をＲＰＭＩ１６４０メヂウムに２×１０6細胞／
ｍｌになるように懸濁してアクリルチャンバーに播種
し、単核球を接着させるため炭酸ガスインキュベータ中
で３７℃、２時間孵置した（Ｈｕｒｔら、Ａｔｈｅｒｏ
ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９８７，６７：１１５−１２
６）。非接着細胞を除くため、チャンバーを氷冷ＰＢＳ
にて２回洗浄した。非特異的エステラ−ゼ染色法（Ｙａ
ｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９７１，
５５：２８３−２９０）により調製細胞の９０％以上が
単核球であること、またトリパンブルーにて９０％以上
が生細胞であることを確認した。単核球を１０％のリポ
タンパク欠乏血清を含むＲＰＭＩ１６４０メヂウム中で
６−８日間培養しマクロファージへ分化させた。メヂウ
ムは３日毎に交換した。そのマクロファージをアセチル
ＬＤＬと４８時間インキュベートして泡沫化させ、２ｍ
ｇ／ｍｌの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む氷冷下の
ＰＢＳにて３回洗浄して以下で用いた。
（最終１０Ｕ／ＭＬ）を抗凝固剤として静脈血を採取
し、Ｂｏｙｕｍらの密度勾配遠心法（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９６８，２１（ｓｕｐｐ
ｌ）：７７−９９）によりヒト単核球を分離した。混合
単核球細胞層を氷冷ＰＢＳに懸濁して２回洗浄した。そ
の細胞をＲＰＭＩ１６４０メヂウムに２×１０6細胞／
ｍｌになるように懸濁してアクリルチャンバーに播種
し、単核球を接着させるため炭酸ガスインキュベータ中
で３７℃、２時間孵置した（Ｈｕｒｔら、Ａｔｈｅｒｏ
ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９８７，６７：１１５−１２
６）。非接着細胞を除くため、チャンバーを氷冷ＰＢＳ
にて２回洗浄した。非特異的エステラ−ゼ染色法（Ｙａ
ｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９７１，
５５：２８３−２９０）により調製細胞の９０％以上が
単核球であること、またトリパンブルーにて９０％以上
が生細胞であることを確認した。単核球を１０％のリポ
タンパク欠乏血清を含むＲＰＭＩ１６４０メヂウム中で
６−８日間培養しマクロファージへ分化させた。メヂウ
ムは３日毎に交換した。そのマクロファージをアセチル
ＬＤＬと４８時間インキュベートして泡沫化させ、２ｍ
ｇ／ｍｌの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む氷冷下の
ＰＢＳにて３回洗浄して以下で用いた。
【００１０】（３）Ｔリンパ球の分離とマクロファージ
との共培養 非接着単核球は洗浄した後にＰＢＳに懸濁してＴリンパ
球回収カラムにかけ、非接着性の単球とＢリンパ球を除
いてＴリンパ球を得た。Ｔリンパ球は使用前に２０％の
自家血清を含むＲＰＭＩ１６４０メヂウム中で６−８日
間培養し、氷冷ＰＢＳにて洗浄して以下で用いた。な
お、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いてフロー
サイトメトリーによりＴリンパ球マーカーを決定したと
ころ、ＣＤ２：９１．２％，ＣＤ３：８６．６，ＣＤ
４：５８．１％，ＣＤ８：１１．６％，ＣＤ１９：０．
１４％，ＣＤ２０：０．３７５％であり、分離細胞がＴ
リンパ球であることを確認した。マクロファージをＴリ
ンパ球と共培養する際には、Ｔリンパ球を１０％ＬＰＤ
Ｓを含むＲＰＭＩメヂウムに懸濁してＴｒａｎｓｗｅｌ
ｌR に添加し、メンブラン（０．４ｕｍのポアサイズ）
を隔ててマクロファージと直接接しないようにした。
との共培養 非接着単核球は洗浄した後にＰＢＳに懸濁してＴリンパ
球回収カラムにかけ、非接着性の単球とＢリンパ球を除
いてＴリンパ球を得た。Ｔリンパ球は使用前に２０％の
自家血清を含むＲＰＭＩ１６４０メヂウム中で６−８日
間培養し、氷冷ＰＢＳにて洗浄して以下で用いた。な
