JPH0820600A - 好中球走化性因子 - Google Patents
好中球走化性因子Info
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- JPH0820600A JPH0820600A JP6152005A JP15200594A JPH0820600A JP H0820600 A JPH0820600 A JP H0820600A JP 6152005 A JP6152005 A JP 6152005A JP 15200594 A JP15200594 A JP 15200594A JP H0820600 A JPH0820600 A JP H0820600A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chemotactic factor
- neutrophil chemotactic
- neutrophil
- seq
- amino acid
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- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 以下の性質：（１）少なくとも10-9Ｍの濃度
で、好中球の走化性を誘導する、（２）ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動により、6,400 ダルトンの分子
量の単一バンドを示す、（３）14,000単位／mg蛋白以上
の比活性を示す、を有する好中球走化性因子、およびそ
の遺伝子。 【効果】 本発明により、新規な好中球走化性因子が提
供される。本発明の好中球走化性因子は、血清、血漿や
組織液などから得られた試料中に存在する好中球走化性
因子の標準試薬等として有用である。
で、好中球の走化性を誘導する、（２）ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動により、6,400 ダルトンの分子
量の単一バンドを示す、（３）14,000単位／mg蛋白以上
の比活性を示す、を有する好中球走化性因子、およびそ
の遺伝子。 【効果】 本発明により、新規な好中球走化性因子が提
供される。本発明の好中球走化性因子は、血清、血漿や
組織液などから得られた試料中に存在する好中球走化性
因子の標準試薬等として有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な好中球走化性因
子及びその遺伝子に関する。
子及びその遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】局所感染症に対する生体防御反応におい
ては、外来性の細菌等を殺菌するため、好中球が感染部
位（炎症部位）に集積する。また、癌細胞やウイルス感
染細胞などに対する生体防御反応においては、白血球が
標的局所に動員、集積する。これらの生体防御反応にお
いては、白血球（好中球）を炎症部位や標的部位に動
員、集積させる作用、即ち、白血球の遊走性及び走化性
を誘導する作用が重要な役割を果たす。
ては、外来性の細菌等を殺菌するため、好中球が感染部
位（炎症部位）に集積する。また、癌細胞やウイルス感
染細胞などに対する生体防御反応においては、白血球が
標的局所に動員、集積する。これらの生体防御反応にお
いては、白血球（好中球）を炎症部位や標的部位に動
員、集積させる作用、即ち、白血球の遊走性及び走化性
を誘導する作用が重要な役割を果たす。
【０００３】従来より、好中球の遊走性及び走化性を誘
導する生体内物質（走化性因子）としては、補体フラグ
メントＣ５ａ（J.Biol.Chem.,253,6955-6964,1978)、ロ
イコトリエンＢ4(Praostaglandins,20,411-418,1980)、
ヒト単球由来好中球走化性因子（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,84,9233-9237,1987) 等が知られている。また、ＩＬ
−１βやＴＮＦ等の炎症性サイトカインによって刺激さ
れた細胞から産生された、いわゆるサイトカイン誘導性
好中球走化性因子の存在も確認されている（J.Biol.Che
m.264,19559-19563,1983) 。
導する生体内物質（走化性因子）としては、補体フラグ
メントＣ５ａ（J.Biol.Chem.,253,6955-6964,1978)、ロ
イコトリエンＢ4(Praostaglandins,20,411-418,1980)、
ヒト単球由来好中球走化性因子（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,84,9233-9237,1987) 等が知られている。また、ＩＬ
−１βやＴＮＦ等の炎症性サイトカインによって刺激さ
れた細胞から産生された、いわゆるサイトカイン誘導性
好中球走化性因子の存在も確認されている（J.Biol.Che
m.264,19559-19563,1983) 。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
な好中球走化性因子及びその遺伝子を提供することであ
る。
な好中球走化性因子及びその遺伝子を提供することであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に基づいて鋭意研究を行った結果、ラットにカラゲニン
空気嚢炎症を惹起させて得られた肉芽組織中に、好中球
の走化性を誘導する新規ポリペプチドである好中球走化
性因子を見い出し、これを分離精製することに成功し、
本発明を完成するに至った。
に基づいて鋭意研究を行った結果、ラットにカラゲニン
空気嚢炎症を惹起させて得られた肉芽組織中に、好中球
の走化性を誘導する新規ポリペプチドである好中球走化
性因子を見い出し、これを分離精製することに成功し、
本発明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明は、以下の性質を有する好中
球走化性因子である。 （ａ）少なくとも10-9Ｍの濃度で、好中球の走化性を誘
