JPH08205898A - 伴性無ガンマグロブリン血症に関与する遺伝子を含むｄｎａ断片およびその解析方法 - Google Patents
伴性無ガンマグロブリン血症に関与する遺伝子を含むｄｎａ断片およびその解析方法Info
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- JPH08205898A JPH08205898A JP7034715A JP3471595A JPH08205898A JP H08205898 A JPH08205898 A JP H08205898A JP 7034715 A JP7034715 A JP 7034715A JP 3471595 A JP3471595 A JP 3471595A JP H08205898 A JPH08205898 A JP H08205898A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 伴性無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）に関
与する遺伝子［無ガンマグロブリン血症チロシンキナー
ゼ（ａｔｋ）遺伝子］を含むＤＮＡ断片およびその解析
方法。該ＤＮＡ断片はａｔｋ遺伝子のｍＲＮＡから合成
したｃＤＮＡを用いたヒトゲノミックライブラリーのス
クリーニングによりａｔｋ遺伝子染色体ＤＮＡを取得
し、該遺伝子のｃＤＮＡ領域を包含するサブクローンを
選択することにより得られる。また、その塩基配列を元
にＰＣＲプライマーを設計することで、ａｔｋ遺伝子の
解析方法が提供される。 【効果】 本発明によるＤＮＡ断片により、染色体ＤＮ
Ａを検体とするａｔｋ遺伝子の解析方法を提供し得る。
この解析方法は、ＸＬＡの保因者診断を含む遺伝子診断
および遺伝子治療にも利用可能である。
与する遺伝子［無ガンマグロブリン血症チロシンキナー
ゼ（ａｔｋ）遺伝子］を含むＤＮＡ断片およびその解析
方法。該ＤＮＡ断片はａｔｋ遺伝子のｍＲＮＡから合成
したｃＤＮＡを用いたヒトゲノミックライブラリーのス
クリーニングによりａｔｋ遺伝子染色体ＤＮＡを取得
し、該遺伝子のｃＤＮＡ領域を包含するサブクローンを
選択することにより得られる。また、その塩基配列を元
にＰＣＲプライマーを設計することで、ａｔｋ遺伝子の
解析方法が提供される。 【効果】 本発明によるＤＮＡ断片により、染色体ＤＮ
Ａを検体とするａｔｋ遺伝子の解析方法を提供し得る。
この解析方法は、ＸＬＡの保因者診断を含む遺伝子診断
および遺伝子治療にも利用可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト染色体に由来し、
伴性無ガンマグロブリン血症（X-linked agammaglobuli
naemia；以下、ＸＬＡと略称することがある。）に関与
する無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ遺伝子
（agammaglobulinaemia tyrosine kinase gene；以下ａ
ｔｋ遺伝子と略称することがある。）を含むＤＮＡ断
片、該ＤＮＡ断片に対する相補性を有するオリゴヌクレ
オチド、および該オリゴヌクレオチドを用いた前記ＤＮ
Ａ断片の塩基配列解析方法に関する。
伴性無ガンマグロブリン血症（X-linked agammaglobuli
naemia；以下、ＸＬＡと略称することがある。）に関与
する無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ遺伝子
（agammaglobulinaemia tyrosine kinase gene；以下ａ
ｔｋ遺伝子と略称することがある。）を含むＤＮＡ断
片、該ＤＮＡ断片に対する相補性を有するオリゴヌクレ
オチド、および該オリゴヌクレオチドを用いた前記ＤＮ
Ａ断片の塩基配列解析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および課題】伴性劣性遺伝形式をとる伴性
無ガンマグロブリン血症の臨床的症状としては、細胞性
免疫能は保たれているものの、母親由来イムノブロブリ
ンが消失する乳児期後半より細菌を主とする易感染性が
認められ、多くの症例において末梢血中Ｂ細胞の著減が
観察される。この知見から、本症はＢ細胞の分化成熟障
害によるイムノグロブリン産生の異常に起因すると考え
られてきた。更に、本症の病因遺伝子は、連鎖解析によ
りヒト染色体上 Ｘｑ２１.３−Ｘｑ２２ の位置に存在
すると推定されていた。そして、１９９３年、ベトリエ
らはポジショナルクローニング法により本症に関わるｃ
ＤＮＡを単離し、その塩基配列を決定した結果、ＸＬＡ
患者に由来する前記ｃＤＮＡ上に点突然変異および欠失
などを認め、前記病因遺伝子であるａｔｋ遺伝子がＸＬ
Ａの発症に深く関わっていることを示唆した［Vetrie,D
et al.,Nature 361 226, 1993 参照]。従って、ａｔｋ
遺伝子の解析は、ＸＬＡの検査、診断および治療に役立
つものとして期待されており、現在、ａｔｋ遺伝子に関
する研究は、ベトリエらの前記の報告を基に、被験者の
血液よりｍＲＮＡを抽出し、抽出したｍＲＮＡをｃＤＮ
Ａに逆転写したうえで行われている。
無ガンマグロブリン血症の臨床的症状としては、細胞性
免疫能は保たれているものの、母親由来イムノブロブリ
ンが消失する乳児期後半より細菌を主とする易感染性が
認められ、多くの症例において末梢血中Ｂ細胞の著減が
観察される。この知見から、本症はＢ細胞の分化成熟障
害によるイムノグロブリン産生の異常に起因すると考え
られてきた。更に、本症の病因遺伝子は、連鎖解析によ
りヒト染色体上 Ｘｑ２１.３−Ｘｑ２２ の位置に存在
すると推定されていた。そして、１９９３年、ベトリエ
らはポジショナルクローニング法により本症に関わるｃ
ＤＮＡを単離し、その塩基配列を決定した結果、ＸＬＡ
患者に由来する前記ｃＤＮＡ上に点突然変異および欠失
などを認め、前記病因遺伝子であるａｔｋ遺伝子がＸＬ
Ａの発症に深く関わっていることを示唆した［Vetrie,D
et al.,Nature 361 226, 1993 参照]。従って、ａｔｋ
遺伝子の解析は、ＸＬＡの検査、診断および治療に役立
つものとして期待されており、現在、ａｔｋ遺伝子に関
する研究は、ベトリエらの前記の報告を基に、被験者の
血液よりｍＲＮＡを抽出し、抽出したｍＲＮＡをｃＤＮ
Ａに逆転写したうえで行われている。
【０００３】しかしながら、一般的に、ｍＲＮＡは分解
を受けやすく、また生体成分としての含有量も低いため
に試料の採取には多量の採血を必要とし、さらに抽出に
は繁雑な操作を伴う等、ｍＲＮＡを遺伝子解析の材料と
して取り扱うには多くの困難を伴う。完全長のｍＲＮＡ
を抽出することも非常に困難である。また、ａｔｋ遺伝
子は末梢血有核細胞において発現しているものの、本遺
伝子の解析の対象となるのは小児であり、このことから
も多量の採血を必要とするｍＲＮＡを遺伝子解析の材料
とすることは望ましくない。さらに、限られた情報しか
有しないｍＲＮＡの解析では遺伝子の非アミノ酸コーデ
ィング領域の解析は困難である。
を受けやすく、また生体成分としての含有量も低いため
に試料の採取には多量の採血を必要とし、さらに抽出に
は繁雑な操作を伴う等、ｍＲＮＡを遺伝子解析の材料と
して取り扱うには多くの困難を伴う。完全長のｍＲＮＡ
を抽出することも非常に困難である。また、ａｔｋ遺伝
子は末梢血有核細胞において発現しているものの、本遺
伝子の解析の対象となるのは小児であり、このことから
も多量の採血を必要とするｍＲＮＡを遺伝子解析の材料
とすることは望ましくない。さらに、限られた情報しか
有しないｍＲＮＡの解析では遺伝子の非アミノ酸コーデ
ィング領域の解析は困難である。
【０００４】これに対し、染色体ＤＮＡはｍＲＮＡより
も安定であるために比較的取り扱いが容易であり、染色
体ＤＮＡを解析材料とすれば、ｍＲＮＡの解析では困難
な解析、例えば調節領域、スプライシング部位等の解析
も可能である。さらに、染色体ＤＮＡ上のａｔｋ遺伝子
（以下染色体ａｔｋ遺伝子と称することがある。）の塩
基配列を決定すれば、その塩基配列を元に種々のプライ
マーを設計し、それらのプライマーを用いて被験者の染
色体ａｔｋ遺伝子をＰＣＲ法［Saiki,R.K., Science 23
9 487-491（1988）参照］により増幅して増幅産物を解
析することが可能となる。そして、このような染色体ａ
ｔｋ遺伝子の解析方法により、従来よりも少量の採血試
料を用いての遺伝子解析、繁雑なｍＲＮＡ抽出工程およ
びｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成工程の省略が可能とな
る。また、この解析方法はＸＬＡの保因者診断を含む遺
伝子診断および遺伝子治療にも利用可能であると考えら
れる。しかしながら、本発明者らの知る限り、染色体Ｄ
ＮＡ上のａｔｋ遺伝子の塩基配列に関する報告はない。
も安定であるために比較的取り扱いが容易であり、染色
体ＤＮＡを解析材料とすれば、ｍＲＮＡの解析では困難
な解析、例えば調節領域、スプライシング部位等の解析
も可能である。さらに、染色体ＤＮＡ上のａｔｋ遺伝子
（以下染色体ａｔｋ遺伝子と称することがある。）の塩
基配列を決定すれば、その塩基配列を元に種々のプライ
マーを設計し、それらのプライマーを用いて被験者の染
色体ａｔｋ遺伝子をＰＣＲ法［Saiki,R.K., Science 23
9 487-491（1988）参照］により増幅して増幅産物を解
析することが可能となる。そして、このような染色体ａ
ｔｋ遺伝子の解析方法により、従来よりも少量の採血試
料を用いての遺伝子解析、繁雑なｍＲＮＡ抽出工程およ
びｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成工程の省略が可能とな
る。また、この解析方法はＸＬＡの保因者診断を含む遺
伝子診断および遺伝子治療にも利用可能であると考えら
れる。しかしながら、本発明者らの知る限り、染色体Ｄ
ＮＡ上のａｔｋ遺伝子の塩基配列に関する報告はない。
【０００５】従って、本発明の目的は、染色体ＤＮＡ上
のａｔｋ遺伝子の塩基配列を決定すること、決定された
塩基配列を利用してプライマーとして使用し得るオリゴ
ヌクレオチドを設計すること、および設計されたオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて染色体ＤＮＡを鋳型に
したＰＣＲ法によりａｔｋ遺伝子を増幅して得られた増
幅産物を解析するａｔｋ遺伝子の塩基配列解析方法を提
供することにある。
のａｔｋ遺伝子の塩基配列を決定すること、決定された
塩基配列を利用してプライマーとして使用し得るオリゴ
ヌクレオチドを設計すること、および設計されたオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて染色体ＤＮＡを鋳型に
したＰＣＲ法によりａｔｋ遺伝子を増幅して得られた増
幅産物を解析するａｔｋ遺伝子の塩基配列解析方法を提
供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に鑑み鋭意研究を行ったところ、ａｔｋ遺伝子のｍＲＮ
Ａを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、このａｔｋ遺伝子の
ｃＤＮＡをプローブとして用いてヒトゲノミックライブ
ラリーをスクリーニングすることによりａｔｋ遺伝子を
含む染色体ＤＮＡを取得し、得られたクローンのサブク
ローンの中からａｔｋ遺伝子のｃＤＮＡ領域を包含する
サブクローンを選択し、そして該サブクローンから組換
えプラスミドを調製して塩基配列を決定することによ
り、染色体ＤＮＡ上のａｔｋ遺伝子を同定し、かつ該遺
伝子のエクソンおよびエクソン周辺領域の塩基配列を決
定し得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。
に鑑み鋭意研究を行ったところ、ａｔｋ遺伝子のｍＲＮ
Ａを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、このａｔｋ遺伝子の
ｃＤＮＡをプローブとして用いてヒトゲノミックライブ
ラリーをスクリーニングすることによりａｔｋ遺伝子を
含む染色体ＤＮＡを取得し、得られたクローンのサブク
ローンの中からａｔｋ遺伝子のｃＤＮＡ領域を包含する
サブクローンを選択し、そして該サブクローンから組換
えプラスミドを調製して塩基配列を決定することによ
り、染色体ＤＮＡ上のａｔｋ遺伝子を同定し、かつ該遺
伝子のエクソンおよびエクソン周辺領域の塩基配列を決
定し得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】かくして、本発明によれば、 １） 後記配列表中に配列番号１〜１１として示す塩基
配列のいずれか１つの配列からなる、伴性無ガンマグロ
ブリン血症に関与する遺伝子（無ガンマグロブリン血症
チロシンキナーゼ遺伝子）を含むＤＮＡ断片、 ２） 後記配列表中に配列番号１〜１１として示す塩基
配列のいずれか１つの配列からなるＤＮＡ断片に対する
相補性を有するオリゴヌクレオチド、 ３） 後記配列表中に配列番号１２〜３３として示す塩
