JPH08214873A - 新規セグメント細菌の培養方法、継代方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 新規セグメント細菌の培養方法、継代方法を
提供する。 【構成】 動物の小腸上皮細胞を採取し、クロロホルム
処理した後、無菌の同種の動物に無菌的に投与し、一定
期間無菌的に飼育し、次いで、この動物の糞便を採取
し、再度、新たな無菌の同種の動物に、無菌的に投与
し、一定期間無菌的に飼育し、さらに、必要に応じて、
この糞便採取および新たな動物への無菌的投与操作を数
度繰り返した後に、動物が糞便中の唯一の細菌として、
セグメント細菌を有していることを確認する、培養、継
代方法。 【効果】 動物の腸内に常在し、各種生理作用を有する
セグメント細菌の単離方法を提供することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、腸粘膜における生体防
御機構の増強に関係し、各種の生理活性作用を有する新
規腸内細菌の培養、継代方法に関するものである。さら
に詳しくは、本発明は、マウス等の特定の動物の小腸上
皮細胞を無菌の同種の動物に無菌的に投与し、飼育する
操作を繰り返すことを特徴とする、従来、その培養、継
代方法および単離方法が全く確立されていなかったセグ
メント細菌の単離方法および培養、継代方法、該セグメ
ント細菌を唯一の腸内細菌として有する動物およびその
作出方法等に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ある種の腸内細菌、例えば、乳酸菌やビ
フィズス菌が、生体の健康維持に関与していることは、
従来より研究されており、各種の成果が報告されている
ところである。また、最近、ある特定のビフィズス菌
が、腸管免疫に関係するＩｇＡの産生を増強し、生体防
御機能の増強に寄与していることも見出されている。一
方、古くより、動物の腸内には、繊維状の形態的特徴を
有するセグメント細菌が広く常在することが知られてい
る。しかしながら、このいわゆるセグメント細菌を純粋
培養する方法の確立がいまだ達成されておらず、その性
質や、分類学上の位置など、その詳細については何も分
かっていない状況にあった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】このような状況下にあ
って、本発明者らは、上記セグメント細菌に関する研究
を鋭意積み重ねる中で、該セグメント細菌およびその有
用性に関する各種の知見を得ることに成功して、本発明
を完成するに至ったものであり、腸粘膜における生体防
御機構の増強に関係し、各種の生理活性作用を有するセ
グメント細菌を単離し、その純粋培養方法、継代方法を
確立し、該セグメント細菌の諸性質、有用性等の検討を
行うことを可能とすることが、本発明の目的である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明者らは、ま
ず、該セグメント細菌は、有胞子細菌であると考え、そ
の単離方法を種々検討した。また、該セグメント細菌
は、生体外では、培養することが不可能であるので、ｉ
ｎ ｖｉｖｏにおける培養方法を確立することを検討し
た。また、真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの共通配列（ユ
ニバーサルプライマー）をプライマーとして利用するＰ
ＣＲ法により、該セグメント細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを
単離し、その配列を特定し、その適当な部分配列に相補
的なＤＮＡ配列等をプローブとして用いることにより、
該セグメント細菌の検出方法を確立することを検討し、
また、この方法を用いて、該セグメント細菌が単離され
ていること、純粋に培養されていることの確認を試み
た。

【０００５】その結果、該セグメント細菌の単離方法、
純粋培養方法、継代方法を確立することに成功した。ま
た、該セグメント細菌を唯一の腸内細菌として有する動
物の作出方法を確立した。また、該セグメント細菌が、
配列表の配列番号１の配列式（以下、配列式（Ｉ）と記
載することがある）で示されるＲＮＡ配列を１６Ｓ ｒ
ＲＮＡの配列として有することを明らかにした。

【０００６】該セグメント細菌は、特定の動物の小腸上
皮細胞を採取し、無菌の同種の動物に無菌的に投与し、
飼育する操作を繰り返すことにより単離することができ
る。該セグメント細菌を唯一の腸内微生物として有して
いる動物は、無菌動物に、該セグメント細菌を無菌的に
投与することにより、作出することができる。

【０００７】該セグメント細菌は、動物体内を生育条件
として必須とするので、現行の寄託制度のもとでは、寄
託することが不可能であるが、出願人は、ヤクルト本社
中央研究所において、該セグメント細菌および作出動物
を、厳密な管理下に、保存しており、必要な場合はいつ
でも提供する用意がある。

【０００８】該セグメント細菌は、生体内、特に、腸管
において種々の生理作用を発現する作用を有しており、
該セグメント細菌の培養および継代方法を確立すること
は、該セグメント細菌の生理作用に基づく各種の用途を
確立する上で有用である。

【０００９】以下、詳細に本発明を説明する。 （セグメント細菌の単離方法）本発明においては、例え
ば、無菌マウス等の無菌動物を利用して、セグメント細
菌の単離を行うことができる。即ち、無菌マウスを例に
して説明すると、例えば、小腸の有胞子細菌をターゲッ
トとして、まず、マウス小腸の上皮細胞をエチレンジア
ミンテトラアセテート溶液で遊離させ、次いで、３％ク
ロロホルムで処理する。次いで、この細胞を、滅菌リン
酸緩衝液含有生理食塩水で十分に洗浄した後、無菌マウ
スに経口投与する。この無菌マウスは、無菌アイソレー
ター内で飼育し、投与１月後に糞便を採取する。この糞
便を滅菌ＰＢＳ溶液で段階希釈し、種々の希釈液を、再
度、新たな無菌マウスに経口投与し、無菌アイソレータ
ー内で飼育する。