導する。 （ｂ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、
6,400 ダルトンの分子量の単一バンドを示す。 （ｃ）14,000単位／mg蛋白以上の比活性を示す。
球走化性因子である。 （ａ）少なくとも10-9Ｍの濃度で、好中球の走化性を誘
導する。 （ｂ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、
6,400 ダルトンの分子量の単一バンドを示す。 （ｃ）14,000単位／mg蛋白以上の比活性を示す。
【０００７】さらに、本発明は配列番号１で表されるア
ミノ酸配列を含むポリペプチドからなる好中球走化性因
子−２αである。さらに、本発明は配列番号２で表され
るアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる好中球走化
性因子−２βである。さらに、本発明は配列番号２で表
されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む好中球走
化性因子−２β遺伝子である。
ミノ酸配列を含むポリペプチドからなる好中球走化性因
子−２αである。さらに、本発明は配列番号２で表され
るアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる好中球走化
性因子−２βである。さらに、本発明は配列番号２で表
されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む好中球走
化性因子−２β遺伝子である。
【０００８】さらに、本発明は配列番号６で表される塩
基配列からなる前記好中球走化性因子−２β遺伝子であ
る。ここで、上記比活性（単位／ｍｇ）とは、ワタナベ
らの方法（Japan.J.Phamacol.,39,102,1985 ；上室と下
室をポリカーボネートフィルターで仕切られたマルチウ
ェルタイプのボイデンチェンバーを用いる方法）に従っ
て好中球の走化性を試験したときに、１分間で３×104
個のラット好中球の上室から下室への遊走を引き起こす
活性を１単位として定義されたものを意味する。
基配列からなる前記好中球走化性因子−２β遺伝子であ
る。ここで、上記比活性（単位／ｍｇ）とは、ワタナベ
らの方法（Japan.J.Phamacol.,39,102,1985 ；上室と下
室をポリカーボネートフィルターで仕切られたマルチウ
ェルタイプのボイデンチェンバーを用いる方法）に従っ
て好中球の走化性を試験したときに、１分間で３×104
個のラット好中球の上室から下室への遊走を引き起こす
活性を１単位として定義されたものを意味する。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
好中球走化性因子は、ラットカラゲニン空気嚢炎症（フ
クハラら、Biochemical Pharmacology,18,475-484,196
9)を誘起させて得られた炎症性肉芽組織（カラゲニン肉
芽）が産生するものである。カラゲニン空気嚢炎症を誘
起させるために用いられるラットとしては、Wistar系、
Sprague Dawley系、Donryu系等が挙げられる。
好中球走化性因子は、ラットカラゲニン空気嚢炎症（フ
クハラら、Biochemical Pharmacology,18,475-484,196
9)を誘起させて得られた炎症性肉芽組織（カラゲニン肉
芽）が産生するものである。カラゲニン空気嚢炎症を誘
起させるために用いられるラットとしては、Wistar系、
Sprague Dawley系、Donryu系等が挙げられる。
【００１０】そして、上記ラットの背部皮下に空気を注
射して空気嚢をつくり、翌日、カラゲニン生理食塩液を
注入して７日程飼育したラットから炎症性肉芽組織（カ
ラゲニン肉芽組織）を採取して、該組織をダルベッコ変
法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）等を用いて洗浄する。
次いで、１辺が1.0〜5.0mm程度の立方体状に細片化した
組織を培養に使用することができる。
射して空気嚢をつくり、翌日、カラゲニン生理食塩液を
注入して７日程飼育したラットから炎症性肉芽組織（カ
ラゲニン肉芽組織）を採取して、該組織をダルベッコ変
法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）等を用いて洗浄する。
次いで、１辺が1.0〜5.0mm程度の立方体状に細片化した
組織を培養に使用することができる。
【００１１】細片化した肉芽組織の培養には通常の動物
細胞を培養する培地を使用することができる。例えばＤ
ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地等が
挙げられる。また、培地には必要に応じて各種添加物、
例えば、0.1％(w/v)牛血清アルブミン、25ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ、ペニシリンＧ(0.1mg/ml)等を含有させることもで
きる。
細胞を培養する培地を使用することができる。例えばＤ
ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地等が
挙げられる。また、培地には必要に応じて各種添加物、
例えば、0.1％(w/v)牛血清アルブミン、25ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ、ペニシリンＧ(0.1mg/ml)等を含有させることもで
きる。
【００１２】培養は、ＣＯ2 インキュベーターを用いて
行われ、約５％のＣＯ2 濃度で行われる。培養温度は、
約37℃が望ましい。そして、培養開始から24時間ごとに
培養物を遠心分離してその培養上清を得、新たに培地を
交換して更に24時間培養を続ける一方、得られた培養上
清は精製出発物質とし、精製時まで−20℃以下で凍結保
存しておけばよい。
行われ、約５％のＣＯ2 濃度で行われる。培養温度は、
約37℃が望ましい。そして、培養開始から24時間ごとに
培養物を遠心分離してその培養上清を得、新たに培地を
