JPH0820448B2 - 固定抗体の製造方法 - Google Patents
固定抗体の製造方法Info
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- JPH0820448B2 JPH0820448B2 JP1007706A JP770689A JPH0820448B2 JP H0820448 B2 JPH0820448 B2 JP H0820448B2 JP 1007706 A JP1007706 A JP 1007706A JP 770689 A JP770689 A JP 770689A JP H0820448 B2 JPH0820448 B2 JP H0820448B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ａ 産業上の利用分野 本発明は、固定抗体の製造方法に関する。
ｂ 従来技術及び発明が解決しようとする課題 生体中に存在する微量な物質を測定する方法の一つと
して免疫反応を利用したエンザイムイムノアッセイ（EI
A）やラジオイムノアッセイ（RIA）は臨床検査の重要な
位置を占めている。特にEIAは特異性が高く、放射性物
質を使用しなくても高感度であるので近年急速に発展し
ている。一般にこれらの測定法には不溶性担体に固定化
された抗体（以下「固定抗体」と略す）が用いられてお
り、その具備すべき要件として、特異性が高く、抗体固
定量が大で高活性であり、また酵素標識抗体の非特異的
吸着が少ないことがある。
して免疫反応を利用したエンザイムイムノアッセイ（EI
A）やラジオイムノアッセイ（RIA）は臨床検査の重要な
位置を占めている。特にEIAは特異性が高く、放射性物
質を使用しなくても高感度であるので近年急速に発展し
ている。一般にこれらの測定法には不溶性担体に固定化
された抗体（以下「固定抗体」と略す）が用いられてお
り、その具備すべき要件として、特異性が高く、抗体固
定量が大で高活性であり、また酵素標識抗体の非特異的
吸着が少ないことがある。
従来、固定抗体の製造方法としては、不溶性担体のア
ミノ基，カルボキシル基などと架橋剤を介して不溶性担
体と抗体とを共有結合させる方法、不溶性担体のマトリ
ックス中に固定する方法、あるいは不溶性担体に物理吸
着させる方法などがある。共有結合では抗体が不溶性担
体に強固に結合するという利点があるが、結合反応時に
抗体に悪影響を与えやすいことや、その操作が面倒なこ
とから、簡単な操作で固定抗体が得られる物理吸着法が
主に用いられている。
ミノ基，カルボキシル基などと架橋剤を介して不溶性担
体と抗体とを共有結合させる方法、不溶性担体のマトリ
ックス中に固定する方法、あるいは不溶性担体に物理吸
着させる方法などがある。共有結合では抗体が不溶性担
体に強固に結合するという利点があるが、結合反応時に
抗体に悪影響を与えやすいことや、その操作が面倒なこ
とから、簡単な操作で固定抗体が得られる物理吸着法が
主に用いられている。
物理吸着法の一般的な操作法としては、例えば抗体溶
液中に不溶性担体を浸漬して、４℃で一晩又は25℃で数
時間反応させるという方法が用いられる。
液中に不溶性担体を浸漬して、４℃で一晩又は25℃で数
時間反応させるという方法が用いられる。
しかしながら、物理吸着法では不溶性担体に必ずしも
十分な抗体量が固定できないため、抗体の表面を粗くし
て表面積を増加させたり（特開昭58−70164号公報）、
放射線を照射して表面の性質を改善したりして吸着量を
増加させる（特開昭60−260857号公報）試みがなされて
きたが感度の点で必ずしも十分でなかった。また抗体を
固定する際、抗体を部分変性させるためpH2.5で短時間
処理したり（E.Ishikawa et al,J.Immunoassay １,385
−398,1980）、グアニジンやチオシアン酸イオン，尿素
などの変性剤で前処理してから固定することにより測定
感度を向上させる方法（J.D.Connradie,J.Immunol,Meth
od 59,289−299,1983）が報告されている。
十分な抗体量が固定できないため、抗体の表面を粗くし
て表面積を増加させたり（特開昭58−70164号公報）、
放射線を照射して表面の性質を改善したりして吸着量を
増加させる（特開昭60−260857号公報）試みがなされて
きたが感度の点で必ずしも十分でなかった。また抗体を
固定する際、抗体を部分変性させるためpH2.5で短時間
処理したり（E.Ishikawa et al,J.Immunoassay １,385