【００１０】さらに、例えば、１月後、上記無菌マウス
の糞便を採取し、顕微鏡観察、およびＥＧ培地、ＴＳＡ
培地により、好気的、嫌気的な条件下で培養し、その他
の細菌が検出されないことを確認し、糞便中にセグメン
ト細菌しか存在しないことを確認することによって、セ
グメント細菌を単離することができる。本発明は、上記
方法に限らず、それと同効の方法により同様にして実施
することが可能であり、また、上記無菌マウスに限ら
ず、他の動物についても同様に適用し得るものである。

【００１１】（セグメント細菌単独定着動物の作出方
法）上記セグメント細菌を単独定着した動物の作出は、
好適には、以下のようにして行うことができる。即ち、
無菌マウスを例として説明すると、例えば、通常飼育環
境のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）を断頭放血して開腹し、小
腸上皮細胞を採取することを目的として、腸を取り出し
切り開き、ＰＢＳで内容物を洗浄する。小腸を５ｍｍに
切り刻み、０．４５ｍＭ ジチオスレイトール（ｄｉｔ
ｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含むＨ２３８７培地２０ｍ
ｌを加え、２５℃で５分毎に３回洗浄する。次に、２ｍ
ＭＥＤＴＡを添加した上記培地に変えて３７℃で１０分
毎に、３回振とうする。その時の腸上皮細胞を含む上部
液を集めて１５００ｒｐｍ、５分の遠心を行う。沈降物
をＰＢＳで洗浄後、同様の条件で遠心し、沈降物に嫌気
希釈液を加え懸濁する。上記したように、本発明におい
ては、動物の小腸上皮細胞を採取することが重要であ
る。

【００１２】次いで、全量に対して、例えば、３％のク
ロロホルムを加え、３０分ボルテックスミキサーでよく
混合して、３７℃で、１時間放置した後、ＣＯ₂ ガスを
３０分通じクロロホルムを除く。クロロホルム処理した
懸濁液２００μｌ、即ち、セグメント細菌をおよそ５０
個含むように無菌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に経口投与す
る。投与後、例えば、３．６．９．１３日後に糞便の塗
抹標本を作製し、セグメント細菌の定着を確認する。

【００１３】マウス糞便中の生菌数は、例えば、次のよ
うにして検出することができる。即ち、ＥＧ平板用いて
嫌気グローブボックス内で４〜７日間、またはＴＳＡ平
板を用いて好気条件下で１〜２日間、３７℃で培養する
ことにより、それぞれ嫌気性菌、好気性菌の検出を行
う。また、糞便のグラム染色標本を作製し、直接鏡検に
よる菌数測定を行う。

【００１４】上記方法により採取したセグメント細菌お
よびバチルス菌等が定着したマウスの糞便を、段階希釈
し、再度、新たな無菌マウスに経口投与し、無菌条件下
で飼育することにより、みかけ上、セグメント細菌以外
の菌が検出されない、セグメント細菌単独定着マウスを
得ることができることが確認されたが、本発明は、該方
法に限らず、それと同効の方法により、同様にして、セ
グメント細菌の単独定着マウスが作出されることが確認
された。

【００１５】なお、このマウスは、後記するように、糞
便を材料として作製したセグメント細菌に由来する１６
Ｓ ｒＲＮＡの一部配列を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブ
リダイゼーションの結果からも、一種類のセグメント細
菌の単独定着マウスであることが証明された。

【００１６】（セグメント細菌の培養、継代方法）上記
セグメント細菌は、無菌マウスの小腸内で、単離された
状態で存在しており、該マウスの小腸内容物、即ち、小
腸上皮細胞を無菌的に採取し、別の無菌マウスに経口投
与し、これを無菌的に飼育することで、培養し、継代す
ることが可能である。該セグメント細菌の培養、継代方
法は、無菌マウスに限らず、他の動物についても同様に
実施することが可能である。また、その小腸内容物をア
ンプルに密封し、凍結保存することで、該セグメント細
菌（以下、ＳＦＢ（Ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｆｉｌａｍｅ
ｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉａ）と記載することがあ
る）を長期保存することが可能である。なお、上記によ
り、単離された該セグメント細菌は、生体外で培養する
ための有効な培養方法が確立されておらず、動物体内を
生育条件として必須とするので、現行の寄託制度のもと
では寄託機関に寄託することが不可能であるので、株式
会社ヤクルト本社中央研究所において、分譲可能な状態
に保存されており、必要に応じていつでも提供できるよ
うになっている。

【００１７】（１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の決定）次に、上
記セグメント細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの配列の決定を行
った。即ち、上記により作出した、該セグメント細菌の
みを腸内に有するマウスの糞便を採取し、滅菌水に懸濁
し、糞便液とし、これを溶菌酵素アクロモペプチダーゼ
（商品名）で処理し、糞便液中の細菌を溶菌した。一
方、真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの配列の共通配列（ユ
ニバーサルプライマー）をプライマーとして用いるＰＣ
Ｒ法を行うことにより、該セグメント細菌の１６Ｓ ｒ
ＲＮＡを増幅し、これを大腸菌によるクローニングを経
て１６個の組み換えプラスミドとして、単離し、該１６
Ｓ ｒＲＮＡの全遺伝子配列を図８〜９に示される配列
式（１）のように決定した。