お、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いてフロー
サイトメトリーによりＴリンパ球マーカーを決定したと
ころ、ＣＤ２：９１．２％，ＣＤ３：８６．６，ＣＤ
４：５８．１％，ＣＤ８：１１．６％，ＣＤ１９：０．
１４％，ＣＤ２０：０．３７５％であり、分離細胞がＴ
リンパ球であることを確認した。マクロファージをＴリ
ンパ球と共培養する際には、Ｔリンパ球を１０％ＬＰＤ
Ｓを含むＲＰＭＩメヂウムに懸濁してＴｒａｎｓｗｅｌ
ｌR に添加し、メンブラン（０．４ｕｍのポアサイズ）
を隔ててマクロファージと直接接しないようにした。
【００１１】（４）マクロファージへのＨＤＬ3結合促
進作用 マクロファージを単独であるいはＴリンパ球（１０6 ／
ｍｌ）と共に１０％ＬＰＤＳと１００ｕｇ／ｍｌのＨＤ
Ｌ3を含む１ｍｌのＲＰＭＩメヂウム中で３７℃で２４
時間共培養した。共培養の後に、マクロファージを洗浄
し、２００μｇ／ｍｌのＨＤＬ3と１０μｇ／ｍｌの125
I−ＨＤＬ3と共に４℃で５時間インキュベートした。マ
クロファージを洗浄し、細胞はＰＢＳにて洗浄した後
に、０．１Ｎ−ＮａＯＨを加えて溶解しその一部を用い
て放射活性を測定した。その結果、マクロファージ単独
培養に比べてＴリンパ球との共培養ではマクロファージ
への125I−ＨＤＬ3 結合が増加した（図１）。 （５）マクロファージからのコレステロール流出促進作
用 マクロファージを洗浄した後に、細胞コレステロールプ
ールを平衡化するために１０％ＬＰＤＳを含むＲＰＭＩ
メヂウムを加えてさらに２０時間インキュベートした。
さらに、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡと０．２μＣｉ／ｍｌの
［3Ｈ］コレステロールを含むＲＰＭＩメヂウム中でイ
ンキュベートし、細胞膜コレステロールを標識した。Ｐ
ＢＳにて洗浄後、マクロファージを１０％ＬＰＤＳと５
０μｇ／ｍｌのＨＤＬ3を含むＲＰＭＩメヂウムにて２
４時間インキュベートした。その際、Ｔ細胞（１０6／
ｍｌ）を共培養してその影響をみた。メヂウムを遠心し
てはがれた細胞を取り除き、上清の一部を用いて放射活
性を測定した。細胞はＰＢＳにて洗浄した後に、０．１
Ｎ−ＮａＯＨを加えて溶解し一部を用いて放射活性を測
定した。［3Ｈ］コレステロール流出は、メヂウムと細
胞を合わせた総［3Ｈ］放射活性に対するメヂウムの放
射活性を％で示した。その結果、Ｔリンパ球は、単独で
あるいはＨＤＬ3と共にマクロファージからのコレステ
ロールの搬出を促進することが明らかになった（図
２）。
進作用 マクロファージを単独であるいはＴリンパ球（１０6 ／
ｍｌ）と共に１０％ＬＰＤＳと１００ｕｇ／ｍｌのＨＤ
Ｌ3を含む１ｍｌのＲＰＭＩメヂウム中で３７℃で２４
時間共培養した。共培養の後に、マクロファージを洗浄
し、２００μｇ／ｍｌのＨＤＬ3と１０μｇ／ｍｌの125
I−ＨＤＬ3と共に４℃で５時間インキュベートした。マ
クロファージを洗浄し、細胞はＰＢＳにて洗浄した後
に、０．１Ｎ−ＮａＯＨを加えて溶解しその一部を用い
て放射活性を測定した。その結果、マクロファージ単独
培養に比べてＴリンパ球との共培養ではマクロファージ
への125I−ＨＤＬ3 結合が増加した（図１）。 （５）マクロファージからのコレステロール流出促進作
用 マクロファージを洗浄した後に、細胞コレステロールプ
ールを平衡化するために１０％ＬＰＤＳを含むＲＰＭＩ
メヂウムを加えてさらに２０時間インキュベートした。
さらに、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡと０．２μＣｉ／ｍｌの
［3Ｈ］コレステロールを含むＲＰＭＩメヂウム中でイ
ンキュベートし、細胞膜コレステロールを標識した。Ｐ
ＢＳにて洗浄後、マクロファージを１０％ＬＰＤＳと５
０μｇ／ｍｌのＨＤＬ3を含むＲＰＭＩメヂウムにて２
４時間インキュベートした。その際、Ｔ細胞（１０6／
ｍｌ）を共培養してその影響をみた。メヂウムを遠心し
てはがれた細胞を取り除き、上清の一部を用いて放射活
性を測定した。細胞はＰＢＳにて洗浄した後に、０．１
Ｎ−ＮａＯＨを加えて溶解し一部を用いて放射活性を測