−398,1980）、グアニジンやチオシアン酸イオン，尿素
などの変性剤で前処理してから固定することにより測定
感度を向上させる方法（J.D.Connradie,J.Immunol,Meth
od 59,289−299,1983）が報告されている。
しかしながら、前記の方法ではいずれも前処理した後
に改めて抗体を固定するために、操作が煩雑である。即
ち前記石川等の方法では固定すべき抗体をpH2.5の溶液
中で処理した後この酸性溶液を中和する操作に付し、そ
の後プラスチックビーズに固定している。また尿素を用
いる前記J.D.Connradie等の方法では、尿素で一日前処
理し、次いでその尿素を数日間かけて透析除去する必要
がある。
に改めて抗体を固定するために、操作が煩雑である。即
ち前記石川等の方法では固定すべき抗体をpH2.5の溶液
中で処理した後この酸性溶液を中和する操作に付し、そ
の後プラスチックビーズに固定している。また尿素を用
いる前記J.D.Connradie等の方法では、尿素で一日前処
理し、次いでその尿素を数日間かけて透析除去する必要
がある。
本発明者らはかかる従来技術の欠点に鑑み、抗体の活
性を損うことなく、しかも簡単な操作で固定抗体を製造
する方法につき鋭意検討した結果、前処理を行うことな
く一定範囲のpHで抗体を不溶性担体に直接固定すること
により、抗体の活性を損わずに固定抗体を製造すること
が可能であること、またかかる製造方法で得られた固定
抗体をさらに加熱処理することによって、より活性化さ
れた固定抗体を製造することが可能であることを見いだ
して本発明に到達したものである。
性を損うことなく、しかも簡単な操作で固定抗体を製造
する方法につき鋭意検討した結果、前処理を行うことな
く一定範囲のpHで抗体を不溶性担体に直接固定すること
により、抗体の活性を損わずに固定抗体を製造すること
が可能であること、またかかる製造方法で得られた固定
抗体をさらに加熱処理することによって、より活性化さ
れた固定抗体を製造することが可能であることを見いだ
して本発明に到達したものである。
ｃ 課題を解決するめたの手段 すなわち、本発明は、抗体又は抗体フラグメントを含
有するpH2.0〜4.5の抗体溶液中に不溶性担体を浸漬し
て、該抗体又は抗体フラグメントを該不溶性担体に固定
化する固定抗体の製造方法である。
有するpH2.0〜4.5の抗体溶液中に不溶性担体を浸漬し
て、該抗体又は抗体フラグメントを該不溶性担体に固定
化する固定抗体の製造方法である。
本発明で使用される抗体としてはポリクローナル抗
体，モノクローナル抗体のいずれでもよく、どの様な動
物由来の抗体であっても構わず、また抗体のフラグメン
トとしては、Ｆ（ab′）2,Fab′,Facbなどがあげられ
る。Ｆ（ab′）2,Fab′,Facbなどの抗体のフラグメント
の調整は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体
を公知の方法で酵素処理等することによって得られる。
例えば、抗体をペプシン処理してＦ（ab′）2を得、さ
らにこのフラグメントを還元処理してFab′を得ること
ができる（A.Nisonoff et al,Arch.Biochem.Biophys.8
9,230（1960）,P.Parham,J.Immonol.,131,2895（1983）
等を参照のこと）。
体，モノクローナル抗体のいずれでもよく、どの様な動
物由来の抗体であっても構わず、また抗体のフラグメン
トとしては、Ｆ（ab′）2,Fab′,Facbなどがあげられ
る。Ｆ（ab′）2,Fab′,Facbなどの抗体のフラグメント
の調整は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体
を公知の方法で酵素処理等することによって得られる。
例えば、抗体をペプシン処理してＦ（ab′）2を得、さ
らにこのフラグメントを還元処理してFab′を得ること
ができる（A.Nisonoff et al,Arch.Biochem.Biophys.8
9,230（1960）,P.Parham,J.Immonol.,131,2895（1983）
等を参照のこと）。
本発明の不溶性担体としては、ポリスチレン，ポリエ
ステル，ポリエチレン，ポリプロピレン,ABS,ポリフッ
化ビニル，ポリアミンメチルビニルエーテル−マレイン
酸共重合体,6−ナイロン,6,6−ナイロンなどのプラスチ
ック，アミノ酸重合体，ガラス，シリカゲルなどがあげ
られる。