【００１８】（ＤＮＡプローブの作製とセグメント細菌
の検出）次に、該１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子配列から選
択したＮｏ．９６４からＮｏ．９８８およびＮｏ．１２
３１からＮｏ．１２５５部分（２か所）に対応する下記
の配列式（２）および（３）で示されるＤＮＡ配列を合
成し、これをプローブとして用いて、該マウスの糞便液
中のセグメント細菌と反応させた。その結果、後に示さ
れるように、全セグメント細菌と反応し、前記の単離操
作が成功していることが確認された。 ５′ＴＣＡＴＴＡＣＡＡＧＧＴＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＡＴＧ （２） ５′ＡＴＡＡＧＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＴＡＴＣＡＣＴＡＧＣ （３）

【００１９】（セグメント細菌の生理作用）本発明に係
るセグメント細菌を無菌マウスに経口投与し、その生理
作用を調べた。即ち、投与マウスの腸上皮細胞間リンパ
球（ＩＥＬ）細胞数、その表現型、また、細胞障害活
性、腸内容物におけるＩｇＡ量、小腸上皮細胞（ＩＥ
Ｃ）の分裂指数、組織適合複合体クラスＩＩ分子の発
現、糖脂質アシアロＧＭ１のフコシル化、ゴブレット細
胞の比率、二糖類分解酵素活性等を測定した。その結
果、後記する実施例に具体的に記載したように、該セグ
メント細菌は、腸粘膜免疫系への特有の効果、腸上皮細
胞における生体防因子への特定の効果等を有するきわめ
て有用なものであることが、確認された。なお、上記セ
グメント細菌の有する上記各種生理活性作用は、これま
でに報告された例は見当たらず、本発明者らが見出した
新規なものである。

【００２０】

【実施例】次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説
明するが、本発明は、該実施例によって限定されるもの
ではない。 実施例１ １．セグメント細菌の単離 （１）セグメント細菌（ＳＦＢ）の単独定着化 通常飼育環境のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）を断頭放血して
開腹し、小腸上皮細胞を含む腸を取り出し切り開き、Ｐ
ＢＳで内容物を洗浄した。小腸を５ｍｍに切り刻み、
０．４５ｍＭジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒ
ｅｉｔｏｌ）を含むＨ２３８７培地２０ｍｌを加え、２
５℃で５分毎に３回洗った。次に、２ｍＭＥＤＴＡを添
加した上記培地に変えて、３７℃で１０分毎に、３回振
とうした。この時の腸上皮細胞を含む上部液を集めて１
５００ｒｐｍ、５分の遠心を行った。沈降物をＰＢＳで
洗浄後、同様の条件で遠心し、沈降物に嫌気的に調製し
たリン酸緩衝液を加え懸濁した。

【００２１】次いで、全量に対して３％のクロロホルム
を加え、３０分ボルテックスミキサーでよく混合して、
３７℃で、１時間放置した後、ＣＯ₂ ガスを３０分通じ
クロロホルムを除いた。クロロホルム処理した懸濁液２
００μｌ、即ち、セグメント細菌（ＳＦＢ）をおよそ５
０個含むように無菌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に経口投与
した。投与後、３、６、９、１３日後に糞便の塗抹標本
を作製し、セグメント細菌（ＳＦＢ）の定着を調べた。

【００２２】（２）糞便中の菌数測定 無菌マウスに菌液を投与後、上記により作製した糞便の
塗抹標本における生菌数を測定した。該無菌マウス糞便
中の生菌数は、ＥＧ平板を用いて嫌気グローブボックス
内で４〜７日間、またはＴＳＡ平板を用いて好気条件下
で１〜２日間、３７℃で培養することにより、それぞれ
嫌気性菌、好気性菌の検出を行った。また、糞便の塗抹
標本は、グラム染色標本をして、直接鏡検によって菌数
測定を行った。

【００２３】その結果、投与後６日目で、糞便中にセグ
メント細菌の定着を確認した。糞便希釈液をＥＧ培地上
で嫌気培養しても菌は確認できなかったが、ＴＳＡ培地
で好気培養したところ、バチルスと考えられるグラム陽
性かん菌を確認した。セグメント細菌およびバチルス菌
が定着したマウスの糞便を段階希釈し、再度、新たな無
菌マウスに経口投与し、無菌条件下で飼育することによ
り、セグメント細菌とバチルスの分離を試みた。その結
果、みかけ上、セグメント細菌以外の菌が検出されず、
セグメント細菌の単独定着化が達成されたことを確認す
ることができた。

【００２４】なお、このマウスは、糞便を材料として作
製したセグメント細菌に由来する１６Ｓ ｒＲＮＡの一
部配列を用いた後記するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーションの結果からも、一種類のセグメント細菌の単独
定着マウスであることが証明された。

【００２５】２．セグメント細菌（ＳＦＢ）を唯一の腸
内細菌として有する動物の作出 （１）ＳＦＢ単独定着マウスの作出 上記１．のセグメント細菌（ＳＦＢ）の単独定着化方法
と同様にして、該セグメント細菌を唯一の腸内細菌とし
て有するマウスを作出した。

【００２６】（２）ＳＦＢ単独定着マウスの特性 このマウスは、糞便を材料として作製したセグメント細
菌に由来する１６ＳｒＲＮＡの一部配列を用いたｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果、後に示される
ように、一種類のセグメント細菌の単独定着マウスであ
ることが証明された。即ち、該ＳＦＢ単独定着マウス
は、一種類のセグメント細菌ＢＡＬ０１株を唯一の腸内
細菌として有する点にその特性が存するものとして特定
化されるものである。