交換して更に24時間培養を続ける一方、得られた培養上
清は精製出発物質とし、精製時まで−20℃以下で凍結保
存しておけばよい。
【００１３】ここで、精製出発物質としては、培地を３
回以上（全培養時間として72時間以上）交換して保存し
ておく場合も可能であるが、48時間培養後の２回分の保
存培地を精製出発物質とする場合が好ましい。このよう
にして得られた好中球走化性因子を含有する培養外液を
材料にして、通常の蛋白質の分離、精製に用いられる方
法により、好中球走化性因子を精製することができる。
例えば、塩析法、遠心分離操作法、各種クロマトグラフ
ィーを適宜組み合わせて好中球走化性因子を得ることが
できる。
回以上（全培養時間として72時間以上）交換して保存し
ておく場合も可能であるが、48時間培養後の２回分の保
存培地を精製出発物質とする場合が好ましい。このよう
にして得られた好中球走化性因子を含有する培養外液を
材料にして、通常の蛋白質の分離、精製に用いられる方
法により、好中球走化性因子を精製することができる。
例えば、塩析法、遠心分離操作法、各種クロマトグラフ
ィーを適宜組み合わせて好中球走化性因子を得ることが
できる。
【００１４】各種クロマトグラフィーとしては、疎水性
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフィー、逆相
クロマトグラフィーなどが挙げられる。なお、精製され
た好中球走化性因子のアミノ酸配列は、気相プロテイン
シークエンサーを用いた自動エドマン分解法によって決
定することができる。
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフィー、逆相
クロマトグラフィーなどが挙げられる。なお、精製され
た好中球走化性因子のアミノ酸配列は、気相プロテイン
シークエンサーを用いた自動エドマン分解法によって決
定することができる。
【００１５】また、精製された好中球走化性因子の分子
量については、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法を用いることにより、測定することができ
る。次に、炎症性肉芽組織から精製したｍＲＮＡをもと
にｃＤＮＡを調製するには、プライマーとしてオリゴｄ
Ｔ、ランダムプライマー等を使用し、逆転写酵素により
ｍＲＮＡをＤＮＡに変換することによりｃＤＮＡを得る
ことができる。そして、得られたｃＤＮＡを鋳型とし
て、適当なプライマーを用いてポリメラーゼ・チェイン
・リアクションを行うことができる。
量については、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法を用いることにより、測定することができ
る。次に、炎症性肉芽組織から精製したｍＲＮＡをもと
にｃＤＮＡを調製するには、プライマーとしてオリゴｄ
Ｔ、ランダムプライマー等を使用し、逆転写酵素により
ｍＲＮＡをＤＮＡに変換することによりｃＤＮＡを得る
ことができる。そして、得られたｃＤＮＡを鋳型とし
て、適当なプライマーを用いてポリメラーゼ・チェイン
・リアクションを行うことができる。
【００１６】ＰＣＲに使用するプライマーは、相同性を
有する好中球走化性因子群（Interleukin 8 family) の
ｃＤＮＡの配列中で良く保存されている塩基配列を選ん
で調製する。ＰＣＲによって得られたＤＮＡは、例えば
アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動等の通常使用される方法によって精製することがで
きる。そして、精製されたＤＮＡを微生物由来のレプリ
コンを持つ適当なベクターにつないだ後、適合する宿主
に導入することで目的とするＤＮＡをクローニングする
ことができる。
有する好中球走化性因子群（Interleukin 8 family) の
ｃＤＮＡの配列中で良く保存されている塩基配列を選ん
で調製する。ＰＣＲによって得られたＤＮＡは、例えば
アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動等の通常使用される方法によって精製することがで
きる。そして、精製されたＤＮＡを微生物由来のレプリ
コンを持つ適当なベクターにつないだ後、適合する宿主
に導入することで目的とするＤＮＡをクローニングする
ことができる。
【００１７】ベクターとしては、プラスミドベクター、
ファージベクター、酵母ベクター、ウイルスベクター等
が挙げられる。宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞
等が挙げられる。このようにしてクローニングされたＤ
ＮＡの塩基配列は、放射標識や蛍光標識を用いるジデオ
キシ法、マキサム−ギルバート法等により決定すること
ができる。そして、決定したＤＮＡの塩基配列から、そ
の配列がコードするアミノ酸配列を予測することができ
る。
ファージベクター、酵母ベクター、ウイルスベクター等
が挙げられる。宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞
等が挙げられる。このようにしてクローニングされたＤ
ＮＡの塩基配列は、放射標識や蛍光標識を用いるジデオ
キシ法、マキサム−ギルバート法等により決定すること
ができる。そして、決定したＤＮＡの塩基配列から、そ
の配列がコードするアミノ酸配列を予測することができ
る。
【００１８】好中球走化性因子の好中球遊走活性は、後
述する実施例１に記載の通り、ワタナベらのマルチウェ
ルタイプのボイデンチェンバーを用いる方法（Japan.J.
Phamacol.,39,102,1985)に従って好中球の走化性を試験
することにより測定できる。本発明の好中球走化性因子
は、各種の目的に応じた使用が可能である。例えば、血
清、血漿や組織液などラットから得られた試料中に存在
する好中球走化性因子の標準物質として用いられ得る。
すなわち、本発明の好中球走化性因子をラジオイムノア
ッセイやエンザイムイムノアッセイで定量する際の、標
準抗原として用いられ得る。
述する実施例１に記載の通り、ワタナベらのマルチウェ
ルタイプのボイデンチェンバーを用いる方法（Japan.J.