ステル，ポリエチレン，ポリプロピレン,ABS,ポリフッ
化ビニル，ポリアミンメチルビニルエーテル−マレイン
酸共重合体,6−ナイロン,6,6−ナイロンなどのプラスチ
ック，アミノ酸重合体，ガラス，シリカゲルなどがあげ
られる。
かかる不溶性担体の形状はビーズ，マイクロスフィア
ー，スティック，試験管，フイルム，マイクロプレート
あるいはメンブレンなど特に限定されない。またその表
面は鏡面，粗面などどのような形態であつてもよい。
ー，スティック，試験管，フイルム，マイクロプレート
あるいはメンブレンなど特に限定されない。またその表
面は鏡面，粗面などどのような形態であつてもよい。
本発明においては、上記抗体又は抗体フラグメントを
含有するpH2.0〜4.5の抗体溶液中に、前記の不溶性担体
を浸漬して抗体等を固定化する。
含有するpH2.0〜4.5の抗体溶液中に、前記の不溶性担体
を浸漬して抗体等を固定化する。
かかる溶液は抗体等をpH2.0〜4.5の水溶液に溶解して
得られる。
得られる。
かかる水溶液としては特に限定されないが緩衝液が好
ましい。緩衝液としてはグリシン−塩酸緩衝液，クエン
酸ナトリウム−塩酸緩衝液，フタール酸水素カリウム−
塩酸緩衝液，クエン酸−クエン酸カリウム緩衝液，クエ
ン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液，酢酸ナトリウム−塩
酸緩衝液，酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液，ベロナール緩
衝液などpH2.0〜4.5を満足できるものであればどのよう
な緩衝液でもよく、好ましくはクエン酸−リン酸二ナト
リウム緩衝液である。抗体溶液のpHが2.0未満、又は4.5
より大では、固定後の抗体活性が不十分なため低感度と
なるので好ましくない。なかでもpH2.5〜3.5が好まし
い。緩衝液の塩濃度は0.01〜1Mの範囲で用いられ、好ま
しくは0.1〜0.5Mの範囲である。
ましい。緩衝液としてはグリシン−塩酸緩衝液，クエン
酸ナトリウム−塩酸緩衝液，フタール酸水素カリウム−
塩酸緩衝液，クエン酸−クエン酸カリウム緩衝液，クエ
ン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液，酢酸ナトリウム−塩
酸緩衝液，酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液，ベロナール緩
衝液などpH2.0〜4.5を満足できるものであればどのよう
な緩衝液でもよく、好ましくはクエン酸−リン酸二ナト
リウム緩衝液である。抗体溶液のpHが2.0未満、又は4.5
より大では、固定後の抗体活性が不十分なため低感度と
なるので好ましくない。なかでもpH2.5〜3.5が好まし
い。緩衝液の塩濃度は0.01〜1Mの範囲で用いられ、好ま
しくは0.1〜0.5Mの範囲である。
抗体溶液中の抗体等の濃度及び固定時間等の条件は、
抗体又は抗体フラグメントの種類によって異なるが、一
般には１〜100μg/mlの溶液が用いられ、この溶液中に
抗体を固定すべき不溶性担体を浸漬し４℃で１〜24時
間、又は室温で数時間静置する。
抗体又は抗体フラグメントの種類によって異なるが、一
般には１〜100μg/mlの溶液が用いられ、この溶液中に
抗体を固定すべき不溶性担体を浸漬し４℃で１〜24時
間、又は室温で数時間静置する。
静置が終わり抗体の固定化された不溶性担体は、その
まま風乾するか、遠心分離して水分を除去するかして保
存するか、又はリン酸緩衝液生理食塩水（PBS）で数回
洗浄した後、ウシ血清アルブミンの１％程度のPBS溶液
（以下、BSA−PBSと略す）に室温で２〜12時間静置しPB
Sで数回洗浄し、適当な緩衝液に浸漬して保存する。
まま風乾するか、遠心分離して水分を除去するかして保
存するか、又はリン酸緩衝液生理食塩水（PBS）で数回
洗浄した後、ウシ血清アルブミンの１％程度のPBS溶液
（以下、BSA−PBSと略す）に室温で２〜12時間静置しPB
Sで数回洗浄し、適当な緩衝液に浸漬して保存する。
この様にして作成した固定抗体は、中性付近のpHで固
定した固定抗体よりも抗原結合能が強く、最終的な測定
感度が大幅に上昇する。
定した固定抗体よりも抗原結合能が強く、最終的な測定
感度が大幅に上昇する。
本発明においては、上記方法で得られた固定抗体をさ
らに溶液中で加熱処理することによって、さらに高感度
な固定抗体を得ることのできる固定抗体の製造方法が提
供される。かかる加熱処理は、固定抗体を抗体溶液から