【００２７】（３）ＳＦＢ単独定着マウスの飼育方法 後記３．のセグメント細菌の培養、継代方法と同様にし
て、該ＳＦＢ単独定着マウスを飼育した。飼育方法は、
通常の無菌マウスの飼育条件により、無菌アイソレータ
ー内で無菌的に行った。なお、上記により樹立された該
ＳＦＢ単独定着マウスは、株式会社ヤクルト本社中央研
究所（所在地；東京都国立市谷保１７９６ 電話番号；
０４２５−７７−８９６０）において、分譲可能な状態
に保存されており、必要に応じて第三者が入手すること
ができる状況となっている。

【００２８】３．セグメント細菌の培養、継代 無菌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、Ｈ−２ｄ）にセグメント細
菌（ＳＦＢ）が単独定着したマウスの糞便希釈液を投与
した。以後、ビニールアイソレーター内で無菌マウスと
同様に飼育した。飼育条件は、通常の無菌マウスの飼育
条件による。

【００２９】該セグメント細菌は、無菌マウスの小腸内
で、単離された状態で存在しており、該マウスの小腸内
容物、即ち、小腸上皮細胞、を無菌的に採取し、別の無
菌マウスに経口投与し、これを無菌的に飼育すること
で、培養し、継代することが可能である。該セグメント
細胞の培養、継代は、無菌マウスに限らず、他の動物に
対しても同様に実施することが可能である。また、その
腸内容物をアンプルに密封し、凍結保存することで、該
セグメント細菌を長期保存することが可能である。な
お、上記により、単離された該セグメント細菌は、生体
外で培養するための有効な培養方法が確立されておら
ず、動物体内を生育条件として必須とするので、現行の
寄託制度のもとでは寄託機関に寄託することが不可能で
あるので、株式会社ヤクルト本社中央研究所（所在地；
東京都国立市谷保１７９６ 電話番号；０４２５−７７
−８９６０）において、セグメント細菌ＢＡＬ０１とし
て、厳密な管理下に、保存しており、必要に応じていつ
でも提供する用意がある。

【００３０】４．セグメント細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ配
列の決定 （１）セグメント細菌（ＳＦＢ）懸濁液の溶菌 セグメント細菌（ＳＦＢ）単独定着マウスの盲腸内容物
より、ナイロンメッシュ（＃２００）で大きな食物残渣
を除き、パコール２０／５０／１００％の密度勾配遠心
を行い、２０〜５０％までのパコール液（スウェーデ
ン、ファルマシア社製）を回収して、セグメント細菌
（ＳＦＢ）を濃縮した。セグメント細菌（ＳＦＢ）懸濁
液（１０⁶ ／ｍｌ）をアクロモペプチダーゼ（約１ｍｇ
／ｍｌ、和光純薬社製）を加えて、トリス−塩酸緩衝液
（２０ｍＭ、ｐＨ８．０）で６０分処理をして、溶菌液
を作製した。

【００３１】（２）セグメント細菌（ＳＦＢ）１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ（polymerasechain reaction)
法による増幅 １００℃で５分処理した溶菌液を５μｌ、真正細菌の１
６Ｓ ｒＲＮＡのユニバーサルプライマー、５′−ＧＣ
ＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧ
ＣＴＣＡＧと５′−ＧＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴ
ＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ（２００μｇ／ｍｌ）
を、それぞれ５μｌ、nucleotide mixture(dNTs, 2.5m
M) を５μｌ、ＭｇＣｌ₂ （２５ｍＭ）を４μｌ、ＰＣ
Ｒ緩衝液（×１０）を５μｌ、精製水を１１μｌ、Ｔａ
ｑ polymerase (AmpliTaq 社製）を０．５μｌ、を混合
して、５０μｌ用マイクトチューブに入れて上部をパラ
フィンで重層した。ＰＣＲ装置で、９４℃２分、３７℃
２分、６５℃２分を１サイクル、９４℃１分、３７℃２
分、６５℃２分を３０サイクル、９４℃１分、３７℃２
分、６５℃４分を１サイクル、のプログラムで運転し
た。

【００３２】（３）ＰＣＲ産物の精製 前記のＰＣＲ産物を０．７％アガロースで電気泳動後、
約１６００塩基に相当するバンドを切りだし、透析チュ
ーブに入れて泳動緩衝液を４００μｌ加えて１５分泳動
を行った。内部液を抜き取り、フェノール抽出、エタノ
ール沈澱でＤＮＡを精製した。

【００３３】（４）ＰＣＲ産物の大腸菌へのクローニン
グ ＰＣＲ産物を制限酵素ＳｓｅＩとＮｏｔＩで切断、ベク
ターpBluescript （ストラタジン社製、米国）（ＳＫ
＋、ＫＳ＋）をＰｓｔＩとＮｏｔＩで切断し、後者につ
いては、さらにアルカリ性フォスファターゼ処理を行っ
た。両者をリガーゼで結合し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０
９（Ｔａｋａｒａ製）に導入した。５０μｇ／ｍｌ ア
ンピシリン、８０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ、２０ｍＭ
ＩＰＴＧを含むＬＢプレート上でコロニーを形成させ、
白色のコロニーを選んだ。

【００３４】（５）組換えプラズミドの調製 上記で得られたクローンをＹＴ−培養液（Ampicilin 10
0 μg/ml）で対数増殖期まで培養し、ヘルパーファージ
ＶＣＳＭ−１３またはＲ４０８を加え、さらにＹＴ−br
oth を添加後一夜培養した。培養液に２０％になるよう
ＰＥＧ６０００を加え、ＤＮＡを沈澱させ、ＤＮａｓ
ｅ、ＲＮａｓｅ処理をして一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）
を調製した。二重鎖 ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の調製は、
菌体を集菌して、Cell resuspension bufferに懸濁し、
細胞溶菌液を加えた。中和後、上清にマジックミニカラ
ム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、減圧マニフォールド
装置を使用して精製した。