基配列のいずれか１つの配列により示され、後記配列表
中に配列番号１〜１１として示す塩基配列のいずれか１
つの配列からなるＤＮＡ断片に対する相補性を有するオ
リゴヌクレオチド、および ４） 後記配列表中に配列番号１〜１１として示す塩基
配列のいずれか１つの配列からなるＤＮＡ断片に対する
相補性を有するオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチド
を用いた、伴性無ガンマグロブリン血症に関与する遺伝
子（無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ遺伝子）
を含むＤＮＡ断片の塩基配列解析方法であって、前記オ
リゴヌクレオチドから２種類のオリゴヌクレオチドを選
択し、該２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用いるＰＣＲ法により無ガンマグロブリン血症チロシ
ンキナーゼ遺伝子のエクソンおよびエクソン近傍の塩基
配列を増幅させ、その際、前記２種類のオリゴヌクレオ
チドの塩基配列は、配列表中の配列番号１２と１３、配
列番号１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８
と１９、配列番号２０と２１、配列番号２２と２３、配
列番号２４と２５、配列番号２６と２７、配列番号２８
と２９、配列番号３０と３１、および配列番号３２と３
３の組み合わせのいずれか１組により示されることを特
徴とする、塩基配列解析方法、が提供される。以下に、
本発明をさらに詳細に説明する。
配列のいずれか１つの配列からなる、伴性無ガンマグロ
ブリン血症に関与する遺伝子（無ガンマグロブリン血症
チロシンキナーゼ遺伝子）を含むＤＮＡ断片、 ２） 後記配列表中に配列番号１〜１１として示す塩基
配列のいずれか１つの配列からなるＤＮＡ断片に対する
相補性を有するオリゴヌクレオチド、 ３） 後記配列表中に配列番号１２〜３３として示す塩
基配列のいずれか１つの配列により示され、後記配列表
中に配列番号１〜１１として示す塩基配列のいずれか１
つの配列からなるＤＮＡ断片に対する相補性を有するオ
リゴヌクレオチド、および ４） 後記配列表中に配列番号１〜１１として示す塩基
配列のいずれか１つの配列からなるＤＮＡ断片に対する
相補性を有するオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチド
を用いた、伴性無ガンマグロブリン血症に関与する遺伝
子（無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ遺伝子）
を含むＤＮＡ断片の塩基配列解析方法であって、前記オ
リゴヌクレオチドから２種類のオリゴヌクレオチドを選
択し、該２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用いるＰＣＲ法により無ガンマグロブリン血症チロシ
ンキナーゼ遺伝子のエクソンおよびエクソン近傍の塩基
配列を増幅させ、その際、前記２種類のオリゴヌクレオ
チドの塩基配列は、配列表中の配列番号１２と１３、配
列番号１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８
と１９、配列番号２０と２１、配列番号２２と２３、配
列番号２４と２５、配列番号２６と２７、配列番号２８
と２９、配列番号３０と３１、および配列番号３２と３
３の組み合わせのいずれか１組により示されることを特
徴とする、塩基配列解析方法、が提供される。以下に、
本発明をさらに詳細に説明する。
【０００８】本発明の、染色体ａｔｋ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片は、次の手法により調製することができる。ま
ず、ａｔｋ遺伝子をスクリーニングするためのプローブ
を調製する。ヒト末梢血よりリンパ球を分画した後、こ
のリンパ球画分よりｍＲＮＡを常法に従って調製する。
次に、ベトリエらが報告したオリゴヌクレオチドプライ
マー： 5'ATTGGCGAGCTCAGGATTCTTC3' ［Vetrie,D et a
l., Nature 361 226,1993］を化学合成する。このプラ
イマーを用い、上記ｍＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素に
よりｃＤＮＡを合成する。この合成ｃＤＮＡを鋳型に
し、ベトリエらが報告したプライマー： 5'GCAGGCCTGGG
ATACGGATC3' および 5'GGAAATTTGGAGCCTACTGAG3'を用い
たＰＣＲ法［Saiki,R.K., Science 239 487-491（198
8）参照］によりスクリーニングプローブであるａｔｋ
遺伝子のｃＤＮＡを増幅調製する。
Ａ断片は、次の手法により調製することができる。ま
ず、ａｔｋ遺伝子をスクリーニングするためのプローブ
を調製する。ヒト末梢血よりリンパ球を分画した後、こ
のリンパ球画分よりｍＲＮＡを常法に従って調製する。
次に、ベトリエらが報告したオリゴヌクレオチドプライ
マー： 5'ATTGGCGAGCTCAGGATTCTTC3' ［Vetrie,D et a
l., Nature 361 226,1993］を化学合成する。このプラ
イマーを用い、上記ｍＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素に
よりｃＤＮＡを合成する。この合成ｃＤＮＡを鋳型に
し、ベトリエらが報告したプライマー： 5'GCAGGCCTGGG
ATACGGATC3' および 5'GGAAATTTGGAGCCTACTGAG3'を用い
たＰＣＲ法［Saiki,R.K., Science 239 487-491（198
8）参照］によりスクリーニングプローブであるａｔｋ
遺伝子のｃＤＮＡを増幅調製する。
【０００９】増幅されたａｔｋ遺伝子ｃＤＮＡをスクリ
ーニングプローブとして用い、ヒトゲノミックライブラ
リーをコロニーハイブリダイゼーション法でスクリーニ
ングすることにより、ａｔｋ遺伝子染色体ＤＮＡを包含
するクローンを得ることができる。得られたクローンを
サブクローンした後、上記プローブを用いたコロニーハ
イブリダイゼーション法によるスクリーニングの反復及
び／又は染色体歩行等を行うことにより、ａｔｋ遺伝子
のｃＤＮＡ領域を包含するサブクローンを選択すること
ができる。次に、これらのサブクローンより組換えプラ
スミドを調製する。この組換えプラスミドの調製は、常
法、例えばアルカリ法［T.Maniatis et al., Molecular
Cloning, 1.38,(1989), Cold Spring Harbor Laborato
ry 参照］に従い行うことができる。そして、組換えプ
ラスミドの保持する挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は、例え
ばダイジデオキシ法［L.Smith et al., Nature 1986, 3
21:674-679 参照］等の慣用の手法により決定すること
ができる。以上の手順により、ａｔｋ遺伝子を同定する
と共にそのエクソン及びエクソン周辺領域の塩基配列を
決定することができる。かくして得られた、ａｔｋ遺伝
子を包含する染色体ＤＮＡ領域の塩基配列を後記配列表
中に配列番号１〜１１として示す。
ーニングプローブとして用い、ヒトゲノミックライブラ
リーをコロニーハイブリダイゼーション法でスクリーニ
ングすることにより、ａｔｋ遺伝子染色体ＤＮＡを包含
するクローンを得ることができる。得られたクローンを
サブクローンした後、上記プローブを用いたコロニーハ
イブリダイゼーション法によるスクリーニングの反復及
び／又は染色体歩行等を行うことにより、ａｔｋ遺伝子
のｃＤＮＡ領域を包含するサブクローンを選択すること
ができる。次に、これらのサブクローンより組換えプラ
スミドを調製する。この組換えプラスミドの調製は、常
法、例えばアルカリ法［T.Maniatis et al., Molecular
Cloning, 1.38,(1989), Cold Spring Harbor Laborato
ry 参照］に従い行うことができる。そして、組換えプ
ラスミドの保持する挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は、例え
ばダイジデオキシ法［L.Smith et al., Nature 1986, 3
21:674-679 参照］等の慣用の手法により決定すること
ができる。以上の手順により、ａｔｋ遺伝子を同定する
と共にそのエクソン及びエクソン周辺領域の塩基配列を
決定することができる。かくして得られた、ａｔｋ遺伝
子を包含する染色体ＤＮＡ領域の塩基配列を後記配列表
中に配列番号１〜１１として示す。
【００１０】後記配列表中に配列番号１〜１１として示
す塩基配列を包含する本発明のヒトａｔｋ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片は、ヒトゲノミックライブラリーから分離さ
れたヒトａｔｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片のみならず、通
常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばパーキンズエルマ
ージャパンアプライドバイオシステムズディビジョン製
モデル３９４ＤＮＡ合成装置を用いて合成されたもので
あってもよい。さらに、本発明のＤＮＡ断片は、その機
能を実質的に損なわない限り、配列の一部の塩基が他の
塩基で置換されていてもよく、または新たに塩基が挿入
されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位、削
除あるいは修飾されていてもよく、これらの誘導体は何
れも本発明の染色体ａｔｋ遺伝子のＤＮＡ断片に包含さ
れる。
す塩基配列を包含する本発明のヒトａｔｋ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片は、ヒトゲノミックライブラリーから分離さ
れたヒトａｔｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片のみならず、通
常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばパーキンズエルマ
ージャパンアプライドバイオシステムズディビジョン製
モデル３９４ＤＮＡ合成装置を用いて合成されたもので
あってもよい。さらに、本発明のＤＮＡ断片は、その機
能を実質的に損なわない限り、配列の一部の塩基が他の
塩基で置換されていてもよく、または新たに塩基が挿入
されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位、削
除あるいは修飾されていてもよく、これらの誘導体は何
れも本発明の染色体ａｔｋ遺伝子のＤＮＡ断片に包含さ
れる。
【００１１】本発明のＤＮＡ断片を増幅するためのＰＣ
Ｒ法において使用可能なオリゴヌクレオチドプライマー
の設計は、後記配列表中に配列番号１〜１１として示
す、染色体ａｔｋ遺伝子を含む塩基配列を参考にして、
ａｔｋ遺伝子の種々の解析目的に応じて行うことができ
る。例えば、エクソン−イントロンジャンクション領
域、アミノ酸コーディング領域、あるいは発現調節領域
等の解析が可能となるような位置にプライマーを設計お
よび設定すれば良い。プライマーの設定に際しては、Ｄ
ＮＡＳＩＳ Ｍａｃ（日立製作所製）等の商業的データ
ーベースあるいは非商業的データベースを利用するコン
ピュター検索により効率化を図ることができる
Ｒ法において使用可能なオリゴヌクレオチドプライマー
の設計は、後記配列表中に配列番号１〜１１として示
す、染色体ａｔｋ遺伝子を含む塩基配列を参考にして、
ａｔｋ遺伝子の種々の解析目的に応じて行うことができ
る。例えば、エクソン−イントロンジャンクション領
域、アミノ酸コーディング領域、あるいは発現調節領域
等の解析が可能となるような位置にプライマーを設計お
よび設定すれば良い。プライマーの設定に際しては、Ｄ
ＮＡＳＩＳ Ｍａｃ（日立製作所製）等の商業的データ
ーベースあるいは非商業的データベースを利用するコン
ピュター検索により効率化を図ることができる
【００１２】ａｔｋ遺伝子を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマーは、後記配列表中に配列番号１〜１
１として示すＤＮＡ塩基配列の一部に対する相補性を有
するものであれば如何なるものであってもよい。染色体
ａｔｋ遺伝子を解析するために用いるオリゴヌクレオチ
ドプライマーの具体例としては、下記の組合せ（プライ