Phamacol.,39,102,1985)に従って好中球の走化性を試験
することにより測定できる。本発明の好中球走化性因子
は、各種の目的に応じた使用が可能である。例えば、血
清、血漿や組織液などラットから得られた試料中に存在
する好中球走化性因子の標準物質として用いられ得る。
すなわち、本発明の好中球走化性因子をラジオイムノア
ッセイやエンザイムイムノアッセイで定量する際の、標
準抗原として用いられ得る。
【００１９】
【実施例】以下に、本発明を実施例により更に詳しく説
明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。 〔実施例１〕 好中球走化性因子の好中球遊走誘導活性
の測定 好中球の走化性は、ワタナベらのマルチウェルタイプの
ボイデンチェンバーを用いる方法によって測定した。上
室および下室は、直径２μｍの小孔を有するポリカーボ
ネートフィルター（厚さ10μｍ，直径2.0μｍの小孔の
もの）で仕切った。上室に0.3mlのラット好中球懸濁液
(107細胞/ml)、下室に0.4mlの検査試料液をそれぞれ加
えた。ボイデンチェンバーを37℃で60分間、５％ＣＯ2
の存在下でインキュベートした後に、下室へ遊走した好
中球の数をコールターカウンターで計測した。好中球遊
走活性は、次式で計算される遊走率によって表される。 遊走率（％）＝（下室へ移動した細胞数）／（始めに上
室へ入れた細胞数）×100 尚、60分のインキュベーションを行った時に、１分間あ
たりに換算して１％（３×104）の細胞を下室へ遊走さ
せる活性を１単位とした。
明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。 〔実施例１〕 好中球走化性因子の好中球遊走誘導活性
の測定 好中球の走化性は、ワタナベらのマルチウェルタイプの
ボイデンチェンバーを用いる方法によって測定した。上
室および下室は、直径２μｍの小孔を有するポリカーボ
ネートフィルター（厚さ10μｍ，直径2.0μｍの小孔の
もの）で仕切った。上室に0.3mlのラット好中球懸濁液
(107細胞/ml)、下室に0.4mlの検査試料液をそれぞれ加
えた。ボイデンチェンバーを37℃で60分間、５％ＣＯ2
の存在下でインキュベートした後に、下室へ遊走した好
中球の数をコールターカウンターで計測した。好中球遊
走活性は、次式で計算される遊走率によって表される。 遊走率（％）＝（下室へ移動した細胞数）／（始めに上
室へ入れた細胞数）×100 尚、60分のインキュベーションを行った時に、１分間あ
たりに換算して１％（３×104）の細胞を下室へ遊走さ
せる活性を１単位とした。
【００２０】〔実施例２〕 カラゲニン肉芽組織からの
好中球走化性因子の産生 フクハラらの方法（Biochem.Phamacol.18,475-484,196
9)に従ってカラゲニン空気嚢炎症を惹起した。即ち、体
重170〜200ｇのWistar系雄性ラットの背部皮下に空気８
mlを注射して空気嚢を作製した。翌日、該空気嚢内に２
％カラゲニン生理食塩溶液（Seakem 202;Marine Colloi
d 社、NJ,USA)を注入した。
好中球走化性因子の産生 フクハラらの方法（Biochem.Phamacol.18,475-484,196
9)に従ってカラゲニン空気嚢炎症を惹起した。即ち、体
重170〜200ｇのWistar系雄性ラットの背部皮下に空気８
mlを注射して空気嚢を作製した。翌日、該空気嚢内に２
％カラゲニン生理食塩溶液（Seakem 202;Marine Colloi
d 社、NJ,USA)を注入した。
【００２１】尚、カラゲニン溶液は110℃で15分間滅菌
し、約50℃まで冷えた時にペニシリンＧ、ストレプトマ
イシンをそれぞれ0.1ml/mlの割合で加えたものを使用し
た。カラゲニン生理食塩溶液を注入した後、ラットを７
日間飼育して炎症性肉芽組織（カラゲニン肉芽組織）を
形成させた。次いで、該カラゲニン肉芽組織を採取し、
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）で洗浄し
た。
し、約50℃まで冷えた時にペニシリンＧ、ストレプトマ
イシンをそれぞれ0.1ml/mlの割合で加えたものを使用し
た。カラゲニン生理食塩溶液を注入した後、ラットを７
日間飼育して炎症性肉芽組織（カラゲニン肉芽組織）を
形成させた。次いで、該カラゲニン肉芽組織を採取し、
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）で洗浄し
た。
【００２２】洗浄後のカラゲニン肉芽組織組織を１×１
×１mm程度の立方体状に細片化したのち、２日間ＤＭＥ
Ｍ中で培養した（37℃，５％ＣＯ2）。ＤＭＥＭの量は
組織１断片あたり４mlとした。この時使用するＤＭＥＭ
には、0.1％(v/w)牛血清アルブミン、25mＭのＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液、ペニシリンＧ(0.1mg/ml)、ストレプトマイシ
ン(0.1mg/ml)が含まれる。
×１mm程度の立方体状に細片化したのち、２日間ＤＭＥ
Ｍ中で培養した（37℃，５％ＣＯ2）。ＤＭＥＭの量は
組織１断片あたり４mlとした。この時使用するＤＭＥＭ
には、0.1％(v/w)牛血清アルブミン、25mＭのＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液、ペニシリンＧ(0.1mg/ml)、ストレプトマイシ
ン(0.1mg/ml)が含まれる。
【００２３】培地は１日ごとに交換し、この培地を集め
（1,500rpm、20分の遠心分離を行って培養上清を回収し
た）、精製時まで−30℃で凍結保存した。２日間の培養
で得られた培養上清は7,000mlであった。
（1,500rpm、20分の遠心分離を行って培養上清を回収し
た）、精製時まで−30℃で凍結保存した。２日間の培養
で得られた培養上清は7,000mlであった。
【００２４】〔実施例３〕 好中球走化性因子の精製 実施例１に記載した方法で好中球走化性因子の好中球走
化活性を測定すると共に、実施例２で得られた培養上清
より好中球走化性因子を精製した。以下の操作は、逆相
ＨＰＬＣを除きすべて４℃にて行った。
化活性を測定すると共に、実施例２で得られた培養上清
より好中球走化性因子を精製した。以下の操作は、逆相
ＨＰＬＣを除きすべて４℃にて行った。
【００２５】培養上清7,000mlに硫酸アンモニウムを加
え、80％飽和とした。遠心して沈殿物を集め、これを50
mＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）に溶解した。尚、こ
の緩衝液には他に３mＭフェニルメタンスルホニルフル
オリド（ phenylmethanesulfonyl fluoride）、 30mＭ
ＥＤＴＡ、10mＭ Ｎ−エチルマレイミド（N-ethylmalei
mide）が含まれている。
え、80％飽和とした。遠心して沈殿物を集め、これを50
mＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）に溶解した。尚、こ
の緩衝液には他に３mＭフェニルメタンスルホニルフル
オリド（ phenylmethanesulfonyl fluoride）、 30mＭ
ＥＤＴＡ、10mＭ Ｎ−エチルマレイミド（N-ethylmalei
mide）が含まれている。
【００２６】前記培養上清の沈殿物を溶解した50mＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）を透析チューブに入れ、
膜外液に対して24時間透析を行った。次にヘパリン−セ
ファロース（heparin-Sepharose)ＣＬ−６Ｂカラム（2.