【００３５】（６）ＤＮＡ塩基配列の決定 ジデオキシヌクレオチドを含むヌクレオチド混合液、Ａ
ｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、さ
らに、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡテンプレートを加
え、９６℃３０秒、５０℃１５秒、６０℃４分２５サイ
クルで反応させた。用いたプライマーは、ＫＳ＋クロー
ンに対して５′−ＧＴＡＧＣＡＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＣ
Ｃ、５′−ＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧ、ＳＫ
＋クローンに対して５′−ＧＧＧＡＧＡＡＡＧＣＡＧＧ
ＧＧＡＣＣ、５′−ＡＧＴＡＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＡＧ
ＧＣ、５′−ＣＧＧＡＡＴＡＡＣＴＧＧＧＣＧＴＡ、
５′−ＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧ、ベクター
Ｍ１３サイトから塩基配列の決定には、４種のDye−Ｍ
１３primerを用いて反応させた。ＤＮＡシークエンサー
（ファルマシア３７３Ａ）を用いて、得られた反応物を
ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、レーザーによっ
て各色素の吸収をモニターし、塩基配列を決定した。そ
の結果、配列表の配列番号１の配列式（図８〜９の配列
式（１））で示される１６Ｓ ｒＲＮＡの配列が決定さ
れた。該ＲＮＡ配列は、対応するＤＮＡ配列を含むベク
ターを大腸菌に形質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｊ
Ｍ１０９（ｐＢＳ ＫＳ−ＭＳＦＢ１６Ｓ）として、工
業技術院生命工学工業技術研究所に（受託番号）ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４７５４として寄託済みである。

【００３６】（７）ＰＣＲプライマーの合成 各種ＰＣＲ反応に必要なプライマーおよび蛍光標識した
oligo nucleotideプローブはＤＮＡ合成機にて合成し、
Ｇ−１０カラムによって脱塩、精製した。

【００３７】（８）in situ ハイブリダイゼーション 得られたセグメント（ＳＦＢ）単独定着マウスの盲腸内
容物を希釈後、３７％フォルムアルデヒドで固定して、
ネオプレーンでコートしたスライドグラス上に塗抹し
た。３．７％フォルムアルデヒド、９０％メタノールで
再度固定し、水洗後、５０ｍＭボロハイドライドナトリ
ウムで処理した。蛍光標識したプローブを７５０ｍＭ
食塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％牛血清アルブミン溶
液（ＢＳＡ）、１０％硫酸デキストラン、０．０１％ポ
リアデニル酸を含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液に約
２ｎｇ／ｍｌに溶解し、内容物塗抹標本の上に加えて、
湿箱中で３７℃で一夜反応させた。スライドグラスを３
７℃で数回洗浄して、直ちに蛍光顕微鏡下で観察した。

【００３８】５．ＤＮＡプローブの作製とセグメント細
菌の検出 また、該遺伝子配列から選択したＮｏ．９６４からＮ
ｏ．９８８部分とＮｏ．１２３１からＮｏ．１２５５部
分（２か所）に相補的なＤＮＡ配列をＤＮＡ合成器を用
いて合成し、これをプローブとして用いて、該マウスの
糞便液中のセグメント細菌とハイブリダイゼーション反
応させたところ、両プローブとも全セグメント細菌と反
応し、前記の単離操作が成功していることが確認され
た。上記により、該ＤＮＡをプローブとして用いること
により、該セグメント細菌を検出できることが分かっ
た。また、本検出法を用いれば、該セグメント細菌の増
殖促進作用を有する物質の検索も可能である。即ち、動
物に被験物質を投与し、該動物の投与後のセグメント細
菌量を計測し、経時変化、または、被験物質を与えない
コントロール群と比較することで被験物質のセグメント
細菌の増殖促進効果の有無を確認することができる。

【００３９】６．セグメント細菌の生理作用 （１）フローサイトメトリーによるリンパ球表面抗原の
解析 モノクローナル抗体として、抗-panγδTCR (GL3、 Phar
mingen 、 USA) 、抗-panαβTCR (H57-597,Pharmingen
、 USA)、 FITC-抗-CD3 ε(145-2C11, Boeringer, Deut
ch) 、FITC- 抗-Lyt-3 (53-5.8, Pharmingen) 、FITC-
抗-Thy-1.2 (Pharmingen) 、PE-抗-Lyt-2 (53-6.7, Pha
rmingen)、 Biotin-抗-CD4 (Rm-4.5, Pharmingen)、およ
びポリクローナル抗体として、FITC- 抗-mouse Igs (Ca
ltag, USA)、を使用した。

【００４０】後記する方法により調製した腸上皮細胞間
リンパ球（ＩＥＬ）標品を検鏡下で計測した後、２×１
０⁵ の細胞を上記の抗体で０℃で３０分反応後、ハンク
ス液を加えて遠心して、必要な場合はその沈降物にアビ
ジン−ＦＩＴＣまたはアビジン−ＰＥ、アビジン−サイ
トクロームを加えて０℃、３０分反応させた。染色終了
後の細胞は２％ パラホルムアルデヒドで固定後、ハン
クス液で２倍希釈して、分析まで４℃で保存した。蛍光
分析はＥＰＩＣＳ−Ｅｌｉｔｅ（ＣＯＵＬＴＥＲ社、Ｕ
ＳＡ）を用いて前方散乱と側方散乱でリンパ球区分にゲ
ートを設定して２カラーまたは３カラー分析を行った。