マーセット）を挙げることができる。 １）配列番号１の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-TTCTCCATTTTCTTCCTCAT 配列番号１２ 5'-CAAATCTGCTGTTCCCCATC 配列番号１３ ２）配列番号２の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-TCAGAAAAGAGCAATGCATC 配列番号１４ 5'-GCCTTTCGAGATTTGGTGAG 配列番号１５ ３）配列番号３の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-CTGAATCCTAACTGCTGAAG 配列番号１６ 5'-TTCCTTCTTTCTTTGGAAACAT 配列番号１７ ４）配列番号４の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-ATATCATCACTGGCTTCTTG 配列番号１８ 5'-TTCCATTTAAGCAGTGGCAG 配列番号１９ ５）配列番号５の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-GAGTGCTTGGTATCTTGACA 配列番号２０ 5'-CTTTTTGCGTGTAGGGAGTG 配列番号２１
レオチドプライマーは、後記配列表中に配列番号１〜１
１として示すＤＮＡ塩基配列の一部に対する相補性を有
するものであれば如何なるものであってもよい。染色体
ａｔｋ遺伝子を解析するために用いるオリゴヌクレオチ
ドプライマーの具体例としては、下記の組合せ（プライ
マーセット）を挙げることができる。 １）配列番号１の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-TTCTCCATTTTCTTCCTCAT 配列番号１２ 5'-CAAATCTGCTGTTCCCCATC 配列番号１３ ２）配列番号２の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-TCAGAAAAGAGCAATGCATC 配列番号１４ 5'-GCCTTTCGAGATTTGGTGAG 配列番号１５ ３）配列番号３の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-CTGAATCCTAACTGCTGAAG 配列番号１６ 5'-TTCCTTCTTTCTTTGGAAACAT 配列番号１７ ４）配列番号４の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-ATATCATCACTGGCTTCTTG 配列番号１８ 5'-TTCCATTTAAGCAGTGGCAG 配列番号１９ ５）配列番号５の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-GAGTGCTTGGTATCTTGACA 配列番号２０ 5'-CTTTTTGCGTGTAGGGAGTG 配列番号２１
【００１３】６）配列番号６の塩基配列を解析するため
のオリゴヌクレオチドプライマー 5'-GCATATGAATCTGTCTCCTG 配列番号２２ 5'-TTCCTCCTGGAAGATTGTGG 配列番号２３ ７）配列番号７の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-TAACCTCCAATCTGCTTATG 配列番号２４ 5'-CTTATTCAAGGAGAATGCT 配列番号２５ ８）配列番号８の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-TCCTCCTACAGACAGCTTCT 配列番号２６ 5'-CTCAGGGCCTTGGAATAGTA 配列番号２７ ９）配列番号９の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-ATTCCACCTCCTACACCACA 配列番号２８ 5'-ACCCCAGAGAAATAAGGAGT 配列番号２９ １０）配列番号１０の塩基配列を解析するためのオリゴ
ヌクレオチドプライマー 5'-TCATGACCCCAAAGAATCAC 配列番号３０ 5'-CCAGCAAATAGATTGAGAGT 配列番号３１ １１）配列番号１１の塩基配列を解析するためのオリゴ
ヌクレオチドプライマー 5'-ATGCAACAAGTCCTGAATCC 配列番号３２ 5'-AGAGCTGTATAATCTGTGTA 配列番号３３ 上記オリゴヌクレオチドプライマーは、それ自体既知の
通常用いられている核酸合成装置、例えばアプライド・
バイオシステム（Applied Biosystems）製モデル３９４
ＤＮＡ合成機を用いて固相合成により容易に調製するこ
とができる。
のオリゴヌクレオチドプライマー 5'-GCATATGAATCTGTCTCCTG 配列番号２２ 5'-TTCCTCCTGGAAGATTGTGG 配列番号２３ ７）配列番号７の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-TAACCTCCAATCTGCTTATG 配列番号２４ 5'-CTTATTCAAGGAGAATGCT 配列番号２５ ８）配列番号８の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-TCCTCCTACAGACAGCTTCT 配列番号２６ 5'-CTCAGGGCCTTGGAATAGTA 配列番号２７ ９）配列番号９の塩基配列を解析するためのオリゴヌク
レオチドプライマー 5'-ATTCCACCTCCTACACCACA 配列番号２８ 5'-ACCCCAGAGAAATAAGGAGT 配列番号２９ １０）配列番号１０の塩基配列を解析するためのオリゴ
ヌクレオチドプライマー 5'-TCATGACCCCAAAGAATCAC 配列番号３０ 5'-CCAGCAAATAGATTGAGAGT 配列番号３１ １１）配列番号１１の塩基配列を解析するためのオリゴ
ヌクレオチドプライマー 5'-ATGCAACAAGTCCTGAATCC 配列番号３２ 5'-AGAGCTGTATAATCTGTGTA 配列番号３３ 上記オリゴヌクレオチドプライマーは、それ自体既知の
通常用いられている核酸合成装置、例えばアプライド・
バイオシステム（Applied Biosystems）製モデル３９４
ＤＮＡ合成機を用いて固相合成により容易に調製するこ
とができる。
【００１４】本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを
用いるＰＣＲ法は、サイキの方法［Saiki,R.K., Scienc
e 239 487-491（1988）参照］に準じて容易に行うこと
ができる。ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片の解析
方法には特に制限はないが、制限酵素を利用する方法、
ＳＳＣＰ法（シングルストランドコンホメィションポリ
モルフィズム）[Orita,M. et al.：Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, vol.86 2766-2770,1989 参照］、ＲＮＡアー
ゼプロテクションアッセイキット（Ribonuclease Prote
ction Assay Kit）を用いたＲＮＡアーゼプロテクショ
ン法（RibonucleaseProtection Assay)［Richard M. My
ers et al.: Science vol.230 1242-1246, 1985 参
照］、ＰＣＲーＳＳＯ法（ピーシーアールシークエンス
スペシフィックオリゴヌクレオチド)［Saiki,R.K. et a
l.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol86,6230-6234, 1
989 参照]、およびその他通常用いられる塩基配列決定
法等を好適に用いることができる。
用いるＰＣＲ法は、サイキの方法［Saiki,R.K., Scienc
e 239 487-491（1988）参照］に準じて容易に行うこと
ができる。ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片の解析
方法には特に制限はないが、制限酵素を利用する方法、
ＳＳＣＰ法（シングルストランドコンホメィションポリ
モルフィズム）[Orita,M. et al.：Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, vol.86 2766-2770,1989 参照］、ＲＮＡアー
ゼプロテクションアッセイキット（Ribonuclease Prote
ction Assay Kit）を用いたＲＮＡアーゼプロテクショ
ン法（RibonucleaseProtection Assay)［Richard M. My
ers et al.: Science vol.230 1242-1246, 1985 参
照］、ＰＣＲーＳＳＯ法（ピーシーアールシークエンス
スペシフィックオリゴヌクレオチド)［Saiki,R.K. et a
l.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol86,6230-6234, 1
989 参照]、およびその他通常用いられる塩基配列決定
法等を好適に用いることができる。
【００１５】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識
を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって
本発明の範囲は何ら限定されるものではない。実施例１：染色体ａｔｋ遺伝子スクリーニングプローブ
の調製 １−１．ｍＲＮＡの調製 健常者の末梢血３０ｍｌを採取し、これに等量の６Ｍ
ＧＴＣ（グアニジンイソチオシアネート）溶液を添加し
てよく混和し、さらに注射針を用いてホモジナイズし
た。次いで、ホモジナイズ溶液１ｍｌに対し０.５ｇの
割合でセシウムクロライド（ＣｓＣｌ）を添加して完全
に溶解させた。５.７Ｍ ＣｓＣｌおよび０.１Ｍ エチレ
ンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を含む溶液０.
４ｍｌを２.２ｍｌ容のポリアロマーチューブに入れ、
その上に前記ＣｓＣｌ含有ホモジナイズ溶液を重層し
て、５５００ｒｐｍ、２０℃、３時間の条件で超遠心分
離［ＴＬＳ５５ローターおよびＴＬ１００（BECMAN製）
使用］を行った。遠心分離後は常法［T.Maniatis et a
l., Molecular Cloning, 1.25, (1989),Cold Spring Ha
rbor Laboratory 参照］に従って操作を行い、０.１ｍ
ｇのＲＮＡを得た。得られたＲＮＡをオリゴｄＴラテッ
クス（宝酒造製）を用いたアフィニティクロマトグラフ
により精製し、１２μｇのｍＲＮＡを得た。
説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識
を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって
本発明の範囲は何ら限定されるものではない。実施例１：染色体ａｔｋ遺伝子スクリーニングプローブ
の調製 １−１．ｍＲＮＡの調製 健常者の末梢血３０ｍｌを採取し、これに等量の６Ｍ
ＧＴＣ（グアニジンイソチオシアネート）溶液を添加し
てよく混和し、さらに注射針を用いてホモジナイズし
た。次いで、ホモジナイズ溶液１ｍｌに対し０.５ｇの
割合でセシウムクロライド（ＣｓＣｌ）を添加して完全
に溶解させた。５.７Ｍ ＣｓＣｌおよび０.１Ｍ エチレ
ンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を含む溶液０.
４ｍｌを２.２ｍｌ容のポリアロマーチューブに入れ、
その上に前記ＣｓＣｌ含有ホモジナイズ溶液を重層し
て、５５００ｒｐｍ、２０℃、３時間の条件で超遠心分
離［ＴＬＳ５５ローターおよびＴＬ１００（BECMAN製）
使用］を行った。遠心分離後は常法［T.Maniatis et a
l., Molecular Cloning, 1.25, (1989),Cold Spring Ha
rbor Laboratory 参照］に従って操作を行い、０.１ｍ
ｇのＲＮＡを得た。得られたＲＮＡをオリゴｄＴラテッ
クス（宝酒造製）を用いたアフィニティクロマトグラフ
により精製し、１２μｇのｍＲＮＡを得た。
【００１６】１−２．ａｔｋ遺伝子ｃＤＮＡの調製 まず、ベトリエらが報告したプライマー：5'-ATTGGCGAG
CTCAGGATTCTTC［Vetrie,D. et al., Nature 361 226,19
93］を自動ＤＮＡ合成機［モデル394, アプライドバイ
オシステムズ（Applied Biosystems）製］を用いて化学
合成した。次に、実施例１−１．で調製したｍＲＮＡ
１.５μgを鋳型として、前記合成プライマーをプライマ
ーとしてそれぞれ用い、ｃＤＮＡ合成キット［ベーリン
ガーマンハイムバイオケミカ（Boehringer Mannheim Bi
ochemica）製］により製造者のマニュアルに従いｃＤＮ
Ａを合成した。得られた合成液５μｌを鋳型として全量
１００μｌの系にてＰＣＲを行った。その際に用いた反
応液の組成を下記に示す。 １×緩衝液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.