5×17cm；ファルマシア社製）を通し、目的物をカラム
に結合させた。直線的に塩濃度を1.5Ｍまで上昇させた
とき、0.7Ｍから1.2Ｍの塩濃度で溶出する画分を回収し
た。この画分を50mＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.2)−2
0mＭ塩化ナトリウム緩衝液に対して透析を行った後、同
じ緩衝液で平衡化したＣＭ−セファデックス（Sephade
x) Ｃ−25カラム（2.5×16cm；ファルマシア社製）に通
した。緩衝液でカラムを洗浄したのち、塩濃度を1.5Ｍ
まで直線的に上昇させたとき、0.2〜0.6Ｍの塩濃度で溶
出する画分を回収した。この画分を0.02Ｍ酢酸アンモニ
ウム溶液に透析した後、凍結乾燥した。６Ｍグアニジン
塩酸塩溶液に溶解し、C-18 ODS (Tosoh,0.45×25cm）カ
ラム（0.05％トリフルオロ酢酸溶液で平衡化したもの）
に注入し、アセトニトリル濃度を０から64％まで直線的
に増加させた。この時の流速は0.8ml/minで行った。
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）を透析チューブに入れ、
膜外液に対して24時間透析を行った。次にヘパリン−セ
ファロース（heparin-Sepharose)ＣＬ−６Ｂカラム（2.
5×17cm；ファルマシア社製）を通し、目的物をカラム
に結合させた。直線的に塩濃度を1.5Ｍまで上昇させた
とき、0.7Ｍから1.2Ｍの塩濃度で溶出する画分を回収し
た。この画分を50mＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.2)−2
0mＭ塩化ナトリウム緩衝液に対して透析を行った後、同
じ緩衝液で平衡化したＣＭ−セファデックス（Sephade
x) Ｃ−25カラム（2.5×16cm；ファルマシア社製）に通
した。緩衝液でカラムを洗浄したのち、塩濃度を1.5Ｍ
まで直線的に上昇させたとき、0.2〜0.6Ｍの塩濃度で溶
出する画分を回収した。この画分を0.02Ｍ酢酸アンモニ
ウム溶液に透析した後、凍結乾燥した。６Ｍグアニジン
塩酸塩溶液に溶解し、C-18 ODS (Tosoh,0.45×25cm）カ
ラム（0.05％トリフルオロ酢酸溶液で平衡化したもの）
に注入し、アセトニトリル濃度を０から64％まで直線的
に増加させた。この時の流速は0.8ml/minで行った。
【００２７】その結果、好中球遊走活性を有する４つの
ピーク（Ｐ−１，Ｐ−２，Ｐ−３，Ｐ−４）が溶出した
（図１参照）。このうち、２番目に溶出したＰ−２及び
４番目に溶出したＰ−４に好中球走化性因子が高純度で
含まれていた。以下、Ｐ−２及びＰ−４に溶出した好中
球走化性因子を、それぞれ「好中球走化性因子−２
α」、「好中球走化性因子−２β」と称する。
ピーク（Ｐ−１，Ｐ−２，Ｐ−３，Ｐ−４）が溶出した
（図１参照）。このうち、２番目に溶出したＰ−２及び
４番目に溶出したＰ−４に好中球走化性因子が高純度で
含まれていた。以下、Ｐ−２及びＰ−４に溶出した好中
球走化性因子を、それぞれ「好中球走化性因子−２
α」、「好中球走化性因子−２β」と称する。
【００２８】最終的に得られた精製好中球走化性因子−
２α及び好中球走化性因子−２βは、共に14,000単位/m
g蛋白の比活性を有していた。また、両物質は、10-9〜1
0-7Ｍの低濃度で好中球の遊走を誘導した（図２参
照）。図２において、「●」は好中球走化性因子−２
α、「○」は好中球走化性因子−２βの好中球遊走活性
を示す。
２α及び好中球走化性因子−２βは、共に14,000単位/m
g蛋白の比活性を有していた。また、両物質は、10-9〜1
0-7Ｍの低濃度で好中球の遊走を誘導した（図２参
照）。図２において、「●」は好中球走化性因子−２
α、「○」は好中球走化性因子−２βの好中球遊走活性
を示す。
【００２９】〔実施例４〕 ＳＤＳポリアクリルアミド
電気泳動 SchaggerとVon Jagowの方法(Anal.Biochem.166,368-37
9,1987) に従って9.6％から16.0％迄のアクリルアミド
濃度の不連続スラブゲルを用いて、好中球走化性因子−
２α及び好中球走化性因子−２βの電気泳動を行った結
果、共に分子量6,400ダルトンの位置に単一バンドが確
認された（図３参照）。図３中、Ｐ−２及びＰ−４で示
されるレーンのバンドは、それぞれ好中球走化性因子−
２α及び好中球走化性因子−２βに対応する。また、Ｍ
は標準分子量マーカーを表す。
電気泳動 SchaggerとVon Jagowの方法(Anal.Biochem.166,368-37
9,1987) に従って9.6％から16.0％迄のアクリルアミド
濃度の不連続スラブゲルを用いて、好中球走化性因子−
２α及び好中球走化性因子−２βの電気泳動を行った結
果、共に分子量6,400ダルトンの位置に単一バンドが確
認された（図３参照）。図３中、Ｐ−２及びＰ−４で示
されるレーンのバンドは、それぞれ好中球走化性因子−
２α及び好中球走化性因子−２βに対応する。また、Ｍ
は標準分子量マーカーを表す。
【００３０】〔実施例５〕 好中球走化性因子−２αの
一次構造の決定 好中球走化性因子−２αをＶ８プロテアーゼにて断片化
し、逆相ＨＰＬＣにて各部分ペプチドを分取した。ペプ
チドを470A気相プロテインシーケンサーを用いた自動エ
ドマン分解を行いアミノ酸配列を決定した。その結果、
明らかとなった好中球走化性因子−２αの一次構造を配
列番号１に示す。
一次構造の決定 好中球走化性因子−２αをＶ８プロテアーゼにて断片化
し、逆相ＨＰＬＣにて各部分ペプチドを分取した。ペプ
チドを470A気相プロテインシーケンサーを用いた自動エ
ドマン分解を行いアミノ酸配列を決定した。その結果、
明らかとなった好中球走化性因子−２αの一次構造を配
列番号１に示す。
【００３１】〔実施例６〕 カルボキシペプチダーゼＰ
による好中球走化性因子−２αのＣ末端アミノ酸の解析 １nmolの好中球走化性因子−２αとカルボキシペプチダ
ーゼＰ ２μgを0.2mlの0.05Ｍクエン酸緩衝液に溶解
し、30℃でインキュベーションを行った。12時間後、５
μLの５％酢酸溶液を加えて反応を止め、乾燥させた。
加水分解されて遊離してくるＣ末端アミノ酸をフェニル
イソチオシアネート（phenylisothiocyanate）と反応さ