【００４１】（２）腸上皮細胞間リンパ球（ＩＥＬ）の
調製 マウスを断頭放血して開腹し、腸を取り出した。パイエ
ル板、腸間膜を除き、腸を切り開いて、冷ＰＢＳで内容
物を充分に洗浄した。小腸を１−１．５ｃｍに切り刻
み、０．４５ｍＭ ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏ
ｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含むＨ２３８７培地を２ｍｌ／he
ad加えて往復型シェーカー（１００ｒｐｍ、２５℃）で
振とうし、５分毎に５回培地を交換した。その後、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを添加した上記培地に変えて、３７℃、１
３０ｒｐｍで１０分毎に３回振とうした。その時の腸上
皮細胞を含む上部液を集めて１０００ｒｐｍ、１０分の
遠心を行った。沈降物を５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０
培地に再懸濁して３７℃で２時間加温した。大きな凝集
物を除き、残りを綿カラム（０．１５ｇ／ｔｕｂｅ）で
濾過した。３０％パコール密度勾配遠心を行い、沈降物
を回収し再度密度勾配遠心を行い、４４／７０％の界面
に腸上皮細胞間リンパ球（ＩＥＬ）を回収し、フローサ
イトメトリーによってリンパ球表面抗原を解析した。

【００４２】（３）腸上皮細胞間リンパ球（ＩＥＬ）の
細胞障害活性（ＣＴＬ）の測定⁵¹ ＣｒでラベルしたＰ８１５細胞と腸上皮細胞間リンパ
球（ＩＥＬ）を９６穴マイクロプレートに加え（Ｅ／Ｔ
５０：１）、１４５−２Ｃ１１抗体（ＣＤ３抗体；
０．２μｇ／ｍｌ）またはＨ５７−５９７抗体（αβＴ
ＣＲ抗体；０．２μｇ／ｍｌ）を加えて６時間放置し、
上清に遊離してきた放射活性の量を測定することにより
算出した。

【００４３】（４）組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ
Ｉ分子の免疫組織化学および組織学的検索 回盲部より約５ｃｍの回腸をテイッシュマウントを用い
て−８０℃で包埋し、クライオトームで５μｍの凍結切
片を作製した。組織片を通常マウス血清で３０分ブロッ
キングを行い、ビオチン化モノクローナル抗体抗Ｉ−Ａ
^b （Ｉ−Ａ^k に交差）と抗Ｉ−Ｅ^d （Ｉ−Ｅ^k に交差）
の混合液、パーオキシダーゼ標識アビジンで反応させ、
３，３′ジアミノベンチジンで発色させた。切片の１部
をパラホルムアルデヒド固定し、蒸留水で洗浄後１％メ
タ過ヨウ素酸ナトリウムで５−１０分処理し、水洗後シ
ッフ試薬（Ｍｅｒｃｋ社）で遮光下で１０−３０分反応
させた。さらに、０．０５Ｍ亜硫酸ナトリウムで洗浄
後、水洗を行いマイヤーへマトキシリン液で１５分染色
を行い、組織学的検索を行った。

【００４４】（５）分裂指数の測定 マウス屠殺９０分前にビンクリスチンをマウス当たり２
０μｇを腹腔内に投与した。回盲部より幽門部側に５ｃ
ｍの回腸部の組織をカルノアの固定液で固定した。固定
液を水に置換した後、１Ｎ塩酸で５６℃で１時間処理し
た。冷水で数回洗浄した後シッフ試薬を加え、遮光下で
６０分反応させた、組織を水で数回洗浄し、１５％酢酸
液内で実体顕微鏡下にクリプトを単離し、クリプト当た
りの分裂中期の細胞数を計測し分裂指数とした。

【００４５】（６）腸内容物のＩｇＡの測定 腸内容物をＰＢＳで希釈して、マウスミエローマＩｇＡ
を標準物質としてサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定し
た。９６穴プレートに抗マウスＩｇＡ（Ｚｙｍｅｄ社）
を吸着させ、ゼラチン−ＰＢＳでブロッキングをして、
サンプルを加え３７℃で反応させた。さらに、パーオキ
シダーゼ標識抗マウスＩｇＡ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社）を
加え、過酸化水素を基質として、ｏ−フェニレンジアミ
ンで発色させた。

【００４６】（７）糖脂質の分析 菌叢投与後、０、１、４、７、１４日後に糞便を採取し
クロロホルム：メタノール混液（２：１）で総脂質を抽
出後、薄層プレートにスポットして（１．５ｍｇ相
当）、クロロホルム：メタノール：水（６０：４０：
８）で展開し、卵白アルブミン溶液でブロッキングを行
い、ウサギ抗アシアロＧＭ１、抗フコシルアシアロＧＭ
１抗体の混合液中で反応させ、次に、パーオキシダーゼ
標識抗ウサギＩｇＧを加えて、４−クロロ−１−ナフト
ールを用いて発色させた。

【００４７】（８）二糖類分解酵素活性の測定 小腸のＥＤＴＡ処理で遊離してきた上皮細胞を一部サン
プリングし、ＰＢＳで洗浄し、活性測定まで−２０℃で
保存した。マイクロラボチューブミキサーで均一に懸濁
した後、タンパク質量、各種酵素活性を測定した。スク
ラーゼ、マルターゼ、ラクターゼの基質溶液は、スクロ
ース、マルトース、ラクトースの５６ｍＭ マイレン酸
緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に溶解したものを用い
た。酵素反応は、３７℃で１時間行い、沸騰水中で５分
静置して反応を終了させた。遊離してきたグルコースを
グルコースＣＩＩテストワコー（和光純薬）で測定し
た。