定した。［3Ｈ］コレステロール流出は、メヂウムと細
胞を合わせた総［3Ｈ］放射活性に対するメヂウムの放
射活性を％で示した。その結果、Ｔリンパ球は、単独で
あるいはＨＤＬ3と共にマクロファージからのコレステ
ロールの搬出を促進することが明らかになった（図
２）。
【００１２】（６）細胞コレステロール含量減少作用 マクロファージを洗浄し、単独であるいはＴリンパ球
（０．２５×１０6、０．５×１０6、１×１０6あるい
は２×１０6個）と共に１０％ＬＰＤＳと１００μｇ／
ｍｌのＨＤＬ3を含む１ｍｌのＲＰＭＩメヂウム中で３
７℃で２４時間共培養した。２４時間の培養の後にマク
ロファージを２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む氷冷した０．
０５Ｍトリス塩酸−０．１５Ｍ−ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．４）にて４回、その緩衝液のみで２回洗浄した後
に、細胞脂質を１ｍｌのヘキサン／イソプロパノール
（３：２，容量比）を加えて３０分間静置することによ
り２回にわたり抽出した。また、ウェルに１ｍｌの０．
１Ｎ−ＮａＯＨを添加して脂質抽出後の細胞を溶解しそ
の一部を用いてＬｏｗｒｙ法によりタンパク量を測定し
た。脂質抽出物は窒素気流中で乾固した後に５０μｌの
イソプロパノールに溶解し、一部を用いてＨｅｉｄｅｒ
とＢｏｙｅｔｔの方法（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９
７８，１９：１０６８−１０７０）により総コレステロ
−ルおよび遊離コレステロールを測定した。その結果、
マクロファージの総コレステロール含量は、対照に比べ
ＨＤＬ3単独でも減少したものの、さらにＴリンパ球
（１×１０6）と共培養することにより顕著に減少し
た。また、マクロファージのコレステロール含量は共培
養するＴリンパ球の濃度に依存して減少した（図３）。
（０．２５×１０6、０．５×１０6、１×１０6あるい
は２×１０6個）と共に１０％ＬＰＤＳと１００μｇ／
ｍｌのＨＤＬ3を含む１ｍｌのＲＰＭＩメヂウム中で３
７℃で２４時間共培養した。２４時間の培養の後にマク
ロファージを２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む氷冷した０．
０５Ｍトリス塩酸−０．１５Ｍ−ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．４）にて４回、その緩衝液のみで２回洗浄した後
に、細胞脂質を１ｍｌのヘキサン／イソプロパノール
（３：２，容量比）を加えて３０分間静置することによ
り２回にわたり抽出した。また、ウェルに１ｍｌの０．
１Ｎ−ＮａＯＨを添加して脂質抽出後の細胞を溶解しそ
の一部を用いてＬｏｗｒｙ法によりタンパク量を測定し
た。脂質抽出物は窒素気流中で乾固した後に５０μｌの
イソプロパノールに溶解し、一部を用いてＨｅｉｄｅｒ
とＢｏｙｅｔｔの方法（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９
７８，１９：１０６８−１０７０）により総コレステロ
−ルおよび遊離コレステロールを測定した。その結果、
マクロファージの総コレステロール含量は、対照に比べ
ＨＤＬ3単独でも減少したものの、さらにＴリンパ球
（１×１０6）と共培養することにより顕著に減少し
た。また、マクロファージのコレステロール含量は共培
養するＴリンパ球の濃度に依存して減少した（図３）。
【００１３】実施例２ マウス細胞における本発明物質の作用特性 （１）リポタンパクおよびリポタンパク欠乏血清（ＬＰ
ＤＳ）の調製 マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、雄性、７週齢）の血漿から
低比重リポタンパク（ＬＤＬ：ｄ＝１．０１９−１．０
６３ｇ／ｍｌ）および高比重リポタンパク（ＨＤＬ3：
ｄ＝１．１２５−１．２１ｇ／ｍｌ）をＨａｖｅｌらの
方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９５５，３４：
１３４５−１３５３）で超遠心により分離した。ＬＰＤ