３），１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2，５０ｍＭ ＫＣｌ，０．０１％ ゼラチン） ０.２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ） ２５ｐｍｏｌの各プライマー ３単位（０.６μｌ）Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ［ベ
ーリンガーマンハイムバイオケミカ製］
CTCAGGATTCTTC［Vetrie,D. et al., Nature 361 226,19
93］を自動ＤＮＡ合成機［モデル394, アプライドバイ
オシステムズ（Applied Biosystems）製］を用いて化学
合成した。次に、実施例１−１．で調製したｍＲＮＡ
１.５μgを鋳型として、前記合成プライマーをプライマ
ーとしてそれぞれ用い、ｃＤＮＡ合成キット［ベーリン
ガーマンハイムバイオケミカ（Boehringer Mannheim Bi
ochemica）製］により製造者のマニュアルに従いｃＤＮ
Ａを合成した。得られた合成液５μｌを鋳型として全量
１００μｌの系にてＰＣＲを行った。その際に用いた反
応液の組成を下記に示す。 １×緩衝液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.
３），１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2，５０ｍＭ ＫＣｌ，０．０１％ ゼラチン） ０.２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ） ２５ｐｍｏｌの各プライマー ３単位（０.６μｌ）Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ［ベ
ーリンガーマンハイムバイオケミカ製］
【００１７】尚、上記ＰＣＲに用いたプライマーは、ベ
トリエら[Vetrie,D et al., Nature361 226,1993］が報
告した下記のプライマー： 5'GCAGGCCTGGGATACGGATC および 5'GGAAATTTGGAGCCTACT
GAG であった。ＰＣＲによる増幅反応は、変性（９４℃、３
０秒間）、アニーリング（５５℃、３０秒間）、伸長
（７２℃、６０秒間）の順序で行い、これを３５サイク
ル繰り返した。
トリエら[Vetrie,D et al., Nature361 226,1993］が報
告した下記のプライマー： 5'GCAGGCCTGGGATACGGATC および 5'GGAAATTTGGAGCCTACT
GAG であった。ＰＣＲによる増幅反応は、変性（９４℃、３
０秒間）、アニーリング（５５℃、３０秒間）、伸長
（７２℃、６０秒間）の順序で行い、これを３５サイク
ル繰り返した。
【００１８】遺伝子増幅反応終了後、反応終了液を３％
アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的ｃＤＮＡ
である大きさ約５１８ｂｐのＰＣＲ産物が検出された。
このＰＣＲ産物を常法により泳動ゲルから抽出した後、
抽出液を常法に従い等量のフェノール／クロロホルム
（１：１、v/v）混和液で処理して抽出精製した。次い
で、１／１０倍量の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６.０）
と２.５倍量のエタノールを添加して沈殿を形成させ、
これを−８０℃で０.５時間静置した後に１５０００ｒ
ｐｍ、４℃、１５分間の条件で遠心分離に供してその沈
殿を回収し、目的ｃＤＮＡ１μｇを得た。次に、得られ
たｃＤＮＡ５００ｎｇを反応液５０μｌに添加して３７
℃で１時間反応させた。使用した反応液の組成を下記に
示す。 １×緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９.
３），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，５ｍＭ ジチオスレイトール，２ｍＭ ＡＴ
Ｐ） ２０単位 Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ［ベーリンガ
ーマンハイムバイオケミカ製］
アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的ｃＤＮＡ
である大きさ約５１８ｂｐのＰＣＲ産物が検出された。
このＰＣＲ産物を常法により泳動ゲルから抽出した後、
抽出液を常法に従い等量のフェノール／クロロホルム
（１：１、v/v）混和液で処理して抽出精製した。次い
で、１／１０倍量の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６.０）
と２.５倍量のエタノールを添加して沈殿を形成させ、
これを−８０℃で０.５時間静置した後に１５０００ｒ
ｐｍ、４℃、１５分間の条件で遠心分離に供してその沈
殿を回収し、目的ｃＤＮＡ１μｇを得た。次に、得られ
たｃＤＮＡ５００ｎｇを反応液５０μｌに添加して３７
℃で１時間反応させた。使用した反応液の組成を下記に
示す。 １×緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９.
３），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，５ｍＭ ジチオスレイトール，２ｍＭ ＡＴ
Ｐ） ２０単位 Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ［ベーリンガ
ーマンハイムバイオケミカ製］
【００１９】反応終了後、常法に従いこの反応液を等量
のフェノール／クロロホルム（１：１、v/v）混和液で
処理して抽出精製した後、１／１０倍量の３Ｍ 酢酸ナ
トリウム（ｐＨ６.０）と２.５倍量のエタノールを添加
して沈殿を形成させた。これを−８０℃で０.５時間静
置した後に１５０００ｒｐｍ、４℃、１５分間の条件で
遠心分離に供してその沈殿を回収し、目的ｃＤＮＡ４０
０ｎｇを得た。得られたｃＤＮＡ３００ｎｇを、制限酵
素ＳｍａＩにより消化した BluescriptSK+ ベクター
（東洋紡製）１００ｎｇと混合した後、ＤＮＡライゲー
ションキット（宝酒造製）を用いて製造者のマニュアル
に従い両者のＤＮＡ断片を連結させ、この溶液を用い
て、エシエリヒア・コリ ＨＢ１０１ コンピテント細胞
（E.coli HB101 Competent Cell：宝酒造製）を製造者
のマニュアルに従い形質転換した。
のフェノール／クロロホルム（１：１、v/v）混和液で
処理して抽出精製した後、１／１０倍量の３Ｍ 酢酸ナ
トリウム（ｐＨ６.０）と２.５倍量のエタノールを添加
して沈殿を形成させた。これを−８０℃で０.５時間静
置した後に１５０００ｒｐｍ、４℃、１５分間の条件で
遠心分離に供してその沈殿を回収し、目的ｃＤＮＡ４０
０ｎｇを得た。得られたｃＤＮＡ３００ｎｇを、制限酵
素ＳｍａＩにより消化した BluescriptSK+ ベクター
（東洋紡製）１００ｎｇと混合した後、ＤＮＡライゲー
ションキット（宝酒造製）を用いて製造者のマニュアル
に従い両者のＤＮＡ断片を連結させ、この溶液を用い
て、エシエリヒア・コリ ＨＢ１０１ コンピテント細胞
（E.coli HB101 Competent Cell：宝酒造製）を製造者
のマニュアルに従い形質転換した。
【００２０】得られた形質転換体を、５０ μg/ml（最
終濃度）のアンピシリンを含むＬＢ培地プレート［組
成：バクトトリプトン（DIFCO製） １０ｇ、バクトイー
ストエクストラクト（DIFCO製）５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ
を純水に溶解して１Ｌとした］で３７℃にて１８時間培
養し、プレート上に生じたコロニーを同組成の液体培地
１.５ｍｌに植菌し、３７℃にて一晩培養した。次い
で、この培養液から遠心分離［遠心条件：１５０００ｒ
ｐｍ、２５℃、２分間］により形質転換株を収穫し、該
株の保持するプラスミドを常法［T.Maniatis et al., M
olecular Cloning,1.25, (1989), Cold Spring Harbor
Laboratory 参照］に従い抽出した。
終濃度）のアンピシリンを含むＬＢ培地プレート［組
成：バクトトリプトン（DIFCO製） １０ｇ、バクトイー
ストエクストラクト（DIFCO製）５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ
を純水に溶解して１Ｌとした］で３７℃にて１８時間培
養し、プレート上に生じたコロニーを同組成の液体培地
１.５ｍｌに植菌し、３７℃にて一晩培養した。次い
で、この培養液から遠心分離［遠心条件：１５０００ｒ
ｐｍ、２５℃、２分間］により形質転換株を収穫し、該
株の保持するプラスミドを常法［T.Maniatis et al., M
olecular Cloning,1.25, (1989), Cold Spring Harbor
Laboratory 参照］に従い抽出した。
【００２１】得られたプラスミドＤＮＡ２００ｎｇを各
々１単位の制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩ［ベーリンガ
ーマンハイムバイオケミカ製］と共に３７℃で２時間イ
ンキュベートして二重消化し、次いでアガロースゲル電
気泳動に供したところ、大きさ約５１８ｂｐの目的ｃＤ
ＮＡ断片が前記 BluescriptSK+ ベクター中に挿入され
ていることが確認された。次に、この組換えプラスミド
に挿入されていたｃＤＮＡ断片の塩基配列を、パーキン
ズエルマージャパンアプライドバイオシステムズディビ
ジョン（PerkinsElmer Japan Applied Biosystems Divi
sion）製タックダイデオキシターミネーターサイクルシ
ークエンスキット（Taq Dye Deoxy Terminator Cycle S
equencekit)を用いたダイジデオキシ法［L.Smith et a
l., Nature, 1986, 321:674-679参照］により決定し
た。得られた塩基配列は、ベトリエらの報告とよく一致
していた［Vetrie,D et al., Nature, 361, 226, 1993
参照］。この大きさ約５１８ｂｐの挿入ＤＮＡ断片を、
染色体ａｔｋ遺伝子スクリーニングプローブとして、以
後の研究に供した。
々１単位の制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩ［ベーリンガ
ーマンハイムバイオケミカ製］と共に３７℃で２時間イ
ンキュベートして二重消化し、次いでアガロースゲル電
気泳動に供したところ、大きさ約５１８ｂｐの目的ｃＤ
ＮＡ断片が前記 BluescriptSK+ ベクター中に挿入され
ていることが確認された。次に、この組換えプラスミド
に挿入されていたｃＤＮＡ断片の塩基配列を、パーキン
ズエルマージャパンアプライドバイオシステムズディビ
ジョン（PerkinsElmer Japan Applied Biosystems Divi
sion）製タックダイデオキシターミネーターサイクルシ
ークエンスキット（Taq Dye Deoxy Terminator Cycle S
equencekit)を用いたダイジデオキシ法［L.Smith et a
l., Nature, 1986, 321:674-679参照］により決定し
た。得られた塩基配列は、ベトリエらの報告とよく一致
していた［Vetrie,D et al., Nature, 361, 226, 1993
参照］。この大きさ約５１８ｂｐの挿入ＤＮＡ断片を、
染色体ａｔｋ遺伝子スクリーニングプローブとして、以
後の研究に供した。
【００２２】実施例２：染色体ａｔｋ遺伝子のクローニ
ング 上記実施例１で調製したａｔｋ遺伝子スクリーニングプ
ローブを用いてヒトゲノムミックライブラリーより染色
体ａｔｋ遺伝子のクローニングを行った。健常者の末梢
血を採血し、これに３倍量のＡ液［組成：１５５ｍＭ
ＮＨ4Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ3，１００ｍＭ ＥＤＴＡ
・２Ｎａ，(ｐＨ７.４)］を混和させて氷水中に１５分
間放置した後、１０００ｒｐｍ、４℃で１０分間の遠心
分離に供した。得られた上清を除き、Ｂ液［組成：１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ，８ｍＭ 尿素，１％ ＳＤＳ，(ｐＨ７.０)］を加え
て３０分間緩やかに転倒混和した。この混和液を常法に