せ、フェニルチオカルバモイル（phenylthiocarbamoy
l）誘導体に変換した。誘導体の逆相ＨＰＬＣカラムか
らの溶出時間を標準物質のそれと比較した結果、遊離し
たアミノ酸はセリンであることが判明した。従って、好
中球走化性因子−２αのＣ末端アミノ酸はセリンである
ことがわかった。
による好中球走化性因子−２αのＣ末端アミノ酸の解析 １nmolの好中球走化性因子−２αとカルボキシペプチダ
ーゼＰ ２μgを0.2mlの0.05Ｍクエン酸緩衝液に溶解
し、30℃でインキュベーションを行った。12時間後、５
μLの５％酢酸溶液を加えて反応を止め、乾燥させた。
加水分解されて遊離してくるＣ末端アミノ酸をフェニル
イソチオシアネート（phenylisothiocyanate）と反応さ
せ、フェニルチオカルバモイル（phenylthiocarbamoy
l）誘導体に変換した。誘導体の逆相ＨＰＬＣカラムか
らの溶出時間を標準物質のそれと比較した結果、遊離し
たアミノ酸はセリンであることが判明した。従って、好
中球走化性因子−２αのＣ末端アミノ酸はセリンである
ことがわかった。
【００３２】〔実施例７〕 好中球走化性因子−２βの
Ｎ末端アミノ酸配列の決定 実施例３で得られた好中球走化性因子−２βを逆相ＨＰ
ＬＣにて各部分ペプチドを分取した。各ペプチドを470
Ａ気相プロテインシーケンサーを用いた自動エドマン分
解を行い、アミノ酸配列を決定した。その結果、明らか
となった好中球走化性因子−２βのＮ末端35残基のアミ
ノ酸配列を配列番号３に示す。
Ｎ末端アミノ酸配列の決定 実施例３で得られた好中球走化性因子−２βを逆相ＨＰ
ＬＣにて各部分ペプチドを分取した。各ペプチドを470
Ａ気相プロテインシーケンサーを用いた自動エドマン分
解を行い、アミノ酸配列を決定した。その結果、明らか
となった好中球走化性因子−２βのＮ末端35残基のアミ
ノ酸配列を配列番号３に示す。
【００３３】〔実施例８〕 好中球走化性因子−２βの
クローニング及びｃＤＮＡの塩基配列の決定並びに好中
球走化性因子−２βの一次構造の推定 滅菌したproteose peptone (Difco Laboratories) の10
％（W/V)ＰＢＳ溶液をWistar雄ラットの腹腔に33mg/kg
投与した。４日後に腹腔に浸潤した細胞を回収し、洗浄
後牛胎児血清を10％の濃度で含むＤＭＥＭ培地に細胞を
懸濁した。該細胞を細胞培養用プラスチックシャーレに
蒔き、炭酸培養器中で５時間の培養を行った後、シャー
レに付着しなかった細胞を洗浄除去した。次いで、大腸
菌のエンドトキシン（Difco Laboratories) を３μg/ml
及び牛血清アルブミンを0.1％(V/W) の割合で加えたＤ
ＭＥＭ培地を前記シャーレに加えて、更に15時間の培養
を行った。
クローニング及びｃＤＮＡの塩基配列の決定並びに好中
球走化性因子−２βの一次構造の推定 滅菌したproteose peptone (Difco Laboratories) の10
％（W/V)ＰＢＳ溶液をWistar雄ラットの腹腔に33mg/kg
投与した。４日後に腹腔に浸潤した細胞を回収し、洗浄
後牛胎児血清を10％の濃度で含むＤＭＥＭ培地に細胞を
懸濁した。該細胞を細胞培養用プラスチックシャーレに
蒔き、炭酸培養器中で５時間の培養を行った後、シャー
レに付着しなかった細胞を洗浄除去した。次いで、大腸
菌のエンドトキシン（Difco Laboratories) を３μg/ml
及び牛血清アルブミンを0.1％(V/W) の割合で加えたＤ
ＭＥＭ培地を前記シャーレに加えて、更に15時間の培養
を行った。
【００３４】培養終了後、細胞に含まれるＲＮＡをＲＮ
ＡzorＢ（Biotecx Laboratories)を用いて抽出した。得
られたＲＮＡを12から18塩基対のoligo(dT) プライマー
とSuperscript 逆転写酵素（Gibco)を用いて42℃で20分
間反応させてｃＤＮＡを得た。該ｃＤＮＡを鋳型とし
て、以下の２種類のプライマーを用いてＰＣＲを行っ
た。即ち、５’側のプライマーには配列番号４に示され
た塩基配列のもの、３’側のプライマーには配列番号５
に示された塩基配列のものを用いた。
ＡzorＢ（Biotecx Laboratories)を用いて抽出した。得
られたＲＮＡを12から18塩基対のoligo(dT) プライマー
とSuperscript 逆転写酵素（Gibco)を用いて42℃で20分
間反応させてｃＤＮＡを得た。該ｃＤＮＡを鋳型とし
て、以下の２種類のプライマーを用いてＰＣＲを行っ
た。即ち、５’側のプライマーには配列番号４に示され
た塩基配列のもの、３’側のプライマーには配列番号５
に示された塩基配列のものを用いた。
【００３５】20mＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.8 ）、1
0mＭ塩化カリウム、10mＭ硫酸アンモニウム、0.1 ％(V/
W) トリトンＸ−100、ＢＳＡ（１mg/ml)及びｄＮＴＰ
（0.33mＭ）を含む溶液にVent ＤＮＡポリメラーゼ（Ne
w England Biolabs)を溶解し、更に、前記２種類のプラ
イマーをそれぞれ6.7μＭずつ溶解させ反応溶液とし
た。反応条件は、94℃１分間、55℃１分間及び72℃２分
間の連続した反応を１サイクルとしてこれを30サイクル
行った。
0mＭ塩化カリウム、10mＭ硫酸アンモニウム、0.1 ％(V/
W) トリトンＸ−100、ＢＳＡ（１mg/ml)及びｄＮＴＰ
（0.33mＭ）を含む溶液にVent ＤＮＡポリメラーゼ（Ne
w England Biolabs)を溶解し、更に、前記２種類のプラ
イマーをそれぞれ6.7μＭずつ溶解させ反応溶液とし
た。反応条件は、94℃１分間、55℃１分間及び72℃２分
間の連続した反応を１サイクルとしてこれを30サイクル
行った。
【００３６】反応終了後のＰＣＲ産物を、1.5％低温融
解アガロースゲル（low-temperature-melting agarose
gel)を用いた電気泳動により精製し、精製したＰＣＲ断
片を直接プラスミドベクターpBluescript KS+(Stratage
ne)の制限酵素Ｈinc II部位に導入した。得られた遺伝
子の塩基配列の決定はsequenase(US Biochemicals)を用
いて行った。
解アガロースゲル（low-temperature-melting agarose