Ｓはフィブリンを取り除いた後超遠心した際の最下層画
分（ｄ＞１．２５）から得た。 （２）マクロファージとＴリンパ球の調製およびそれら
の共培養 マウス腹腔から常在性のマクロファ−ジを常法に従って
分離した。実施例１におけるヒトマクロファージと同様
に泡沫化させて以下に用いた。また、マウス（Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６Ｊ、雄性、７週齢）からヘパリンナトリウム（最
終１０Ｕ／ＭＬ）を抗凝固剤として静脈血を採取し、先
に述べたヒトＴリンパ球の分離法に準じてマウスＴリン
パ球を分離した。なお、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒ
ｙ）を用いてフローサイトメトリーによりＴリンパ球マ
ーカーを決定したところ、ＣＤ２：９１．２％，ＣＤ
３：８６．６，ＣＤ４：５８．１％，ＣＤ８：１１．６
％，ＣＤ１９：０．１４％，ＣＤ２０：０．３７５％で
あり、分離細胞がＴリンパ球であることを確認した。マ
クロファージを単独であるいはＴリンパ球と共に１０％
ＬＰＤＳを含む１ｍｌのＲＰＭＩメヂウム中で３７℃で
２４時間培養した。共培養においては、Ｔリンパ球をＴ
ｒａｎｓｗｅｌｌRに添加し、メンブラン（０．４μｍ
のポアサイズ）を隔ててマクロファージと直接接しない
ようにした。
ＤＳ）の調製 マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、雄性、７週齢）の血漿から
低比重リポタンパク（ＬＤＬ：ｄ＝１．０１９−１．０
６３ｇ／ｍｌ）および高比重リポタンパク（ＨＤＬ3：
ｄ＝１．１２５−１．２１ｇ／ｍｌ）をＨａｖｅｌらの
方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９５５，３４：
１３４５−１３５３）で超遠心により分離した。ＬＰＤ
Ｓはフィブリンを取り除いた後超遠心した際の最下層画
分（ｄ＞１．２５）から得た。 （２）マクロファージとＴリンパ球の調製およびそれら
の共培養 マウス腹腔から常在性のマクロファ−ジを常法に従って
分離した。実施例１におけるヒトマクロファージと同様
に泡沫化させて以下に用いた。また、マウス（Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６Ｊ、雄性、７週齢）からヘパリンナトリウム（最
終１０Ｕ／ＭＬ）を抗凝固剤として静脈血を採取し、先
に述べたヒトＴリンパ球の分離法に準じてマウスＴリン
パ球を分離した。なお、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒ
ｙ）を用いてフローサイトメトリーによりＴリンパ球マ
ーカーを決定したところ、ＣＤ２：９１．２％，ＣＤ
３：８６．６，ＣＤ４：５８．１％，ＣＤ８：１１．６
％，ＣＤ１９：０．１４％，ＣＤ２０：０．３７５％で
あり、分離細胞がＴリンパ球であることを確認した。マ
クロファージを単独であるいはＴリンパ球と共に１０％
ＬＰＤＳを含む１ｍｌのＲＰＭＩメヂウム中で３７℃で
２４時間培養した。共培養においては、Ｔリンパ球をＴ
ｒａｎｓｗｅｌｌRに添加し、メンブラン（０．４μｍ
のポアサイズ）を隔ててマクロファージと直接接しない
ようにした。
【００１４】（３）細胞コレステロール含量減少作用 マクロファージを洗浄し、単独であるいはＴリンパ球
（０．２５×１０6、０．５×１０6あるいは２×１
０6）と共に１０％ＬＰＤＳと１００μｇ／ｍｌのＨＤ
Ｌ3を含む１ｍｌのＲＰＭＩメヂウム中で３７℃で２４
時間共培養した。２４時間の培養の後にマクロファージ
を２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む氷冷した０．０５Ｍトリ
ス塩酸−０．１５Ｍ−ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に
て４回、その緩衝液のみで２回洗浄した。細胞脂質は実
施例１におけるヒトマクロファージの場合と同様に抽出
し、コレステロール含量を測定した。また、ウェルに１
ｍｌの０．１Ｎ−ＮａＯＨを添加して脂質抽出後の細胞