従いフェノールおよびフェノール／クロロホルム（１：
１、v/v）処理して抽出精製した後、２.５倍量の冷エタ
ノールを加えて染色体ＤＮＡを析出させ、析出したＤＮ
Ａをガラス棒で巻き取り回収した。得られたＤＮＡをＴ
Ｅ溶液［組成：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ・２Ｎａ，(ｐＨ８.０)］に溶解させて、以後の研
究に用いる染色体ＤＮＡ試料とした。
ング 上記実施例１で調製したａｔｋ遺伝子スクリーニングプ
ローブを用いてヒトゲノムミックライブラリーより染色
体ａｔｋ遺伝子のクローニングを行った。健常者の末梢
血を採血し、これに３倍量のＡ液［組成：１５５ｍＭ
ＮＨ4Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ3，１００ｍＭ ＥＤＴＡ
・２Ｎａ，(ｐＨ７.４)］を混和させて氷水中に１５分
間放置した後、１０００ｒｐｍ、４℃で１０分間の遠心
分離に供した。得られた上清を除き、Ｂ液［組成：１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ，８ｍＭ 尿素，１％ ＳＤＳ，(ｐＨ７.０)］を加え
て３０分間緩やかに転倒混和した。この混和液を常法に
従いフェノールおよびフェノール／クロロホルム（１：
１、v/v）処理して抽出精製した後、２.５倍量の冷エタ
ノールを加えて染色体ＤＮＡを析出させ、析出したＤＮ
Ａをガラス棒で巻き取り回収した。得られたＤＮＡをＴ
Ｅ溶液［組成：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ・２Ｎａ，(ｐＨ８.０)］に溶解させて、以後の研
究に用いる染色体ＤＮＡ試料とした。
【００２３】得られた染色体ＤＮＡ１００μｇを、１単
位の制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ［ベーリンガーマンハイムバ
イオケミカ製］と共に、緩衝液［組成：１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，７ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2，(ｐＨ７.５）］中、３７℃で１０分間インキュベ
ートして部分消化した。この緩衝液から、常法［T.Mani
atis., Molecular Cloning, 9.24 (1989), Cold Spring
Harbor Laboratory参照］に従いショ糖密度勾配超遠心
を用いて大きさ約４５Ｋｂの消化ＤＮＡ断片を分画し、
エタノール沈殿により目的ＤＮＡ断片約１０μｇを回収
した。得られたＤＮＡ断片１μｇを、ｐＷＥ１５コスミ
ドベクター［ストラテジーン（STRATAGENE）製］の制限
酵素ＢａｍＨＩ消化断片１μｇ、および３単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造製）と共に１６℃で１８時間イン
キュベートして、該ＤＮＡ断片をｐＷＥ１５コスミドベ
クターの制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位に連結させた。
位の制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ［ベーリンガーマンハイムバ
イオケミカ製］と共に、緩衝液［組成：１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，７ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2，(ｐＨ７.５）］中、３７℃で１０分間インキュベ
ートして部分消化した。この緩衝液から、常法［T.Mani
atis., Molecular Cloning, 9.24 (1989), Cold Spring
Harbor Laboratory参照］に従いショ糖密度勾配超遠心
を用いて大きさ約４５Ｋｂの消化ＤＮＡ断片を分画し、
エタノール沈殿により目的ＤＮＡ断片約１０μｇを回収
した。得られたＤＮＡ断片１μｇを、ｐＷＥ１５コスミ
ドベクター［ストラテジーン（STRATAGENE）製］の制限
酵素ＢａｍＨＩ消化断片１μｇ、および３単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造製）と共に１６℃で１８時間イン
キュベートして、該ＤＮＡ断片をｐＷＥ１５コスミドベ
クターの制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位に連結させた。
【００２４】上記連結反応終了後、液中のＤＮＡ連結物
を、ギガパックIIパッケージングエクストラクト（GIGA
PACK II PACKAGING EXTRACT)（ストラテジーン製）を用
いてパッケージングした。パッケージング溶液の１／１
００倍量を、ＬＢ培地［組成：１０ g/l バクトトリプ
トン，１０ g/l ＮａＣｌ，５ g/l バクトイーストエキ
ストラクト］中、３０℃で一晩培養した大腸菌ＳＵＲＥ
株（ストラテジーン製）に感染させ、感染株を５０ μg
/ml の濃度でアンピシリンを含有する前記ＬＢ培地の寒
天培地上に塗抹し、３７℃で一晩培養した後、形質転換
株の生育コロニー数を測定した。
を、ギガパックIIパッケージングエクストラクト（GIGA
PACK II PACKAGING EXTRACT)（ストラテジーン製）を用
いてパッケージングした。パッケージング溶液の１／１
００倍量を、ＬＢ培地［組成：１０ g/l バクトトリプ
トン，１０ g/l ＮａＣｌ，５ g/l バクトイーストエキ
ストラクト］中、３０℃で一晩培養した大腸菌ＳＵＲＥ
株（ストラテジーン製）に感染させ、感染株を５０ μg
/ml の濃度でアンピシリンを含有する前記ＬＢ培地の寒
天培地上に塗抹し、３７℃で一晩培養した後、形質転換
株の生育コロニー数を測定した。
【００２５】この結果から、４×１０5個程度の形質転
換株が得られるようにパッケージング溶液の量を定め、
上記と同様にして、前記パッケージング溶液を用いてパ
ッケージングＤＮＡを大腸菌ＳＵＲＥ株に感染させた
後、これを培養して形質転換株のコロニーを形成させ
た。得られた形質転換株を、コロニーハイブリダイゼー
ション法［T.Maniatis etal., Molecular Cloning, 1.9
0,(1989), Cold Spring Harbor Laboratory 参照］によ
りスクリーニングした。尚、スクリーニングプローブと
しては、実施例１で調製したプローブをランダムプライ
マーＤＮＡラベリングキット（宝酒造製）を用いて［α
32Ｐ］ｄＣＴＰラベルしたものを使用した。
換株が得られるようにパッケージング溶液の量を定め、
上記と同様にして、前記パッケージング溶液を用いてパ
ッケージングＤＮＡを大腸菌ＳＵＲＥ株に感染させた
後、これを培養して形質転換株のコロニーを形成させ
た。得られた形質転換株を、コロニーハイブリダイゼー
ション法［T.Maniatis etal., Molecular Cloning, 1.9
0,(1989), Cold Spring Harbor Laboratory 参照］によ
りスクリーニングした。尚、スクリーニングプローブと
しては、実施例１で調製したプローブをランダムプライ
マーＤＮＡラベリングキット（宝酒造製）を用いて［α
32Ｐ］ｄＣＴＰラベルしたものを使用した。
【００２６】スクリーニングして得られた陽性クローン
から、常法［T.Maniatis et al., Molecular Cloning,
1.25,(1989), Cold Spring Harbor Laboratory 参照］
に従いコスミドＤＮＡを抽出した。抽出して得られたコ
スミドＤＮＡ ２００ｎｇを１単位の制限酵素ＢａｍＨ
Ｉと共に、緩衝液［組成：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ2，(ｐＨ
７.５)］中、３７℃で２時間インキュベートして消化し
た。ＤＮＡ消化物を０.７％アガロースゲル電気泳動に
供した後、サザンブロット法［Southern,E., J.Mol.Bi
o., 98, 503 (1975）参照］を用いてナイロンメンブレ
ン［バイオダインＢ ＢＮＢＺＦ３ＲＴ；ポールバイオ
サポートディビジョン（Pall Bio Support Division）
製］に１６時間ブロッティングさせた。
から、常法［T.Maniatis et al., Molecular Cloning,
1.25,(1989), Cold Spring Harbor Laboratory 参照］
に従いコスミドＤＮＡを抽出した。抽出して得られたコ
スミドＤＮＡ ２００ｎｇを１単位の制限酵素ＢａｍＨ
Ｉと共に、緩衝液［組成：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ2，(ｐＨ
７.５)］中、３７℃で２時間インキュベートして消化し
た。ＤＮＡ消化物を０.７％アガロースゲル電気泳動に
供した後、サザンブロット法［Southern,E., J.Mol.Bi
o., 98, 503 (1975）参照］を用いてナイロンメンブレ
ン［バイオダインＢ ＢＮＢＺＦ３ＲＴ；ポールバイオ
サポートディビジョン（Pall Bio Support Division）
製］に１６時間ブロッティングさせた。
【００２７】次いで、２×ＳＳＣ溶液［組成：０.３Ｍ
ＮａＣｌ，０.０３Ｍ クエン酸三ナトリウム］を用いて
メンブレンを洗浄した後、ＵＶ照射してＤＮＡをメンブ
レンに固定した。このメンブレンを、ランダムプライマ
ーＤＮＡラベリングキット（宝酒造製）により［α
32Ｐ］ｄＣＴＰラベルした染色体ａｔｋ遺伝子スクリー
ニングプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション
法［T.Maniatis et al., Molecular Cloning, 1.25,(19
89), Cold Spring Harbor Laboratory 参照］に供し
た。その結果、大きさ約８Ｋｂの画分に陽性のバンドが
検出された。これは、同時に対照として行った染色体Ｄ
ＮＡ消化物のサザンハイブリダイゼーションの結果とよ
く一致した。
ＮａＣｌ，０.０３Ｍ クエン酸三ナトリウム］を用いて
メンブレンを洗浄した後、ＵＶ照射してＤＮＡをメンブ
レンに固定した。このメンブレンを、ランダムプライマ
ーＤＮＡラベリングキット（宝酒造製）により［α
32Ｐ］ｄＣＴＰラベルした染色体ａｔｋ遺伝子スクリー
ニングプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション
法［T.Maniatis et al., Molecular Cloning, 1.25,(19
89), Cold Spring Harbor Laboratory 参照］に供し
た。その結果、大きさ約８Ｋｂの画分に陽性のバンドが
検出された。これは、同時に対照として行った染色体Ｄ
ＮＡ消化物のサザンハイブリダイゼーションの結果とよ
く一致した。
【００２８】この大きさ約８ｋｂのＤＮＡ断片を用い、
常法に従い染色体歩行を行ってその染色体配列を決定し
たところ、ベトリエらが報告したａｔｋ遺伝子のアミノ
酸コーディング領域の２７４番目から２５４１番目まで
の領域［Vetrie,D et al., Nature, 361, 226, 1993 参
照］が、染色体ＤＮＡ上で１７ヶの領域に分かれて存在
することが判明した。これらの領域の塩基配列の決定
は、実施例１と同様にして、まず常法に従いサブクロー
ンを作成し、そのサブクローンが保持するプラスミドを
アルカリ法［T.Maniatis et al., Molecular Cloning,
1.38,(1989), Cold Spring Harbor Laboratory 参照］
により調製した後、前記タックダイデオキシターミネー
ターサイクルシークエンスキットを用いたダイジデオキ
シ法［L.Smith, Nature 1986, 321:674-679 参照］によ
り実施した。これにより目的とする染色体ａｔｋ遺伝子
が同定された。複数の領域に別れて存在する染色体ａｔ
ｋ遺伝子のアミノ酸をコードする領域をそれぞれ包含す
る染色体ＤＮＡ領域の塩基配列を、後記配列表中に配列
番号１〜１１として示す。
常法に従い染色体歩行を行ってその染色体配列を決定し
たところ、ベトリエらが報告したａｔｋ遺伝子のアミノ
酸コーディング領域の２７４番目から２５４１番目まで
の領域［Vetrie,D et al., Nature, 361, 226, 1993 参