【００４８】（９）セグメント細菌（ＳＦＢ）の特有の
効果とその評価 （腸粘膜免疫系への効果）腸管粘膜系の生体防御系にお
いて重要な役割を果たしている腸上皮細胞間リンパ球
（ＩＥＬ）の細胞数、表現型、細胞障害活性をセグメン
ト細菌投与前と投与後に経時的に調べた。セグメント細
菌投与後１４日目から、腸上皮細胞間リンパ球（ＩＥ
Ｌ）の細胞数が顕著に増加した。特に機能的にもよく分
かっているαβ細胞受容体をもったＴ細胞（αβＴ細
胞）の割合が増えることが明らかとなった（図１）。こ
のことから、本発明のセグメント細菌は、腸上皮間リン
パ球の活性増強剤の有効成分として有用である。さら
に、Ｔｈｙ−１抗原を発現した成熟したＴ細胞（Ｔｈｙ
−１）の割合が増えることも明らかとなった（図２）。
これらの腸上皮細胞間リンパ球（ＩＥＬ）は、癌細胞Ｐ
８１５細胞を標的とした細胞障害活性を発揮した（図
３）。腸管内の病原性細菌、ウイルスなどの中和作用を
もち、感染防御因子として働く分泌型ＩｇＡの産生も促
進された（図４）。このことから、本発明のセグメント
細菌は、腸粘膜ＩｇＡ産生促進剤の有効成分として有用
である。

【００４９】（腸上皮細胞の生体防御因子への効果）腸
管内の病原因子に対して、腸上皮細胞は、生体防御ライ
ンの最前線に位置するだけでなく、腸上皮細胞間リンパ
球（ＩＥＬ）などのリンパ球に抗原提示機能を発揮して
Ｔ細胞を活性化する働きも想定されている。これまで、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｏｇｉｎｏｓａの細胞
接着の受容体と考えられているアシアロＧＭ１糖脂質は
セグメント菌の投与によりフコシル化されることが示さ
れ（図５）、この結果より、腸上皮細胞の病原菌やウイ
ルスに対する受容体がブロックされることが明らかとな
った。

【００５０】さらに、Ｔ細胞への腸管内抗原を提示する
ために必要な組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子
がセグメント細菌投与後７−１４日目に発現した（表
１）。このことから、本発明のセグメント細菌は、腸上
皮細胞組織適合抗原発現促進剤及び病原細菌の定着抑制
剤の有効成分として有用である。その他、小腸上皮細胞
分裂指数の促進（表２）、腸粘膜上皮細胞の成熟の指標
として用いられている吸収細胞／杯細胞（ゴブレット細
胞）の比率（図６）、二糖類分解酵素活性（図７ａ〜
ｃ）もセグメント細胞投与によって通常のＳＰＦ（ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）マウスと
同等になり、小腸上皮細胞の成熟化が促進された。この
ことから、本発明のセグメント細菌は、腸上皮細胞成熟
促進剤の有効成分として有用である。

【００５１】

【表１】 注）＋＋〜−は、発現の程度を示す。

【００５２】

【表２】

【００５３】これらの結果は、いずれも病原性細菌のい
ない常在性腸内フローラによって起こされる効果そのも
のである。即ち、腸内フローラの中でセグメント細菌が
これらの生理作用を担っている腸内細菌の少なくとも一
つであることが分かった。腸管内の病原因子に対する防
御システムは、以上のようにセグメント細菌によって活
性化されていることが判明した。

【００５４】

【発明の効果】以上詳述したとおり、本発明は、腸粘膜
における生体防御機構の増強に関係するセグメント細菌
の培養、継代方法等に関するものであり、本発明によれ
ば次のような効果が得られる。 （１）動物の腸内に常在し、各種生理作用を有するセグ
メント細菌の単離方法を提供することができる。 （２）セグメント細菌を唯一の腸内細菌として有する動
物およびその作出方法を提供することができる。 （３）従来、有効な培養方法が確立されていなかったセ
グメント細菌の培養方法、継代方法を提供することがで
きる。