を溶解し、その一部を用いてＬｏｗｒｙ法によりタンパ
ク量を測定した。その結果、マクロファージの総コレス
テロール含量は、アセチルＬＤＬを添加して培養するこ
とにより顕著に増加した。増加したコレステロール含量
は、対照に比べＨＤＬ3単独でも減少したものの、Ｔリ
ンパ球との共培養ではＴリンパ球の濃度に依存してさら
に減少した（図４）。また、マクファージの総コレステ
ロール含量は、ＨＤＬ3をメディウムに添加しなくて
も、対照に比べＴリンパ球との共培養によりＴリンパ球
の濃度に依存して減少した（図５）。さらに、あらかじ
めＴリンパ球を培養して得た培養液（コンディションド
メディウム）は、ＨＤＬ3単独よりも強いマクファージ
の総コレステロ−ル含量低下作用を示した（図６）。本
コンディションドメディウムの総コレステロール含量低
下作用は、トリプシン前処理により５０％抑制された。
（０．２５×１０6、０．５×１０6あるいは２×１
０6）と共に１０％ＬＰＤＳと１００μｇ／ｍｌのＨＤ
Ｌ3を含む１ｍｌのＲＰＭＩメヂウム中で３７℃で２４
時間共培養した。２４時間の培養の後にマクロファージ
を２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む氷冷した０．０５Ｍトリ
ス塩酸−０．１５Ｍ−ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に
て４回、その緩衝液のみで２回洗浄した。細胞脂質は実
施例１におけるヒトマクロファージの場合と同様に抽出
し、コレステロール含量を測定した。また、ウェルに１
ｍｌの０．１Ｎ−ＮａＯＨを添加して脂質抽出後の細胞
を溶解し、その一部を用いてＬｏｗｒｙ法によりタンパ
ク量を測定した。その結果、マクロファージの総コレス
テロール含量は、アセチルＬＤＬを添加して培養するこ
とにより顕著に増加した。増加したコレステロール含量
は、対照に比べＨＤＬ3単独でも減少したものの、Ｔリ
ンパ球との共培養ではＴリンパ球の濃度に依存してさら
に減少した（図４）。また、マクファージの総コレステ
ロール含量は、ＨＤＬ3をメディウムに添加しなくて
も、対照に比べＴリンパ球との共培養によりＴリンパ球
の濃度に依存して減少した（図５）。さらに、あらかじ
めＴリンパ球を培養して得た培養液（コンディションド
メディウム）は、ＨＤＬ3単独よりも強いマクファージ
の総コレステロ−ル含量低下作用を示した（図６）。本
コンディションドメディウムの総コレステロール含量低
下作用は、トリプシン前処理により５０％抑制された。
【００１５】
【発明の効果】本発明の蛋白質は、細胞のコレステロー
ル含量を低下させることができるので、細胞の脱泡沫化
を促進させることができる。したがって、心筋梗塞など
心臓病、脳梗塞など脳疾患および糸球体硬化など腎疾患
などアテローム性動脈硬化症に関連した諸疾患の予防、
治療に有利に用いることができる。
ル含量を低下させることができるので、細胞の脱泡沫化
を促進させることができる。したがって、心筋梗塞など
心臓病、脳梗塞など脳疾患および糸球体硬化など腎疾患
などアテローム性動脈硬化症に関連した諸疾患の予防、
治療に有利に用いることができる。
【図１】は、ヒトマクロファージへのＨＤＬ3結合促進
作用の結果を示す。
作用の結果を示す。
【図２】は、ヒトマクロファージからのコレステロール
搬出促進作用の結果を示す。
搬出促進作用の結果を示す。
【図３】は、ヒトマクロファージのコレステロール含量
に対する減少作用の結果を示す。
に対する減少作用の結果を示す。
【図４】は、マクロファージのコレステロール含量がＨ
ＤＬ3の存在下で、Ｔリンパ球との共培養により、Ｔリ
ンパ球数に依存して減少することを示す。
ＤＬ3の存在下で、Ｔリンパ球との共培養により、Ｔリ
ンパ球数に依存して減少することを示す。
【図５】は、マウスマクロファージのコレステロール含
量がＨＤＬ3がなくても、Ｔリンパ球と共培養するだけ
で減少することを示す。
量がＨＤＬ3がなくても、Ｔリンパ球と共培養するだけ
で減少することを示す。
【図６】は、マウスマクロファージのコレステロール含
量が、Ｔリンパ球をあらかじめ培養した後の培養液によ
っても、ＨＤＬ3存在下で減少することを示す。