照］が、染色体ＤＮＡ上で１７ヶの領域に分かれて存在
することが判明した。これらの領域の塩基配列の決定
は、実施例１と同様にして、まず常法に従いサブクロー
ンを作成し、そのサブクローンが保持するプラスミドを
アルカリ法［T.Maniatis et al., Molecular Cloning,
1.38,(1989), Cold Spring Harbor Laboratory 参照］
により調製した後、前記タックダイデオキシターミネー
ターサイクルシークエンスキットを用いたダイジデオキ
シ法［L.Smith, Nature 1986, 321:674-679 参照］によ
り実施した。これにより目的とする染色体ａｔｋ遺伝子
が同定された。複数の領域に別れて存在する染色体ａｔ
ｋ遺伝子のアミノ酸をコードする領域をそれぞれ包含す
る染色体ＤＮＡ領域の塩基配列を、後記配列表中に配列
番号１〜１１として示す。
【００２９】実施例３：染色体ａｔｋ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片の塩基配列の解析に使用し得るオリゴヌクレオチ
ドプライマーの調製 実施例２で得られた、染色体ａｔｋ遺伝子を含むＤＮＡ
断片の塩基配列、即ち後記配列表中に配列番号１〜１１
として示す塩基配列を用い、これらの塩基配列それぞれ
に対し、各配列内に存在するアミノ酸コーディング領域
を挟むオリゴヌクレオチドプライマーセットを設計し、
それらを常法に従い合成した。合成したオリゴヌクレオ
チドの塩基配列を後記配列表中に配列番号１２〜３３と
して示す。尚、配列番号１２および１３は配列番号１の
塩基配列を元に設計したオリゴヌクレオチドプライマー
セットであり、以下、配列番号１４および１５は配列番
号２、配列番号１６および１７は配列番号３、配列番号
１８および１９は配列番号４、配列番号２０および２１
は配列番号５、配列番号２２および２３は配列番号６、
配列番号２４および２５は配列番号７、配列番号２６お
よび２７は配列番号８、配列番号２８および２９は配列
番号９、配列番号３０および３１は配列番号１０、なら
びに配列番号３２および３３は配列番号１１の塩基配列
をそれぞれ元にして設計したオリゴヌクレオチドプライ
マーセットである。これらのオリゴヌクレオチドをそれ
ぞれＰＣＲプライマーとして用いて、以下の手順にてＰ
ＣＲ法を実施した。
Ａ断片の塩基配列の解析に使用し得るオリゴヌクレオチ
ドプライマーの調製 実施例２で得られた、染色体ａｔｋ遺伝子を含むＤＮＡ
断片の塩基配列、即ち後記配列表中に配列番号１〜１１
として示す塩基配列を用い、これらの塩基配列それぞれ
に対し、各配列内に存在するアミノ酸コーディング領域
を挟むオリゴヌクレオチドプライマーセットを設計し、
それらを常法に従い合成した。合成したオリゴヌクレオ
チドの塩基配列を後記配列表中に配列番号１２〜３３と
して示す。尚、配列番号１２および１３は配列番号１の
塩基配列を元に設計したオリゴヌクレオチドプライマー
セットであり、以下、配列番号１４および１５は配列番
号２、配列番号１６および１７は配列番号３、配列番号
１８および１９は配列番号４、配列番号２０および２１
は配列番号５、配列番号２２および２３は配列番号６、
配列番号２４および２５は配列番号７、配列番号２６お
よび２７は配列番号８、配列番号２８および２９は配列
番号９、配列番号３０および３１は配列番号１０、なら
びに配列番号３２および３３は配列番号１１の塩基配列
をそれぞれ元にして設計したオリゴヌクレオチドプライ
マーセットである。これらのオリゴヌクレオチドをそれ
ぞれＰＣＲプライマーとして用いて、以下の手順にてＰ
ＣＲ法を実施した。
【００３０】健常者末梢血より常法に従い調製した５０
ng/μl 染色体ＤＮＡ５μｌと、溶液｛組成：１０×緩
衝液［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）１０
μｌ，５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０.０
１％（W/V）ゼラチン］１０μｌ，０.２ｍＭ ｄＮＴＰ
ｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）１０μ
ｌ，２５ pmol/μl プライマー １μｌづつ計２μｌ，
３単位（０.６μｌ）Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ
（ベーリンガーマンハイムバイオケミカ製），純水７
２.４μｌ｝とを混和して反応液とし、全量１００μｌ
の系にてＰＣＲを実施した。増幅反応は、変性（９４
℃，３０秒間）、変性（９４℃、３０秒間）、アニーリ
ング（５５℃，３０秒間）、伸長（７２℃，６０秒間）
の順序で行い、これを４０サイクル繰り返した。上記遺
伝子増幅反応終了後、それぞれのＰＣＲ反応液を３％ア
ガロースゲル電気泳動に供したところ、それぞれの反応
液において、大きさ約１７３ｂｐ、１５６ｂｐ、１６７
ｂｐ、１３７ｂｐ、２９８ｂｐ、１７０ｂｐ、１５４ｂ
ｐ、１４３ｂｐ、１４８ｂｐ、２５２ｂｐ、および１８
１ｂｐの各ＰＣＲ産物が検出された。
ng/μl 染色体ＤＮＡ５μｌと、溶液｛組成：１０×緩
衝液［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）１０
μｌ，５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０.０
１％（W/V）ゼラチン］１０μｌ，０.２ｍＭ ｄＮＴＰ
ｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）１０μ
ｌ，２５ pmol/μl プライマー １μｌづつ計２μｌ，
３単位（０.６μｌ）Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ
（ベーリンガーマンハイムバイオケミカ製），純水７
２.４μｌ｝とを混和して反応液とし、全量１００μｌ
の系にてＰＣＲを実施した。増幅反応は、変性（９４
℃，３０秒間）、変性（９４℃、３０秒間）、アニーリ
ング（５５℃，３０秒間）、伸長（７２℃，６０秒間）
の順序で行い、これを４０サイクル繰り返した。上記遺
伝子増幅反応終了後、それぞれのＰＣＲ反応液を３％ア
ガロースゲル電気泳動に供したところ、それぞれの反応
液において、大きさ約１７３ｂｐ、１５６ｂｐ、１６７
ｂｐ、１３７ｂｐ、２９８ｂｐ、１７０ｂｐ、１５４ｂ
ｐ、１４３ｂｐ、１４８ｂｐ、２５２ｂｐ、および１８
１ｂｐの各ＰＣＲ産物が検出された。
【００３１】各ＰＣＲ産物を５００ｎｇづつ取り、それ
ぞれを反応液［組成：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ
８.０)，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，２ｍＭ ＡＴＰ，１０単
位 Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（polynucleotide K
inase）］５０μｌ中、３７℃で１時間反応させた。反
応終了液を常法に従い等量のフェノール／クロロホルム
（１：１、v/v）で処理して抽出精製し、エタノール沈
殿によりＤＮＡを折出させて回収した。次いで、ＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造製）を用い、得られたＤ
ＮＡ３００ｎｇを、制限酵素ＳｍａＩにて消化したｐＵ
Ｃ１９（宝酒造製）１００ｎｇに連結させた。この１１
ヶのライゲーション反応物を用いてエシエリヒア・コリ
ＨＢ１０１コンピテント細胞（宝酒造製）を製造者のマ
ニュアルに従い形質転換させた。次に、実施例１−２．
と同様にして、得られた１１ケの形質転換株を単離し、
挿入ＤＮＡ断片の存在を確認した後で該挿入ＤＮＡ断片
の塩基配列を決定したところ、挿入ＤＮＡ断片の塩基配
列はそれぞれＰＣＲに用いたプライマーの組に対応して
いること、例えば、後記配列表中に配列番号１２および
１３として示すプライマーの組を用いて増幅されたＤＮ
Ａ断片の塩基配列は後記配列表中に配列番号１として示
す塩基配列と一致することが確認された。
ぞれを反応液［組成：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ
８.０)，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，２ｍＭ ＡＴＰ，１０単
位 Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（polynucleotide K
inase）］５０μｌ中、３７℃で１時間反応させた。反
応終了液を常法に従い等量のフェノール／クロロホルム
（１：１、v/v）で処理して抽出精製し、エタノール沈
殿によりＤＮＡを折出させて回収した。次いで、ＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造製）を用い、得られたＤ
ＮＡ３００ｎｇを、制限酵素ＳｍａＩにて消化したｐＵ
Ｃ１９（宝酒造製）１００ｎｇに連結させた。この１１
ヶのライゲーション反応物を用いてエシエリヒア・コリ
ＨＢ１０１コンピテント細胞（宝酒造製）を製造者のマ
ニュアルに従い形質転換させた。次に、実施例１−２．
と同様にして、得られた１１ケの形質転換株を単離し、
挿入ＤＮＡ断片の存在を確認した後で該挿入ＤＮＡ断片
の塩基配列を決定したところ、挿入ＤＮＡ断片の塩基配
列はそれぞれＰＣＲに用いたプライマーの組に対応して
いること、例えば、後記配列表中に配列番号１２および
１３として示すプライマーの組を用いて増幅されたＤＮ
Ａ断片の塩基配列は後記配列表中に配列番号１として示
す塩基配列と一致することが確認された。
【００３２】実施例４：染色体ａｔｋ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片の塩基配列の解析に使用し得るオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いた増幅塩基配列の解析 伴性無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）が疑われる男児
より末梢血を採取し、実施例２と同様の方法で染色体Ｄ
ＮＡを抽出した。このＤＮＡサンプルを用い、染色体ａ
ｔｋ遺伝子の解析をＰＣＲ−ＳＳＣＰ法［Orita,M et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86 2766-2770,
1989 参照］に従い実施した。まず、サンプル中の染色
体ＤＮＡを鋳型とし、実施例３で調製した本発明のプラ
イマーセットをＰＣＲプライマーとして用い、全量２５
μｌの系にてＰＣＲを実施した。その際の反応液組成を
以下に示す。 １００ ng/μl ＤＮＡ ３μｌ、 １０×緩衝液［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.
３)，５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０.０１％(W/V) ゼラチ
ン］２.５μｌ、 ２ｍＭ ｄＮＴＰ １.５μｌ、 ［α32Ｐ］ｄＣＴＰ（〜１１０ TBq/mmole）１μｌ、 ５ pmoles/μl プライマー １μｌづつ計２μｌ、 ５ 単位/μl Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ ０.２μｌ、 純水 １４.８μｌ
Ａ断片の塩基配列の解析に使用し得るオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いた増幅塩基配列の解析 伴性無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）が疑われる男児
より末梢血を採取し、実施例２と同様の方法で染色体Ｄ
ＮＡを抽出した。このＤＮＡサンプルを用い、染色体ａ
ｔｋ遺伝子の解析をＰＣＲ−ＳＳＣＰ法［Orita,M et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86 2766-2770,
1989 参照］に従い実施した。まず、サンプル中の染色
体ＤＮＡを鋳型とし、実施例３で調製した本発明のプラ
イマーセットをＰＣＲプライマーとして用い、全量２５
μｌの系にてＰＣＲを実施した。その際の反応液組成を
以下に示す。 １００ ng/μl ＤＮＡ ３μｌ、 １０×緩衝液［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.