取り出してから直接に、または固体抗体を取り出してか
ら洗浄後１％程度のBSA−PBS溶液に浸漬し、洗浄したあ
とに行ってもよい。
らに溶液中で加熱処理することによって、さらに高感度
な固定抗体を得ることのできる固定抗体の製造方法が提
供される。かかる加熱処理は、固定抗体を抗体溶液から
取り出してから直接に、または固体抗体を取り出してか
ら洗浄後１％程度のBSA−PBS溶液に浸漬し、洗浄したあ
とに行ってもよい。
加熱処理する温度，時間は固定する抗体によって異な
るが、30〜80℃の間で行うのが好ましく、時間は１時間
〜数日間、なかでも２〜24時間が好ましい。
るが、30〜80℃の間で行うのが好ましく、時間は１時間
〜数日間、なかでも２〜24時間が好ましい。
加熱処理は、溶液中で行うのが好ましい。かかる溶液
として好ましいのはpH6〜８の緩衝液があげられる。か
かる緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液，フタール
酸水素緩衝液、リン酸二水素カリウム−硼砂緩衝液，リ
ン酸二ナトリウム−クエン酸緩衝液，ベロナール緩衝
液，トリス−塩酸緩衝液などpH6〜８にすることのでき
る緩衝液ならばどのような緩衝液でもよいが、リン酸緩
衝液が好ましく用いられる。緩衝液の塩濃度は0.01〜1M
の範囲で用いられる。
として好ましいのはpH6〜８の緩衝液があげられる。か
かる緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液，フタール
酸水素緩衝液、リン酸二水素カリウム−硼砂緩衝液，リ
ン酸二ナトリウム−クエン酸緩衝液，ベロナール緩衝
液，トリス−塩酸緩衝液などpH6〜８にすることのでき
る緩衝液ならばどのような緩衝液でもよいが、リン酸緩
衝液が好ましく用いられる。緩衝液の塩濃度は0.01〜1M
の範囲で用いられる。
この様にして加熱処理した固定抗体は、加熱処理しな
い固定抗体に比べると抗体活性が強く、最終的な測定感
度は大幅に上昇する。
い固定抗体に比べると抗体活性が強く、最終的な測定感
度は大幅に上昇する。
本発明の方法で得られた固定抗体は、通常のEIA測定
キット、例えば、TSH,GH,LH,FSH,HCG,プロラクチン，パ
ラサイロイドホルモン，インスリンなどのホルモン；例
えばフェリチン,CEA,アルファフェトプロテインなどの
ペプチド；例えばプロテインC,プロテインS,プラスミン
・α２プラスミノーゲンインヒビター複合体，組織プラ
スミノーゲンアクチベーター・プラスミノーゲンアクチ
ベーターインヒビター複合体，トロンビン，アンチトロ
ンビンIII複合体，トロンボモジュリンなどの線溶系蛋
白、に使用することができるが、これらに限られるもの
ではない。
キット、例えば、TSH,GH,LH,FSH,HCG,プロラクチン，パ
ラサイロイドホルモン，インスリンなどのホルモン；例
えばフェリチン,CEA,アルファフェトプロテインなどの
ペプチド；例えばプロテインC,プロテインS,プラスミン
・α２プラスミノーゲンインヒビター複合体，組織プラ
スミノーゲンアクチベーター・プラスミノーゲンアクチ
ベーターインヒビター複合体，トロンビン，アンチトロ
ンビンIII複合体，トロンボモジュリンなどの線溶系蛋
白、に使用することができるが、これらに限られるもの
ではない。
つぎに実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ ヒト繊毛性性腺刺激ホルモン（HCG）に対するモノク
ローナル抗体を、pHの異なる溶液中（pH1〜９）に10μg
/mlになるように溶解し、この中にポリスチレン製のス
ティックを浸漬して、４℃で18時間インキュベーション
した。その後このスティックを10mMPBS（pH7.2）中で３
回洗浄して、抗体固定化スティックとした。この抗体固
定化スティックを、0mIU/ml、10mIU/ml又は100mIU/mlの
HCG0.25mlと0.75mlのペルオキシダーゼ標識抗HCG抗体を
混合した液の中に浸して20分間インキュベーションし
た。次にスティックを水道水で洗浄し、0.17％H2O2７部
（容量部）と0.06％3,3′,5,5′−テトラメチルベンジ
ジン３部（容量部）を混合した溶液中でインキュベーシ
ョンした。10分後にスティックを除去し、残った溶液の
吸光度を分光光度計を用いて測定波長650nmで測定し
た。こうして得られた結果を第１図に示す。図から明ら
かなようにpH2.5〜4.0においては、0mIU/mlでの吸光度