量が、Ｔリンパ球をあらかじめ培養した後の培養液によ
っても、ＨＤＬ3存在下で減少することを示す。
図１の＊は、ｐ＜０.０５で有意であることを示す。 図２の＊は、対照に対してｐ＜０.０５で有意であるこ
とを示す。 図２の†は、ＨＤＬ3単独に対してｐ＜０.０５で有意で
あることを示す。 図３の＊は、Ｔリンパ球非存在下に対してｐ＜０.０５
で有意であることを示す。 図４の＊は、対照に対してｐ＜０.０５で有意であるこ
とを示す。 図４の＊＊は、対照に対してｐ＜０.０１で有意である
ことを示す。 図６の＊は、対照に対してｐ＜０．０５で有意であるこ
とを示す。 図６の＊＊は、対照に対してｐ＜０．０１で有意である
こと示す。 図６の†は、ＨＤＬ3に対してＰ＜０.０５で有意である
こと示す。 （＋）は、添加を示す。 （−）は、無添加を示す。
とを示す。 図２の†は、ＨＤＬ3単独に対してｐ＜０.０５で有意で
あることを示す。 図３の＊は、Ｔリンパ球非存在下に対してｐ＜０.０５
で有意であることを示す。 図４の＊は、対照に対してｐ＜０.０５で有意であるこ
とを示す。 図４の＊＊は、対照に対してｐ＜０.０１で有意である
ことを示す。 図６の＊は、対照に対してｐ＜０．０５で有意であるこ
とを示す。 図６の＊＊は、対照に対してｐ＜０．０１で有意である
こと示す。 図６の†は、ＨＤＬ3に対してＰ＜０.０５で有意である
こと示す。 （＋）は、添加を示す。 （−）は、無添加を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】哺乳動物のＴ細胞で産生され、細胞のコレ
ステロール含量低下作用を有する蛋白質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7012178A JPH08198898A (ja) | 1995-01-30 | 1995-01-30 | コレステロール搬出促進物質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7012178A JPH08198898A (ja) | 1995-01-30 | 1995-01-30 | コレステロール搬出促進物質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08198898A true JPH08198898A (ja) | 1996-08-06 |
Family
ID=11798180
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7012178A Withdrawn JPH08198898A (ja) | 1995-01-30 | 1995-01-30 | コレステロール搬出促進物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08198898A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002085363A1 (en) * | 2001-04-19 | 2002-10-31 | Kowa Co., Ltd. | Remedial agent for glomerular disease |
-
1995
- 1995-01-30 JP JP7012178A patent/JPH08198898A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002085363A1 (en) * | 2001-04-19 | 2002-10-31 | Kowa Co., Ltd. | Remedial agent for glomerular disease |
| US7504415B2 (en) | 2001-04-19 | 2009-03-17 | Kowa Co., Ltd. | Therapeutic agent for glomerular disease |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
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