３)，５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０.０１％(W/V) ゼラチ
ン］２.５μｌ、 ２ｍＭ ｄＮＴＰ １.５μｌ、 ［α32Ｐ］ｄＣＴＰ（〜１１０ TBq/mmole）１μｌ、 ５ pmoles/μl プライマー １μｌづつ計２μｌ、 ５ 単位/μl Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ ０.２μｌ、 純水 １４.８μｌ
【００３３】増幅反応は、まず、反応液を９６℃に４分
間維持した後、アニーリング（５５℃、０.５分間）、
伸長（７２℃、１分間）、変性（９４℃、０．５分間）
の順序で行い、これを４０回繰り返した後、５５℃に１
分間、７２℃に３分間、そして１０℃に２０分間それぞ
れ維持して行った。反応終了後、各反応終了物を純水で
５倍に希釈した溶液から２μｌ取り、これを８μｌのロ
ーディングダイ（loading dye）溶液［組成：９５％ホ
ルムアミド，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０.０１％（W/V）キ
シレンシアノール，０.０１％（W/V）ブロモフェノール
ブルー］と混合した。混合液を加熱して９５℃に２分間
維持した後に急冷し、５％グリセロール含有５％ポリア
クリルアミドゲル（アクリルアミドモノマー：ビス＝９
９：１）電気泳動に供した。泳動終了後にゲルドライヤ
ーを用いてゲルを乾燥させ、オートラジオグラムを撮影
した。供試サンプルのオートラジオグラムと、同時に泳
動させた健常者由来サンプルのオートラジオグラムとを
比較したところ、後記配列表の配列番号１０に示す塩基
配列を含むＤＮＡ断片において、供試サンプルのオート
ラジオグラムには健常者由来サンプルと移動度の異なる
バンドが認められた。この解析結果により、配列番号１
０に示す塩基配列中の遺伝子領域内における変異点の存
在が強く疑われた。
間維持した後、アニーリング（５５℃、０.５分間）、
伸長（７２℃、１分間）、変性（９４℃、０．５分間）
の順序で行い、これを４０回繰り返した後、５５℃に１
分間、７２℃に３分間、そして１０℃に２０分間それぞ
れ維持して行った。反応終了後、各反応終了物を純水で
５倍に希釈した溶液から２μｌ取り、これを８μｌのロ
ーディングダイ（loading dye）溶液［組成：９５％ホ
ルムアミド，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０.０１％（W/V）キ
シレンシアノール，０.０１％（W/V）ブロモフェノール
ブルー］と混合した。混合液を加熱して９５℃に２分間
維持した後に急冷し、５％グリセロール含有５％ポリア
クリルアミドゲル（アクリルアミドモノマー：ビス＝９
９：１）電気泳動に供した。泳動終了後にゲルドライヤ
ーを用いてゲルを乾燥させ、オートラジオグラムを撮影
した。供試サンプルのオートラジオグラムと、同時に泳
動させた健常者由来サンプルのオートラジオグラムとを
比較したところ、後記配列表の配列番号１０に示す塩基
配列を含むＤＮＡ断片において、供試サンプルのオート
ラジオグラムには健常者由来サンプルと移動度の異なる
バンドが認められた。この解析結果により、配列番号１
０に示す塩基配列中の遺伝子領域内における変異点の存
在が強く疑われた。
【００３４】そこで、この遺伝子断片の塩基配列の決定
を行った。後記配列表中に配列番号１０として示す塩基
配列を元に設計した、後記配列表中に配列番号３０およ
び３１として示す２種類のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ
プライマーとし、ラベル体を含まない以外は上記と同様
にして再度ＰＣＲを行い、この遺伝子領域を調製した。
ＰＣＲ反応終了液を、実施例１と同様にして、フェノー
ル：クロロホルム（１：１、v/v）混液で処理して精製
し、エタノール沈殿により濃縮させた。次いで、このＤ
ＮＡ断片の末端を常法に従いリン酸化した後、これをプ
ラスミドｐＵＣ１９（宝酒造製）に連結してクローニン
グを行った。得られたクローンを用い、実施例１と同様
の方法により増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。そ
の結果、患児由来のＰＣＲ産物においては、ａｔｋ遺伝
子内のコドン４４１の塩基配列：ＧＡＡ（Ｇｌｕ）がＴ
ＡＡ（終止コドン）に変異していることが明らかとなっ
た。
を行った。後記配列表中に配列番号１０として示す塩基
配列を元に設計した、後記配列表中に配列番号３０およ
び３１として示す２種類のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ
プライマーとし、ラベル体を含まない以外は上記と同様
にして再度ＰＣＲを行い、この遺伝子領域を調製した。
ＰＣＲ反応終了液を、実施例１と同様にして、フェノー
ル：クロロホルム（１：１、v/v）混液で処理して精製
し、エタノール沈殿により濃縮させた。次いで、このＤ
ＮＡ断片の末端を常法に従いリン酸化した後、これをプ
ラスミドｐＵＣ１９（宝酒造製）に連結してクローニン
グを行った。得られたクローンを用い、実施例１と同様
の方法により増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。そ
の結果、患児由来のＰＣＲ産物においては、ａｔｋ遺伝
子内のコドン４４１の塩基配列：ＧＡＡ（Ｇｌｕ）がＴ
ＡＡ（終止コドン）に変異していることが明らかとなっ
た。
【００３５】この変異は増幅ＤＮＡ断片中に存在する制
限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位に生じており、変異により配
列中の前記部位は制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位として機
能し得ないことが予想された。そこで、本遺伝子領域を
上記と同様にして再度ＰＣＲにより標識増幅させ、制限
酵素ＥｃｏＲＩで処理して３％アガロースゲル電気泳動
に供し、エチジウムブロマイドで染色した後、ＵＶ照射
下写真撮影をした。その結果、健常者由来のＰＣＲ産物
は２つの断片（大きさ１８３ｂｐおよび６９ｂｐのバン
ド）に切断されたのに対し、患児由来のＰＣＲ産物は切
断されていなかった（大きさ２５２ｂｐのバンド）。さ
らに、患児母親は保因者のパターン（大きさ２５２ｂ
ｐ、１８３ｂｐおよび６９ｂｐのバンド）を示し、患児
妹は健常者のパターン（大きさ１８３ｂｐおよび６９ｂ
ｐのバンド）を示した（図１参照）。
限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位に生じており、変異により配
列中の前記部位は制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位として機
能し得ないことが予想された。そこで、本遺伝子領域を
上記と同様にして再度ＰＣＲにより標識増幅させ、制限
酵素ＥｃｏＲＩで処理して３％アガロースゲル電気泳動
に供し、エチジウムブロマイドで染色した後、ＵＶ照射
下写真撮影をした。その結果、健常者由来のＰＣＲ産物
は２つの断片（大きさ１８３ｂｐおよび６９ｂｐのバン
ド）に切断されたのに対し、患児由来のＰＣＲ産物は切
断されていなかった（大きさ２５２ｂｐのバンド）。さ
らに、患児母親は保因者のパターン（大きさ２５２ｂ
ｐ、１８３ｂｐおよび６９ｂｐのバンド）を示し、患児
妹は健常者のパターン（大きさ１８３ｂｐおよび６９ｂ
ｐのバンド）を示した（図１参照）。
【００３６】これらの結果から、本患児が有する遺伝子
の変異は、変位部位の存在する遺伝子の塩基配列を決定
することなしに、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いることによ
り特定化することが可能となった。この知見から、本発
明の染色体ａｔｋ遺伝子解析方法は家系診断或いは出生
前診断にも有効であると予想される。
の変異は、変位部位の存在する遺伝子の塩基配列を決定
することなしに、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いることによ
り特定化することが可能となった。この知見から、本発
明の染色体ａｔｋ遺伝子解析方法は家系診断或いは出生
前診断にも有効であると予想される。
【００３７】
【発明の効果】本発明の染色体ａｔｋ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片、およびそれに対する相補性を有するオリゴヌク
レオチドを用いることにより、従来よりも患者に負担を
かけずに、少量のサンプルでａｔｋ遺伝子を解析し得る
方法が提供される。さらにこの方法は、伴性無ガンマグ
ロブリン血症の保因者診断を含む遺伝子診断および遺伝
子治療に利用可能であり、産業上非常に利用価値の高い
ものである。
Ａ断片、およびそれに対する相補性を有するオリゴヌク
レオチドを用いることにより、従来よりも患者に負担を
かけずに、少量のサンプルでａｔｋ遺伝子を解析し得る
方法が提供される。さらにこの方法は、伴性無ガンマグ
ロブリン血症の保因者診断を含む遺伝子診断および遺伝
子治療に利用可能であり、産業上非常に利用価値の高い
ものである。
【００３８】
配列番号：１ 配列の長さ：２１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：７０．.１６８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CAAAATCTAAT CATCTGGTTG CTTAATCCCTC TTAATCTTTC TCCATTTTCT TCCTCATTCT 60 ACTTCTCAG AGA AGA GGC AGT AAG AAG GGT TCA ATA GAT GTT GAG AAG ATC 111 Arg Arg Gly Ser Lys Lys Gly Ser Ile Asp Val Glu Lys Ile 1 5 10 ACT TGT GTT GAA ACA GTG GTT CCT GAA AAA AAT CCT CCT CCA GAA AGA 159 Thr Cys Val Glu Thr Val Val Pro Glu Lys Asn Pro Pro Pro Glu Arg 15 20 25 30 CAG ATT CCG GTAAGAAGAG ACCAATGTCT GAGATGGGGA ACAGCAGATT TGA 211 Gln Ile Pro
【００３９】配列番号：２ 配列の長さ：１７２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：５８．.１２６ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AAATTCAGAA AAGAGCAATG CATCAACCAA TAACCATTTT TTCTTATTTC ATTACAG AGA 60 Arg 1 AGA GGT GAA GAG TCC AGT GAA ATG GAG CAA ATT TCA ATC ATT GAA AGG TTC 111 Arg Gly Glu Glu Ser Ser Glu Met Glu Gln Ile Ser Ile Ile Glu Arg Phe 5 10 15 CCT TAT CCC TTC CAG GTGAGTTATT TTCTCTCACC AAATCTCGAA AGGCCCCTGT 166 Pro Tyr Pro Phe Gln 20 AACACA 172
【００４０】配列番号：３ 配列の長さ：２０９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６２．.１４３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CGAGGTCTTT CTCCGTTTTT CTGAATCCTA ACTGCTGAAG TCTGTGTTTT CATCGACCCA 60 G GTT GTA TAT GAT GAA GGG CCT CTC TAC GTC TTC TCC CCA ACT GAA GAA 109 Val Val Tyr Asp Glu Gly Pro Leu Tyr Val Phe Ser Pro Thr Glu Glu 1 5 10 15 CTA AGG AAG CGG TGG ATT CAC CAG CTC AAA AAC G GTGAGAATTA TTTGGAAAAT 163 Leu Arg Lys Arg Trp Ile His Gln Leu Lys Asn 20 25 AAATGTTTCC AAAGAAAGAA GGAAAGGAAG GAAGAGGAGA TAGACG 209
【００４１】配列番号：４ 配列の長さ：１９３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：５５．.１２２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTGGCCCCTT TCCTAAAGTG CATTCCATAT CATCACTGGC TTCTTGCTTT GCAG GC 56 Ser 1 TTA AAA CCT GGG AGT TCT CAC CGG AAG ACA AAA AAG CCT CTT CCC CCA 104 Leu Lys Pro Gly Ser Ser His Arg Lys Thr Lys Lys Pro Leu Pro Pro 5 10 15 ACG CCT GAG GAG GAC CAG GTATACAGGG CAAACTGGGT GCTGCCACTG 152 Thr Pro Glu Glu Asp Gln 20 CTTAAATGGA AACTTATAGT CAAGCCCTAA GAACACACTC C 193
【００４２】配列番号：５ 配列の長さ：４１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１３７．.３２４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TGGTTGTTGA ATGACTGCTG AGTGATATTT TAGTATGCCT GATTTGGGTG TCNTGAGTAA 60 GCCAGAGAGT TGGGAGAGAA GAGAAGAGTG CTTGGTATCT TGACAAACCC TCCTACCTTT 120 TCTCCTAACT ACATAG ATC TTG AAA AAG CCA CTA CCG CCT GAG CCA GCA GCA 172 Ile Leu Lys Lys Pro Leu Pro Pro Glu Pro Ala Ala 1 5 10 GCA CCA GTC TCC ACA AGT GAG CTG AAA AAG GTT GTG GCC CTT TAT GAT 220 Ala Pro Val Ser Thr Ser Glu Leu Lys Lys Val Val Ala Leu Tyr Asp 15 20 25 TAC ATG CCA ATG AAT GCA AAT GAT CTA CAG CTG CGG AAG GGT GAT GAA 268 Tyr Met Pro Met Asn Ala Asn Asp Leu Gln Leu Arg Lys Gly Asp Glu 30 35 40 TAT TTT ATC TTG GAG GAA AGC AAC TTA CCA TGG TGG AGA GCA CGA GAT 316 Tyr Phe Ile Leu Glu Glu Ser Asn Leu Pro Trp Trp Arg Ala Arg Asp 45 50 55 60 AAA AAT GG GTGAGTCCAC ACCAGCCCTT CCTGAGCCTG GTGCCTGCCC ACTCCCTACA 374 Lys Asn Gly CGCAAAAAGT GCTGCGGCAT AATTCCCGTG ATCAGCA 411
【００４３】配列番号：６ 配列の長さ：２６８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１４７．.２０９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CAGAGACATG ATTGTCTTTG AGGGAGGTGC ATGATACATA TACCTCCATT TGAGATTTGT 60 TCTGAGCTCA GGGACGTGGG CATATGAATC TGTCTCCTGG AGACTGGGGA GGTGCTGGAT 120 GAACTGCCAC ATTGTTTCCT TCACAG G CAG GAA GGC TAC ATT CCT AGT AAC 171 Gln Glu Gly Tyr Ile Pro Ser Asn 1 5 TAT GTC ACT GAA GCA GAA GAC TCC ATA GAA ATG TAT GA GTAAGTATGT 219 Tyr Val Thr Glu Ala Glu Asp Ser Ile Glu Met Tyr Glu 10 15 20 TTATGTCAGT CCACAATCTT CCAGGAGGAA CTCTCTCTCT CTCTATAT A 268