は上昇することなく、10mIU/mlと100mIU/mlでの吸光度
が著しく高くなっており、結局感度が上昇していること
がわかる。
ローナル抗体を、pHの異なる溶液中（pH1〜９）に10μg
/mlになるように溶解し、この中にポリスチレン製のス
ティックを浸漬して、４℃で18時間インキュベーション
した。その後このスティックを10mMPBS（pH7.2）中で３
回洗浄して、抗体固定化スティックとした。この抗体固
定化スティックを、0mIU/ml、10mIU/ml又は100mIU/mlの
HCG0.25mlと0.75mlのペルオキシダーゼ標識抗HCG抗体を
混合した液の中に浸して20分間インキュベーションし
た。次にスティックを水道水で洗浄し、0.17％H2O2７部
（容量部）と0.06％3,3′,5,5′−テトラメチルベンジ
ジン３部（容量部）を混合した溶液中でインキュベーシ
ョンした。10分後にスティックを除去し、残った溶液の
吸光度を分光光度計を用いて測定波長650nmで測定し
た。こうして得られた結果を第１図に示す。図から明ら
かなようにpH2.5〜4.0においては、0mIU/mlでの吸光度
は上昇することなく、10mIU/mlと100mIU/mlでの吸光度
が著しく高くなっており、結局感度が上昇していること
がわかる。
実施例２ HCGに対するモノクローナル抗体の代わりにLHに対す
るモノクローナル抗体を用い、実施例１と全く同様の操
作でHCGの代わりにLHを測定した結果を第２図に示す。H
CGの場合と同様にpH2.0〜4.0において約1.5〜約２倍以
上も感度の上昇が見られることが判る。
るモノクローナル抗体を用い、実施例１と全く同様の操
作でHCGの代わりにLHを測定した結果を第２図に示す。H
CGの場合と同様にpH2.0〜4.0において約1.5〜約２倍以
上も感度の上昇が見られることが判る。
実施例３ 実施例１と同様にして、pHの異なる溶液中（pH1〜
９）に凝固系の蛋白であるプロテインＣに対するモノク
ローナル抗体を10μg/mlになるように溶解した溶液中
に、ポリスチレンビーズ（積水化学＃80）を浸漬し、２
〜８℃で20±４時間インキュベーションした。次にビー
ズをPBSで洗浄した。こうして得られたビーズを抗体固
定ビーズとした。この抗体固定ビーズを、PBSで51倍希
釈した標準人血清、又はPBSのみと、ペルオキシダーゼ
標識抗プロテインＣ抗体の混合液中でインキュベーシヨ
ンし、洗浄した後実施例１と同様にして発色させ、吸光
度を測定した。その結果を第３図に示す。図から明らか
なようにpH2.0〜3.0において約４〜５倍の感度の上昇が
見られることが判る。
９）に凝固系の蛋白であるプロテインＣに対するモノク
ローナル抗体を10μg/mlになるように溶解した溶液中
に、ポリスチレンビーズ（積水化学＃80）を浸漬し、２
〜８℃で20±４時間インキュベーションした。次にビー
ズをPBSで洗浄した。こうして得られたビーズを抗体固
定ビーズとした。この抗体固定ビーズを、PBSで51倍希
釈した標準人血清、又はPBSのみと、ペルオキシダーゼ
標識抗プロテインＣ抗体の混合液中でインキュベーシヨ
ンし、洗浄した後実施例１と同様にして発色させ、吸光
度を測定した。その結果を第３図に示す。図から明らか
なようにpH2.0〜3.0において約４〜５倍の感度の上昇が
見られることが判る。
実施例４ ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターに
対するマウスモノクローナル抗体（JTI−４）を0.1Mリ
ン酸・クエン酸緩衝液（pH3.0）に20μg/mlになる様に
溶解し、この中にポリスチレン製ビーズ（積水化学＃8
0）を浸漬して、４℃で一夜静置した。PBSで洗浄したあ
と、１％BSA−PBS溶液に室温で２時間浸漬し、PBSで洗
浄後、PBS中で50℃の水谷上で１〜６時間加熱処理し、
４℃で保存した。
対するマウスモノクローナル抗体（JTI−４）を0.1Mリ
ン酸・クエン酸緩衝液（pH3.0）に20μg/mlになる様に
溶解し、この中にポリスチレン製ビーズ（積水化学＃8
0）を浸漬して、４℃で一夜静置した。PBSで洗浄したあ
と、１％BSA−PBS溶液に室温で２時間浸漬し、PBSで洗
浄後、PBS中で50℃の水谷上で１〜６時間加熱処理し、
４℃で保存した。
加熱処理したビーズを、ヒト組織プラスミノーゲンア
クチベーター・プラスミノーゲンアクチベーターインヒ
ビター複合体のPBS溶液（O,20ng/ml）0.3mlに入れ、37
℃で２時間インキュベーションした。Tween20を0.05％