gel)を用いた電気泳動により精製し、精製したＰＣＲ断
片を直接プラスミドベクターpBluescript KS+(Stratage
ne)の制限酵素Ｈinc II部位に導入した。得られた遺伝
子の塩基配列の決定はsequenase(US Biochemicals)を用
いて行った。
【００３７】その結果、配列番号６に示す塩基配列が決
定された。このｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列も併
せて配列番号６に示す。この結果より、好中球走化性因
子−２βの一次構造は、配列番号６に示す塩基配列の97
番目のアルギニンから300番目のロイシンである68個の
アミノ酸配列であることが明らかになった。好中球走化
性因子−２βの一次構造を表すアミノ酸配列を配列番号
２に示す。
定された。このｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列も併
せて配列番号６に示す。この結果より、好中球走化性因
子−２βの一次構造は、配列番号６に示す塩基配列の97
番目のアルギニンから300番目のロイシンである68個の
アミノ酸配列であることが明らかになった。好中球走化
性因子−２βの一次構造を表すアミノ酸配列を配列番号
２に示す。
【００３８】尚、好中球走化性因子−２β遺伝子が組み
込まれたプラスミドＤＮＡを保有する株は「CINC-2β／
E. coli J M109」と称し、通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１４３７７として
寄託されている。
込まれたプラスミドＤＮＡを保有する株は「CINC-2β／
E. coli J M109」と称し、通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１４３７７として
寄託されている。
【００３９】
【発明の効果】本発明により、新規な好中球走化性因子
が提供される。本発明の新規な好中球走化性因子は、血
清、血漿や組織液などから得られた試料中に存在する好
中球走化性因子の標準試薬等として用いられ得る。
が提供される。本発明の新規な好中球走化性因子は、血
清、血漿や組織液などから得られた試料中に存在する好
中球走化性因子の標準試薬等として用いられ得る。
【００４０】
配列番号：１ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Arg Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Lys Thr Leu Pro Arg Val Asp Phe 1 5 10 15 Glu Asn Ile Gln Ser Leu Thr Val Thr Pro Pro Gly Pro His Cys Thr 20 25 30 Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asp Gly Gln Glu Val Cys Leu 35 40 45 Asn Pro Gln Ala Pro Arg Leu Gln Lys Ile Ile Gln Lys Leu Leu Lys 50 55 60 Ser Asp Lys Ser 68 65
【００４１】配列番号：２ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Arg Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Lys Thr Leu Pro Arg Val Asp Phe 1 5 10 15 Glu Asn Ile Gln Ser Leu Thr Val Thr Pro Pro Gly Pro His Cys Thr 20 25 30 Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asp Gly Gln Glu Val Cys Leu 35 40 45 Asn Pro Gln Ala Pro Arg Leu Gln Lys Ile Ile Gln Lys Leu Leu Lys 50 55 60 Ser Pro Ser Leu 68 65
【００４２】配列番号：３ 配列の長さ：３５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Arg Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Lys Thr Leu Pro Arg Val Asp Phe 1 5 10 15 Glu Asn Ile Gln Ser Leu Thr Val Thr Pro Pro Gly Pro His Cys Thr 20 25 30 Gln Thr Glu 35
【００４３】配列番号：４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GAGCTCACAC TTCAGCCTAG CG 22
【００４４】配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TACGAGGAAG ACATAAAATG T 21
【００４５】配列番号：６ 配列の長さ：６７４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： CC ATG GCC CCT CCC ACC CGC CGG CTC CTC AAT GCT GCA CTG CTT CTG 47 Met Ala Pro Pro Thr Arg Arg Leu Leu Asn Ala Ala Leu Leu Leu -30 -25 -20 CTG CTT CTG CTG ATG GCC ACC AGC CAC CAG CCT TCA GGG ACT GTT GTG 95 Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Ser His Gln Pro Ser Gly Thr Val Val -15 -10 -5 GCC CGT GAG CTG CGC TGT CAG TGC CTG AAG ACC CTA CCA AGG GTT GAT 143 Ala