【００４４】配列番号：７ 配列の長さ：１８５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：５９．.１１３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TGTAACCTCC AATCTGCTTA TGACCAGGAG CCACTCAAGC AGCACTCTCC CTTCACAG 58 G TGG TAT TCC AAA CAC ATG ACT CGG AGT CAG GCT GAG CAA CTG CTA 104 Trp Tyr Ser Lys His Met Thr Arg Ser Gln Ala Glu Gln Leu Leu 1 5 10 15 AAG CAA GAG GTAAGTGTGG AACCACTAGC ACACAGCATT CTCCTTGAAT 153 Lys Gln Glu AAGTGAGGAT CTTGAACTGA GGGCCTGTTC TG 185
【００４５】配列番号：８ 配列の長さ：１９０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６５．.１４４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GCAGGTGGGA TGCAGGTGTG AGCACCACTT CCTCCTACAG ACAGCTTCTT TTTCGTTGTT 60 TCA G GGG AAA GAA GGA GGT TTC ATT GTC AGA GAC TCC AGC AAA GCT GGC 109 Gly Lys Glu Gly Gly Phe Ile Val Arg Asp Ser Ser Lys Ala Gly 1 5 10 15 AAA TAT ACA GTG TCT GTG TTT GCT AAA TCC ACA GG GTGAGTGCTA 154 Lys Tyr Thr Val Ser Val Phe Ala Lys Ser Thr Gly 20 25 CTATTCCAAG GCCCTGAGGA CAAAGAACAG GGGTAC 190
【００４６】配列番号：９ 配列の長さ：２０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：７６．.１５０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGCTTTAAGT GAGGATGTGT GAGGCATTCC ACCTCCTACA CCACACCAAC AGCATGACCT 60 CTCTCTCTGT TTCAG GA CTC ATA TCC AGG CTC AAA TAT CCA GTG TCT CAA 110 Gly Leu Ile Ser Arg Leu Lys Tyr Pro Val Ser Gln 1 5 10 CAA AAC AAG AAT GCA CCT TCC ACT GCA GGC CTG GGA TAC G GTAACTCCTT 160 Gln Asn Lys Asn Ala Pro Ser Thr Ala Gly Leu Gly Tyr 15 20 25 ATTTCTCTGG GGTAGGGTGG ACTGGCCAGT TGCAAAAACT ACCT 204
【００４７】配列番号：１０ 配列の長さ：３０３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：８０．.２５１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ACCCAGTAGG GATTTTTCGT CTATTGTAAG AATTATACAT TCATGACCCC AAAGAATCAC 60 ACCAAGACTT TATTGTTAG GA TCA TGG GAA ATT GAT CCA AAG GAC CTG 108 Gly Ser Trp Glu Ile Asp Pro Lys Asp Leu 1 5 10 ACC TTC TTG AAG GAG CTG GGG ACT GGA CAA TTT GGG GTA GTG AAG TAT 156 Thr Phe Leu Lys Glu Leu Gly Thr Gly Gln Phe Gly Val Val Lys Tyr 15 20 25 GGG AAA TGG AGA GGC CAG TAC GAC GTG GCC ATC AAG ATG ATC AAA GAA 204 Gly Lys Trp Arg Gly Gln Tyr Asp Val Ala Ile Lys Met Ile Lys Glu 30 35 40 GGC TCC ATG TCT GAA GAT GAA TTC ATT GAA GAA GCC AAA GTC ATG AT 251 Gly Ser Met Ser Glu Asp Glu Phe Ile Glu Glu Ala Lys Val Met Met 45 50 55 GTGAGTTATA GCCCAAACTC AACTCTCAAT CTATTTGCTG GAGTCTAGGAA TT 303
【００４８】配列番号：１１ 配列の長さ：２４３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：７０．.１８８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GTGCCAAGAA TACGTAAGCA AATATCAAGC CTCCAAATCC TAATGCAACA AGTCCTGAAT 60 CCCTTGCAG G TAT GTC CTG GAT GAT GAA TAC ACA AGC TCA GTA GGC TCC 109 Tyr Val Leu Asp Asp Glu Tyr Thr Ser Ser Val Gly Ser 1 5 10 AAA TTT CCA GTC CGG TGG TCC CCA CCG GAA GTC CTG ATG TAT AGC AAG 157 Lys Phe Pro Val Arg Trp Ser Pro Pro Glu Val Leu Met Tyr Ser Lys 15 20 25 TTC AGC AGC AAA TCT GAC ATT TGG GCT TTT G GTAAGTGGAT AAGATTACAC 208 Phe Ser Ser Lys Ser Asp Ile Trp Ala Phe 30 35 AGATTATACA GCTCTAAGGA TAAGAAATGC AATGG 243
【００４９】配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCTCCATTTTCTTCCTCAT 20
【００５０】配列番号：１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAAATCTGCTGTTCCCCATC 20
【００５１】配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCAGAAAAGAGCAATGCATC 20
【００５２】配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCCTTTCGAGATTTGGTGAG 20
【００５３】配列番号：１６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGAATCCTAACTGCTGAAG 20
【００５４】配列番号：１７ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCCTTCTTTCTTTGGAAACAT 22
【００５５】配列番号：１８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATATCATCACTGGCTTCTTG 20
【００５６】配列番号：１９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCCATTTAAGCAGTGGCAG 20
【００５７】配列番号：２０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGTGCTTGGTATCTTGACA 20
【００５８】配列番号：２１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTTTTGCGTGTAGGGAGTG 20
【００５９】配列番号：２２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCATATGAATCTGTCTCCTG 20
【００６０】配列番号：２３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCCTCCTGGAAGATTGTGG 20
【００６１】配列番号：２４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAACCTCCAATCTGCTTATG 20
【００６２】配列番号：２５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTATTCAAGGAGAATGCT 20
【００６３】配列番号：２６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCCTCCTACAGACAGCTTCT 20
【００６４】配列番号：２７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTCAGGGCCTTGGAATAGTA 20
【００６５】配列番号：２８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATTCCACCTCCTACACCACA 20
【００６６】配列番号：２９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACCCCAGAGAAATAAGGAGT 20
【００６７】配列番号：３０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCATGACCCCAAAGAATCAC 20
【００６８】配列番号：３１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCAGCAAATAGATTGAGAGT 20
【００６９】配列番号：３２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGCAACAAGTCCTGAATCC 20
【００７０】配列番号：３３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGAGCTGTATAATCTGTGTA 20
【図１】健常者、患児、患児母親および患児妹にそれぞ
れ由来する同種のＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで切
断した切断断片を３％アガロースゲル電気泳動に供し、
エチジウムブロマイド染色した後に撮影したＵＶ照射下
写真である。
れ由来する同種のＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで切
断した切断断片を３％アガロースゲル電気泳動に供し、
エチジウムブロマイド染色した後に撮影したＵＶ照射下
写真である。
【図２】図１の写真を白黒反転して模式的に表した図で
ある。但し、見易くするために白黒反転させ、約１．５
倍に拡大して読み取り易くしてある。染色の程度は３段
階に表現されており、網掛けが最も染色の強いバンド
を、ドットが最も染色の弱いバンドを示している。
ある。但し、見易くするために白黒反転させ、約１．５
倍に拡大して読み取り易くしてある。染色の程度は３段
階に表現されており、網掛けが最も染色の強いバンド
を、ドットが最も染色の弱いバンドを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大隅 一興 東京都板橋区志村三丁目30番１号 株式会 社三菱化学ビーシーエル内 (72)発明者 山森 俊治 東京都板橋区志村三丁目30番１号 株式会 社三菱化学ビーシーエル内
Claims (4)
- 【請求項１】 配列表中に配列番号１〜１１として示す
塩基配列のいずれか１つの配列からなる、伴性無ガンマ
グロブリン血症に関与する遺伝子（無ガンマグロブリン
血症チロシンキナーゼ遺伝子）を含むＤＮＡ断片。 - 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡ断片に対する相
補性を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 配列表中に配列番号１２〜３３として示
す塩基配列のいずれか１つの配列により示される、請求
項２に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 請求項２に記載のオリゴヌクレオチドを
用いる、伴性無ガンマグロブリン血症に関与する遺伝子
（無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ遺伝子）を
含むＤＮＡ断片の塩基配列解析方法であって、前記オリ
ゴヌクレオチドから２種類のオリゴヌクレオチドを選択
し、該２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いるＰＣＲ（ポリメラーゼチェンリアクション）法に
より無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ遺伝子の
エクソンおよびエクソン近傍の塩基配列を増幅させ、そ
の際、前記２種類のオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列表中の配列番号１２と１３、配列番号１４と１５、
配列番号１６と１７、配列番号１８と１９、配列番号２
０と２１、配列番号２２と２３、配列番号２４と２５、
配列番号２６と２７、配列番号２８と２９、配列番号３
０と３１、および配列番号３２と３３の組み合わせのい
ずれか１組により示されることを特徴とする、塩基配列
解析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7034715A JPH08205898A (ja) | 1995-02-01 | 1995-02-01 | 伴性無ガンマグロブリン血症に関与する遺伝子を含むｄｎａ断片およびその解析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7034715A JPH08205898A (ja) | 1995-02-01 | 1995-02-01 | 伴性無ガンマグロブリン血症に関与する遺伝子を含むｄｎａ断片およびその解析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08205898A true JPH08205898A (ja) | 1996-08-13 |
Family
ID=12422042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7034715A Pending JPH08205898A (ja) | 1995-02-01 | 1995-02-01 | 伴性無ガンマグロブリン血症に関与する遺伝子を含むｄｎａ断片およびその解析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08205898A (ja) |
-
1995
- 1995-02-01 JP JP7034715A patent/JPH08205898A/ja active Pending
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