溶解したPBS（以下PBS−Ｔと略す）で洗浄後、ペルオキ
シダーゼ標識マウス抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターモノクローナル抗体（JTA−１）のFab′フラグ
メントPBS−Ｔ溶液（0.6μg/mlを0.3ml）を加え、37℃
で30分間インキュベーションした。
クチベーター・プラスミノーゲンアクチベーターインヒ
ビター複合体のPBS溶液（O,20ng/ml）0.3mlに入れ、37
℃で２時間インキュベーションした。Tween20を0.05％
溶解したPBS（以下PBS−Ｔと略す）で洗浄後、ペルオキ
シダーゼ標識マウス抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターモノクローナル抗体（JTA−１）のFab′フラグ
メントPBS−Ｔ溶液（0.6μg/mlを0.3ml）を加え、37℃
で30分間インキュベーションした。
PBSで洗浄後、2.5mMH2O2−0.025％3,3′,5,5′トラメ
チルペンチジン溶液（0.3ml）を加え、37℃で30分間発
色させた。1N硫酸（1ml）で発色反応を停止し、450nmの
吸光度を測定した。こうして得られた結果を第４図に示
す。
チルペンチジン溶液（0.3ml）を加え、37℃で30分間発
色させた。1N硫酸（1ml）で発色反応を停止し、450nmの
吸光度を測定した。こうして得られた結果を第４図に示
す。
図から明らかな如く、加熱処理することにより、0ng/
mlのODは上昇することなく20ng/mlのODは上昇し、加熱
時間２時間以上で約２倍のODを示した。
mlのODは上昇することなく20ng/mlのODは上昇し、加熱
時間２時間以上で約２倍のODを示した。
なおマウス抗ヒト・プラスミノーゲンアクチベーター
インヒビター・モノクローナル抗体（JTI−４）は、特
願昭63−81366号（発明の名称「プラスミノーゲンアク
ティベーターインヒビターに対するモノクローナル抗
体」，昭和63年４月４日出願）に記載される方法で得
た。即ち、Van Mourich J.A.et al.,J.Biol.Chem.,259,
14914〜14921（1984）らの方法を応用しヒト血管壁内皮
細胞の培養上清から単離・精製したプラスミノーゲンア
クチベーターインヒビター（PAI）を抗原としてマウス
を免疫して得られた脾臓細胞を用い、常法に従って細胞
融合により、抗PAIモノクローナル抗体を産性するハイ
ブリドーマ４クローン（JTI1〜４）を得た。JTI1〜４は
全て、PAI及びｔ−PA−PAI複合体を認識し、サブクラス
がIgG1,Kで、JTI−４はPAI阻害活性の中和能を有さず、
quiescentPAI,SDS活性化PAIのいずれにも結合した。
インヒビター・モノクローナル抗体（JTI−４）は、特
願昭63−81366号（発明の名称「プラスミノーゲンアク
ティベーターインヒビターに対するモノクローナル抗
体」，昭和63年４月４日出願）に記載される方法で得
た。即ち、Van Mourich J.A.et al.,J.Biol.Chem.,259,
14914〜14921（1984）らの方法を応用しヒト血管壁内皮
細胞の培養上清から単離・精製したプラスミノーゲンア
クチベーターインヒビター（PAI）を抗原としてマウス
を免疫して得られた脾臓細胞を用い、常法に従って細胞
融合により、抗PAIモノクローナル抗体を産性するハイ
ブリドーマ４クローン（JTI1〜４）を得た。JTI1〜４は
全て、PAI及びｔ−PA−PAI複合体を認識し、サブクラス
がIgG1,Kで、JTI−４はPAI阻害活性の中和能を有さず、
quiescentPAI,SDS活性化PAIのいずれにも結合した。
また、マウス抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー・モノクローナル抗体（JTA−１）は、特願昭63−813
67号（発明の名称「プラスミノーゲンアクティベーター
に対するモノクローナル抗体」，昭和63年４月４日出
願）に記載の方法で得た。即ちヒト・メラノーマ細胞培
養上清から、Rijken D.C.らの方法（RijkenD.C.et al,
J.Biol.Chem.,256,7035〜7041（1981）を応用して単離
・精製したtPAを抗原としてマウスを免疫して得られた
脾臓細胞を用いて常法に従い細胞融合し、抗tPAモノク
ローナル抗体を産出するハイブリドーマをクローン化
し、抗tPAモノクローナル抗体JTA1〜４を産出する４の