Arg Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Lys Thr Leu Pro Arg Val Asp 1 5 10 15 TTT GAG AAC ATC CAG AGC TTG ACG GTG ACC CCT CCA GGA CCG CAC TGC 191 Phe Glu Asn Ile Gln Ser Leu Thr Val Thr Pro Pro Gly Pro His Cys 20 25 30 ACC CAG ACA GAA GTC ATA GCC ACT CTC AAG GAT GGT CAA GAA GTT TGT 239 Thr Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asp Gly Gln Glu Val Cys 35 40 45 CTC AAC CCT CAA GCT CCC AGG CTT CAG AAA ATC ATC CAG AAG TTA CTG 287 Leu Asn Pro Gln Ala Pro Arg Leu Gln Lys Ile Ile Gln Lys Leu Leu 50 55 60 AAG AGC CCC TCC CTG TGA 305 Lys Ser Pro Ser Leu 65 68 CACTGAAGAG TTACGATGTC AGTGCATTCA AATAACGTCC GAGTCGATCC CTTGCAAATT 365 CATTAAAACC ATCGAGGTGA TATACGAGAA TATTTACTGC AACAGAATGG AAGTGATAGC 425 AGTGCTAAGA GACGGGAATG CAATTTGTTT GCATCCGAAT TCTACGTGCG TGAGGACTCT 485 TATCGACAAC ATTCCTAGCA GACCTTTCAT ACCTAAGGAC TACGCATCAG CGAACAATCT 545 ACGTGGAATG AAGTTTATGT ACAGTGTTGA GTTTGAAAAG CTCCTATATC TTTCATTTAT 605 GGAGCCTCAG GACGGATAAT GGCGCCATGC AGCCTTTTAC TGACTGACAG ACTACCCACA 665 GGTTGCTTA 674
【図１】逆相ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図２】好中球の遊走活性を示す図である。
【図３】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果
を示す図である。
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】 以下の性質を有する好中球走化性因子： （１）少なくとも10-9Ｍの濃度で、好中球の走化性を誘
導する。 （２）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、
6,400 ダルトンの分子量の単一バンドを示す。 （３）14,000単位／mg蛋白以上の比活性を示す。 - 【請求項２】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
むポリペプチドからなる好中球走化性因子−２α。 - 【請求項３】 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含
むポリペプチドからなる好中球走化性因子−２β。 - 【請求項４】 配列番号２で表されるアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡを含む好中球走化性因子−２β遺伝子。 - 【請求項５】 配列番号６で表される塩基配列からなる
請求項４記載の好中球走化性因子−２β遺伝子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6152005A JPH0820600A (ja) | 1994-07-04 | 1994-07-04 | 好中球走化性因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6152005A JPH0820600A (ja) | 1994-07-04 | 1994-07-04 | 好中球走化性因子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0820600A true JPH0820600A (ja) | 1996-01-23 |
Family
ID=15530991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6152005A Pending JPH0820600A (ja) | 1994-07-04 | 1994-07-04 | 好中球走化性因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0820600A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001066734A1 (fr) * | 2000-03-07 | 2001-09-13 | Japan Tobacco Inc, | Polypeptides capables le pouvoir de stimuler les neutrophiles |
-
1994
- 1994-07-04 JP JP6152005A patent/JPH0820600A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001066734A1 (fr) * | 2000-03-07 | 2001-09-13 | Japan Tobacco Inc, | Polypeptides capables le pouvoir de stimuler les neutrophiles |
| US7285618B1 (en) | 2000-03-07 | 2007-10-23 | Japan Tobacco Inc. | Polypeptides having neutrophil stimulating activity |
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