【００５５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１４７７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｒＲＮＡ 配列 GAGUUUGAUC CUGGCUCAGG ACGAACGCUG GCGGCGUGCC UAACACAUGC AAGUUGAGCG 60 GAGAUAUAUG GAGCUUGCUU UAUAUAACUU AGCAGCGAAC GGGUGAGUAA CACGUAGAUA 120 AUCUAUCCUA UACUGGGGGA UAGCCCGAUG AAAGUUGGAU UAAUACCGCA UAUAGCUAUA 180 UAGUUGCAUG AUUAUGUAGU GAAAGAUUUA UUGGUAUAGG AGGAGUCUGC GGCACAUUAG 240 CUAGUAGGUG AGGUAAAGGC UUACCUAGGC GACGAUGUGU AGCCGGUCUG AGAGGAUGAA 300 CGGCCACAAU GGAACUGAGA CACGGUCCAU ACUGCUACGG GAGGCAGCAG UGGGGAAUAU 360 UGCACAAUGG GGGAAACCCU GAUGCAGCAA CGCCGCGUGA GUGAAGAAGG UUUUCGGAUU 420 GUAAAGCUCU GUUAGCAGGG AAGAGGAAGG ACGGUACCUG CAGAGGAAGC CACGGCUAAC 480 UACGUGCCAG CAGCCGCGGU AAUACGUAGG UGGCAAGCGU UGUUCGGAAU AACUGGGCGU 540 AAAGGAUGCG UAGGCGGUUA AACANGWUAU AUGUUAAAUA UAUAGGCUUA ACCUGUAGAA 600 AGCAUAUAAA ACUGUUUAAC UAGAGUGCAG GAGAGGUAAG UGGAAUUCCU AGUGUAGCGG 660 UGAAAUGCGU AGAGAUUAGG AAGAACACCA GUGGCGAAGG CGACUUACUG GACUGUAACU 720 GACGCUGAGG CAUGAGAGCA UGGGGAGCAA ACAGGAUUAG AUACCCUGGU AGUCCAUGCU 780 GUAAACGAUG GGUACUAGGU GUGGGUUGUG AAUAACAAUU CGUNCCGUCA CAAACGCAAU 840 AAGUACCCCG CCUGAGGAGU ACGAUCGCAA GAUUAAAACU CAAAGGAAUU GACGGGGACC 900 CGCACAAGCA GCGGAGCAUG UGGUUUAAUU CGAAGCAACG CGAAGAACCU UACCUAAACU 960 UGACAUACCU UGAAUUACCU UGUAAUGAGG GAACCUCCCA AGACCAAGGA UACAGGUGGU 1020 GCAUGGUUGU CGUCAGCUCG UGUCGUGAGA UGUUGGGUUA AGUCCCGCAA CGAGCGCAAC 1080 CCUUGUUGUU AAUUGCUAAC AGGUUAAGCU GAGCACUUUA GCGAGACAGC CUAGGUUAAC 1140 UAGGAGGAAG GUGGGGAUGA CGUCAAAUCA UCAUGCCCCU UACGUUUAGG GCUACACACG 1200 UGCUACAAUG GUGAGAACAG AGRGAAGCAA GCUAGUGAUA GUGAGCAAAA CUUAUAAAAC 1260 UCAUCUCAGU UCGGAUUGCA GGCUGAAACU CGCCUGUAUG AAGAUGGAGU UGCUAGUAAU 1320 CGCGAAUCAG AAUGUCGCGG UGAAUACGUU CCCGGGUCUU GUACACACCG CCCGUCACAC 1380 CAUGAGAGUU GGCAACACCC GAAACCUGUG GGCUAACCAU AUAGGAGGCA GCAGUCUAAG 1440 GUGGGGUCAG UGAUUGGGGU GAAGUCGUAA CAAGGUA 1477 配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｒＲＮＡ 配列 TCATTACAAG GTAATTCAAG GTATG 25 配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｒＲＮＡ 配列 ATAAGTTTTG CTCACTATCA CTAGC 25

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のセグメント細菌投与によるαβ細胞
受容体をもったＴ細胞の細胞増殖試験結果を示す。

【図２】 本発明のセグメント細菌投与によるＴｈｙ−
１抗原を発現した成熟Ｔ細胞の細胞増殖試験結果を示
す。

【図３】 本発明のセグメント細菌投与による細胞障害
試験の結果を示す。

【図４】 本発明のセグメント細菌投与による分泌型Ｉ
ｇＡ産生促進試験の結果を示す。

【図５】 本発明のセグメント細菌投与によるアシアロ
ＧＭ１糖脂質のフコシル化反応試験の結果を示す。

【図６】 本発明のセグメント細菌投与による吸収細胞
／ゴブレット細胞の比率に及ぼす影響を示す。

【図７】 本発明のセグメント細菌投与による二糖類
（ａ〜ｃ）分解酵素活性に及ぼす影響を示す。

【図８】 本発明のセグメント細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ
の配列（１−８００）を示す。

【図９】 本発明のセグメント細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ
の配列（８０１−１４７７）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 今岡 明美 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 松本 敏 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 動物の腸内に常在するセグメント細菌の
   単離方法であって、動物の小腸上皮細胞を採取し、クロ
   ロホルム処理した後、無菌の同種の動物に無菌的に投与
   し、一定期間無菌的に飼育し、次いで、この動物の糞便
   を採取し、再度、新たな無菌の同種の動物に、無菌的に
   投与し、一定期間無菌的に飼育し、さらに、必要に応じ
   て、この糞便採取および新たな動物への無菌的投与操作
   を数度繰り返した後に、該動物が糞便中の唯一の細菌と
   して、セグメント細菌を有していることを確認すること
   を特徴とする、セグメント細菌の単離方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の方法にて単離されたセグ
   メント細菌を、無菌の同種の動物に、無菌条件下に投与
   し、さらに無菌条件下に飼育することを特徴とする、セ
   グメント細菌を唯一の腸内細菌として有する動物の作出
   方法。
3. 【請求項３】 請求項２記載の作出方法を繰り返すこと
   を特徴とする、セグメント細菌の培養、および継代方
   法。
4. 【請求項４】 請求項２記載の方法で作出されたことを
   特徴とする、セグメント細菌を唯一の腸内細菌として有
   する動物。
5. 【請求項５】 動物が、マウスである、請求項１記載の
   セグメント細菌の単離方法。
6. 【請求項６】 動物が、マウスである、請求項４記載の
   セグメント細菌を唯一の腸内細菌として有する動物。
7. 【請求項７】 セグメント細菌が、配列表の配列番号１
   の配列式で示されるＲＮＡ配列を、１６Ｓ ｒＲＮＡの
   配列として有するセグメント細菌ＢＡＬ０１であること
   を特徴とする、請求項１記載のセグメント細菌の単離方
   法。
8. 【請求項８】 セグメント細菌が、配列表の配列番号１
   の配列式で示されるＲＮＡ配列を、１６Ｓ ｒＲＮＡの
   配列として有するセグメント細菌ＢＡＬ０１であること
   を特徴とする、請求項４記載のセグメント細菌を唯一の
   腸内細菌として有する動物。