クローンを得た。
ー・モノクローナル抗体（JTA−１）は、特願昭63−813
67号（発明の名称「プラスミノーゲンアクティベーター
に対するモノクローナル抗体」，昭和63年４月４日出
願）に記載の方法で得た。即ちヒト・メラノーマ細胞培
養上清から、Rijken D.C.らの方法（RijkenD.C.et al,
J.Biol.Chem.,256,7035〜7041（1981）を応用して単離
・精製したtPAを抗原としてマウスを免疫して得られた
脾臓細胞を用いて常法に従い細胞融合し、抗tPAモノク
ローナル抗体を産出するハイブリドーマをクローン化
し、抗tPAモノクローナル抗体JTA1〜４を産出する４の
クローンを得た。
JTA1〜４はいずれも、tPA及びtPA−PAI複合体に結合
し、JTA−1,2,4はtPAのＨ鎖に結合するが、JTA−３は結
合せず、いずれもサブクラスIgG1,Kであった。
し、JTA−1,2,4はtPAのＨ鎖に結合するが、JTA−３は結
合せず、いずれもサブクラスIgG1,Kであった。
上記マウス抗ヒトtPAモノクローナル抗体を、A.Nison
offらの方法によって処理し、該抗体のFab′フラグメン
トを得た。
offらの方法によって処理し、該抗体のFab′フラグメン
トを得た。
実施例５ ウシ・コンドロカルシンに対するウサギ抗体を0.1Mリ
ン酸・クエン酸緩衝液（pH3.0）に20μg/mlになる様に
溶解し、この中にポリスチレンビーズ（積水化学，＃8
0）を浸漬して、４℃で一夜静置した。PBSで洗浄したあ
と、１％BSA−PBS溶液に室温で２時間浸漬した後、PBS
で洗浄後、PBS中で50℃の水浴中で３時間〜６日間加熱
処理し、４℃で保存した。
ン酸・クエン酸緩衝液（pH3.0）に20μg/mlになる様に
溶解し、この中にポリスチレンビーズ（積水化学，＃8
0）を浸漬して、４℃で一夜静置した。PBSで洗浄したあ
と、１％BSA−PBS溶液に室温で２時間浸漬した後、PBS
で洗浄後、PBS中で50℃の水浴中で３時間〜６日間加熱
処理し、４℃で保存した。
加熱処理したビーズをウシ・コンドロカルシンのPBS
溶液（0,5ng/ml）（0.2ml）と、ペルオキシダーゼ標識
したウシ・コンドロカルシンに対するウサギ抗体（0.2m
l）の混合液に入れ、37℃で２時間静置した。PBS−Ｔで
洗浄したあと、2.5mMH2O2−0.025％3,3′,5,5′−テト
ラメチルベンジシン混合液（0.4ml）を加え、37℃で30
分間発色させた。1N硫酸（1ml）で発色反応を停止し、4
50nmの吸光度を測定した。
溶液（0,5ng/ml）（0.2ml）と、ペルオキシダーゼ標識
したウシ・コンドロカルシンに対するウサギ抗体（0.2m
l）の混合液に入れ、37℃で２時間静置した。PBS−Ｔで
洗浄したあと、2.5mMH2O2−0.025％3,3′,5,5′−テト
ラメチルベンジシン混合液（0.4ml）を加え、37℃で30
分間発色させた。1N硫酸（1ml）で発色反応を停止し、4
50nmの吸光度を測定した。
なおウシ・コンドロカルシンに対するウサギ抗体は、
チョイらの方法（H.U.Choi et al,J.Biol.Chem.258,655
−661,1983）に基づいて、ウシ・コンドロカルシンを家
兎に免疫し得られた抗血清より精製した。
チョイらの方法（H.U.Choi et al,J.Biol.Chem.258,655
−661,1983）に基づいて、ウシ・コンドロカルシンを家
兎に免疫し得られた抗血清より精製した。
こうして得られた結果を第５図に示す。
図から明らかな如く、加熱処理によりOng/mlのODは変
化なく、5ng/mlのODは加熱により約1.6倍のODを示し
た。
化なく、5ng/mlのODは加熱により約1.6倍のODを示し
た。
第１図はpH1〜９のHCG抗体溶液中で固定した固定抗体を
用いた場合のHCGの測定結果を示す。 第２図はpH1〜９のLH抗体溶液中で固定した固定抗体を
用いた場合のLHの測定結果を示す。 第３図はpH1〜９のプロテインＣ抗体溶液中で固定した
固定抗体を用いた場合のプロテインＣの測定結果を示
す。 第４図はpH3.0のヒト・プラスミノーゲンアクチベータ
ーインヒビターMCA抗体溶液で固定した固定抗体を、さ
らに１〜６時間加熱処理した固定抗体を用いた場合の、
ヒト・組織プラスミノーゲンアクチベーター・プラスミ
ノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の測定結果
を示す。 第５図はpH3.0のウサギ抗ウシ・コンドロカルシンPCA抗
体溶液で固定した固定抗体を、さらに加熱時間を変化さ
せて加熱処理した固定抗体を用いた場合の、コンドロカ
ルシンの測定結果を示す。
用いた場合のHCGの測定結果を示す。 第２図はpH1〜９のLH抗体溶液中で固定した固定抗体を
用いた場合のLHの測定結果を示す。 第３図はpH1〜９のプロテインＣ抗体溶液中で固定した
固定抗体を用いた場合のプロテインＣの測定結果を示
す。 第４図はpH3.0のヒト・プラスミノーゲンアクチベータ
ーインヒビターMCA抗体溶液で固定した固定抗体を、さ
らに１〜６時間加熱処理した固定抗体を用いた場合の、
ヒト・組織プラスミノーゲンアクチベーター・プラスミ
ノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の測定結果
を示す。 第５図はpH3.0のウサギ抗ウシ・コンドロカルシンPCA抗
体溶液で固定した固定抗体を、さらに加熱時間を変化さ
せて加熱処理した固定抗体を用いた場合の、コンドロカ
ルシンの測定結果を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】抗体又は抗体フラグメントを含有するpH2.
0〜4.5の抗体溶液中に不溶性担体を浸漬して、該抗体ま
たは抗体フラグメントを該不溶性担体上に固定化する固
定抗体の製造方法。 - 【請求項２】請求項１記載の固定抗体の製造方法におい
て、該抗体又は該フラグメントを該不溶性担体上に固定
化した後、得られた固定抗体を溶液中で加熱処理するこ
とを特徴とする固定抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1007706A JPH0820448B2 (ja) | 1989-01-18 | 1989-01-18 | 固定抗体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1007706A JPH0820448B2 (ja) | 1989-01-18 | 1989-01-18 | 固定抗体の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02189462A JPH02189462A (ja) | 1990-07-25 |
| JPH0820448B2 true JPH0820448B2 (ja) | 1996-03-04 |
Family
ID=11673190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1007706A Expired - Lifetime JPH0820448B2 (ja) | 1989-01-18 | 1989-01-18 | 固定抗体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0820448B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102707048A (zh) * | 2012-05-18 | 2012-10-03 | 北京北方生物技术研究所 | 一种用于免疫分析的固相抗体制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3446636A1 (de) * | 1984-12-20 | 1986-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung eines immunreaktiven poroesen traegermaterials |
-
1989
- 1989-01-18 JP JP1007706A patent/JPH0820448B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102707048A (zh) * | 2012-05-18 | 2012-10-03 | 北京北方生物技术研究所 | 一种用于免疫分析的固相抗体制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02189462A (ja) | 1990-07-25 |
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Legal Events
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